JP2003516164A - Ｔ１レセプター様リガンドｉｉおよびこれの使用 - Google Patents
Ｔ１レセプター様リガンドｉｉおよびこれの使用Info
- Publication number
- JP2003516164A JP2003516164A JP2001544377A JP2001544377A JP2003516164A JP 2003516164 A JP2003516164 A JP 2003516164A JP 2001544377 A JP2001544377 A JP 2001544377A JP 2001544377 A JP2001544377 A JP 2001544377A JP 2003516164 A JP2003516164 A JP 2003516164A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ligand
- polypeptide
- sequence
- antibody
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/202—IL-3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/54—Interleukins [IL]
- G01N2333/545—IL-1
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、新規なＴ１Ｒレセプター（Ｔ１Ｒ）様リガンドＩＩタンパク質に関する。詳細には、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドがまた、これを発現する組み換えベクターおよび宿主細胞がそうであるように、提供される。本発明はさらにＴ１Ｒ様リガンドＩＩを含む薬学的組成物および処方物に関連する。また、治療および診断の目的で、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはアゴニスト／アンタゴニストを用いる方法が提供される。診断キットもさらに提供される。
Description
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、新規のＴ１レセプター（Ｔ１Ｒ）様リガンドＩＩタンパク質に関す
る。特に、単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードする核酸分子が
提供される。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドはまた提供され、同じもの発現
のための組換えベクターおよび宿主細胞も提供される。本発明は、さらにＴ１Ｒ
様リガンドＩＩを含む薬学的組成物および処方物に関連する。また、Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはアゴニスト／アンタゴ
ニストを、治療また診断目的に、使用する方法が提供される。診断キットもまた
提供される。
る。特に、単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードする核酸分子が
提供される。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドはまた提供され、同じもの発現
のための組換えベクターおよび宿主細胞も提供される。本発明は、さらにＴ１Ｒ
様リガンドＩＩを含む薬学的組成物および処方物に関連する。また、Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはアゴニスト／アンタゴ
ニストを、治療また診断目的に、使用する方法が提供される。診断キットもまた
提供される。
【０００２】
（関連技術）
（インターロイキン−１）
インターロイキン（ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β）は、他のサイトカインまた
小メディエイタ分子に呼応して、ほとんど全ての型の細胞に影響を与える「多機
能な」サイトカインである（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．、Ｂｌｏｏｄ ８７
：２０９５−２１４７（１９９６年３月））。ＩＬ−１遺伝子ファミリーには、
以下の３つのメンバーがある：ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１レセプタ
ーアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、アゴニス
トであり、ＩＬ−１Ｒａは特異なレセプターアンタゴニストである。ＩＬ−１α
およびＩＬ−１βは、リーダー配列なしの前駆体として合成される。それぞれの
前駆体の分子量は。３１ｋＤである。１７ｋＤの「成熟」形態への、ＩＬ−１α
またはＩＬ−１βのプロセシングは、特定の細胞性（ｃｅｌｌｕｌａｒ）プロテ
アーゼを必要とする。対照的に、ＩＬ−１Ｒａはシグナルペプチドを伴って発達
し、迅速に細胞外に輸送され、分泌ＩＬ−１Ｒａ（ｓＩＬ−１Ｒａ）と呼ばれて
いる。
小メディエイタ分子に呼応して、ほとんど全ての型の細胞に影響を与える「多機
能な」サイトカインである（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．、Ｂｌｏｏｄ ８７
：２０９５−２１４７（１９９６年３月））。ＩＬ−１遺伝子ファミリーには、
以下の３つのメンバーがある：ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１レセプタ
ーアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、アゴニス
トであり、ＩＬ−１Ｒａは特異なレセプターアンタゴニストである。ＩＬ−１α
およびＩＬ−１βは、リーダー配列なしの前駆体として合成される。それぞれの
前駆体の分子量は。３１ｋＤである。１７ｋＤの「成熟」形態への、ＩＬ−１α
またはＩＬ−１βのプロセシングは、特定の細胞性（ｃｅｌｌｕｌａｒ）プロテ
アーゼを必要とする。対照的に、ＩＬ−１Ｒａはシグナルペプチドを伴って発達
し、迅速に細胞外に輸送され、分泌ＩＬ−１Ｒａ（ｓＩＬ−１Ｒａ）と呼ばれて
いる。
【０００３】
（ＩＬ−１レセプターおよびリガンド）
ＩＬ−１経路のレセプターとリガンドは、よく規定されている（総説としては
、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：１３１４〜１３２５（
１９９４）；Ｊ．Ｅ．ら、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａ
ｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｅ
ｌｌｅｓ，Ｖｏｌ．３，ＪＡＩ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，
Ｃ．Ｔ．（１９９４），ｐｐ．１９７−２２２）。３つのリガンド， ＩＬ−１
α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は
、ＩＬ−１レセプターの以下の３つの形態に結合する：８０ｋＤタイプＩ ＩＬ
−１レセプター（ＩＬ−１Ｒ１）（Ｓｉｍｓ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４１：５８５−５８９（１９８８））、６８ｋＤａタイプＩＩ ＩＬ−１レセプ
ター（ＩＬ−ＩＲＨ）（ＭｃＭａｈａｎ、Ｃ．Ｊ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．１０：２
８２１〜２８３２（１９９１））、および可溶性形態であるタイあプＩＩ ＩＬ
−１Ｒ（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）（Ｃｏｌｏｔｔａ、Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
１：４７２〜４７５（１９９３））。
、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：１３１４〜１３２５（
１９９４）；Ｊ．Ｅ．ら、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａ
ｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｅ
ｌｌｅｓ，Ｖｏｌ．３，ＪＡＩ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，
Ｃ．Ｔ．（１９９４），ｐｐ．１９７−２２２）。３つのリガンド， ＩＬ−１
α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は
、ＩＬ−１レセプターの以下の３つの形態に結合する：８０ｋＤタイプＩ ＩＬ
−１レセプター（ＩＬ−１Ｒ１）（Ｓｉｍｓ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４１：５８５−５８９（１９８８））、６８ｋＤａタイプＩＩ ＩＬ−１レセプ
ター（ＩＬ−ＩＲＨ）（ＭｃＭａｈａｎ、Ｃ．Ｊ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．１０：２
８２１〜２８３２（１９９１））、および可溶性形態であるタイあプＩＩ ＩＬ
−１Ｒ（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）（Ｃｏｌｏｔｔａ、Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
１：４７２〜４７５（１９９３））。
【０００４】
ＩＬ−１リガンドとレセプターの相互作用は、損傷や感染に対するＩＬ−１媒
介宿主応答の刺激および調節において基礎的な役割を担う。ＩＬ−ＩＲＩを発現
し、そしてＩＬ−１αまたはＩＬ−１βで処理された細胞は、以下を含むいくつ
かの方法で応答する：核でのｒｅｌ関連性転写因子ＮＦ−κβの局在化の刺激（
総説については、Ｔｈａｎｏｓ、Ｄ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｃｅｌｌ
８０：５２９−５３２（１９９６）を参照のこと），表皮増殖因子レセプター
（ＥＧＦＲ）のトレオニン残基６６９（Ｔｈｒ−６６９）をリン酸化するミトゲ
ン−活性化プロテインキナーゼスーパーファミリーのプロテインキナーゼの活性
化（Ｇｕｙ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１８４６−１８５
２（１９９２）；Ｂｉｒｄ，Ｔ．Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
８：２２８６１−２２８７０（１９９１）；Ｂｉｒｄ，Ｔ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．ｃｈｅｍ．２６９：３１８３６−３１８４４ （１９９４））、およびＩＬ
−８遺伝子の転写の刺激（Ｍｕｋａｉｄａ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６５：２１１２８−２１１３３（１９９０））。
介宿主応答の刺激および調節において基礎的な役割を担う。ＩＬ−ＩＲＩを発現
し、そしてＩＬ−１αまたはＩＬ−１βで処理された細胞は、以下を含むいくつ
かの方法で応答する：核でのｒｅｌ関連性転写因子ＮＦ−κβの局在化の刺激（
総説については、Ｔｈａｎｏｓ、Ｄ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｃｅｌｌ
８０：５２９−５３２（１９９６）を参照のこと），表皮増殖因子レセプター
（ＥＧＦＲ）のトレオニン残基６６９（Ｔｈｒ−６６９）をリン酸化するミトゲ
ン−活性化プロテインキナーゼスーパーファミリーのプロテインキナーゼの活性
化（Ｇｕｙ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１８４６−１８５
２（１９９２）；Ｂｉｒｄ，Ｔ．Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
８：２２８６１−２２８７０（１９９１）；Ｂｉｒｄ，Ｔ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．ｃｈｅｍ．２６９：３１８３６−３１８４４ （１９９４））、およびＩＬ
−８遺伝子の転写の刺激（Ｍｕｋａｉｄａ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６５：２１１２８−２１１３３（１９９０））。
【０００５】
（ＩＬ−１ＲＩ−様ファミリー）
様々な系からの多くのタンパク質がＩＬ１−ＲＩの細胞質ドメインに対して相
同性を示している。これの広範なＩＬ−１ＲＩ様ファミリーは、哺乳動物タンパ
ク質，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質、および植物（タバコ）タンパク質を含
む（Ｇａｙ，Ｎ．Ｊ．およびＫｅｉｔｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：３
５５−３５６（１９９１）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ ５２：
２６９−２７９ （１９８８）； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｄ．Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ
ｓ＆Ｄｅｖ．５：７９７−８０７ （１９９１）；Ｅｄｏｎ， Ｅ．ら、Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：８８５−８９９ （１９９４）；Ｍｉｔｃｈａｎ，
Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：５７７７−５７８２ （Ｍａｒ
ｃｈ ８， １９９６））。
同性を示している。これの広範なＩＬ−１ＲＩ様ファミリーは、哺乳動物タンパ
ク質，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質、および植物（タバコ）タンパク質を含
む（Ｇａｙ，Ｎ．Ｊ．およびＫｅｉｔｈ，Ｆ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：３
５５−３５６（１９９１）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ ５２：
２６９−２７９ （１９８８）； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｄ．Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ
ｓ＆Ｄｅｖ．５：７９７−８０７ （１９９１）；Ｅｄｏｎ， Ｅ．ら、Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：８８５−８９９ （１９９４）；Ｍｉｔｃｈａｎ，
Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：５７７７−５７８２ （Ｍａｒ
ｃｈ ８， １９９６））。
【０００６】
哺乳動物ＩＬ−ＩＲＩ様レセプターファミリーのメンバーとしては、マウスタ
ンパク質ＭｙＤ８８（Ｌｏｒｄ， Ｋ．Ａ． ｅｔａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
５：１０９５−１０９７ （１９９０））およびヒト遺伝子であるｒｓｃ７Ｓ
６（Ｎｏｍｕｒａ， Ｎ．ら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．１：２７−３５ （１９９４）
）が挙げられる。別のマウスレセプターのメンバーＴＩ／ＳＴ２は、ＢＡＬＢ／
ｃ−３Ｔ３細胞 で発現する新規の一次応答遺伝子として以前に特徴づけられた
（Ｋｌｅｍｅｎｚ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７０８〜５７１２（１９８９）；Ｔｏｍｉｎａｇａ、Ｓ
．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５８：３０１−３０４（１９８９）；Ｔｏｍｉｎａｇ
ａ、Ｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１８：８３〜８７（１９９３））。膜貫通タ
ンパク質ｍｕｌＬ−１Ｒ ＡｃＰ（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ、Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３７５７−１３７６５（１９９５））は、タイプ
Ｉ ＩＬ−１ＲおよびタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの両方に対して相同性を有してい
る。ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰは、近年、ＩＬ−１βに対するＩＬ−１ＲＩの親和性を
増大していることが示され、そしてＩＬ−１応答に関連し得る。
ンパク質ＭｙＤ８８（Ｌｏｒｄ， Ｋ．Ａ． ｅｔａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
５：１０９５−１０９７ （１９９０））およびヒト遺伝子であるｒｓｃ７Ｓ
６（Ｎｏｍｕｒａ， Ｎ．ら、ＤＮＡ Ｒｅｓ．１：２７−３５ （１９９４）
）が挙げられる。別のマウスレセプターのメンバーＴＩ／ＳＴ２は、ＢＡＬＢ／
ｃ−３Ｔ３細胞 で発現する新規の一次応答遺伝子として以前に特徴づけられた
（Ｋｌｅｍｅｎｚ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７０８〜５７１２（１９８９）；Ｔｏｍｉｎａｇａ、Ｓ
．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５８：３０１−３０４（１９８９）；Ｔｏｍｉｎａｇ
ａ、Ｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１８：８３〜８７（１９９３））。膜貫通タ
ンパク質ｍｕｌＬ−１Ｒ ＡｃＰ（Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ、Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３７５７−１３７６５（１９９５））は、タイプ
Ｉ ＩＬ−１ＲおよびタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの両方に対して相同性を有してい
る。ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰは、近年、ＩＬ−１βに対するＩＬ−１ＲＩの親和性を
増大していることが示され、そしてＩＬ−１応答に関連し得る。
【０００７】
（Ｔ１レセプター）
Ｔ１／ＳＴ２レセプター（以後、「Ｔ１レセプター」とする）は、ＩＬ−１レ
セプターファミリー（Ｂｅｒｇｅｒ、Ｇ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１１７６（１
９９４））のメンバーとして、異なる種において、様々な相同性を有する。ラッ
トにおいて、これはＦｉｔ−１と呼ばれ、エストロゲン誘導性（ｅｓｔｒｏｇｅ
ｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であり、マウスのＩＬ−１ＲＩおよびＩＩにそれぞれ
、２６％〜２９％のアミノ酸相同性を有するｃ−ｆｏｓ依存的な膜貫通タンパク
質である。マウスにおいて、Ｆｉｔ−１タンパク質はＳＴ１と呼ばれ、そしてヒ
トにおいてはこれはＴ１と呼ばれる。２つＩＬ−１レセプターおよびＦｉ１−１
／ＳＴ２／Ｔ１遺伝子の構成は、これらが共通祖先に由来することを示している
（Ｓｉｍｓ、Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、７：４８３（１９９５））。Ｆｉ
ｔ−１は、２つの形態で存在している：ＩＬ−１ＲＩのドメインに類似している
細胞質ゾルドメイン（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｄｏｍａｉｎ）を有する膜形態（Ｆ
ｉｔ−１Ｍ）、およびＦｉｔ−１Ｓ（これは分泌され、そしてＦｉｔ−Ｍの細胞
外ドメインを含む）。
セプターファミリー（Ｂｅｒｇｅｒ、Ｇ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１１７６（１
９９４））のメンバーとして、異なる種において、様々な相同性を有する。ラッ
トにおいて、これはＦｉｔ−１と呼ばれ、エストロゲン誘導性（ｅｓｔｒｏｇｅ
ｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であり、マウスのＩＬ−１ＲＩおよびＩＩにそれぞれ
、２６％〜２９％のアミノ酸相同性を有するｃ−ｆｏｓ依存的な膜貫通タンパク
質である。マウスにおいて、Ｆｉｔ−１タンパク質はＳＴ１と呼ばれ、そしてヒ
トにおいてはこれはＴ１と呼ばれる。２つＩＬ−１レセプターおよびＦｉ１−１
／ＳＴ２／Ｔ１遺伝子の構成は、これらが共通祖先に由来することを示している
（Ｓｉｍｓ、Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、７：４８３（１９９５））。Ｆｉ
ｔ−１は、２つの形態で存在している：ＩＬ−１ＲＩのドメインに類似している
細胞質ゾルドメイン（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｄｏｍａｉｎ）を有する膜形態（Ｆ
ｉｔ−１Ｍ）、およびＦｉｔ−１Ｓ（これは分泌され、そしてＦｉｔ−Ｍの細胞
外ドメインを含む）。
【０００８】
多くの方法において、これらＦｉｔ−１タンパク質の２つの形態は、膜結合お
よび可溶性ＩＬ−１ＲＩの形態に類似している。ＩＬ−１ｓＲＩが、細胞結合形
態のタンパク質分解性切断に由来することが示されてきた（Ｓｉｍｓ、Ｊ．Ｅ．
ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７：４８３（１９９５））。一方、Ｆｉｔ−１遺伝子は
、２つのプロモーターの制御下にあり、これは、レセプターの膜形態また可溶形
態のいずれかについてコードする２つのアイソフォームを生み出す。２つのＲＮ
Ａ転写物が、遺伝子の３’末端の選択的ＲＮＡスプライシングにより、生み出さ
れる。ＩＬ−１βが、Ｆｉｔ−１に弱く結合して、そしてシグナルを移入しない
（Ｒｅｉｋｅｒｓｔｏｒｇｅｒ、Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１
７６４５（１９９５））が、細胞質ゾルＦｉｔ−１に融合した細胞外のマウスＩ
Ｌ−１ＲＩから構成されるキメラレセプターは、ＩＬ−１シグナルを移入する（
Ｒｅｉｋｅｒｓｔｏｒｇｅｒ、Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１７
６４５（１９９５））。Ｆｉｔ−１の細胞質ゾル性部分は、ＩＬ−１ＲＩのＧＴ
Ｐアーゼ様配列と整列する（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．
４：１８５１（１９９５））（以下を参照）。
よび可溶性ＩＬ−１ＲＩの形態に類似している。ＩＬ−１ｓＲＩが、細胞結合形
態のタンパク質分解性切断に由来することが示されてきた（Ｓｉｍｓ、Ｊ．Ｅ．
ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７：４８３（１９９５））。一方、Ｆｉｔ−１遺伝子は
、２つのプロモーターの制御下にあり、これは、レセプターの膜形態また可溶形
態のいずれかについてコードする２つのアイソフォームを生み出す。２つのＲＮ
Ａ転写物が、遺伝子の３’末端の選択的ＲＮＡスプライシングにより、生み出さ
れる。ＩＬ−１βが、Ｆｉｔ−１に弱く結合して、そしてシグナルを移入しない
（Ｒｅｉｋｅｒｓｔｏｒｇｅｒ、Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１
７６４５（１９９５））が、細胞質ゾルＦｉｔ−１に融合した細胞外のマウスＩ
Ｌ−１ＲＩから構成されるキメラレセプターは、ＩＬ−１シグナルを移入する（
Ｒｅｉｋｅｒｓｔｏｒｇｅｒ、Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１７
６４５（１９９５））。Ｆｉｔ−１の細胞質ゾル性部分は、ＩＬ−１ＲＩのＧＴ
Ｐアーゼ様配列と整列する（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．
４：１８５１（１９９５））（以下を参照）。
【０００９】
（様々な疾患状態におけるＩＬ−１産生）
増大したＩＬ−１産生が、以下に罹患する患者および激しい運動後の健康な被
験体の中で報告されている：様々なウイルス性、細菌性、真菌性、および寄生虫
性の感染症；脈管内の凝固；高用量ＩＬ−２療法；固化した腫瘍（ｓｏｌｉｄ
ｔｕｍｏｒｓ）；白血病；アルツハイマー疾患；ＨＩＶ−ｌ感染；自己免疫障害
；外傷（外科）；血液透析；虚血性の疾患（心筋梗塞）；非感染性の肝炎；ぜん
息；ＵＶ照射；閉鎖性頭部外傷；膵臓炎；歯周炎；対宿主性移植片病；移植拒絶
反応。アルツハイマー疾患の患者における、増大したＩＬ−１βの産生およびア
ミロイド前駆体タンパク質の放出におけるＩＬ−１の潜在的な役割との関連性が
ある（Ｖａｓｉｌａｋｏｓ，Ｊ．Ｐ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５４：２８９
（１９９４））。しかし，ほとんどの条件において，ＩＬ−１は単なる増大し
た産生を提示する唯一のサイトカインでなく、従って、任意の特定疾患の病原関
連するＩＬ−１検出の特異性は、欠如している．様々な疾患状態において，ＩＬ
−１αではなく、ＩＬ−１βが、循環において検出される。
験体の中で報告されている：様々なウイルス性、細菌性、真菌性、および寄生虫
性の感染症；脈管内の凝固；高用量ＩＬ−２療法；固化した腫瘍（ｓｏｌｉｄ
ｔｕｍｏｒｓ）；白血病；アルツハイマー疾患；ＨＩＶ−ｌ感染；自己免疫障害
；外傷（外科）；血液透析；虚血性の疾患（心筋梗塞）；非感染性の肝炎；ぜん
息；ＵＶ照射；閉鎖性頭部外傷；膵臓炎；歯周炎；対宿主性移植片病；移植拒絶
反応。アルツハイマー疾患の患者における、増大したＩＬ−１βの産生およびア
ミロイド前駆体タンパク質の放出におけるＩＬ−１の潜在的な役割との関連性が
ある（Ｖａｓｉｌａｋｏｓ，Ｊ．Ｐ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５４：２８９
（１９９４））。しかし，ほとんどの条件において，ＩＬ−１は単なる増大し
た産生を提示する唯一のサイトカインでなく、従って、任意の特定疾患の病原関
連するＩＬ−１検出の特異性は、欠如している．様々な疾患状態において，ＩＬ
−１αではなく、ＩＬ−１βが、循環において検出される。
【００１０】
（治療におけるＩＬ−１）
ＩＬ−１が多くの重要な生物学的な活性を提示すること見出されてきたが、こ
れはまた、治療用量に近いある用量において毒性であることも見出されてきた （Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：２０９５−２１４７（Ｍ
ａｒｃｈ １５， １９９６））。一般に、ＩＬ−１のいずれのアイソフォーム
における急性の毒力は、皮下注射の場合と比較すると静脈注射後の方がより大き
い。皮下注射は、有意な局所的な疼痛、紅斑、腫脹と関連性がある（Ｋｉｔａｍ
ｕｒａ、Ｔ．、＆Ｔａｋａｋｕ、Ｆ．、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ７：１７０（１９８９
）；Ｌａｕｇｈｌｉｎ、Ｍ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６７：２６７（１
９９３））。１００ ｎｇ／ｋｇ以上の用量で静脈内にＩＬ−１を受けた患者は
、有意な低血圧を経験する。４〜３２ｎｇ／ｋｇのＩＬ−１βを静脈内に受けた
患者は、最も高い用量レベルにおいて、唯一の低血圧のエピソードが生じた（Ｌ
ａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６７：２６７（１９９３
））。
れはまた、治療用量に近いある用量において毒性であることも見出されてきた （Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：２０９５−２１４７（Ｍ
ａｒｃｈ １５， １９９６））。一般に、ＩＬ−１のいずれのアイソフォーム
における急性の毒力は、皮下注射の場合と比較すると静脈注射後の方がより大き
い。皮下注射は、有意な局所的な疼痛、紅斑、腫脹と関連性がある（Ｋｉｔａｍ
ｕｒａ、Ｔ．、＆Ｔａｋａｋｕ、Ｆ．、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ７：１７０（１９８９
）；Ｌａｕｇｈｌｉｎ、Ｍ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６７：２６７（１
９９３））。１００ ｎｇ／ｋｇ以上の用量で静脈内にＩＬ−１を受けた患者は
、有意な低血圧を経験する。４〜３２ｎｇ／ｋｇのＩＬ−１βを静脈内に受けた
患者は、最も高い用量レベルにおいて、唯一の低血圧のエピソードが生じた（Ｌ
ａｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６７：２６７（１９９３
））。
【００１１】
正常な骨髄貯蔵（ｎｏｒｍａｌ ｍａｒｒｏｗ ｒｅｓｅｒｖｅｓ）がある患
者における、ＩＬ−１関連する骨髄刺激（ｍｙｅｌｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）
とは対照的に、５日用量（３０〜１００ ｎｇ／ｋｇ）のＩＬ−１ ａで処置し
た再生不良性貧血の患者は、末梢血球算定また骨髄細胞性（ｂｏｎｅ ｍａｒｒ
ｏｗ ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ ）における増加は見られなかった（Ｗａｌｓｈ
，Ｃ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ ８０：１０６（１９９
２））。ＩＬ−１は、様々な化学療法のレジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）を経験
してきた患者に、好中球減少および血小板減少の絶望を減少させるために投与さ
れてきた。
者における、ＩＬ−１関連する骨髄刺激（ｍｙｅｌｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）
とは対照的に、５日用量（３０〜１００ ｎｇ／ｋｇ）のＩＬ−１ ａで処置し
た再生不良性貧血の患者は、末梢血球算定また骨髄細胞性（ｂｏｎｅ ｍａｒｒ
ｏｗ ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ ）における増加は見られなかった（Ｗａｌｓｈ
，Ｃ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ ８０：１０６（１９９
２））。ＩＬ−１は、様々な化学療法のレジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）を経験
してきた患者に、好中球減少および血小板減少の絶望を減少させるために投与さ
れてきた。
【００１２】
４０ｎｇ／ｋｇのＩＬ−１αを、０日〜１３日で用いた、骨髄細胞または肝細
胞の日常的な治療で、よりはやい好中球減少の回復（メジアン；１２日、Ｐ＜．
００１）が生じた（Ｗｅｉｓｄｏｒｆ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４：
２０４４（１９９４））。処置の１４日後、骨髄は有意に、投じられた骨髄系の
前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅ
ｌｌｓ）を伴って富化された。パージした（ｐｕｒｇｅｄ）またはパージしない
（ｎｏｎｐｕｒｇｅｄ）骨髄を移植した時点で開始して５日間に亘り、５０ ｎ
ｇ／ｋｇ／ｄのＩＬ−１βを受けたＡＭＬの患者において、同様の結果が報告さ
れている（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ， Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８３：３４７３（１
９９４））。ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βのいずれかの低用量をヒト注射するこ
とにより、この分子の性質が確かになる。
胞の日常的な治療で、よりはやい好中球減少の回復（メジアン；１２日、Ｐ＜．
００１）が生じた（Ｗｅｉｓｄｏｒｆ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８４：
２０４４（１９９４））。処置の１４日後、骨髄は有意に、投じられた骨髄系の
前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅ
ｌｌｓ）を伴って富化された。パージした（ｐｕｒｇｅｄ）またはパージしない
（ｎｏｎｐｕｒｇｅｄ）骨髄を移植した時点で開始して５日間に亘り、５０ ｎ
ｇ／ｋｇ／ｄのＩＬ−１βを受けたＡＭＬの患者において、同様の結果が報告さ
れている（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ， Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８３：３４７３（１
９９４））。ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βのいずれかの低用量をヒト注射するこ
とにより、この分子の性質が確かになる。
【００１３】
（可溶性のＩＬ−１レセプターを用いた疾患の改善）
マウスＩＬ−１ｓＲＩのマウスに対する投与は、異所性（ｈｅｔｅｒｏｔｏｐ
ｉｃ）心臓同種移植片の生存を増加させ、そして同種異系細胞に対する異所性の
リンパ節の応答を減少させた（Ｆａｎｓｌｏｗ，Ｗ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４８：７３９（１９９０））。免疫誘導性関節炎（ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｕ
ｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）のラットモデルにおいて、マウスＩＬ−１ ｓＲ
Ｉの局所的な点滴注入は、関節の腫脹および組織破壊を減少させた（Ｄｏｗｅｒ
，Ｓ．Ｋ．ら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１１３（１９９
４））。このようなデータは、正常な対側性の（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）
関節に投与されたＩＬ−１ｓＲＩの量は、全身に作用することを示唆する実験的
な自己免疫脳炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｔ）のモデル
のおいて、ＩＬ−１ｓＲＩはこの疾患の重篤度を減少した（Ｊａｃｏｂｓ，Ｃ．
Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２９８３（１９９１））。
ｉｃ）心臓同種移植片の生存を増加させ、そして同種異系細胞に対する異所性の
リンパ節の応答を減少させた（Ｆａｎｓｌｏｗ，Ｗ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４８：７３９（１９９０））。免疫誘導性関節炎（ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｕ
ｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）のラットモデルにおいて、マウスＩＬ−１ ｓＲ
Ｉの局所的な点滴注入は、関節の腫脹および組織破壊を減少させた（Ｄｏｗｅｒ
，Ｓ．Ｋ．ら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１１３（１９９
４））。このようなデータは、正常な対側性の（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）
関節に投与されたＩＬ−１ｓＲＩの量は、全身に作用することを示唆する実験的
な自己免疫脳炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｔ）のモデル
のおいて、ＩＬ−１ｓＲＩはこの疾患の重篤度を減少した（Ｊａｃｏｂｓ，Ｃ．
Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２９８３（１９９１））。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、図１のアミノ酸配列（配列番号２）を有するヒトＴ１レセプター（
Ｔ１Ｒ）様リガンドＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単
離された核酸分子を提供する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、約２２９アミノ酸残基
からなるポリペプチド（これは、Ｎ末端のメチオニン、約２６アミノ酸残基のリ
ーダー配列、約１６８残基の細胞外成熟ドメイン、約２３残基の膜貫通ドメイン
、および約１２アミノ酸残基の細胞内ドメインを含み、そして推定分子量は２６
ｋＤａである）をコードする、オープンリーディングフレームを含む。推定され
る成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の２０３残基の配列は、配列番号２で示
される（アミノ酸残基１〜２０３）。
Ｔ１Ｒ）様リガンドＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単
離された核酸分子を提供する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、約２２９アミノ酸残基
からなるポリペプチド（これは、Ｎ末端のメチオニン、約２６アミノ酸残基のリ
ーダー配列、約１６８残基の細胞外成熟ドメイン、約２３残基の膜貫通ドメイン
、および約１２アミノ酸残基の細胞内ドメインを含み、そして推定分子量は２６
ｋＤａである）をコードする、オープンリーディングフレームを含む。推定され
る成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の２０３残基の配列は、配列番号２で示
される（アミノ酸残基１〜２０３）。
【００１５】
本発明はまた、１９９６年７月１２日にＡＴＣＣ寄託番号９７６５５として寄
託されたｃＤＮＡによりコードされたアミノ酸を含むＴ１Ｒ様リガンドＩＩをコ
ードする、単離された核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、上記
の寄託されたｃＤＮＡにコードされた成熟したポリペプチドをコードする。
託されたｃＤＮＡによりコードされたアミノ酸を含むＴ１Ｒ様リガンドＩＩをコ
ードする、単離された核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、上記
の寄託されたｃＤＮＡにコードされた成熟したポリペプチドをコードする。
【００１６】
従って、本発明の一つの局面は、以下からなる群より選択されたヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する：（ａ）配
列番号２の完全なアミノ酸配列を含むＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコー
ドする、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２の完全なアミノ酸配列Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリペプチドをコードするが、Ｎ末端のメチオニン残基がない、ヌク
レオチド配列；（ｃ）配列番号２において、約１〜約２０３の位置のアミノ酸配
列を含む、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコードする、ヌクレオチド
配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤＮＡによりコードされ
た、完全なアミノ酸配列を含む、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコードす
る、ヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤＮＡ
によりコードされた、アミノ酸配列を含む成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ
）、および（ｅ）のヌクレオチド配列のうち任意のものに、相補的なヌクレオチ
ド配列。
配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する：（ａ）配
列番号２の完全なアミノ酸配列を含むＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコー
ドする、ヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２の完全なアミノ酸配列Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリペプチドをコードするが、Ｎ末端のメチオニン残基がない、ヌク
レオチド配列；（ｃ）配列番号２において、約１〜約２０３の位置のアミノ酸配
列を含む、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコードする、ヌクレオチド
配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤＮＡによりコードされ
た、完全なアミノ酸配列を含む、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコードす
る、ヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤＮＡ
によりコードされた、アミノ酸配列を含む成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ
）、および（ｅ）のヌクレオチド配列のうち任意のものに、相補的なヌクレオチ
ド配列。
【００１７】
さらなる本発明の実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
）または（ｆ）のうち任意のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％同一
であるヌクレオチド配列、およびより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、
９７％、９８％、または９９％同一である、ヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチド、または、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ
）のポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイズする、ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を包含する。
このハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ストリジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下で、Ａ残基だけからなる、またはＴ残基だけかなる、ヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドにはハイブリダイズしない。本発明のさらなる
核酸の実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ
）のアミノ酸配列を持つＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのエピトープ含有部
位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関
する。
）または（ｆ）のうち任意のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％同一
であるヌクレオチド配列、およびより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、
９７％、９８％、または９９％同一である、ヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチド、または、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ
）のポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイズする、ポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を包含する。
このハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ストリジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下で、Ａ残基だけからなる、またはＴ残基だけかなる、ヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドにはハイブリダイズしない。本発明のさらなる
核酸の実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ
）のアミノ酸配列を持つＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのエピトープ含有部
位のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関
する。
【００１８】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む、組換えベクター、この組
換えベクターを含む宿主細胞、およびＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたは
それらのフラグメントの組換え技術による産生に関する。
換えベクターを含む宿主細胞、およびＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたは
それらのフラグメントの組換え技術による産生に関する。
【００１９】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む単離され
たＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを提供する：（ａ）完全な２２９アミノ酸
配列（配列番号２に示されたリーダー配列を含む）を有する、Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）完全な２２９アミノ酸配列（配列番号
２に示したリーダー配列を含むが、Ｎ末端のメチオニン残基はない）を有する、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの、アミノ酸配列；（ｃ）配列番号２におけ
る、１〜２０３の位置のアミノ酸配列を含む、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペ
プチド（リーダー配列なし）の、アミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６
５５に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされた完全なアミノ酸配列（リーダー
配列を含む）を含む、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのアミノ酸配列；およ
び（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
されたアミノ酸配列を含む、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのアミノ酸
配列。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも、９０％同一なアミノ酸配列、
および、好ましくは、上記の配列に対して９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを有するポリペプチドである
。
たＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを提供する：（ａ）完全な２２９アミノ酸
配列（配列番号２に示されたリーダー配列を含む）を有する、Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）完全な２２９アミノ酸配列（配列番号
２に示したリーダー配列を含むが、Ｎ末端のメチオニン残基はない）を有する、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの、アミノ酸配列；（ｃ）配列番号２におけ
る、１〜２０３の位置のアミノ酸配列を含む、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペ
プチド（リーダー配列なし）の、アミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６
５５に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされた完全なアミノ酸配列（リーダー
配列を含む）を含む、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのアミノ酸配列；およ
び（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
されたアミノ酸配列を含む、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのアミノ酸
配列。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも、９０％同一なアミノ酸配列、
および、好ましくは、上記の配列に対して９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを有するポリペプチドである
。
【００２０】
本発明のこの局面のさらなる実施形態は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、
または（ｅ）に記載されたアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプ
チドのエピトープ含有部位のアミノ酸配列を有する、ペプチドまたはポリヌクレ
オチドに関する。本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのエピトープ含有
部位のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドは、このようなポリペプ
チドの部分を、少なくとも６または７、好ましくは少なくとも９、およびより好
ましくは少なくと約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸として含むが、上に記載した
本発明のポリペプチドの完全なアミノ配列の長さ以下の、任意の長さのエピトー
プ含有ポリペプチドはまた、本発明に含まれる。別の実施形態において、本発明
は、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）に記載したアミノ酸配列を有
するＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドに特異的に結合する、単離した抗体を含
む。
または（ｅ）に記載されたアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプ
チドのエピトープ含有部位のアミノ酸配列を有する、ペプチドまたはポリヌクレ
オチドに関する。本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのエピトープ含有
部位のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドは、このようなポリペプ
チドの部分を、少なくとも６または７、好ましくは少なくとも９、およびより好
ましくは少なくと約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸として含むが、上に記載した
本発明のポリペプチドの完全なアミノ配列の長さ以下の、任意の長さのエピトー
プ含有ポリペプチドはまた、本発明に含まれる。別の実施形態において、本発明
は、上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）に記載したアミノ酸配列を有
するＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドに特異的に結合する、単離した抗体を含
む。
【００２１】
本発明はまた、上に記載のポリペプチドのフラグメントに関する。本発明し配
列従った好ましいポリペプチドフラグメントは、以下を含むポリペプチドを包含
する：成熟ポリペプチド（配列番号２における、約１〜約２０３のアミノ酸残基
）、細胞外ドメイン（配列番号２における、約１〜約１６８のアミノ酸残基）、
膜貫通ドメイン（配列番号２における、約１６９〜約１９１のアミノ酸残基）、
細胞内ドメイン（配列番号２における、約１９２〜約２０３のアミノ酸残基）、
または膜貫通ドメインの全てまたは部分削った細胞外および細胞内ドメイン。
列従った好ましいポリペプチドフラグメントは、以下を含むポリペプチドを包含
する：成熟ポリペプチド（配列番号２における、約１〜約２０３のアミノ酸残基
）、細胞外ドメイン（配列番号２における、約１〜約１６８のアミノ酸残基）、
膜貫通ドメイン（配列番号２における、約１６９〜約１９１のアミノ酸残基）、
細胞内ドメイン（配列番号２における、約１９２〜約２０３のアミノ酸残基）、
または膜貫通ドメインの全てまたは部分削った細胞外および細胞内ドメイン。
【００２２】
さらに、本発明は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソ
ンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリングの技術を通して、生成
可能である、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの融合ポリペプチドを提供する。
ンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリングの技術を通して、生成
可能である、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの融合ポリペプチドを提供する。
【００２３】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド配列
を含むタンパク質を提供する。このタンパク質は、単量体また多量体の形態で存
在し得る。これらのタンパク質および、これらのタンパク質を含有する組成物（
好ましくは、薬学的組成物）の調製はまた、提供される。
を含むタンパク質を提供する。このタンパク質は、単量体また多量体の形態で存
在し得る。これらのタンパク質および、これらのタンパク質を含有する組成物（
好ましくは、薬学的組成物）の調製はまた、提供される。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドおよびタンパク質を
発現する、トランスジェニック動物を提供する。
発現する、トランスジェニック動物を提供する。
【００２５】
さらなる別の実施形態において、染色体同定を可能にする染色体アッセイを提
供する。本発明の核酸は、ヒト個体の染色体の特定位置を、特異的に標的化し、
そしてそれにハイブリダイズする。一旦、配列が、正確な染色体位置に対してマ
ッピングされた場合、染色体上における、この配列の物理的な部分を、遺伝地図
データと関連づけ得る。
供する。本発明の核酸は、ヒト個体の染色体の特定位置を、特異的に標的化し、
そしてそれにハイブリダイズする。一旦、配列が、正確な染色体位置に対してマ
ッピングされた場合、染色体上における、この配列の物理的な部分を、遺伝地図
データと関連づけ得る。
【００２６】
別の実施形態、本発明は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのアンチセンスおよびリボザ
イムアンタゴニストを提供する。
イムアンタゴニストを提供する。
【００２７】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩの生物学的活性は、Ｔ１ＲリガンドおよびＩＬ
−１の生物学的活性と類似し得ると考えられている。「正常な」Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩ遺伝子発現レベル、すなわちＴ１ＲリガンドまたはＩＬ−１に関連する疾
患に罹患していない個体から採取した組織および体液における発現レベルに対し
て、有意に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの、より高いまたはより低いレベルが、Ｔ１
ＲリガンドまたはＩＬ−１関連疾患に罹患する個体から採取した組織または体液
（例えば、血清、血漿、尿素、滑液および髄液（ｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ））
において検出し得る。従って、本発明に従うＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現の
発現検出は、診断マーカーであある。従って、本発明は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
の発現レベルを検出するために使用する診断キットを提供する。
−１の生物学的活性と類似し得ると考えられている。「正常な」Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩ遺伝子発現レベル、すなわちＴ１ＲリガンドまたはＩＬ−１に関連する疾
患に罹患していない個体から採取した組織および体液における発現レベルに対し
て、有意に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの、より高いまたはより低いレベルが、Ｔ１
ＲリガンドまたはＩＬ−１関連疾患に罹患する個体から採取した組織または体液
（例えば、血清、血漿、尿素、滑液および髄液（ｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ））
において検出し得る。従って、本発明に従うＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現の
発現検出は、診断マーカーであある。従って、本発明は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
の発現レベルを検出するために使用する診断キットを提供する。
【００２８】
本発明はまた、本明細書中に記載したアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリペプチドに特異的結合する抗体を産生または単離するための、方法を提
供する。このような抗体は、本明細書中で記載したように、診断的または治療的
に有用でありる。
ＩＩポリペプチドに特異的結合する抗体を産生または単離するための、方法を提
供する。このような抗体は、本明細書中で記載したように、診断的または治療的
に有用でありる。
【００２９】
本発明はさらに、体内におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ活性のレベルが増大した
また減少したレベルを必要とする個体の処置のための方法に関し、ここでこの方
法は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたはそのインヒビターを含有する組
成物を、そのような個体に対して投与する工程を包含する。
また減少したレベルを必要とする個体の処置のための方法に関し、ここでこの方
法は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたはそのインヒビターを含有する組
成物を、そのような個体に対して投与する工程を包含する。
【００３０】
このように、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの薬学的組成物が提供され得る。Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩの組成物はまた提供され、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド
、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、および／または、それら
のフラグメントおよびそれらの改変体の治療用量を投与する方法も同様に提供す
る。
リガンドＩＩの組成物はまた提供され、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド
、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、および／または、それら
のフラグメントおよびそれらの改変体の治療用量を投与する方法も同様に提供す
る。
【００３１】
最後に、本発明は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩコードするポリヌクレオチド、抗体
、アゴニスト、アンタゴニスト、および／または、それらのフラグメントおよび
改変体を、遺伝子治療において使用する方法を提供する。
、アゴニスト、アンタゴニスト、および／または、それらのフラグメントおよび
改変体を、遺伝子治療において使用する方法を提供する。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、図１に示すアミノ酸配列（配列番号２）（これは、クローンしたｃ
ＤＮＡを配列決定することにより同定された）を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩを
コードするポリヌクレオチドを包含する分離された核酸分子を提供する。本発明
のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、Ｔ１Ｒリガンドと配列相同性を有する（
配列番号３）。
ＤＮＡを配列決定することにより同定された）を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩを
コードするポリヌクレオチドを包含する分離された核酸分子を提供する。本発明
のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、Ｔ１Ｒリガンドと配列相同性を有する（
配列番号３）。
【００３３】
図１の核酸配列（配列番号１）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション
特許デポジトリー１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍ
ａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に、１９９６年７月１２日に寄託
し、受託番号９７６５５を割り当てられた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｕｌｌａ
，ＣＡ）に含まれる。
特許デポジトリー１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍ
ａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に、１９９６年７月１２日に寄託
し、受託番号９７６５５を割り当てられた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｕｌｌａ
，ＣＡ）に含まれる。
【００３４】
（核酸分子）
別に指示がない限り、本明細書でＤＮＡ分子を配列決定することによって決定
されたヌクレオチド配列のすべては、自動化ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を
使用して決定し、そして本明細書で決定されたＤＮＡ分子によってコードされる
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の全てのアミノ酸配列は、上記のよう
に決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって予想された。従って、当該分野で公知の
ように、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について、
本明細書で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくらかの誤差を含み得る。
自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、代表的には、配列決定されたＤ
ＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％同一、より代
表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。
されたヌクレオチド配列のすべては、自動化ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を
使用して決定し、そして本明細書で決定されたＤＮＡ分子によってコードされる
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の全てのアミノ酸配列は、上記のよう
に決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって予想された。従って、当該分野で公知の
ように、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について、
本明細書で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくらかの誤差を含み得る。
自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、代表的には、配列決定されたＤ
ＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％同一、より代
表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。
【００３５】
実際の配列は、当該分野で周知の手動ＤＮＡ配列決定法を含む他のアプローチ
によって、より正確に決定され得る。同様に当該分野で公知のように、実際の配
列と比較しての、決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は
、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列が、その
ような挿入または欠失の点で開始して配列決定されたＤＮＡ分子によって実際に
コードされるアミノ酸配列とは完全に異なるように、ヌクレオチド配列の翻訳に
おけるフレームシフトを引き起こす。
によって、より正確に決定され得る。同様に当該分野で公知のように、実際の配
列と比較しての、決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は
、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列が、その
ような挿入または欠失の点で開始して配列決定されたＤＮＡ分子によって実際に
コードされるアミノ酸配列とは完全に異なるように、ヌクレオチド配列の翻訳に
おけるフレームシフトを引き起こす。
【００３６】
別に指示がない限り、本明細書に示される各「ヌクレオチド配列」は、デオキ
シリボヌクレオチドの配列（省略されたＡ，Ｇ，ＣおよびＴ）として表される。
しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」により、ＤＮ
Ａ分子またはポリヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドの配列）ならびにＲ
ＮＡ分子またはポリヌクレオチド（リボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の
対応する配列）が意図され、ここでは、特定のデオキシヌクレオチド配列中の各
チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）が、リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）によ
って置換されている。例えば、省略されたデオキシリボヌクレオチドを用いて示
された配列番号１に配列を有するＲＮＡ分子の参照は、配列番号１における各デ
オキシヌクレオチドＡ、ＧまたはＣが対応するリボヌクレオチドＡ，Ｇに置きか
えられ、そして各デオキシヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵに置きかえられ
た配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図する。
シリボヌクレオチドの配列（省略されたＡ，Ｇ，ＣおよびＴ）として表される。
しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」により、ＤＮ
Ａ分子またはポリヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドの配列）ならびにＲ
ＮＡ分子またはポリヌクレオチド（リボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の
対応する配列）が意図され、ここでは、特定のデオキシヌクレオチド配列中の各
チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）が、リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）によ
って置換されている。例えば、省略されたデオキシリボヌクレオチドを用いて示
された配列番号１に配列を有するＲＮＡ分子の参照は、配列番号１における各デ
オキシヌクレオチドＡ、ＧまたはＣが対応するリボヌクレオチドＡ，Ｇに置きか
えられ、そして各デオキシヌクレオチドＴがリボヌクレオチドＵに置きかえられ
た配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図する。
【００３７】
「単離された」核酸分子は、天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡま
たはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発
明の目的のために単離されたと見なされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例
には、異種宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子あるいは溶液中の精製
された（部分的または実質的に）ＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子
には、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロのＲＮＡ転写物が含まれ
る。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に産生されたこのような分子を
さらに含む。
たはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発
明の目的のために単離されたと見なされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例
には、異種宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子あるいは溶液中の精製
された（部分的または実質的に）ＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子
には、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロのＲＮＡ転写物が含まれ
る。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に産生されたこのような分子を
さらに含む。
【００３８】
本明細書において提供される情報を用いて（例えば図１における核酸配列（配
列番号１））、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコードする本発明の核酸分
子を、標準クローニングおよびスクリーニングの工程（例えば初めの材料として
ｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングする工程）を用いて入手し得る。本発
明に描かれる、図１に記載される核酸分子（配列番号１）は、９週令のヒト胚組
織由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。さらに、この遺伝子はまた
、以下のヒト細胞型由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて見出された：前立腺ア
ネルギーＴ細胞、ＴＦ２７４基質、ＷＩ３８、Ｓｏａｒｅｓ ｂｒｅａｓｔおよ
びＳｏａｒｅｓ ｐｌａｃｅｎｔａ。
列番号１））、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコードする本発明の核酸分
子を、標準クローニングおよびスクリーニングの工程（例えば初めの材料として
ｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングする工程）を用いて入手し得る。本発
明に描かれる、図１に記載される核酸分子（配列番号１）は、９週令のヒト胚組
織由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。さらに、この遺伝子はまた
、以下のヒト細胞型由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて見出された：前立腺ア
ネルギーＴ細胞、ＴＦ２７４基質、ＷＩ３８、Ｓｏａｒｅｓ ｂｒｅａｓｔおよ
びＳｏａｒｅｓ ｐｌａｃｅｎｔａ。
【００３９】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩｃＤＮＡは、開始コドンが配列番号１に示される核酸配
列の位置５５〜５７にある、約２２９アミノ酸残基のタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームを含む；約２６アミノ酸残基かつ推定分子量が約２
６ｋＤａの推定されるリーダー配列。成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質のア
ミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基１から残基２０３に示される。成熟Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、３つの主な構造的ドメインを有する。これら
は、細胞外ドメイン（配列番号２においてアミノ酸残基約１から約１６８由来）
；膜貫通ドメイン（配列番号２においてアミノ酸残基約１６９から約１９１由来
）；細胞内ドメイン（配列番号２においてアミノ酸残基約１９２から約２０３由
来）を含む。配列番号２における本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、
Ｔ１Ｒリガンド（これは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ４１８０４において利用可
能である）に約５６％同一性であり、約７５％の類似性である。
列の位置５５〜５７にある、約２２９アミノ酸残基のタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームを含む；約２６アミノ酸残基かつ推定分子量が約２
６ｋＤａの推定されるリーダー配列。成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質のア
ミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基１から残基２０３に示される。成熟Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、３つの主な構造的ドメインを有する。これら
は、細胞外ドメイン（配列番号２においてアミノ酸残基約１から約１６８由来）
；膜貫通ドメイン（配列番号２においてアミノ酸残基約１６９から約１９１由来
）；細胞内ドメイン（配列番号２においてアミノ酸残基約１９２から約２０３由
来）を含む。配列番号２における本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、
Ｔ１Ｒリガンド（これは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ４１８０４において利用可
能である）に約５６％同一性であり、約７５％の類似性である。
【００４０】
示されるように、本発明はまた、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の
成熟形態を提供する。シグナル仮説に従うと、哺乳動物細胞によって分泌される
タンパク質は、一旦粗面小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の移出が開始され
ると成熟タンパク質から切断される、シグナルまたは分泌リーダー配列を有する
。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞でさえ、分泌タンパク質を同じ特異性
で切断する。しかし、いくつかの場合には、分泌されたタンパク質の切断は完全
に均一ではなく、このことによりそのタンパク質に関して２つ以上の成熟種を生
じる。さらに、分泌されたタンパク質の切断特異性は、完全なタンパク質の一次
構造によって最終的に決定されること、すなわち、そのポリペプチドのアミノ酸
配列に固有であることが長い間公知であった。それゆえ、本発明は、ＡＴＣＣ受
託番号９７６５５として同定され、そして配列番号２に示される宿主に含まれる
ｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｔ１Ｒ様リガ
ンドＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。ＡＴＣＣ受託
番号９７６５５として同定される宿主に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
ドされるアミノ酸配列を有する成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、寄託さ
れた宿主中のベクターに含まれるクローンのヒトＤＮＡ配列によってコードされ
る完全オープンリーディングフレームの哺乳動物細胞（例えば、以下に記載のＣ
ＯＳ細胞）における発現によって産生されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の
成熟形態を意味する。以下に示されるように、ＡＴＣＣ受託番号９７６５５に含
まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｔ１Ｒ
様リガンドＩＩは、配列番号２に示される推定「成熟」Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタ
ンパク質（約１から約２０３までのアミノ酸）とは、コンピューター分析に基づ
いて推定される切断部位の精度に依存して、異なるかもしれないし、異ならない
かもしれない。
成熟形態を提供する。シグナル仮説に従うと、哺乳動物細胞によって分泌される
タンパク質は、一旦粗面小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の移出が開始され
ると成熟タンパク質から切断される、シグナルまたは分泌リーダー配列を有する
。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞でさえ、分泌タンパク質を同じ特異性
で切断する。しかし、いくつかの場合には、分泌されたタンパク質の切断は完全
に均一ではなく、このことによりそのタンパク質に関して２つ以上の成熟種を生
じる。さらに、分泌されたタンパク質の切断特異性は、完全なタンパク質の一次
構造によって最終的に決定されること、すなわち、そのポリペプチドのアミノ酸
配列に固有であることが長い間公知であった。それゆえ、本発明は、ＡＴＣＣ受
託番号９７６５５として同定され、そして配列番号２に示される宿主に含まれる
ｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｔ１Ｒ様リガ
ンドＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。ＡＴＣＣ受託
番号９７６５５として同定される宿主に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
ドされるアミノ酸配列を有する成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、寄託さ
れた宿主中のベクターに含まれるクローンのヒトＤＮＡ配列によってコードされ
る完全オープンリーディングフレームの哺乳動物細胞（例えば、以下に記載のＣ
ＯＳ細胞）における発現によって産生されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の
成熟形態を意味する。以下に示されるように、ＡＴＣＣ受託番号９７６５５に含
まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｔ１Ｒ
様リガンドＩＩは、配列番号２に示される推定「成熟」Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタ
ンパク質（約１から約２０３までのアミノ酸）とは、コンピューター分析に基づ
いて推定される切断部位の精度に依存して、異なるかもしれないし、異ならない
かもしれない。
【００４１】
タンパク質が、分泌リーダーおよびそのリーダー配列に対する切断点を有する
か否かを予測するための方法が、利用可能である。なぜなら、成熟タンパク質の
シグナル配列およびＮ末端におけるあるアミノ酸残基（特に切断部位を直接取り
囲む残基）に存在する分泌タンパク質についての多くの特異的切断が公知である
からである。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１〜２８
６（１９８５））の方法は、完全な（切断されていない）タンパク質の短いＮ末
端荷電領域および置換された非荷電領域由来の情報を用いる。ｖｏｎ Ｈｅｉｎ
ｊｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３〜４６９０（１９
８６））の方法は、切断部位を取り巻く残基（典型的な残基−１３から＋２であ
り、ここで＋１は、成熟タンパク質のアミノ酸末端を示す）由来の情報を用いる
。これらの方法の各々についての、公知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点を予
測することの精度は、７５〜８０％の範囲にある（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出
）。しかし、これらの２つの方法は、所定のタンパク質について、同じ推定切断
点（単数または複数）を常に生じるとは限らない。
か否かを予測するための方法が、利用可能である。なぜなら、成熟タンパク質の
シグナル配列およびＮ末端におけるあるアミノ酸残基（特に切断部位を直接取り
囲む残基）に存在する分泌タンパク質についての多くの特異的切断が公知である
からである。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１〜２８
６（１９８５））の方法は、完全な（切断されていない）タンパク質の短いＮ末
端荷電領域および置換された非荷電領域由来の情報を用いる。ｖｏｎ Ｈｅｉｎ
ｊｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３〜４６９０（１９
８６））の方法は、切断部位を取り巻く残基（典型的な残基−１３から＋２であ
り、ここで＋１は、成熟タンパク質のアミノ酸末端を示す）由来の情報を用いる
。これらの方法の各々についての、公知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点を予
測することの精度は、７５〜８０％の範囲にある（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前出
）。しかし、これらの２つの方法は、所定のタンパク質について、同じ推定切断
点（単数または複数）を常に生じるとは限らない。
【００４２】
当業者が理解するように、上記で議論されたような配列決定誤差の可能性、お
よび異なる公知のタンパク質におけるリーダーについての切断部位の可変性のた
めに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる実際のＴ１Ｒ様リガンドＩＩは
、約２２９アミノ酸を含むが、２１５〜２４５アミノ酸の範囲のどこかであり得
；そしてこのタンパク質の推定リーダー配列は、約２６アミノ酸であるが、約１
５〜約３０アミノ酸の範囲のどこかであり得る。さらに例えば、配列番号２にお
けるＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の細胞外ドメイン、細胞内ドメインおよび
膜貫通ドメインの正確な位置は、ドメインを規定するのに用いられる基準に依存
して、わずかに変り得る（例えば、正確なアミノ酸位置は、配列番号２に示した
ように比較され得る約１から約５残基異なり得る）。
よび異なる公知のタンパク質におけるリーダーについての切断部位の可変性のた
めに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる実際のＴ１Ｒ様リガンドＩＩは
、約２２９アミノ酸を含むが、２１５〜２４５アミノ酸の範囲のどこかであり得
；そしてこのタンパク質の推定リーダー配列は、約２６アミノ酸であるが、約１
５〜約３０アミノ酸の範囲のどこかであり得る。さらに例えば、配列番号２にお
けるＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の細胞外ドメイン、細胞内ドメインおよび
膜貫通ドメインの正確な位置は、ドメインを規定するのに用いられる基準に依存
して、わずかに変り得る（例えば、正確なアミノ酸位置は、配列番号２に示した
ように比較され得る約１から約５残基異なり得る）。
【００４３】
示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより、または合成的に産生して得
られるｃＤＮＡおよびゲノムｃＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖ま
たは一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖とし
ても知られる）であり得るか、またはそれは非コード鎖（アンチセンス鎖ともい
われる）であり得る。
またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより、または合成的に産生して得
られるｃＤＮＡおよびゲノムｃＤＮＡを含む）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖ま
たは一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖とし
ても知られる）であり得るか、またはそれは非コード鎖（アンチセンス鎖ともい
われる）であり得る。
【００４４】
本発明の単離された核酸分子は、図１（配列番号１）に示される核酸配列の位
置５５〜５７に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を
含むＤＮＡ分子および、開始コドンが図１（配列番号１）に示される核酸配列の
位置５５〜５７にあるＯＲＦの全てまたは一部が実質的に異なる配列を包含する
ＤＮＡ分子をさらに含むが、ここで本発明の単離された核酸分子は、遺伝子コー
ドの縮重によるが、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質またはそれらのフラグメン
トをなおコードする。当然、遺伝子コードは、当該分野で周知である。従って、
上記のような縮重改変体を生成することは当業者には慣用的である。
置５５〜５７に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を
含むＤＮＡ分子および、開始コドンが図１（配列番号１）に示される核酸配列の
位置５５〜５７にあるＯＲＦの全てまたは一部が実質的に異なる配列を包含する
ＤＮＡ分子をさらに含むが、ここで本発明の単離された核酸分子は、遺伝子コー
ドの縮重によるが、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質またはそれらのフラグメン
トをなおコードする。当然、遺伝子コードは、当該分野で周知である。従って、
上記のような縮重改変体を生成することは当業者には慣用的である。
【００４５】
別の局面において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号９７６５５として１９９６年
７月１２日に寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡクローンによってコード
されるアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードする単離
された核酸分子を提供する。好ましくはこの核酸分子は、上記に記載される寄託
されたｃＤＮＡクローンによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
７月１２日に寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡクローンによってコード
されるアミノ酸配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードする単離
された核酸分子を提供する。好ましくはこの核酸分子は、上記に記載される寄託
されたｃＤＮＡクローンによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【００４６】
本発明はまた、配列番号１に示されるヌクレオチド配列または上記の寄託され
たクローンに含まれるＴ１Ｒ様リガンドＩＩのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有
する単離された核酸分子、あるいは上記の配列の１つに相補的な配列を有する単
離された核酸分子を提供する。このような単離された分子、特にＤＮＡ分子は、
染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのため
の、およびヒト組織におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の発現を、例えば、ノ
ーザンブロット分析により検出するためのプローブとして有用である。本明細書
に詳細に記載したように、ある組織においての変化したＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺
伝子発現は、ある疾患の指標に成り得る。
たクローンに含まれるＴ１Ｒ様リガンドＩＩのｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有
する単離された核酸分子、あるいは上記の配列の１つに相補的な配列を有する単
離された核酸分子を提供する。このような単離された分子、特にＤＮＡ分子は、
染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのため
の、およびヒト組織におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の発現を、例えば、ノ
ーザンブロット分析により検出するためのプローブとして有用である。本明細書
に詳細に記載したように、ある組織においての変化したＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺
伝子発現は、ある疾患の指標に成り得る。
【００４７】
本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。例えば、寄託されたｃＤＮＡ ＡＴＣＣ受託番号９７６５５、受託さ
れたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列をコードする核酸配列、図
１に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）、
図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）またはそれらに対する相補鎖を
有する単離された核酸分子のフラグメントによって、少なくとも約１５ｎｔ、そ
してより好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約
３０ｎｔ、そしてましてや少なくとも約４０、５０、１００、１５０、２００、
２５０、３００、、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０
、６００または６５０ｎｔ長のフラグメントが好ましく意図される。これらのフ
ラグメントは、本明細書で議論される診断用プローブおよびプライマーを含むが
、これに限定されない、多くの利便性を有する。当然、より大きいフラグメント
である、例えば７００〜１２４４ｎｔ長のフラグメントもまた、寄託されたｃＤ
ＮＡ ＡＴＣＣ登録番号９７６５５、または図１に示されるヌクレオチド配列（
配列番号１）のほとんど（全てでないとしても）に対応するフラグメントもまた
、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントに
より、例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１に示される
ヌクレオチド配列（配列番号１）からの２０以上の連続する塩基を含むフラグメ
ントが意図される。
に関する。例えば、寄託されたｃＤＮＡ ＡＴＣＣ受託番号９７６５５、受託さ
れたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列をコードする核酸配列、図
１に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）、
図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）またはそれらに対する相補鎖を
有する単離された核酸分子のフラグメントによって、少なくとも約１５ｎｔ、そ
してより好ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約
３０ｎｔ、そしてましてや少なくとも約４０、５０、１００、１５０、２００、
２５０、３００、、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０
、６００または６５０ｎｔ長のフラグメントが好ましく意図される。これらのフ
ラグメントは、本明細書で議論される診断用プローブおよびプライマーを含むが
、これに限定されない、多くの利便性を有する。当然、より大きいフラグメント
である、例えば７００〜１２４４ｎｔ長のフラグメントもまた、寄託されたｃＤ
ＮＡ ＡＴＣＣ登録番号９７６５５、または図１に示されるヌクレオチド配列（
配列番号１）のほとんど（全てでないとしても）に対応するフラグメントもまた
、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントに
より、例えば、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１に示される
ヌクレオチド配列（配列番号１）からの２０以上の連続する塩基を含むフラグメ
ントが意図される。
【００４８】
遺伝子が寄託され、そして図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）が
提供されるので、このようなＤＮＡフラグメントを産生することは、当業者には
慣用的なことである。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による
剪断は、種々の大きさのフラグメントを生じるのに、簡便に用いられ得る。ある
いは、そのようなフラグメントを、合成的に生じ得る。
提供されるので、このようなＤＮＡフラグメントを産生することは、当業者には
慣用的なことである。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による
剪断は、種々の大きさのフラグメントを生じるのに、簡便に用いられ得る。ある
いは、そのようなフラグメントを、合成的に生じ得る。
【００４９】
例えば、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドフラグメントの代表
例としては、例えば、以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を有するフラグメ
ントまたは以下のおおよそのヌクレオチド数の配列から構成されるフラグメント
挙げられる：配列番号１の１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜
２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、
４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６００〜
６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、
８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１
０５１〜１１００、１１０１〜１１５０および／または１１５１〜１２１０、ま
たはそれら対する相補鎖、または寄託されたプラスミドに含まれたｃＤＮＡ。こ
の文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された範囲、いずれかの末端も
しくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌク
レオチドだけ大きいかまたは小さな範囲を含む。
例としては、例えば、以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を有するフラグメ
ントまたは以下のおおよそのヌクレオチド数の配列から構成されるフラグメント
挙げられる：配列番号１の１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜
２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、
４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６００〜
６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、
８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１
０５１〜１１００、１１０１〜１１５０および／または１１５１〜１２１０、ま
たはそれら対する相補鎖、または寄託されたプラスミドに含まれたｃＤＮＡ。こ
の文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された範囲、いずれかの末端も
しくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌク
レオチドだけ大きいかまたは小さな範囲を含む。
【００５０】
本発明の好ましい核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩ細胞外ドメインを含むポリペプチド（配列番号２における約
１から約１６８のアミノ酸残基）；Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ膜貫通ドメインを含む
ポリペプチド（配列番号２における約１６９から約１９１のアミノ酸残基）；Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩ細胞内ドメインを含むポリペプチド（配列番号２における約
１９２から約２０３のアミノ酸残基）；およびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの膜貫通ド
メインがすべてまたは一部欠損したもの有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩ細胞外ドメ
インおよび細胞内ドメインを含むポリペプチド。さらに好ましい本発明の核酸フ
ラグメントは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質のエピトープ保有位置をコード
する核酸分子を含む。特に分離された核酸分子は、配列番号２における以下のア
ミノ酸残基を有す（これは本発明者らが、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の疎
水性領域であることを決定したものである）：配列番号２における約１７から約
２６のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約５６から約７２
のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約１０３から約１２０
のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約１３６から約１４９
のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号２における約１５５から約
１７１のアミノ酸残基を含むポリペプチド。他のこのようなＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉタンパク質のエピトープ保有位置を決定する方法は、本明細書に詳細に記載さ
れる。
１Ｒ様リガンドＩＩ細胞外ドメインを含むポリペプチド（配列番号２における約
１から約１６８のアミノ酸残基）；Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ膜貫通ドメインを含む
ポリペプチド（配列番号２における約１６９から約１９１のアミノ酸残基）；Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩ細胞内ドメインを含むポリペプチド（配列番号２における約
１９２から約２０３のアミノ酸残基）；およびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの膜貫通ド
メインがすべてまたは一部欠損したもの有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩ細胞外ドメ
インおよび細胞内ドメインを含むポリペプチド。さらに好ましい本発明の核酸フ
ラグメントは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質のエピトープ保有位置をコード
する核酸分子を含む。特に分離された核酸分子は、配列番号２における以下のア
ミノ酸残基を有す（これは本発明者らが、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の疎
水性領域であることを決定したものである）：配列番号２における約１７から約
２６のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約５６から約７２
のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約１０３から約１２０
のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約１３６から約１４９
のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号２における約１５５から約
１７１のアミノ酸残基を含むポリペプチド。他のこのようなＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉタンパク質のエピトープ保有位置を決定する方法は、本明細書に詳細に記載さ
れる。
【００５１】
好ましくは、本発明のポリペプチドフラグメントは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機
能活性を示すポリペプチドをコードする。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ「機能活性」を
示すポリペプチドによって、１つ以上の公知の機能活性（これは、全長（完全な
）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク
質に関連する）を示すポリペプチドを示し得るポリペプチドを意味する。このよ
うな機能活性は、生物学的活性（例えば、インビボまたはインビトロにおける造
血制御能力（例えば、刺激））、抗原性（抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体に結合す
る（またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドと結合について競合する）能力、
免疫原性（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドに結合する抗体を産生する能力）
、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドとマルチマーを形成する能力およ
びＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドについてのレセプターまたはリガンドに結
合する能力を含むがこれらに限定されない。
能活性を示すポリペプチドをコードする。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ「機能活性」を
示すポリペプチドによって、１つ以上の公知の機能活性（これは、全長（完全な
）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク
質に関連する）を示すポリペプチドを示し得るポリペプチドを意味する。このよ
うな機能活性は、生物学的活性（例えば、インビボまたはインビトロにおける造
血制御能力（例えば、刺激））、抗原性（抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体に結合す
る（またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドと結合について競合する）能力、
免疫原性（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドに結合する抗体を産生する能力）
、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドとマルチマーを形成する能力およ
びＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドについてのレセプターまたはリガンドに結
合する能力を含むがこれらに限定されない。
【００５２】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、ならびにそのフラグメント、改変体、誘
導体、およびアナログの機能的活性は、種々の方法によりアッセイされ得る。
導体、およびアナログの機能的活性は、種々の方法によりアッセイされ得る。
【００５３】
例えば、抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体と結合するか、または抗Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩ抗体との結合に関して全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドと競合する
能力をアッセイする、１つの実施形態において、当該分野において公知の種々の
イムノアッセイが使用され得る。このようなアッセイとしては、放射免疫アッセ
イ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ
、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、イ
ンサイチュ免疫アッセイ（例えば、金コロイド、酵素または放射性同位体標識を
用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集ア
ッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテイ
ンＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競合およ
び非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態で
は、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実
施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合
を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標
識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出について当該分野で
公知であり、そして本発明の範囲内である。
ドＩＩ抗体との結合に関して全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドと競合する
能力をアッセイする、１つの実施形態において、当該分野において公知の種々の
イムノアッセイが使用され得る。このようなアッセイとしては、放射免疫アッセ
イ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ
、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、イ
ンサイチュ免疫アッセイ（例えば、金コロイド、酵素または放射性同位体標識を
用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集ア
ッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテイ
ンＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競合およ
び非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態で
は、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実
施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合
を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標
識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出について当該分野で
公知であり、そして本発明の範囲内である。
【００５４】
別の実施形態では、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドリガンドが同定される
場合、または本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体がマル
チマー化する能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルク
ロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにア
フィニティーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイ
され得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ
．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、その基質
へのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ
得る。
場合、または本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、または誘導体がマル
チマー化する能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルク
ロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにア
フィニティーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイ
され得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ
．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、その基質
へのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ
得る。
【００５５】
さらに、本明細書中に記載のアッセイさもなければ当該分野で公知の他のアッ
セイは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドならびにそのフラグメント、改変体
、誘導体、およびアナログが、（例えば、（例えば、刺激してかまたは阻害して
）インビトロまたはインビボでの造血を調節するために）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
に関連した生物学的活性を惹起する能力を測定するために、慣用的に適用され得
る。例えば、当該分野で公知の技術（例えば、チミジン取り込みについてのアッ
セイすることなど）は、造血細胞の増殖を阻害する本発明の組成物の能力に関し
てアッセイするために、適用され得るか、または慣用的に改変され得る。
セイは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドならびにそのフラグメント、改変体
、誘導体、およびアナログが、（例えば、（例えば、刺激してかまたは阻害して
）インビトロまたはインビボでの造血を調節するために）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
に関連した生物学的活性を惹起する能力を測定するために、慣用的に適用され得
る。例えば、当該分野で公知の技術（例えば、チミジン取り込みについてのアッ
セイすることなど）は、造血細胞の増殖を阻害する本発明の組成物の能力に関し
てアッセイするために、適用され得るか、または慣用的に改変され得る。
【００５６】
他の方法は、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内である。
【００５７】
さらに、本発明は、以下に関連したｃＤＮＡクローン（ＨＰＶＡＡ８３Ｒ（配
列番号１１））から決定されている配列番号１の広い部分に関連したヌクレオチ
ド配列を有する核酸分子を同定している。
列番号１１））から決定されている配列番号１の広い部分に関連したヌクレオチ
ド配列を有する核酸分子を同定している。
【００５８】
以下の公開ＥＳＴは、以下の広い部分に関連する：配列番号１：ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号ＡＡ０１３０９９（配列番号１２）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ２
５１０８４（配列番号１３）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ５８５６２（配列番号
１４）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｎ２８８７８（配列番号１５）、ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号ＡＡ０１９３４８（配列番号１６）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｎ４９
６１５（配列番号１７）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ１１２６７５（配列番号
１８）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ０８２１６１（配列番号１９）、ＧｅｎＢ
ａｎｋ登録番号ＲＨ０３６１３（配列番号２０）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ５
４７１７（配列番号２１）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２７１６７（配列番号２
２）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ１８８７４１（配列番号２３）、ＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号ＡＡ０９４７３５（配列番号２４）、およびＧｅｎＢａｎｋ登録番
号ＡＡ２８５１４３（配列番号２５）。
ｋ登録番号ＡＡ０１３０９９（配列番号１２）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ２
５１０８４（配列番号１３）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ５８５６２（配列番号
１４）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｎ２８８７８（配列番号１５）、ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号ＡＡ０１９３４８（配列番号１６）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｎ４９
６１５（配列番号１７）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ１１２６７５（配列番号
１８）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ０８２１６１（配列番号１９）、ＧｅｎＢ
ａｎｋ登録番号ＲＨ０３６１３（配列番号２０）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｒ５
４７１７（配列番号２１）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｈ２７１６７（配列番号２
２）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ１８８７４１（配列番号２３）、ＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号ＡＡ０９４７３５（配列番号２４）、およびＧｅｎＢａｎｋ登録番
号ＡＡ２８５１４３（配列番号２５）。
【００５９】
別の局面において、本発明は、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ寄
託番号９７６５５中に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部
に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポ
リヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（
ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ
／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩インキュベーシ
ョン、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄することを意味
する。ポリヌクレオチドの「部分（一部）」とハイブリダイズするポリヌクレオ
チドとは、少なくとも参照ポリヌクレオチドの約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、お
よびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約
３０ｎｔ、およびさらにより好ましくは少なくとも約３０〜７０ｎｔに対してハ
イブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意味す
る。これらは、上記または本明細書中でさらに詳細に議論されるような診断プロ
ーブまたはプライマーとして有用である。
託番号９７６５５中に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部
に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポ
リヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（
ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ
／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩インキュベーシ
ョン、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄することを意味
する。ポリヌクレオチドの「部分（一部）」とハイブリダイズするポリヌクレオ
チドとは、少なくとも参照ポリヌクレオチドの約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、お
よびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約
３０ｎｔ、およびさらにより好ましくは少なくとも約３０〜７０ｎｔに対してハ
イブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意味す
る。これらは、上記または本明細書中でさらに詳細に議論されるような診断プロ
ーブまたはプライマーとして有用である。
【００６０】
当然のことながら、この参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮＡ
クローン）の大きい部分、例えば、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５
０ｎｔ、３００ｎｔ、３５０ｎｔ、４００ｎｔ、４５０ｎｔ、５００ｎｔ、５５
０ｎｔ、６００ｎｔ、もしくは６５０ｎｔ長の部分にか、またはこの参照ポリヌ
クレオチドの全長にもハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、本発明に従
うプローブとして有用であり、事実、このポリヌクレオチドは、全てではないと
しても、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列のほとんどかまたは図１に示さ
れるようなヌクレオチド配列のほとんどに対応するポリヌクレオチドである。例
えば、「少なくとも２０ヌクレオチド長」のポリヌクレオチドの部分とは、参照
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または配
列番号１に示されるようなヌクレオチド配列）由来の２０個以上連続するヌクレ
オチドを意味する。示されるように、このような部分は、従来のＤＮＡハイブリ
ダイゼーション技術に従うプローブとしてか、またはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら
，編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）において記載
されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプ
ライマーとしてのいずれかで、診断上有用である。
クローン）の大きい部分、例えば、１００ｎｔ、１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５
０ｎｔ、３００ｎｔ、３５０ｎｔ、４００ｎｔ、４５０ｎｔ、５００ｎｔ、５５
０ｎｔ、６００ｎｔ、もしくは６５０ｎｔ長の部分にか、またはこの参照ポリヌ
クレオチドの全長にもハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、本発明に従
うプローブとして有用であり、事実、このポリヌクレオチドは、全てではないと
しても、寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列のほとんどかまたは図１に示さ
れるようなヌクレオチド配列のほとんどに対応するポリヌクレオチドである。例
えば、「少なくとも２０ヌクレオチド長」のポリヌクレオチドの部分とは、参照
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または配
列番号１に示されるようなヌクレオチド配列）由来の２０個以上連続するヌクレ
オチドを意味する。示されるように、このような部分は、従来のＤＮＡハイブリ
ダイゼーション技術に従うプローブとしてか、またはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら
，編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）において記載
されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプ
ライマーとしてのいずれかで、診断上有用である。
【００６１】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ ｃＤＮＡは、寄託されており、その決定されているヌ
クレオチド配列は、図１（配列番号１）において提供されているため、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩ ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを生
成することは、当業者にとって慣用的である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ
切断またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩ ｃＤＮＡクローンの超音波処理による剪断を
用いて、剪断分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドである種々のサ
イズのＤＮＡ部分を容易に生成し得る。あるいは、このハイブリダイズする本発
明のポリヌクレオチドは、公知の技術に従って合成的に生成され得る。
クレオチド配列は、図１（配列番号１）において提供されているため、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩ ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを生
成することは、当業者にとって慣用的である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ
切断またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩ ｃＤＮＡクローンの超音波処理による剪断を
用いて、剪断分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドである種々のサ
イズのＤＮＡ部分を容易に生成し得る。あるいは、このハイブリダイズする本発
明のポリヌクレオチドは、公知の技術に従って合成的に生成され得る。
【００６２】
当然のことながら、ポリＡ配列（例えば、図１（配列番号１）に示されるＴ１
Ｒ様リガンドＩＩ ｃＤＮＡの３’末端のポリＡ領域（ｔｒａｃｔ））のみに、
またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的ストレッチにのみに、ハイブリダイズする
ポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするよう用いられる
本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチ
ドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、
事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。
Ｒ様リガンドＩＩ ｃＤＮＡの３’末端のポリＡ領域（ｔｒａｃｔ））のみに、
またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的ストレッチにのみに、ハイブリダイズする
ポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするよう用いられる
本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチ
ドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、
事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。
【００６３】
示されるように、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩをコードする本発明の核酸分子は、以
下を含み得るが、これらに限定されない：単独で成熟ポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする配列；この成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（
例えば、約２６個のアミノ酸のリーダー配列（例えば、プレタンパク質配列また
はプロタンパク質配列）をコードする配列）；さらなる非コード配列を伴う、さ
らなる上記のコード配列を含むかまたは含まない、この成熟ポリペプチドのコー
ド配列（さらなる非コード配列は、例えば、イントロンおよび非コード５’配列
および３’配列（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む
、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えば、リボソーム結合およびｍ
ＲＮＡの安定性）を担う、転写される非翻訳配列を含むが、これらに限定されな
い））；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸をコードするさらな
るコード配列。従って、このポリペプチドをコードする配列は、融合されたポリ
ペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列のような、マーカーアミ
ノ酸配列と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態において
、マーカー配列は、例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に提
供されるタグのような、ヘキサヒスチジンペプチドである。中でも、これらの多
くは公然と利用可能であり、そして／または市販されている。例えば、Ｇｅｎｔ
ｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４
（１９８９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質
の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパ
ク質由来のエピトープに対応する、精製のために有用な別のペプチドであり、そ
れは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８４）によって
記載されている。他のそのような融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端にてＦ
ｃに融合されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質またはそのフラグメントを含む
。
下を含み得るが、これらに限定されない：単独で成熟ポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする配列；この成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（
例えば、約２６個のアミノ酸のリーダー配列（例えば、プレタンパク質配列また
はプロタンパク質配列）をコードする配列）；さらなる非コード配列を伴う、さ
らなる上記のコード配列を含むかまたは含まない、この成熟ポリペプチドのコー
ド配列（さらなる非コード配列は、例えば、イントロンおよび非コード５’配列
および３’配列（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む
、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えば、リボソーム結合およびｍ
ＲＮＡの安定性）を担う、転写される非翻訳配列を含むが、これらに限定されな
い））；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸をコードするさらな
るコード配列。従って、このポリペプチドをコードする配列は、融合されたポリ
ペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列のような、マーカーアミ
ノ酸配列と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態において
、マーカー配列は、例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に提
供されるタグのような、ヘキサヒスチジンペプチドである。中でも、これらの多
くは公然と利用可能であり、そして／または市販されている。例えば、Ｇｅｎｔ
ｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４
（１９８９）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質
の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパ
ク質由来のエピトープに対応する、精製のために有用な別のペプチドであり、そ
れは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８４）によって
記載されている。他のそのような融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端にてＦ
ｃに融合されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質またはそのフラグメントを含む
。
【００６４】
本発明はさらに、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の一部、アナログまたは誘
導体をコードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、天然に存在
し得る（例えば、天然の対立遺伝子改変体）。「対立遺伝子改変体」とは、生物
の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態の１つを
意味する。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の以下が挙げられるがこ
れらに限定されない変異誘発技術を用いて生成され得る：アラニンスキャニング
、ＰＣＲ変異誘発、部位指向性変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこと）、カ
セット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）
を参照のこと）、制限選択変異誘発（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉ
ｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒ
ａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６）を
参照のこと）。
導体をコードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、天然に存在
し得る（例えば、天然の対立遺伝子改変体）。「対立遺伝子改変体」とは、生物
の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態の１つを
意味する。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の以下が挙げられるがこ
れらに限定されない変異誘発技術を用いて生成され得る：アラニンスキャニング
、ＰＣＲ変異誘発、部位指向性変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）を参照のこと）、カ
セット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）
を参照のこと）、制限選択変異誘発（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉ
ｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒ
ａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６）を
参照のこと）。
【００６５】
このような改変体としては、ヌクレオチド置換、欠失、または付加により生成
される改変体が挙げられる。この置換、欠失または付加は、１つ以上のヌクレオ
チドを含み得る。改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方におい
て改変され得る。コード領域における改変は、保存的アミノ酸または非保存的ア
ミノ酸の置換、欠失または付加を生成し得る。これらの中で特に好ましいのは、
サイレントな置換、付加および欠失である。これらは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩま
たはその一部の特性および活性を改変しない。また、この点において特に好まし
いのは、保存的置換である。
される改変体が挙げられる。この置換、欠失または付加は、１つ以上のヌクレオ
チドを含み得る。改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方におい
て改変され得る。コード領域における改変は、保存的アミノ酸または非保存的ア
ミノ酸の置換、欠失または付加を生成し得る。これらの中で特に好ましいのは、
サイレントな置換、付加および欠失である。これらは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩま
たはその一部の特性および活性を改変しない。また、この点において特に好まし
いのは、保存的置換である。
【００６６】
本発明のさらなる実施態様は、以下のヌクレオチド配列に対して、少なくとも
９０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％
または９９％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号２におけるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２におけるアミノ酸配列を有
するが、アミノ末端メチオニンを欠く、ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；（ｃ）配列番号２の約１位〜３３１位のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれ
るｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤ
ＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；あるいは（ｆ）上記の（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに
対して相補的なヌクレオチド配列。
９０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％
または９９％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離され
た核酸分子を含む：（ａ）配列番号２におけるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２におけるアミノ酸配列を有
するが、アミノ末端メチオニンを欠く、ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；（ｃ）配列番号２の約１位〜３３１位のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれ
るｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤ
ＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；あるいは（ｆ）上記の（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに
対して相補的なヌクレオチド配列。
【００６７】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例
えば、少なくとも９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
とは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の
各１００ヌクレオチドあたり５つまでのミスマッチを含み得るこのポリヌクレオ
チド配列を除く参照配列に対して同一である、このポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列を意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９
５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照
配列のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るかまたは別のヌクレオチドで置
換され得、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレ
オチドが、その参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらのミスマッチは、参
照ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端の位置において、またはこれら
の末端の位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もし
くは参照配列内の１個以上連続した群の状態のいずれかで散在して生じ得る。参
照（照会（ｑｕｅｒｙ））配列は、図１（配列番号１）に示されるようなヌクレ
オチド配列をコードする全Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩであり得るか、あるいは、本明
細書に記載されるような、任意のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドフラグ
メント（例えば、本明細書に記載されるようなＴ１Ｒ様リガンドＩＩのＮ末端お
よび／またはＣ末端の欠失のいずれかのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チド）、改変体、誘導体またはアナログであり得る。
えば、少なくとも９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
とは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の
各１００ヌクレオチドあたり５つまでのミスマッチを含み得るこのポリヌクレオ
チド配列を除く参照配列に対して同一である、このポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列を意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９
５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、その参照
配列のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るかまたは別のヌクレオチドで置
換され得、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレ
オチドが、その参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらのミスマッチは、参
照ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端の位置において、またはこれら
の末端の位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もし
くは参照配列内の１個以上連続した群の状態のいずれかで散在して生じ得る。参
照（照会（ｑｕｅｒｙ））配列は、図１（配列番号１）に示されるようなヌクレ
オチド配列をコードする全Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩであり得るか、あるいは、本明
細書に記載されるような、任意のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドフラグ
メント（例えば、本明細書に記載されるようなＴ１Ｒ様リガンドＩＩのＮ末端お
よび／またはＣ末端の欠失のいずれかのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チド）、改変体、誘導体またはアナログであり得る。
【００６８】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１（配列番号１）に示
されるコード化ヌクレオチド配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレ
オチド配列に対して、少なくとも９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％
同一、９８％同一、または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラ
ム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇ
ｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような
公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに決定され得る。Ｂｅｓｔ
ｆｉｔは、２つの配列間で相同性の最も高いセグメントを見出すために、Ｓｍｉ
ｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａ
ｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリ
ズムを使用する。特定の配列が本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％
同一であるか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列
プログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性のパーセンテージが参照
ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のヌクレオチド
の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターを
設定する。
されるコード化ヌクレオチド配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレ
オチド配列に対して、少なくとも９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％
同一、９８％同一、または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラ
ム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇ
ｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような
公知のコンピュータープログラムを使用して従来通りに決定され得る。Ｂｅｓｔ
ｆｉｔは、２つの配列間で相同性の最も高いセグメントを見出すために、Ｓｍｉ
ｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａ
ｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリ
ズムを使用する。特定の配列が本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％
同一であるか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列
プログラムを使用する場合、当然のことながら、同一性のパーセンテージが参照
ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のヌクレオチド
の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターを
設定する。
【００６９】
特定の実施形態では、参照（照会）配列（本発明の配列）と対象配列との間の
同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａ
ｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づ
くＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。同一性パーセ
ントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好まし
いパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉ
ｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、
Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ
Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌ
ｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列
の長さ（いずれかより短い方）である。この実施形態に従って、同一性パーセン
トを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’の短
縮を考慮しないという事実を考慮するために、対象配列が、５’または３’欠失
のために（内部欠失が理由ではなく）、照会配列より短い場合、手動の補正が結
果に対してなされる。照会配列に対して、５’末端または３’末端で短縮化され
た対象配列について、同一性パーセントは、照会配列の総塩基のパーセントとし
て、一致／整列されない対象配列の５’および３’である照会配列の塩基の数を
計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かの決
定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセン
トが、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定
された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに
到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的に使用されるものである
。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される場合、照会配列と一致／整列されいていな
い、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのス
コアを手動で調整する目的で算定される。例えば、９０塩基の対象配列は、同一
性パーセントを決定するために１００塩基の照会配列に整列される。欠失は、対
象配列の５’末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０
塩基で一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致して
いない５’および３’末端での塩基の数／照会配列の塩基の総数）を表し、その
ため１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントの
スコアから差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同
一性パーセントは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩
基の照会配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、照
会と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基は存在しない。この場合
、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再
び、照会配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で
補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａ
ｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づ
くＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。同一性パーセ
ントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好まし
いパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉ
ｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、
Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ
Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌ
ｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列
の長さ（いずれかより短い方）である。この実施形態に従って、同一性パーセン
トを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’の短
縮を考慮しないという事実を考慮するために、対象配列が、５’または３’欠失
のために（内部欠失が理由ではなく）、照会配列より短い場合、手動の補正が結
果に対してなされる。照会配列に対して、５’末端または３’末端で短縮化され
た対象配列について、同一性パーセントは、照会配列の総塩基のパーセントとし
て、一致／整列されない対象配列の５’および３’である照会配列の塩基の数を
計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かの決
定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセン
トが、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定
された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに
到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的に使用されるものである
。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される場合、照会配列と一致／整列されいていな
い、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのス
コアを手動で調整する目的で算定される。例えば、９０塩基の対象配列は、同一
性パーセントを決定するために１００塩基の照会配列に整列される。欠失は、対
象配列の５’末端で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０
塩基で一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致して
いない５’および３’末端での塩基の数／照会配列の塩基の総数）を表し、その
ため１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントの
スコアから差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同
一性パーセントは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩
基の照会配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、照
会と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基は存在しない。この場合
、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再
び、照会配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で
補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【００７０】
本願は、例えば、本明細書中で開示される核酸配列（例えば、本明細書中で開
示されたＮ末端および／またはＣ末端の欠失を有するポリペプチドをコードする
核酸分子（例えば、配列番号２の−２６〜２０３のアミノ酸をコードする核酸分
子））に対して、それらがＴ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を有するポリペプチド
をコードするか否かに関わらず、少なくとも９０％同一、９５％同一、９６％同
一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一である核酸分子に関する。なぜ
ならば、特定の核酸分子が、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を有するポリペプチ
ドをコードしない場合ですら、当業者はこの核酸分子を（例えば、ハイブリダイ
ゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）
使用する方法をなお知っているからである。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を有
するポリペプチドをコードしない特定の核酸分子の使用としては、特に、（１）
ｃＤＮＡライブラリー中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子またはその対立遺伝子改
変体もしくはスプライス改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａ
ｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載さ
れるような、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための
、分裂中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブリダ
イゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および（３）特定の組織におけるＴ１
Ｒ様リガンドＩＩ ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が挙げ
られる。
示されたＮ末端および／またはＣ末端の欠失を有するポリペプチドをコードする
核酸分子（例えば、配列番号２の−２６〜２０３のアミノ酸をコードする核酸分
子））に対して、それらがＴ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を有するポリペプチド
をコードするか否かに関わらず、少なくとも９０％同一、９５％同一、９６％同
一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一である核酸分子に関する。なぜ
ならば、特定の核酸分子が、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を有するポリペプチ
ドをコードしない場合ですら、当業者はこの核酸分子を（例えば、ハイブリダイ
ゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）
使用する方法をなお知っているからである。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を有
するポリペプチドをコードしない特定の核酸分子の使用としては、特に、（１）
ｃＤＮＡライブラリー中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子またはその対立遺伝子改
変体もしくはスプライス改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａ
ｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載さ
れるような、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための
、分裂中期染色体スプレッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブリダ
イゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および（３）特定の組織におけるＴ１
Ｒ様リガンドＩＩ ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析が挙げ
られる。
【００７１】
しかし、本明細書に記載される核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する核酸分子が好ましい
。これらは、事実、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能的活性を有するポリペプチドをコ
ードする。「Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能的活性を有するポリペプチド」とは、例
えば、特定のイムノアッセイまたは生物学的アッセイにおいて測定されるように
、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド（例えば、完全（全長）Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩ、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ、および可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
（例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの細胞外ドメインに含まれる配列を有する））
の機能活性と、同一である必要はないが、類似している活性を示すポリペプチド
を意味する。例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
に結合するＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの能力を決定することによって慣
用的に測定され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性はまた、このポリペプチド
を発現している細胞において造血を誘導するポリペプチド（例えば、細胞表面上
にないかまたは発現している同種のリガンド）の能力を決定することによって測
定され得る。
、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する核酸分子が好ましい
。これらは、事実、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能的活性を有するポリペプチドをコ
ードする。「Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能的活性を有するポリペプチド」とは、例
えば、特定のイムノアッセイまたは生物学的アッセイにおいて測定されるように
、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド（例えば、完全（全長）Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩ、成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ、および可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
（例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの細胞外ドメインに含まれる配列を有する））
の機能活性と、同一である必要はないが、類似している活性を示すポリペプチド
を意味する。例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
に結合するＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの能力を決定することによって慣
用的に測定され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性はまた、このポリペプチド
を発現している細胞において造血を誘導するポリペプチド（例えば、細胞表面上
にないかまたは発現している同種のリガンド）の能力を決定することによって測
定され得る。
【００７２】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ活性は、公知のレセプター結合アッセイさらにアッセイ
され得る（Ｍｉｔｃｈａｎ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５
７７７−５７８３（１９９６）；およびＧａｙｌｅ，Ｍ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７１：５７８４−５７８９（１９９６））。これらのアッセイと
しては、ＮＦ−κＢゲルシフトアッセイ、インビトロでのＴｈｒ−６６９キナー
ゼアッセイ、およびＩＬ−８プロモーター活性アッセイが挙げられる。
され得る（Ｍｉｔｃｈａｎ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５
７７７−５７８３（１９９６）；およびＧａｙｌｅ，Ｍ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７１：５７８４−５７８９（１９９６））。これらのアッセイと
しては、ＮＦ−κＢゲルシフトアッセイ、インビトロでのＴｈｒ−６６９キナー
ゼアッセイ、およびＩＬ−８プロモーター活性アッセイが挙げられる。
【００７３】
これらのアッセイを実施することは、適切なレセプターに対するｃＤＮＡを含
む発現ベクターを有する哺乳動物に導入するために最初に必要である。例えば、
Ｔ１／ＳＴ２レセプターに対するｃＤＮＡを含む発現ベクターは、使用され得る
。このｃＤＮＡは、（Ｋｌｅｍｅｎｚ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：５７０８−５７１２（１９８９）；Ｔｏｍｉｎａ
ｇａ，Ｓ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５８：３０１−３０４；Ｂｅｒｇｅｒｓ，
Ｇ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１１７６−１１８８）に記載されるように得られ
得る。あるいは、Ｔ１／ＳＴ２ ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増
幅され得る。適切な組織または細胞型（例えばＮＩＨ−３Ｔ３（Ｋｌｅｍｅｎｚ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５７０８−５
７１２（１９８９））由来のｍＲＮＡから調製された市販されているｃＤＮＡラ
イブラリーは、テンプレートとして使用され得る。いくつかの導入（ｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔｉｏｎ）方法のいずれかを用いて、適切な細胞株（例えば、ＣＯＳ７細
胞）は、Ｔ１／ＳＴ２発現プラスミドを導入され得る。レセプターの発現は、放
射免疫測定法（Ｍｉｔｃｈａｍ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１
：５７７７−５７８３（１９９６）を参照のこと）によって検証され得る。導入
後１〜３日で、コンフルエントな導入されたＣＯＳ７細胞を、１〜１０ｎｇのＴ
１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質で、１５分〜２０時間刺激する。Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩによる刺激持続時間は、どのアッセイを使用し、そして慣用的な実験を用
いて決定し得るかに依存して変更する。
む発現ベクターを有する哺乳動物に導入するために最初に必要である。例えば、
Ｔ１／ＳＴ２レセプターに対するｃＤＮＡを含む発現ベクターは、使用され得る
。このｃＤＮＡは、（Ｋｌｅｍｅｎｚ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：５７０８−５７１２（１９８９）；Ｔｏｍｉｎａ
ｇａ，Ｓ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５８：３０１−３０４；Ｂｅｒｇｅｒｓ，
Ｇ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１１７６−１１８８）に記載されるように得られ
得る。あるいは、Ｔ１／ＳＴ２ ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増
幅され得る。適切な組織または細胞型（例えばＮＩＨ−３Ｔ３（Ｋｌｅｍｅｎｚ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５７０８−５
７１２（１９８９））由来のｍＲＮＡから調製された市販されているｃＤＮＡラ
イブラリーは、テンプレートとして使用され得る。いくつかの導入（ｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔｉｏｎ）方法のいずれかを用いて、適切な細胞株（例えば、ＣＯＳ７細
胞）は、Ｔ１／ＳＴ２発現プラスミドを導入され得る。レセプターの発現は、放
射免疫測定法（Ｍｉｔｃｈａｍ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１
：５７７７−５７８３（１９９６）を参照のこと）によって検証され得る。導入
後１〜３日で、コンフルエントな導入されたＣＯＳ７細胞を、１〜１０ｎｇのＴ
１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質で、１５分〜２０時間刺激する。Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩによる刺激持続時間は、どのアッセイを使用し、そして慣用的な実験を用
いて決定し得るかに依存して変更する。
【００７４】
ＮＦ−κＢアッセイを実施するために、導入された細胞からの核抽出物は、刺
激後直ちに調製される（Ｏｓｔｒｏｗｓｋ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６６：１２７２２０１２７３３（１９９１））。イムノグロブリンκ軽鎖由来
のＮＦ−κＢエンハンサーエレメントを含む二本鎖合成的オリゴヌクレオチドプ
ローブ（５’ＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＡＧＡＧＧＡ ３’（配列
番号１０））を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いたリン酸化によって５’末端を標
識化する。核抽出物（１０μｇ）を、室温で２０分間、放射性標識プローブとイ
ンキュベートし、タンパク質−ＤＮＡ複合体を、０．５×ＴＢＥ、１０％ポリペ
プチドアクリルアミドゲルで電気泳動することによって分離する。
激後直ちに調製される（Ｏｓｔｒｏｗｓｋ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６６：１２７２２０１２７３３（１９９１））。イムノグロブリンκ軽鎖由来
のＮＦ−κＢエンハンサーエレメントを含む二本鎖合成的オリゴヌクレオチドプ
ローブ（５’ＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＡＧＡＧＧＡ ３’（配列
番号１０））を、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いたリン酸化によって５’末端を標
識化する。核抽出物（１０μｇ）を、室温で２０分間、放射性標識プローブとイ
ンキュベートし、タンパク質−ＤＮＡ複合体を、０．５×ＴＢＥ、１０％ポリペ
プチドアクリルアミドゲルで電気泳動することによって分離する。
【００７５】
インビボのＴｈｒ−６６９キナーゼアッセイを実施するために、トランスフェ
クト細胞の細胞質抽出物を刺激後すぐに調製する（Ｂｉｒｄ、Ｔ．Ａ．ら、Ｃｙ
ｔｏｋｉｎｅ ４：４２９−４４０（１９９２））。１０μｌの細胞抽出物を、
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５μＭ
ＡＴＰ、７５μＣｉ／ｍｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、および７５０μＭ 基質ペ
プチド（ＥＧＦＲの残基６６３−６７３）を含む２０μｌの反応混合物に加える
。ブランクは、ペプチドの代わりに蒸留Ｈ２Ｏと共にインキュベートされる。３
０℃で２０分のインキュベート後、この反応をギ酸の添加により終了させる。反
応液を遠心分離により明澄にし、３０μｌの上清をホスホセルロースペーパーデ
ィスク上にスポットする。洗浄（７５ｍＭオルトリン酸で３回）および乾燥後、
ペプチドが取り込まれている数をＣｅｒｅｎｋｏｖカウントをモニターすること
により決定する。結果を、刺激された細胞で検出される活性と比較して、刺激を
受けていない細胞で検出されるＴｈｒ−６６９キナーゼ活性の比率として表す。
クト細胞の細胞質抽出物を刺激後すぐに調製する（Ｂｉｒｄ、Ｔ．Ａ．ら、Ｃｙ
ｔｏｋｉｎｅ ４：４２９−４４０（１９９２））。１０μｌの細胞抽出物を、
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５μＭ
ＡＴＰ、７５μＣｉ／ｍｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、および７５０μＭ 基質ペ
プチド（ＥＧＦＲの残基６６３−６７３）を含む２０μｌの反応混合物に加える
。ブランクは、ペプチドの代わりに蒸留Ｈ２Ｏと共にインキュベートされる。３
０℃で２０分のインキュベート後、この反応をギ酸の添加により終了させる。反
応液を遠心分離により明澄にし、３０μｌの上清をホスホセルロースペーパーデ
ィスク上にスポットする。洗浄（７５ｍＭオルトリン酸で３回）および乾燥後、
ペプチドが取り込まれている数をＣｅｒｅｎｋｏｖカウントをモニターすること
により決定する。結果を、刺激された細胞で検出される活性と比較して、刺激を
受けていない細胞で検出されるＴｈｒ−６６９キナーゼ活性の比率として表す。
【００７６】
ＩＬ−８プロモーター活性化アッセイを実施するために、ＣＯＳ７細胞（マル
チウェル組織培養プレート上に１×１０５細胞／ウェル）を、Ｔ１／ＳＴ２レセ
プター発現ベクターおよびｐＩＬ８ｐレセプタープラスミドを用いて同時トラン
スフェクトする（Ｍｉｔｃｈａｍ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１：５７７７−５７８３（１９９６））。トランスフェクト後のある日に、培地
を交換し、細胞を１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１αで刺激するかまたは刺激せずに残す
。刺激から１２〜１６時間後、細胞を、５％（ｗ／ｖ）非脂肪粉乳（５％ＭＢＭ
）を含む結合培地で２度洗浄し、２ｍｌの５％ＭＢＭを用いて室温で３０分間ブ
ロックした。ついで細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−２Ｒα抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含む１．５ｍｌ／ウェルの５％
ＭＢＭを用いて室温で６０〜９０分間、穏やかに振動させながらインキュベート
する。細胞を５％ＭＢＭで一度洗浄し、そして１：１００希釈の１２５Ｉ−ヒツ
ジ抗マウスＩｇＧを（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）含む１ｍｌ／ウェ
ルの５％ＭＢＭと共に、室温で６０分間インキュベートする。ウェルを、５％Ｍ
ＢＭで４回、およびリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄する。ウェルを、１ｍｌの
０．５Ｍ ＮａＯＨの添加により裸にし、合計計数を決定する。結果を、２連ま
たは３連ウェルを平均した総ｃｐｍとして表す。
チウェル組織培養プレート上に１×１０５細胞／ウェル）を、Ｔ１／ＳＴ２レセ
プター発現ベクターおよびｐＩＬ８ｐレセプタープラスミドを用いて同時トラン
スフェクトする（Ｍｉｔｃｈａｍ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１：５７７７−５７８３（１９９６））。トランスフェクト後のある日に、培地
を交換し、細胞を１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１αで刺激するかまたは刺激せずに残す
。刺激から１２〜１６時間後、細胞を、５％（ｗ／ｖ）非脂肪粉乳（５％ＭＢＭ
）を含む結合培地で２度洗浄し、２ｍｌの５％ＭＢＭを用いて室温で３０分間ブ
ロックした。ついで細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−２Ｒα抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含む１．５ｍｌ／ウェルの５％
ＭＢＭを用いて室温で６０〜９０分間、穏やかに振動させながらインキュベート
する。細胞を５％ＭＢＭで一度洗浄し、そして１：１００希釈の１２５Ｉ−ヒツ
ジ抗マウスＩｇＧを（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）含む１ｍｌ／ウェ
ルの５％ＭＢＭと共に、室温で６０分間インキュベートする。ウェルを、５％Ｍ
ＢＭで４回、およびリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄する。ウェルを、１ｍｌの
０．５Ｍ ＮａＯＨの添加により裸にし、合計計数を決定する。結果を、２連ま
たは３連ウェルを平均した総ｃｐｍとして表す。
【００７７】
従って、「Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質活性を有するポリペプチド」は、
上記のアッセイの少なくとも１つにおいてＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質活性
を示すポリペプチドに関する。
上記のアッセイの少なくとも１つにおいてＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質活性
を示すポリペプチドに関する。
【００７８】
もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡ核酸
配列、または表１に示された核酸配列（配列番号１）もしくはこれらのフラグメ
ントに少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同
一である配列を有する核酸分子の大多数が、「Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を
有する」ポリペプチドをコードすることをすぐに認識する。実際、これらの任意
のヌクレオチド配列の縮重改変体は、すべて同一のポリペプチドをコードするの
で、このことは、上記に記載された比較アッセイを実行することさえなしに、当
業者には明らかである。当該分野において、縮重改変体でないこのような核酸分
子について、妥当な数がまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を有するポリペプ
チドをコードすることがさらに認識される。このことは、当業者が、以下にさら
に記載するように、タンパク質機能により少ない効果を与えるようであるか、ま
たは有意に効果を与えないようであるかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１
つの脂肪族アミノ酸の第２の脂肪族アミノ酸への置換）に十分に熟知しているか
らである。
配列、または表１に示された核酸配列（配列番号１）もしくはこれらのフラグメ
ントに少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同
一である配列を有する核酸分子の大多数が、「Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を
有する」ポリペプチドをコードすることをすぐに認識する。実際、これらの任意
のヌクレオチド配列の縮重改変体は、すべて同一のポリペプチドをコードするの
で、このことは、上記に記載された比較アッセイを実行することさえなしに、当
業者には明らかである。当該分野において、縮重改変体でないこのような核酸分
子について、妥当な数がまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ機能活性を有するポリペプ
チドをコードすることがさらに認識される。このことは、当業者が、以下にさら
に記載するように、タンパク質機能により少ない効果を与えるようであるか、ま
たは有意に効果を与えないようであるかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１
つの脂肪族アミノ酸の第２の脂肪族アミノ酸への置換）に十分に熟知しているか
らである。
【００７９】
例えば、表現型について静かなアミノ酸置換の生成方法に関する手引きは、Ｂ
ｏｗｉｅ、Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９
０）中に提供される。ここで、著者らは、変化に対するアミノ酸配列の耐性を研
究するために２つの主なアプローチがあることを示している。第１の方法は、変
異が自然の選択により受け入れられるかまたは拒絶される、進化のプロセスによ
る。第２のアプローチは、クローン化された遺伝子の特定の位置でのアミノ酸の
変化を誘導するために遺伝子操作を用い、そして機能性を維持する配列を同定す
るために選択またはスクリーンを用いる。著者らが記載するように、これらの研
究は、タンパク質がアミノ酸置換についての驚くべき耐性を有することを明らか
にした。著者らはさらに、アミノ酸の変化が、タンパク質の特定の位置で許容さ
れるようであることを示す。例えば、最も埋没したアミノ酸残基は、非極性側鎖
を必要とし、一般的に表面側鎖のわずかな性質のみが保存される。他のこのよう
な表現型について静かな置換は、Ｂｏｗｉｅ、Ｊ．Ｕ．ら、前出、および本明細
書中で列挙される参照に記載される。
ｏｗｉｅ、Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９
０）中に提供される。ここで、著者らは、変化に対するアミノ酸配列の耐性を研
究するために２つの主なアプローチがあることを示している。第１の方法は、変
異が自然の選択により受け入れられるかまたは拒絶される、進化のプロセスによ
る。第２のアプローチは、クローン化された遺伝子の特定の位置でのアミノ酸の
変化を誘導するために遺伝子操作を用い、そして機能性を維持する配列を同定す
るために選択またはスクリーンを用いる。著者らが記載するように、これらの研
究は、タンパク質がアミノ酸置換についての驚くべき耐性を有することを明らか
にした。著者らはさらに、アミノ酸の変化が、タンパク質の特定の位置で許容さ
れるようであることを示す。例えば、最も埋没したアミノ酸残基は、非極性側鎖
を必要とし、一般的に表面側鎖のわずかな性質のみが保存される。他のこのよう
な表現型について静かな置換は、Ｂｏｗｉｅ、Ｊ．Ｕ．ら、前出、および本明細
書中で列挙される参照に記載される。
【００８０】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクタ
ーで遺伝子操作された宿主細胞、および組み換え技術によるＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉポリペプチドまたはこれらのフラグメントの産生に関する。
ーで遺伝子操作された宿主細胞、および組み換え技術によるＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉポリペプチドまたはこれらのフラグメントの産生に関する。
【００８１】
組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクショ
ン（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、および形質転換の
ような、周知の技術を用いて宿主細胞に導入され得る。ベクターは、例えば、フ
ァージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであり得る。レ
トロウイルスベクターは、複製コンピテントであるか、または複製欠損であり得
る。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に相補する宿主においてのみ起こり得る
。
ン（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、および形質転換の
ような、周知の技術を用いて宿主細胞に導入され得る。ベクターは、例えば、フ
ァージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであり得る。レ
トロウイルスベクターは、複製コンピテントであるか、または複製欠損であり得
る。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に相補する宿主においてのみ起こり得る
。
【００８２】
ポリヌクレオチドは、宿主中で増殖のために選択マーカーを含むベクターに結
合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、沈澱物（例えば、リン酸カルシ
ウム沈澱物）中、または荷電した脂質を有する複合体中で導入され得る。ベクタ
ーがウイルスである場合、それは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビ
トロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、沈澱物（例えば、リン酸カルシ
ウム沈澱物）中、または荷電した脂質を有する複合体中で導入され得る。ベクタ
ーがウイルスである場合、それは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビ
トロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００８３】
好ましいのは、目的のポリヌクレオチドに対するシス作動制御領域を含むベク
ターである。適切なトランス作動因子は、宿主によって供給され得、補完するベ
クターによって提供され得、または宿主への導入に際してベクターそれ自体によ
って供給され得る。
ターである。適切なトランス作動因子は、宿主によって供給され得、補完するベ
クターによって提供され得、または宿主への導入に際してベクターそれ自体によ
って供給され得る。
【００８４】
この点における好ましい特定の実施態様において、ベクターは、誘導性であり
得るか、および／または細胞型特異的であり得る特定の発現を提供する。このよ
うなベクターの中で特に好ましいものは、操作が容易な環境因子（例えば、温度
および栄養添加物）によって誘導性のベクターである。
得るか、および／または細胞型特異的であり得る特定の発現を提供する。このよ
うなベクターの中で特に好ましいものは、操作が容易な環境因子（例えば、温度
および栄養添加物）によって誘導性のベクターである。
【００８５】
本発明において有用な発現ベクターには、染色体由来ベクター、エピソーム由
来ベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリ
オファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキ
ュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽の
ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）由来のベクタ
ー）、ならびにそれらの組み合わせ由来のベクター（例えば、コスミドおよびフ
ァージミド）が挙げられる。
来ベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリ
オファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキ
ュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽の
ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）由来のベクタ
ー）、ならびにそれらの組み合わせ由来のベクター（例えば、コスミドおよびフ
ァージミド）が挙げられる。
【００８６】
ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（少数の例を挙げれば.、例えば、
ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロ
モーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴ
Ｒのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモータ
ーは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始領域、終結領域、および転
写される領域内に、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。この構築物
によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの最初
の位置に翻訳を開始するＡＵＧを、そして最後の適切な位置に終止コドンを含む
。
ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロ
モーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴ
Ｒのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモータ
ーは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始領域、終結領域、および転
写される領域内に、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。この構築物
によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの最初
の位置に翻訳を開始するＡＵＧを、そして最後の適切な位置に終止コドンを含む
。
【００８７】
示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーには、真核細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌の培養に
ついては、テトラサイクリン、またはアンピシリンの耐性遺伝子が挙げられる。
適切な宿主の代表的な例には、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細
胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞が
挙げられる。上記の宿主細胞についての適切な培養培地および条件は、当該分野
で公知である。
を含む。このようなマーカーには、真核細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌の培養に
ついては、テトラサイクリン、またはアンピシリンの耐性遺伝子が挙げられる。
適切な宿主の代表的な例には、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細
胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞が
挙げられる。上記の宿主細胞についての適切な培養培地および条件は、当該分野
で公知である。
【００８８】
細菌における使用のために好ましいベクターの中には、Ｑｉａｇｅｎから市販
されているｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅか
ら市販されているｐＢＳベクター、Ｐｈａｒｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４
６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａより市販されているｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ
２３３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好まし
い真核生物ベクターには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより市販されているｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒ
ｍａｃｉａより市販されているｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶ
ＬならびにＱｉａｇｅｎから市販されているｐＡ２がある。他の適切なベクター
は、当業者に容易に明らかである。
されているｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅか
ら市販されているｐＢＳベクター、Ｐｈａｒｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４
６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａより市販されているｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ
２３３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好まし
い真核生物ベクターには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより市販されているｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒ
ｍａｃｉａより市販されているｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶ
ＬならびにＱｉａｇｅｎから市販されているｐＡ２がある。他の適切なベクター
は、当業者に容易に明らかである。
【００８９】
本発明における使用のために適切な公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３、Ｔ５、およびＴ７プロモ
ーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐ
プロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターには、ＣＭＶ前初期プロ
モーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロ
モーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス
（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば
、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）が含まれる。
ｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３、Ｔ５、およびＴ７プロモ
ーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐ
プロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターには、ＣＭＶ前初期プロ
モーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロ
モーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス
（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば
、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）が含まれる。
【００９０】
構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
て行われ得る。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
て行われ得る。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００９１】
本明細書中で議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、
本発明はまた、遺伝子操作されて内因性の遺伝的物質（例えば、Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩコード配列）を欠失または置換された、ならびに／もしくは本発明のＴ１
Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドと作動可能に連結されている遺伝物質、およ
び内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを活性化、変化、および／または増
幅する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含有する脊椎動物起源
（特に、哺乳動物起源）の一次、二次、および不死化宿主細胞を包含する。例え
ば、当該分野で公知の技術を用いて、異種制御領域（例えば、プロモーターおよ
び／またはエンハンサー）および相同組換えを介してＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリ
ヌクレオチド配列を作動可能に連結し得る（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号；国際公開番号第ＷＯ９６／２９４１１号；国際出願公開番号第ＷＯ９４
／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと）。それぞれの
開示は、本明細書中で参考として援用される。
本発明はまた、遺伝子操作されて内因性の遺伝的物質（例えば、Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩコード配列）を欠失または置換された、ならびに／もしくは本発明のＴ１
Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドと作動可能に連結されている遺伝物質、およ
び内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを活性化、変化、および／または増
幅する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含有する脊椎動物起源
（特に、哺乳動物起源）の一次、二次、および不死化宿主細胞を包含する。例え
ば、当該分野で公知の技術を用いて、異種制御領域（例えば、プロモーターおよ
び／またはエンハンサー）および相同組換えを介してＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリ
ヌクレオチド配列を作動可能に連結し得る（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号；国際公開番号第ＷＯ９６／２９４１１号；国際出願公開番号第ＷＯ９４
／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと）。それぞれの
開示は、本明細書中で参考として援用される。
【００９２】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加し得る。エンハンサーは
、所定の細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるように作用する、
ＤＮＡのシス作動エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐである。エンハン
サーの例は、ＳＶ４０エンハンサー（これは、ｂｐ１００〜２７０の複製起点の
後の側に位置する）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複
製起点の後の側に存在するポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン
ハンサーが含まれる。
ター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加し得る。エンハンサーは
、所定の細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるように作用する、
ＤＮＡのシス作動エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐである。エンハン
サーの例は、ＳＶ４０エンハンサー（これは、ｂｐ１００〜２７０の複製起点の
後の側に位置する）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複
製起点の後の側に存在するポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン
ハンサーが含まれる。
【００９３】
小胞体のルーメンへの、細胞膜周辺腔への、または細胞外環境への翻訳された
ポリペプチドの分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されたポリペプチド
に組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るか、ま
たは異種のシグナルであり得る。
ポリペプチドの分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されたポリペプチド
に組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るか、ま
たは異種のシグナルであり得る。
【００９４】
１つの実施形態において、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドは、ｐｅｌＢ ペクテートリアーゼシグナル配列と融合
され、グラム陰性細菌中でのこのようなポリペプチドの発現および精製に対する
効果を増大させ得る。米国特許第５，５７６，１９５号および５，８４６，８１
８号を参照のこと。これらの内容は、本明細書中でその全体を参考として援用さ
れる。
ドするポリヌクレオチドは、ｐｅｌＢ ペクテートリアーゼシグナル配列と融合
され、グラム陰性細菌中でのこのようなポリペプチドの発現および精製に対する
効果を増大させ得る。米国特許第５，５７６，１９５号および５，８４６，８１
８号を参照のこと。これらの内容は、本明細書中でその全体を参考として援用さ
れる。
【００９５】
したがって、ポリペプチドは、修飾された形態（例えば、融合タンパク質）で
発現され得、そして分泌シグナルを含むだけではなく、また、さらなる異種の機
能的領域を含み得る。例えば、さらなるアミノ酸の領域、特に荷電したアミノ酸
が、ポリペプチドのＮ末端に付加されて、精製の間の、またはその後の操作およ
び保存の間の宿主細胞中での安定性および持続性を改善し得る。また、ペプチド
部分が、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域
は、ポリペプチドの最終調製に先立って除去され得る。分泌もしくは排出を生じ
るための、安定性を改善するための、および精製を容易にするための、ポリペプ
チドへのペプチド部分の付加は、とりわけ、当該分野においてよく知られた、そ
して慣用的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化させ
るために有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ
４６４ ５３３（カナダ国対応特許２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質ま
たはその一部とともに、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合
タンパク質を開示する。多くの場合において、融合タンパク質におけるＦｃ部分
は、治療および診断における使用のために完全に有利であり、従って、例えば、
改善された薬物動態学的な特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。他方
、いくつかの使用については、融合タンパク質が、記載された有利な様式で発現
され、検出され、そして精製された後で、Ｆｃ部分の除去が可能であることが望
ましい。これは、Ｆｃ部分が治療および診断における使用のために障害であるこ
とがわかったときのような場合である（例えば、融合タンパク質が免疫のための
抗原として使用される場合）。薬物の探索において、例えば、ヒトタンパク質、
例えば、ｈＩＬ−５は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高スルー
プットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合された。Ｂｅｎｎ
ｅｔｔ，Ｄ．ら（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅ
ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２〜５８およびＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．ら、（１９
９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２
７０（１６）：９４５９〜９４７１を参照のこと。
発現され得、そして分泌シグナルを含むだけではなく、また、さらなる異種の機
能的領域を含み得る。例えば、さらなるアミノ酸の領域、特に荷電したアミノ酸
が、ポリペプチドのＮ末端に付加されて、精製の間の、またはその後の操作およ
び保存の間の宿主細胞中での安定性および持続性を改善し得る。また、ペプチド
部分が、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域
は、ポリペプチドの最終調製に先立って除去され得る。分泌もしくは排出を生じ
るための、安定性を改善するための、および精製を容易にするための、ポリペプ
チドへのペプチド部分の付加は、とりわけ、当該分野においてよく知られた、そ
して慣用的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化させ
るために有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ
４６４ ５３３（カナダ国対応特許２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質ま
たはその一部とともに、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合
タンパク質を開示する。多くの場合において、融合タンパク質におけるＦｃ部分
は、治療および診断における使用のために完全に有利であり、従って、例えば、
改善された薬物動態学的な特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。他方
、いくつかの使用については、融合タンパク質が、記載された有利な様式で発現
され、検出され、そして精製された後で、Ｆｃ部分の除去が可能であることが望
ましい。これは、Ｆｃ部分が治療および診断における使用のために障害であるこ
とがわかったときのような場合である（例えば、融合タンパク質が免疫のための
抗原として使用される場合）。薬物の探索において、例えば、ヒトタンパク質、
例えば、ｈＩＬ−５は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高スルー
プットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合された。Ｂｅｎｎ
ｅｔｔ，Ｄ．ら（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅ
ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２〜５８およびＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．ら、（１９
９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２
７０（１６）：９４５９〜９４７１を参照のこと。
【００９６】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、
アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホス
ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およ
びレクチンクロマトグラフィーによって、組換え細胞培養から回収および精製さ
れ得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が精製に用
いられる。
アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホス
ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およ
びレクチンクロマトグラフィーによって、組換え細胞培養から回収および精製さ
れ得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が精製に用
いられる。
【００９７】
さらに、本発明のタンパク質は、当業者に公知の技術を用いて化学的に合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆ
ｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｍ．ら
、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば
、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのフラグメントに対応するペプチ
ドが、ペプチドシンセサイザーを用いることにより合成され得る。さらに、所望
される場合、古典的ではないアミノ酸または化学的なアミノ酸アナログが、置換
または付加としてＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド配列中に導入され得る。古
典的でないアミノ酸としては、共通アミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸
、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ
、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミ
ノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン
、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシ
ン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−ア
ラニン、フルオロ−アミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸
、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸アナ
ログが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、このアミノ酸は、Ｄ（右旋
性）またはＬ（左旋性）であり得る。
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆ
ｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｍ．ら
、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば
、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのフラグメントに対応するペプチ
ドが、ペプチドシンセサイザーを用いることにより合成され得る。さらに、所望
される場合、古典的ではないアミノ酸または化学的なアミノ酸アナログが、置換
または付加としてＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド配列中に導入され得る。古
典的でないアミノ酸としては、共通アミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸
、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ
、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミ
ノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン
、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシ
ン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−ア
ラニン、フルオロ−アミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸
、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸アナ
ログが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、このアミノ酸は、Ｄ（右旋
性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【００９８】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、翻訳後プロセスのような自然の
プロセスか、または当該分野で周知の化学的な改変技術かのいずれかによって改
変され得る。同じタイプの改変が、所定のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド中
の種々の部位で、同じ程度かまたは変化した程度で存在し得ることが理解される
。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは、例えば、ユビキチン結合の結果として
枝分かれし得、そしてこれらは、枝分かれを伴ってかまたは伴わないで環化され
得る。環状の、枝分かれした、および枝分かれした環状のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリペプチドは、翻訳後の自然のプロセスから生じ得るかまたは、合成方法によ
って生成され得る。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化
、アミド化、フラビンの共有性の付着、ヘム部分の共有性の付着、ヌクレオチド
またはヌクレオチド誘導体の共有性の付着、脂質または脂質誘導体の共有性の付
着、ホスファチジルイノシトールの共有性の付着、架橋、環化、ジスルフィド結
合形成、ジメチル化、共有性の架橋形成、システインの形成、ピログルタメート
の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、
ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパ
ク質溶解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化およびユビキチン結合のようなタンパク質に対する転移ＲＮＡ
媒介のアミノ酸付加が挙げられる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵ
ＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬ
ＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１−１２頁（
１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−
６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６
３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
プロセスか、または当該分野で周知の化学的な改変技術かのいずれかによって改
変され得る。同じタイプの改変が、所定のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド中
の種々の部位で、同じ程度かまたは変化した程度で存在し得ることが理解される
。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは、例えば、ユビキチン結合の結果として
枝分かれし得、そしてこれらは、枝分かれを伴ってかまたは伴わないで環化され
得る。環状の、枝分かれした、および枝分かれした環状のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリペプチドは、翻訳後の自然のプロセスから生じ得るかまたは、合成方法によ
って生成され得る。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化
、アミド化、フラビンの共有性の付着、ヘム部分の共有性の付着、ヌクレオチド
またはヌクレオチド誘導体の共有性の付着、脂質または脂質誘導体の共有性の付
着、ホスファチジルイノシトールの共有性の付着、架橋、環化、ジスルフィド結
合形成、ジメチル化、共有性の架橋形成、システインの形成、ピログルタメート
の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、
ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパ
ク質溶解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化およびユビキチン結合のようなタンパク質に対する転移ＲＮＡ
媒介のアミノ酸付加が挙げられる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵ
ＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬ
ＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１−１２頁（
１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−
６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６
３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００９９】
本発明はさらに、翻訳中または翻訳後に示差的に改変される（例えば、グリコ
シル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、ヨード化、公知の保護／遮断基によ
る誘導体化、タンパク質溶解性切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの連
結など）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを包含する。多数の化学的改変のい
ずれも公知の技術によって実施され得、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシ
ン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼによる特定の化学的切断、ＮａＢＨ４、アセチ
ル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下での代謝的な合成；など
が挙げられるがこれらに限定されない。
シル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、ヨード化、公知の保護／遮断基によ
る誘導体化、タンパク質溶解性切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの連
結など）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを包含する。多数の化学的改変のい
ずれも公知の技術によって実施され得、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシ
ン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼによる特定の化学的切断、ＮａＢＨ４、アセチ
ル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下での代謝的な合成；など
が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１００】
本発明により包含されるさらなる翻訳後の改変としては、例えば、Ｎ−結合ま
たはＯ−結合糖鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学
性部分の付着、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物鎖の化学的な改変、および原核
宿主細胞の発現で生じるＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。
このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、このタンパク質の検出およ
び単離を可能にする酵素標識、蛍光標識、同位体標識、またはアフィニティー標
識）で改変され得る。
たはＯ−結合糖鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学
性部分の付着、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物鎖の化学的な改変、および原核
宿主細胞の発現で生じるＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。
このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、このタンパク質の検出およ
び単離を可能にする酵素標識、蛍光標識、同位体標識、またはアフィニティー標
識）で改変され得る。
【０１０１】
本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩのポリペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７
９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（
例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール
コポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコー
ルなど）から選択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置
で、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合
した化学部分を含み得る。
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩのポリペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７
９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（
例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール
コポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコー
ルなど）から選択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置
で、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合
した化学部分を含み得る。
【０１０２】
このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は示
した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）である
。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、ある場
合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または抗原
性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリ
コールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。
【０１０３】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してタンパク質に結合
されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば、本
明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦにＰ
ＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−
１０３５（１９９２）（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリエチレングリコ
ールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル基）によってア
ミノ酸残基を介して共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコ
ール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、ポリエチレン
グリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治療目的のため
に好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合で
ある。
【０１０４】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質を具体的に所望し得る。ポリエチレングリ
コールを本発明の組成の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の
型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端
ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部
分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物
質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、
特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リ
ジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得
る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタ
ンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
コールを本発明の組成の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子
から（分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール
分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の
型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端
ペグ化調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部
分から分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物
質の精製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、
特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リ
ジン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得
る。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタ
ンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１０５】
従って、本発明のポリペプチドは、天然に精製された産生物、化学合成手順の
産生物および宿主原核生物または宿主真核生物（例えば、微生物、酵母、高等植
物、昆虫および哺乳動物を含む）由来の組換え手順によって産生された産生物を
含む。組換え産生手順に使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、
グリコシル化され得る、またはグリコシル化され得ない。さらに、宿主媒介プロ
セスの結果としてのいくつかの場合、本発明のポリペプチドはまた、最初の改変
メチオニン残基を含む。
産生物および宿主原核生物または宿主真核生物（例えば、微生物、酵母、高等植
物、昆虫および哺乳動物を含む）由来の組換え手順によって産生された産生物を
含む。組換え産生手順に使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、
グリコシル化され得る、またはグリコシル化され得ない。さらに、宿主媒介プロ
セスの結果としてのいくつかの場合、本発明のポリペプチドはまた、最初の改変
メチオニン残基を含む。
【０１０６】
（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのポリペプチドおよびポリヌクレオチド）
本発明は、さらに、供託されたｃＤＮＡまたは図１（配列番号２）、あるいは
上記のポリペプチドの部分を含むポリペプチドまたはポリヌクレオチドによって
コードされるアミノ酸配列を有する単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩを提供する
。用語「ポリペプチド」および用語「ポリヌクレオチド」は、同義とみなされ（
通常、認識されるので）、そして文脈が、必要とし、ペプチド結語によって結合
される少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示す場合、各用語は、相互転換可能に使
用され得る。この単語「ポリペプチド」は、１０以上のアミノ酸残基を含む鎖の
ために本明細書中で使用される。全てのオリゴヌクレオチド処方物およびポリペ
プチド処方物または本明細書中の配列は、左から右に書かれ、そしてアミノ末端
からカルボキシ末端の方向である。
上記のポリペプチドの部分を含むポリペプチドまたはポリヌクレオチドによって
コードされるアミノ酸配列を有する単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩを提供する
。用語「ポリペプチド」および用語「ポリヌクレオチド」は、同義とみなされ（
通常、認識されるので）、そして文脈が、必要とし、ペプチド結語によって結合
される少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示す場合、各用語は、相互転換可能に使
用され得る。この単語「ポリペプチド」は、１０以上のアミノ酸残基を含む鎖の
ために本明細書中で使用される。全てのオリゴヌクレオチド処方物およびポリペ
プチド処方物または本明細書中の配列は、左から右に書かれ、そしてアミノ末端
からカルボキシ末端の方向である。
【０１０７】
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質によって、天然の環境から除去
されたポリペプチドまたはタンパク質を射とされる。例えば、宿主細胞において
発現される組換え的に産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切
な技術（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ６７：３１−
４０（１９８８）に記載の１工程法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ）によっ
て実質的に、精製された組換えポリペプチドまたはポリペプチドである場合、本
発明の目的のために単離されたと見なされる。
されたポリペプチドまたはタンパク質を射とされる。例えば、宿主細胞において
発現される組換え的に産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切
な技術（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ６７：３１−
４０（１９８８）に記載の１工程法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ）によっ
て実質的に、精製された組換えポリペプチドまたはポリペプチドである場合、本
発明の目的のために単離されたと見なされる。
【０１０８】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または
機能において有意な効果を含まなずに改変され得ることが、当該分野で認識され
る。配列におけるこのような差異が、考えられる場合、活性を決定されるタンパ
ク質における臨海領域があることえお思い出すべきである。一般に、３次構造を
形成する残基を置換する可能性はある、ただし、同様の機能を行う残基が使用さ
れる。他の例では、置換が、タンパク質の非臨海領域で起きる場合、残基の型は
、完全に重要であり得ない。
機能において有意な効果を含まなずに改変され得ることが、当該分野で認識され
る。配列におけるこのような差異が、考えられる場合、活性を決定されるタンパ
ク質における臨海領域があることえお思い出すべきである。一般に、３次構造を
形成する残基を置換する可能性はある、ただし、同様の機能を行う残基が使用さ
れる。他の例では、置換が、タンパク質の非臨海領域で起きる場合、残基の型は
、完全に重要であり得ない。
【０１０９】
従って、本発明は、さらに、実質的なＴ１Ｒ様リガンドＩＩ活性を示すＴ１Ｒ
様リガンドＩＩの変異体、または例えば、本明細書中に論じられたタンパク質部
分といったＴ１Ｒ様リガンドＩＩの領域を含むＴ１Ｒ様リガンドＩＩの変異体を
含む。このような変異体は、欠失、挿入、転置、反復および型置換（例えば、法
則として強力な親水残基を強力な疎水残基に置換するのではなく、親水残基を別
の親水残基に置換する）を含む。
様リガンドＩＩの変異体、または例えば、本明細書中に論じられたタンパク質部
分といったＴ１Ｒ様リガンドＩＩの領域を含むＴ１Ｒ様リガンドＩＩの変異体を
含む。このような変異体は、欠失、挿入、転置、反復および型置換（例えば、法
則として強力な親水残基を強力な疎水残基に置換するのではなく、親水残基を別
の親水残基に置換する）を含む。
【０１１０】
保存的な置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｕｓ）として典型的に見られるのは、
置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）別のに対して１つ、脂肪性アミノ酸 Ａｌａ、
Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ；ヒドロキシ残基 ＳｅｒおよびＴｈｒの相互変換
、酸性残基 ＡｓｐおよびＧｌｕの相互変換、アミド残基 ＡｓｎとＧｌｎ間の
置換、塩基性残基 ＬｙｓおよびＡｒｇの相互変換、そして芳香族残基Ｐｈｅ、
Ｔｙｒ間の置換である。
置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）別のに対して１つ、脂肪性アミノ酸 Ａｌａ、
Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ；ヒドロキシ残基 ＳｅｒおよびＴｈｒの相互変換
、酸性残基 ＡｓｐおよびＧｌｕの相互変換、アミド残基 ＡｓｎとＧｌｎ間の
置換、塩基性残基 ＬｙｓおよびＡｒｇの相互変換、そして芳香族残基Ｐｈｅ、
Ｔｙｒ間の置換である。
【０１１１】
上記のように、アミノ酸変化が表現型的にサイレントであるようなものに関す
る手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍ
ｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃ
ｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０））に見出され得る。
る手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍ
ｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃ
ｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０））に見出され得る。
【０１１２】
従って、配列番号２、または寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリヌク
レオチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）アミノ酸残基の少
なくとも１つ以上が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは
保存アミノ酸残基、そしてより好ましくは、少なくとも１つ、しかし１０未満の
保存されたアミノ酸残基）で置換されたものであっても良いし、そしてこのよう
な置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされたものであっても
、もしくはそうでなくてもよく、または（ｉｉ）アミノ酸残基の１つ以上が置換
基を含むものであってもよく、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプ
チドの半減期を延長する化合物のような別の化合物（例えば、ポリエチレングリ
コール）と融合されたものでもよく、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポ
リペプチド（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしく
は分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用
される配列）と融合されたものでもよい。このようなフラグメント、誘導体およ
びアナログは、本明細書における教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
レオチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）アミノ酸残基の少
なくとも１つ以上が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは
保存アミノ酸残基、そしてより好ましくは、少なくとも１つ、しかし１０未満の
保存されたアミノ酸残基）で置換されたものであっても良いし、そしてこのよう
な置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされたものであっても
、もしくはそうでなくてもよく、または（ｉｉ）アミノ酸残基の１つ以上が置換
基を含むものであってもよく、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプ
チドの半減期を延長する化合物のような別の化合物（例えば、ポリエチレングリ
コール）と融合されたものでもよく、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポ
リペプチド（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしく
は分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用
される配列）と融合されたものでもよい。このようなフラグメント、誘導体およ
びアナログは、本明細書における教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
【０１１３】
格別興味深いことは、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸、および中
性または負に荷電したアミノ酸との置換である。後者は、タンパク質において低
下した正電荷を生じて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩレセプタータンパク質の特性を改
善する。凝集の阻止は、非常に所望される。タンパク質の凝集は、薬学的処方物
を調製する場合、活性を減じるのみでなく、問題でもあり得る。なぜなら、凝集
物は免疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａ
ｂｅｔｅｓ ３６：８３８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ
．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ １０：３０７〜３７７（１９９３））。
性または負に荷電したアミノ酸との置換である。後者は、タンパク質において低
下した正電荷を生じて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩレセプタータンパク質の特性を改
善する。凝集の阻止は、非常に所望される。タンパク質の凝集は、薬学的処方物
を調製する場合、活性を減じるのみでなく、問題でもあり得る。なぜなら、凝集
物は免疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａ
ｂｅｔｅｓ ３６：８３８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ
．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ １０：３０７〜３７７（１９９３））。
【０１１４】
アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。
Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、ＴＮ
Ｆ−αの、ＴＮＦレセプターの２つの公知の型の１つのみへの選択的結合を生じ
る特定の変異を記載している。従って、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩは、天然
の変異か、またはヒトの操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸置換、欠失ま
たは付加を含み得る。
Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６〜２６８（１９９３）は、ＴＮ
Ｆ−αの、ＴＮＦレセプターの２つの公知の型の１つのみへの選択的結合を生じ
る特定の変異を記載している。従って、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩは、天然
の変異か、またはヒトの操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸置換、欠失ま
たは付加を含み得る。
【０１１５】
示されるように、変化は好ましくはわずかな性質の変化、例えば、タンパク質
の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換である（表ＩＩを
参照のこと）。
の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換である（表ＩＩを
参照のこと）。
【０１１６】
【表１】
もちろん、熟練者が置換するアミノ酸の数は、上記の因子を含む、多くの因子
に依存する。一般に、任意の所定のＰＡＰＡＩポリペプチドのための置換の数は
、５０、４０、３０、２０、１０，５または３より多い。
に依存する。一般に、任意の所定のＰＡＰＡＩポリペプチドのための置換の数は
、５０、４０、３０、２０、１０，５または３より多い。
【０１１７】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質中の機能に必須であるアミノ酸は、
部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発のような、当該分野で
公知の方法によって同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分
子中の全ての残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分
子は、生物学的活性、例えば、レセプター結合またはインビトロ増殖活性につい
て試験される。リガンド−レセプター結合のために重要な部位もまた、結晶化、
核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造解析によって決定され得る（Ｓｍ
ｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）および
ｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発のような、当該分野で
公知の方法によって同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分
子中の全ての残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分
子は、生物学的活性、例えば、レセプター結合またはインビトロ増殖活性につい
て試験される。リガンド−レセプター結合のために重要な部位もまた、結晶化、
核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造解析によって決定され得る（Ｓｍ
ｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）および
ｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【０１１８】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離形態で提供される。「単離された
ポリペプチド」によって、そのネイティブな環境から取り出されたポリペプチド
が意図される。従って、組換え宿主細胞中で産生され、そして／またはその中に
含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。組換
え宿主細胞から部分的または実質的に精製されたポリペプチドもまた、「単離さ
れたポリペプチド」として意図される。例えばＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチ
ドの組換え産生されたバージョンが、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ Ｇｅｎ
ｅ ６７：３１〜４０（１９８８）に記載される１工程の方法によって実質的に
精製され得る。
ポリペプチド」によって、そのネイティブな環境から取り出されたポリペプチド
が意図される。従って、組換え宿主細胞中で産生され、そして／またはその中に
含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。組換
え宿主細胞から部分的または実質的に精製されたポリペプチドもまた、「単離さ
れたポリペプチド」として意図される。例えばＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチ
ドの組換え産生されたバージョンが、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ Ｇｅｎ
ｅ ６７：３１〜４０（１９８８）に記載される１工程の方法によって実質的に
精製され得る。
【０１１９】
本発明のポリペプチドは、以下を含む：リーダーを含む寄託されたｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドを含む；リーダーを含まない寄託されたｃＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；配列番号
２のアミノ酸およそ−２６〜およそ２０３を含むか、またはこれらからなる、ポ
リペプチド；配列番号２のアミノ酸およそ−２５〜およそ２０３を含む、ポリペ
プチド；配列番号２のアミノ酸およそ１〜およそ２０３を含む、ポリペプチド；
配列番号２のポリペプチド）に対して、委託されたｃＤＮＡによってコードされ
たポリペプチドに対して、少なくとも９０％同一、より好ましくは、少なくとも
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、ポリペプチド。そし
て、本発明のポリペプチドは、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは
、少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一部もまた含む。
よりコードされるポリペプチドを含む；リーダーを含まない寄託されたｃＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；配列番号
２のアミノ酸およそ−２６〜およそ２０３を含むか、またはこれらからなる、ポ
リペプチド；配列番号２のアミノ酸およそ−２５〜およそ２０３を含む、ポリペ
プチド；配列番号２のアミノ酸およそ１〜およそ２０３を含む、ポリペプチド；
配列番号２のポリペプチド）に対して、委託されたｃＤＮＡによってコードされ
たポリペプチドに対して、少なくとも９０％同一、より好ましくは、少なくとも
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、ポリペプチド。そし
て、本発明のポリペプチドは、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは
、少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの一部もまた含む。
【０１２０】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの参照アミノ酸配列に、例えば、少なくと
も９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、そのポリペプチ
ドのポリペプチド配列が、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの参照アミノ酸配列の各１００
アミノ酸あたり５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、その参照配列
に同一であることが意図される。換言すると、参照アミノ酸配列に少なくとも９
５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列のアミノ
酸残基の５％までが、欠失または、別のアミノ酸で置換され得るか、または参照
配列の総アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が、その参照配列に挿入され得
る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置またはカル
ボキシ末端位置、あるいはこれらの末端位置間のどこかで生じ得、参照配列の残
基間で個々にか、または参照配列内で１個以上連続する群としてかのいずれかで
間に散在する。
も９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、そのポリペプチ
ドのポリペプチド配列が、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの参照アミノ酸配列の各１００
アミノ酸あたり５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、その参照配列
に同一であることが意図される。換言すると、参照アミノ酸配列に少なくとも９
５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列のアミノ
酸残基の５％までが、欠失または、別のアミノ酸で置換され得るか、または参照
配列の総アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が、その参照配列に挿入され得
る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置またはカル
ボキシ末端位置、あるいはこれらの末端位置間のどこかで生じ得、参照配列の残
基間で個々にか、または参照配列内で１個以上連続する群としてかのいずれかで
間に散在する。
【０１２１】
実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、（図１）配列番
号２に示されるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンまたはそのフ
ラグメントによりコードされるアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９５％、９
６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、ＢＥＳＴＦＩＴプログ
ラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａ
ｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐ
ａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７
１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来のように決定さ
れ得る。特定の配列が、本発明に従う参照配列に、例えば９５％同一か否かを決
定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを
使用する場合、もちろん、参照アミノ酸配列の全長に渡って同一性の百分率が算
出されるように、そして参照配列中のアミノ酸残基の合計の数の５％までの相同
性のギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
号２に示されるアミノ酸配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンまたはそのフ
ラグメントによりコードされるアミノ酸配列に、少なくとも９０％、９５％、９
６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、ＢＥＳＴＦＩＴプログ
ラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａ
ｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐ
ａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７
１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来のように決定さ
れ得る。特定の配列が、本発明に従う参照配列に、例えば９５％同一か否かを決
定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを
使用する場合、もちろん、参照アミノ酸配列の全長に渡って同一性の百分率が算
出されるように、そして参照配列中のアミノ酸残基の合計の数の５％までの相同
性のギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【０１２２】
特定の実施形態において、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と対象配
列との間の同一性（全体的配列整列もいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍ
ｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズム
に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。ＦＡ
ＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｐ
ＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏ
ｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ
Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ
（どちらかより短い方）である。この実施形態に従うと、対象配列がＮ末端また
はＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い場
合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に対
象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないという事実を考慮して、手動
の補正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対する、Ｎ末端およびＣ末端
で短縮されている対象配列についての、同一性パーセントは、問い合わせ配列の
総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列の
Ｎ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補
正される。残基が一致／整列されているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列
の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから
差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用
して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同
一性パーセントのスコアが、この実施形態の目的で使用されるものである。問い
合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみ
が、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。すな
わち、問い合わせ残基は、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側に
のみ位置する。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列を、同一性パーセントを決
定するために１００残基の問い合わせ配列と整列する。この欠失は、対象配列の
Ｎ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基
の一致／整列を示さない。この１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致して
いないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表
し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのス
コアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的
な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列を、
１００残基の問い合わせ配列と比較する。この場合、欠失は、内部欠失であり、
そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残
基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセント
は、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置
のみが、手動で補正される。他の手動の補正は、この実施形態の目的のためには
なされない。
列との間の同一性（全体的配列整列もいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍ
ｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズム
に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。ＦＡ
ＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｐ
ＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏ
ｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ
Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ
（どちらかより短い方）である。この実施形態に従うと、対象配列がＮ末端また
はＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い場
合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に対
象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないという事実を考慮して、手動
の補正が結果に対してなされる。問い合わせ配列に対する、Ｎ末端およびＣ末端
で短縮されている対象配列についての、同一性パーセントは、問い合わせ配列の
総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列の
Ｎ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補
正される。残基が一致／整列されているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列
の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから
差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用
して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同
一性パーセントのスコアが、この実施形態の目的で使用されるものである。問い
合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみ
が、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。すな
わち、問い合わせ残基は、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側に
のみ位置する。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列を、同一性パーセントを決
定するために１００残基の問い合わせ配列と整列する。この欠失は、対象配列の
Ｎ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基
の一致／整列を示さない。この１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致して
いないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表
し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのス
コアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的
な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列を、
１００残基の問い合わせ配列と比較する。この場合、欠失は、内部欠失であり、
そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残
基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセント
は、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置
のみが、手動で補正される。他の手動の補正は、この実施形態の目的のためには
なされない。
【０１２３】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に記載のポリペプチドのフラグメ
ントが提供される。好ましいフラグメントは、以下を含む：細胞外ドメイン（配
列番号２の約１〜約１６８までのアミノ酸残基）；膜貫通領域（配列番号２の約
１６９〜約１９１までのアミノ酸残基）；細胞内領域（配列番号２の約１９２〜
約２０３までのアミノ酸残基）および欠失された膜貫通ドメインのス全てまたは
部分を有する細胞内ドメイン。
ントが提供される。好ましいフラグメントは、以下を含む：細胞外ドメイン（配
列番号２の約１〜約１６８までのアミノ酸残基）；膜貫通領域（配列番号２の約
１６９〜約１９１までのアミノ酸残基）；細胞内領域（配列番号２の約１９２〜
約２０３までのアミノ酸残基）および欠失された膜貫通ドメインのス全てまたは
部分を有する細胞内ドメイン。
【０１２４】
多数のタンパク質について、１以上のアミノ酸を実質的な生物学的活性の損失
なくＮ末端またはＣ末端より欠損し得ることが当該分野において周知である。し
かし、タンパク質のＮ末端またはＣ末端からの１以上のアミノ酸の欠損がタンパ
ク質の１以上の生物学的機能の修飾または損失を生じる場合、他のＴ１Ｒ様レセ
プターリガンド機能活性（例えば、生物学的活性（例えば、造血制御能力）、多
量体化する能力、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドリガンドに結合する能力）
は、まだ保持される。例えば、短縮化Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ変異体のポリペプチ
ドの完全形態または成熟形態を認識する、抗体を誘導および／または結合する能
力は、完全タンパク質または成熟タンパク質の決して大多数ではない残基が、Ｎ
末端から除去される場合、一般に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基
を欠く特定のポリペプチドが免疫学的活性を保持し得るか否かは、本明細書中に
記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の方法により容易に決定され
得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩ変異体
は、いくつかの生物学的活性または免疫学的活性を保持することが予想される。
実際、６と同じくらい少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、頻繁に、免疫応
答を惹起し得る。
なくＮ末端またはＣ末端より欠損し得ることが当該分野において周知である。し
かし、タンパク質のＮ末端またはＣ末端からの１以上のアミノ酸の欠損がタンパ
ク質の１以上の生物学的機能の修飾または損失を生じる場合、他のＴ１Ｒ様レセ
プターリガンド機能活性（例えば、生物学的活性（例えば、造血制御能力）、多
量体化する能力、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドリガンドに結合する能力）
は、まだ保持される。例えば、短縮化Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ変異体のポリペプチ
ドの完全形態または成熟形態を認識する、抗体を誘導および／または結合する能
力は、完全タンパク質または成熟タンパク質の決して大多数ではない残基が、Ｎ
末端から除去される場合、一般に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基
を欠く特定のポリペプチドが免疫学的活性を保持し得るか否かは、本明細書中に
記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の方法により容易に決定され
得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩ変異体
は、いくつかの生物学的活性または免疫学的活性を保持することが予想される。
実際、６と同じくらい少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、頻繁に、免疫応
答を惹起し得る。
【０１２５】
したがって、本発明はさらに、図１（すなわち、配列番号２）（位置番号１９
８のＬｙｓ残基までおよびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）に
示されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩアミノ酸配列のアミノ末端から１以上の残基を欠
損したポリペプチドを提供する。
８のＬｙｓ残基までおよびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）に
示されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩアミノ酸配列のアミノ末端から１以上の残基を欠
損したポリペプチドを提供する。
【０１２６】
特に、本発明はさらに、配列番号２のｎから２０２残基のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドを提供し、ここでｎは、２〜１９８の整数であり、ここでｎは配列
番号２で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、配列番号２に
示される本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのＮ末端欠失は、以下のア
ミノ酸残基から選択されるアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸残基か
ら構成される。
ポリペプチドを提供し、ここでｎは、２〜１９８の整数であり、ここでｎは配列
番号２で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、配列番号２に
示される本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのＮ末端欠失は、以下のア
ミノ酸残基から選択されるアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸残基か
ら構成される。
【０１２７】
【化１】
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる
。
。
【０１２８】
さらに、配列番号２に示される本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの
Ｎ末端欠失はまた、以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸配列を含むか、
または以下のアミノ酸残基から構成される。
Ｎ末端欠失はまた、以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸配列を含むか、
または以下のアミノ酸残基から構成される。
【０１２９】
【化２】
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる
。
。
【０１３０】
上にまた記載したように、タンパク質のＮ末端またはＣ末端からの１以上のア
ミノ酸の欠損がタンパク質の１以上の生物学的機能の修飾または損失を生じる場
合、他のＴ１Ｒ様レセプターリガンド機能活性（例えば、生物学的活性（例えば
、造血制御能力）、多量体化する能力、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドリガ
ンドに結合する能力）は、まだ保持される。例えば、短縮化Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉ変異体のポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する、抗体を誘導およ
び／または結合する能力は、完全タンパク質または成熟タンパク質の決して大多
数ではない残基が、Ｎ末端から除去される場合、一般に保持される。完全なポリ
ペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが免疫学的活性を保持し得るか
否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の方法
により容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するＴ１Ｒ
様リガンドＩＩ変異体は、いくつかの生物学的活性または免疫学的活性を保持す
ることが予想される。実際、６と同じくらい少ないアミノ酸残基からなるペプチ
ドは、頻繁に、免疫応答を惹起し得る。
ミノ酸の欠損がタンパク質の１以上の生物学的機能の修飾または損失を生じる場
合、他のＴ１Ｒ様レセプターリガンド機能活性（例えば、生物学的活性（例えば
、造血制御能力）、多量体化する能力、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドリガ
ンドに結合する能力）は、まだ保持される。例えば、短縮化Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉ変異体のポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する、抗体を誘導およ
び／または結合する能力は、完全タンパク質または成熟タンパク質の決して大多
数ではない残基が、Ｎ末端から除去される場合、一般に保持される。完全なポリ
ペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが免疫学的活性を保持し得るか
否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の方法
により容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するＴ１Ｒ
様リガンドＩＩ変異体は、いくつかの生物学的活性または免疫学的活性を保持す
ることが予想される。実際、６と同じくらい少ないアミノ酸残基からなるペプチ
ドは、頻繁に、免疫応答を惹起し得る。
【０１３１】
したがって、本発明はさらに、配列番号２（位置番号６のＬｅｕ残基までおよ
びこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）に示されるＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩアミノ酸配列のカルボキシ末端から１以上の残基を欠損したポリペプチド
を提供する。
びこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）に示されるＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩアミノ酸配列のカルボキシ末端から１以上の残基を欠損したポリペプチド
を提供する。
【０１３２】
特に、本発明はさらに、図１（すなわち、配列番号２）の１からｍ残基のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｍは、６〜２０２の整数であり、
ここでｍは配列番号２で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。
ノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｍは、６〜２０２の整数であり、
ここでｍは配列番号２で同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。
【０１３３】
好ましくは、配列番号２に示される本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチ
ドのＣ末端欠失は、以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸配列を含むか、
または以下のアミノ酸残基から構成される。
ドのＣ末端欠失は、以下のアミノ酸残基から選択されるアミノ酸配列を含むか、
または以下のアミノ酸残基から構成される。
【０１３４】
【化３】
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる
。
。
【０１３５】
本発明はまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのアミノ末端およびカルボ
キシ末端の両方より１以上のアミノ酸残基を欠損したポリペプチドを提供し、こ
れは、配列番号２のｎ〜ｍ残基を有するよう記載され得、ここでｎおよびｍは、
上に記載するように整数である。
キシ末端の両方より１以上のアミノ酸残基を欠損したポリペプチドを提供し、こ
れは、配列番号２のｎ〜ｍ残基を有するよう記載され得、ここでｎおよびｍは、
上に記載するように整数である。
【０１３６】
本願はまた、ｎ〜ｍとして本明細書中で示されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペ
プチド配列に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％同一なポリペプチドを含むタンパク質に関する。好ましい実施形態では、本願
は、本明細書中に列挙される特定のＴ１Ｒ様リガンドＩＩのＮ末端欠失型および
／またはＣ末端欠失型のアミノ酸配列を有するポリペプチドに、少なくとも９０
％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なポリペプチドを含むタ
ンパク質に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた
、本発明に含まれる。
プチド配列に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％同一なポリペプチドを含むタンパク質に関する。好ましい実施形態では、本願
は、本明細書中に列挙される特定のＴ１Ｒ様リガンドＩＩのＮ末端欠失型および
／またはＣ末端欠失型のアミノ酸配列を有するポリペプチドに、少なくとも９０
％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なポリペプチドを含むタ
ンパク質に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた
、本発明に含まれる。
【０１３７】
特定の好ましい実施形態では、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は、
上記のような融合タンパク質を含む。ここで、融合タンパク質のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩポリペプチドは、ｎ〜ｍとして本明細書中に示されるポリペプチドである
。好ましい実施形態では、本願は、本明細書中に列挙される特定のＴ１Ｒ様リガ
ンドＩＩのＮ末端欠失型および／またはＣ末端欠失型のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードする核酸配列に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一な核酸分子に関する。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
上記のような融合タンパク質を含む。ここで、融合タンパク質のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩポリペプチドは、ｎ〜ｍとして本明細書中に示されるポリペプチドである
。好ましい実施形態では、本願は、本明細書中に列挙される特定のＴ１Ｒ様リガ
ンドＩＩのＮ末端欠失型および／またはＣ末端欠失型のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードする核酸配列に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一な核酸分子に関する。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１３８】
本発明のポリぺプチドフラグメントは、以下を含むか、またあるいは以下から
なる、ポリぺプチドを含む：配列番号２に含まれるアミノ酸配列、寄託されたク
ローン内に含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、あるいは寄託さ
れたクローンに含まれるヌクレオチド配列に（例えば、ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミ
ノ酸配列か、または図１Ａ−Ｄ（配列番号１）に示されるアミノ酸配列か、また
はそれらの相補鎖。タンパク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａ
ｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（そのフラグ
メントが、部分または領域を、最も好ましくは単一の連続した領域として形成す
る）に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、
例えば、以下を含むかあるいは以下からなる、フラグメントが挙げられる：配列
番号２のアミノ酸残基およそ−２５〜−１、１〜５０、５１〜１００、１０１〜
１３０、１３１〜１６９、１７０〜１９１、および／または１９２〜２０３。さ
らに、ポリぺプチドフラグメントは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０
、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０
、１７５または２００アミノ酸長であり得る。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる。
なる、ポリぺプチドを含む：配列番号２に含まれるアミノ酸配列、寄託されたク
ローン内に含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、あるいは寄託さ
れたクローンに含まれるヌクレオチド配列に（例えば、ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミ
ノ酸配列か、または図１Ａ−Ｄ（配列番号１）に示されるアミノ酸配列か、また
はそれらの相補鎖。タンパク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａ
ｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（そのフラグ
メントが、部分または領域を、最も好ましくは単一の連続した領域として形成す
る）に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、
例えば、以下を含むかあるいは以下からなる、フラグメントが挙げられる：配列
番号２のアミノ酸残基およそ−２５〜−１、１〜５０、５１〜１００、１０１〜
１３０、１３１〜１６９、１７０〜１９１、および／または１９２〜２０３。さ
らに、ポリぺプチドフラグメントは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０
、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０
、１７５または２００アミノ酸長であり得る。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドはまた、本発明に含まれる。
【０１３９】
とりわけ、特に好ましい本発明のフラグメントは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの構
造的特性もしくは機能的特性により特徴付けられるフラグメントである。そのよ
うなフラグメントは、完全（すなわち、成熟）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ（配列番号
２）のα−へリックスおよびα−へリックス形成領域（「α領域」）、β−シー
トおよびβ−シート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「
ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域
、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、および高抗原
性指標領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラ
メータを使用して同定されるように、１．５以上の抗原性指標を有するアミノ酸
残基を構成するポリペプチドの領域）を含むアミノ酸残基を含む。特定の好まし
い領域は、図３に開示される領域であり、そして、図１（配列番号２）に示され
るアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域を含むが、それらに限
定されず、そのような好ましい領域としては、これらのコンピュータプログラム
のデフォルトパラメーターを使用して推定されるような、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏ
ｂｓｏｎ推定α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａ
ｓｍａｎ推定α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ推定親水性領域および疎水性領域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ α両親媒
性領域およびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉ表面形成領域ならびにＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域が挙げられる。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドはまた、本発明により含まれる。
造的特性もしくは機能的特性により特徴付けられるフラグメントである。そのよ
うなフラグメントは、完全（すなわち、成熟）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ（配列番号
２）のα−へリックスおよびα−へリックス形成領域（「α領域」）、β−シー
トおよびβ−シート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「
ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域
、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形成領域、および高抗原
性指標領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラ
メータを使用して同定されるように、１．５以上の抗原性指標を有するアミノ酸
残基を構成するポリペプチドの領域）を含むアミノ酸残基を含む。特定の好まし
い領域は、図３に開示される領域であり、そして、図１（配列番号２）に示され
るアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域を含むが、それらに限
定されず、そのような好ましい領域としては、これらのコンピュータプログラム
のデフォルトパラメーターを使用して推定されるような、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏ
ｂｓｏｎ推定α領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａ
ｓｍａｎ推定α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ推定親水性領域および疎水性領域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ α両親媒
性領域およびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉ表面形成領域ならびにＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域が挙げられる。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドはまた、本発明により含まれる。
【０１４０】
さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩの機能的属性をコードする。この点における本発明の好ましい実施形態は、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのαへリックスおよびαへリックス形成領域（「α−領域
」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびタ
ーン形成領域（「ターン−領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−
領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性
領域、表面形成領域および高度抗原性指標領域を含むか、あるいはこれらから構
成されるフラグメントを含む。
ＩＩの機能的属性をコードする。この点における本発明の好ましい実施形態は、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのαへリックスおよびαへリックス形成領域（「α−領域
」）、β−シートおよびβ−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびタ
ーン形成領域（「ターン−領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル−
領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性
領域、表面形成領域および高度抗原性指標領域を含むか、あるいはこれらから構
成されるフラグメントを含む。
【０１４１】
図３および／または表２に示されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩの構造的または機能
的特質を表すデータは、本明細書に記載されるように、デフォルトパラメーター
にセットされたＤＮＡ＊ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用い
て作製された。好ましい実施形態において、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ
、および／またはＸＩＶに提示されるデータは、抗原性について高い程度の可能
性を示すＴ１Ｒ様リガンドＩＩの領域を決定するために使用され得る。高い抗原
性の領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境中のポ
リペプチドの表面に曝露されるようなポリペプチドの領域を提示する値を選択す
ることによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶにおいて提示され
るデータから決定される。
的特質を表すデータは、本明細書に記載されるように、デフォルトパラメーター
にセットされたＤＮＡ＊ＳＴＡＲの種々のモジュールおよびアルゴリズムを用い
て作製された。好ましい実施形態において、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ
、および／またはＸＩＶに提示されるデータは、抗原性について高い程度の可能
性を示すＴ１Ｒ様リガンドＩＩの領域を決定するために使用され得る。高い抗原
性の領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境中のポ
リペプチドの表面に曝露されるようなポリペプチドの領域を提示する値を選択す
ることによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶにおいて提示され
るデータから決定される。
【０１４２】
これらの点において特定の好ましい領域は、図３に示されるが、この領域は、
表２に示されるように、図３に提示されるデータの表の表示を用いることによっ
て提示および同定され得る。図３を作製するために使用されたＤＮＡ＊ＳＴＡＲ
コンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターでセットされ
る）は、表の形式において図３でデータを提示するために使用された（表２を参
照のこと）。図３におけるデータの表の形式は、好ましい領域の特異的な境界を
容易に決定するために使用され得る。
表２に示されるように、図３に提示されるデータの表の表示を用いることによっ
て提示および同定され得る。図３を作製するために使用されたＤＮＡ＊ＳＴＡＲ
コンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターでセットされ
る）は、表の形式において図３でデータを提示するために使用された（表２を参
照のこと）。図３におけるデータの表の形式は、好ましい領域の特異的な境界を
容易に決定するために使用され得る。
【０１４３】
図３および表２に示される上記の好ましい領域は、図１に示されるアミノ酸配
列の分析によって同定される上記のタイプの領域を含むが、これに限定されない
。図３および表２に示される、このような好ましい領域としては、Ｇａｒｎｉｅ
ｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈ
ｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水性領域、Ｅｉｓ
ｅｎｂｅｒｇのα−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓ
ｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域、ならびに高い抗原性指標
のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの領域が挙げられる。
列の分析によって同定される上記のタイプの領域を含むが、これに限定されない
。図３および表２に示される、このような好ましい領域としては、Ｇａｒｎｉｅ
ｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈ
ｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの疎水性領域、Ｅｉｓ
ｅｎｂｅｒｇのα−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓ
ｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域、ならびに高い抗原性指標
のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの領域が挙げられる。
【０１４４】
【表２】
とりわけこの関連において非常に好ましいフラグメントは、いくつかの構造特
徴（例えば、上記に示されたいくつかの特徴）を持ち合わせるＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩの領域を含む。
徴（例えば、上記に示されたいくつかの特徴）を持ち合わせるＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩの領域を含む。
【０１４５】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
またはモレキュラーシーブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｅｖｅ）ろ過カラム分子
の分子量マーカーとして使用され得る。これらのポリペプチドは、本明細書にお
いて記載されるようにＴ１Ｒ様リガンドＩＩ発現の検出のための診断アッセイに
おいて有用であるか、あるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質機能を促進し得
るかまたは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さら
に、このようなポリペプチドは、本発明に従うアゴニストおよびアンタゴニスト
をまた候補とし得るＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を「捕捉」する酵母−２−
ハイブリッド系（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）において
使用され得る。この酵母−２−ハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ
，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４５（１９８９）に記載される。
またはモレキュラーシーブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｅｖｅ）ろ過カラム分子
の分子量マーカーとして使用され得る。これらのポリペプチドは、本明細書にお
いて記載されるようにＴ１Ｒ様リガンドＩＩ発現の検出のための診断アッセイに
おいて有用であるか、あるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質機能を促進し得
るかまたは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。さら
に、このようなポリペプチドは、本発明に従うアゴニストおよびアンタゴニスト
をまた候補とし得るＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を「捕捉」する酵母−２−
ハイブリッド系（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）において
使用され得る。この酵母−２−ハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ
，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４５（１９８９）に記載される。
【０１４６】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あ
るいはＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるポリヌクレオチド配列によってか
、もしくは配列番号１の相補体に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドに
よってコードされるポリペプチド配列のエピトープ、または本明細書において定
義されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより
低いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下でのＡＴＣＣ寄託番号
９７６５５に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド
配列のエピトープを、含むかあるいはこれらからなるポリペプチドを包含する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列（例えば、配列番号２において開示
された配列など）のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列、本発明のエ
ピトープをコードするポリヌクレオチド配列である相補鎖のポリヌクレオチド配
列、および本明細書において定義されるようなストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下もしくはより低いストリンジェンシーなハイブリダイゼーショ
ン条件下でこの相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
るいはＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるポリヌクレオチド配列によってか
、もしくは配列番号１の相補体に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドに
よってコードされるポリペプチド配列のエピトープ、または本明細書において定
義されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより
低いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下でのＡＴＣＣ寄託番号
９７６５５に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド
配列のエピトープを、含むかあるいはこれらからなるポリペプチドを包含する。
本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列（例えば、配列番号２において開示
された配列など）のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列、本発明のエ
ピトープをコードするポリヌクレオチド配列である相補鎖のポリヌクレオチド配
列、および本明細書において定義されるようなストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下もしくはより低いストリンジェンシーなハイブリダイゼーショ
ン条件下でこの相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１４７】
本明細書中で使用される用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物
、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有するポ
リペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピトープを
含むポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
。本明細書で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、動物における抗体応
答を誘発するタンパク質の一部分として定義され、当該分野で公知の任意の方法
によって（例えば、本明細書において記載される抗体を生成するための方法によ
って）測定された。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本
明細書中で使用される場合、用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野で周知の
任意の方法によって（例えば、本明細書中に記載されたイムノアッセイによって
）測定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一
部として定義される。免疫特異的な結合は、非特異的な結合を除外するが、必ず
しも他の抗原との交差反応性を除外する必要はない。抗原性エピトープは、必ず
しも免疫原性を必要とはしない。
、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有するポ
リペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピトープを
含むポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
。本明細書で使用される場合、「免疫原性エピトープ」は、動物における抗体応
答を誘発するタンパク質の一部分として定義され、当該分野で公知の任意の方法
によって（例えば、本明細書において記載される抗体を生成するための方法によ
って）測定された。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本
明細書中で使用される場合、用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野で周知の
任意の方法によって（例えば、本明細書中に記載されたイムノアッセイによって
）測定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得るタンパク質の一
部として定義される。免疫特異的な結合は、非特異的な結合を除外するが、必ず
しも他の抗原との交差反応性を除外する必要はない。抗原性エピトープは、必ず
しも免疫原性を必要とはしない。
【０１４８】
本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、タンパク質のこれらの
一部が抗体応答を惹起する、この場合、このタンパク質全体がこの免疫原である
）は、当該分野で公知の方法によって同定される、例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１
９８４）、前出、固体支持体上の迅速な同時合成のための手順が、酵素結合免疫
染色アッセイにおいて反応するための十分な純度の数百個のポリペプチドを支持
することを開示する。抗体を用いるペプチド合成の相互作用は、次いで、この支
持体からそれらを除去することなく容易に検出される。この様式において、所望
のタンパク質のペプチド保有免疫原性エピトープは、当業者によって慣用的に同
定され得る。例えば、足の疾患ウイルスおよび口の疾患ウイルスのコートタンパ
ク質中の免疫学的に重要なエピトープは、このタンパク質の全２１３個のアミノ
酸配列を覆う可能性のある全２０８個のヘキサペプチドの重複セットの合成によ
る７個のアミノ酸の決定に伴ってＧｅｙｓｅｎらによって定められた。次いで、
エピトープが合成された範囲内で、全２０アミノ酸がいずれの部位でも置換され
るペプチドの完全置換セット、および抗体との反応に対する特異性を与える特定
のアミノ酸抗体を、決定した。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプ
チドアナログは、慣用的にこの方法によってなされ得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８
７）の米国特許第４，７０８，７８１号は、さらに、所望のタンパク質のペプチ
ド保有免疫原性エピトープを同定するこの方法を記載する。
一部が抗体応答を惹起する、この場合、このタンパク質全体がこの免疫原である
）は、当該分野で公知の方法によって同定される、例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１
９８４）、前出、固体支持体上の迅速な同時合成のための手順が、酵素結合免疫
染色アッセイにおいて反応するための十分な純度の数百個のポリペプチドを支持
することを開示する。抗体を用いるペプチド合成の相互作用は、次いで、この支
持体からそれらを除去することなく容易に検出される。この様式において、所望
のタンパク質のペプチド保有免疫原性エピトープは、当業者によって慣用的に同
定され得る。例えば、足の疾患ウイルスおよび口の疾患ウイルスのコートタンパ
ク質中の免疫学的に重要なエピトープは、このタンパク質の全２１３個のアミノ
酸配列を覆う可能性のある全２０８個のヘキサペプチドの重複セットの合成によ
る７個のアミノ酸の決定に伴ってＧｅｙｓｅｎらによって定められた。次いで、
エピトープが合成された範囲内で、全２０アミノ酸がいずれの部位でも置換され
るペプチドの完全置換セット、および抗体との反応に対する特異性を与える特定
のアミノ酸抗体を、決定した。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドのペプ
チドアナログは、慣用的にこの方法によってなされ得る。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８
７）の米国特許第４，７０８，７８１号は、さらに、所望のタンパク質のペプチ
ド保有免疫原性エピトープを同定するこの方法を記載する。
【０１４９】
さらになお、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は
、目的の抗体の特定のパラトープ（抗体結合部位）に対して相補的である位相同
型のエピトープ（すなわち「ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）」）である単量体
（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出するかまたは決定する一般的な方法
を記載する。より一般的に、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３
，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に対して相補的であ
る位相同型リガンドである単量体の配列を検出するかまたは決定する方法を記載
する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｘ
ｔｕｒｅにおけるＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．らの米国特許第５，４８０，９７
１号は、直鎖のＣ１〜Ｃ７−アルキルの過アルキル化（ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅ
ｄ）オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびこのようなペプ
チドのライブラリー、そして、目的のアクセプター分子に優先的に結合する過ア
ルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために、このようなオリゴペプチドの
セットおよびこのようなオリゴペプチドのライブラリーを使用するための方法を
開示する。したがって、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログ
はまた、これらの方法によって慣用的になされ得る。
、目的の抗体の特定のパラトープ（抗体結合部位）に対して相補的である位相同
型のエピトープ（すなわち「ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）」）である単量体
（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出するかまたは決定する一般的な方法
を記載する。より一般的に、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３
，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に対して相補的であ
る位相同型リガンドである単量体の配列を検出するかまたは決定する方法を記載
する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｘ
ｔｕｒｅにおけるＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．らの米国特許第５，４８０，９７
１号は、直鎖のＣ１〜Ｃ７−アルキルの過アルキル化（ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅ
ｄ）オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびこのようなペプ
チドのライブラリー、そして、目的のアクセプター分子に優先的に結合する過ア
ルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために、このようなオリゴペプチドの
セットおよびこのようなオリゴペプチドのライブラリーを使用するための方法を
開示する。したがって、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログ
はまた、これらの方法によって慣用的になされ得る。
【０１５０】
また、ペプチド保有抗原エピトープおよびポリペプチド保有抗原エピトープ（
すなわち、これらは、抗原が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に
関しては、タンパク質配列の模倣部分が抗血清を慣用的に誘発し得る相対的に短
い合成的ペプチドが、部分的に模倣タンパク質と反応することが当該分野におい
て周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発
し得るペプチドは、タンパク質の一次配列中に頻繁に提示され、単純な化学的規
則のセットによって特徴付けられ得、そして、未処理のタンパク質の免疫優性領
域に対しても、またアミノ末端もしくはカルボキシル末端に対してもいずれにも
制限されない。非常に疎水性であるペプチド、および６残基より少ない残基は、
一般に、模倣タンパク質に対して結合する抗体を惹起する効果がない；より長い
可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含むペプチドは、通常、効果的である。Ｓ
ｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出、６６１頁を参照のこと。例えば、これらのガイドラ
インに従って設計された１８〜２０個のペプチド（インフルエンザウイルス赤血
球凝集ＨＡ１ポリペプチドペプチド鎖の配列の７５％を覆う８〜３９残基を含む
）は、ＨＡ１タンパク質または未処理のウイルスと反応した抗体を惹起した；そ
してＭｕＬＶポリメラーゼ由来の１２／１２ペプチドおよび狂犬病糖タンパク質
由来の１８／１８ペプチドは、各々のタンパク質を凝結させた抗体を惹起した。
すなわち、これらは、抗原が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に
関しては、タンパク質配列の模倣部分が抗血清を慣用的に誘発し得る相対的に短
い合成的ペプチドが、部分的に模倣タンパク質と反応することが当該分野におい
て周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発
し得るペプチドは、タンパク質の一次配列中に頻繁に提示され、単純な化学的規
則のセットによって特徴付けられ得、そして、未処理のタンパク質の免疫優性領
域に対しても、またアミノ末端もしくはカルボキシル末端に対してもいずれにも
制限されない。非常に疎水性であるペプチド、および６残基より少ない残基は、
一般に、模倣タンパク質に対して結合する抗体を惹起する効果がない；より長い
可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含むペプチドは、通常、効果的である。Ｓ
ｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出、６６１頁を参照のこと。例えば、これらのガイドラ
インに従って設計された１８〜２０個のペプチド（インフルエンザウイルス赤血
球凝集ＨＡ１ポリペプチドペプチド鎖の配列の７５％を覆う８〜３９残基を含む
）は、ＨＡ１タンパク質または未処理のウイルスと反応した抗体を惹起した；そ
してＭｕＬＶポリメラーゼ由来の１２／１２ペプチドおよび狂犬病糖タンパク質
由来の１８／１８ペプチドは、各々のタンパク質を凝結させた抗体を惹起した。
【０１５１】
本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４個、少なく
とも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、
少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少
なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少
なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、そ
して最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。好ましいポ
リペプチド（免疫原性エピトープあるいは抗原性エピトープを含む）は、少なく
とも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６
５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基長である
。さらなる非排他的な好ましい抗原性エピトープは、本明細書で開示された抗原
性エピトープ、およびそれらの一部を含む。抗原性エピトープは、例えば、この
エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するた
めに有用である。好ましい抗原性エピトープは、本明細書に開示された抗原性エ
ピトープ、および２つ、３つ、４つ、５つ以上のこれらの抗原性エピトープの任
意の組み合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイの標的分子として
使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（
１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６
（１９８３）を参照のこと）。
とも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、
少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少
なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少
なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、そ
して最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。好ましいポ
リペプチド（免疫原性エピトープあるいは抗原性エピトープを含む）は、少なく
とも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６
５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基長である
。さらなる非排他的な好ましい抗原性エピトープは、本明細書で開示された抗原
性エピトープ、およびそれらの一部を含む。抗原性エピトープは、例えば、この
エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するた
めに有用である。好ましい抗原性エピトープは、本明細書に開示された抗原性エ
ピトープ、および２つ、３つ、４つ、５つ以上のこれらの抗原性エピトープの任
意の組み合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイの標的分子として
使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（
１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６
（１９８３）を参照のこと）。
【０１５２】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体またはそのフラグメントを生成するために使
用され得る抗原性ポリペプチドの非限定例としては、以下が挙げられる：配列番
号２における約１７〜約２６個のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２
における約５６〜約７２個のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２にお
ける約１０３〜約１２０個のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２にお
ける約１３６〜約１４９個のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号
２における約１５５〜約１７１個のアミノ酸残基を含むポリペプチド。上記に示
されるように、発明者等は、上記のポリペプチドフラグメントがＴ１Ｒ様ＩＩタ
ンパク質の抗原性領域であることを決定した。
用され得る抗原性ポリペプチドの非限定例としては、以下が挙げられる：配列番
号２における約１７〜約２６個のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２
における約５６〜約７２個のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２にお
ける約１０３〜約１２０個のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２にお
ける約１３６〜約１４９個のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号
２における約１５５〜約１７１個のアミノ酸残基を含むポリペプチド。上記に示
されるように、発明者等は、上記のポリペプチドフラグメントがＴ１Ｒ様ＩＩタ
ンパク質の抗原性領域であることを決定した。
【０１５３】
このため、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、抗
体（モノクローナル抗体、この抗体は、本発明のポリペプチドに対して特異的に
結合する）を惹起するために有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチド
で免疫化されたドナー由来の脾臓細胞の融合によって得られた高比率のハイブリ
ドーマは、一般に、ネイティブなタンパク質と反応する抗体を分泌する。Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅら、前出、６６３頁。抗原性エピトープ保有ペプチドまたはポリペ
プチドによって惹起される抗原は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、
そして異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後のプロセシングを起こすタンパク
質前駆体の種々の領域の運命を追跡するために用いられ得る。このペプチドおよ
び抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的または定量的アッ
セイにおいて（例えば、免疫沈降アッセイにおけるより大きなペプチドに結合ま
たは置換し得るさらに短いペプチド（例えば、約９個のアミノ酸）が示さている
ため、競合アッセイにおいて）使用され得る。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．
ら，Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）７７７頁を参照のこと。本発
明の抗ペプチド抗体はまた、例えば、当該分野で周知の方法を用いる吸着クロマ
トグラフィーによる模倣タンパク質の精製のために有用である。
体（モノクローナル抗体、この抗体は、本発明のポリペプチドに対して特異的に
結合する）を惹起するために有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチド
で免疫化されたドナー由来の脾臓細胞の融合によって得られた高比率のハイブリ
ドーマは、一般に、ネイティブなタンパク質と反応する抗体を分泌する。Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅら、前出、６６３頁。抗原性エピトープ保有ペプチドまたはポリペ
プチドによって惹起される抗原は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、
そして異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後のプロセシングを起こすタンパク
質前駆体の種々の領域の運命を追跡するために用いられ得る。このペプチドおよ
び抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的または定量的アッ
セイにおいて（例えば、免疫沈降アッセイにおけるより大きなペプチドに結合ま
たは置換し得るさらに短いペプチド（例えば、約９個のアミノ酸）が示さている
ため、競合アッセイにおいて）使用され得る。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．
ら，Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）７７７頁を参照のこと。本発
明の抗ペプチド抗体はまた、例えば、当該分野で周知の方法を用いる吸着クロマ
トグラフィーによる模倣タンパク質の精製のために有用である。
【０１５４】
同様に、免疫原性のエピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に
従って抗体を誘導するために使用され得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（
前出）；Ｗｉｌｓｏｎら（前出）；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好まし
い免疫原性エピトープは、本明細書で開示された免疫原性エピトープ、および２
つ、３つ、４つ、５つ以上のこれらの免疫原性エピトープの任意の組み合わせを
含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク
質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対
する抗体応答を惹起するために提示され得るか、または、そのポリペプチドが十
分に長い場合では（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドはキャリア
なしで提示され得る。しかし、８〜１０程度のわずかなアミノ酸を含む免疫原性
エピトープが、変性されたポリペプチドの直鎖エピトープに（少なくとも）結合
し得る抗体を惹起するのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロ
ッティングにおいて）。
従って抗体を誘導するために使用され得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（
前出）；Ｗｉｌｓｏｎら（前出）；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好まし
い免疫原性エピトープは、本明細書で開示された免疫原性エピトープ、および２
つ、３つ、４つ、５つ以上のこれらの免疫原性エピトープの任意の組み合わせを
含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク
質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対
する抗体応答を惹起するために提示され得るか、または、そのポリペプチドが十
分に長い場合では（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドはキャリア
なしで提示され得る。しかし、８〜１０程度のわずかなアミノ酸を含む免疫原性
エピトープが、変性されたポリペプチドの直鎖エピトープに（少なくとも）結合
し得る抗体を惹起するのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロ
ッティングにおいて）。
【０１５５】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を
用いて組み換え手段を含むペプチドまたはポリペプチドを生成するための任意の
従来手段によって生成され得る。（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）、さらに米国
特許第４，６３１，２１１号において記載される、を参照のこと）。例えば、短
いエピトープ保有アミノ酸配列は、組換え生成および組換え精製中、ならびに抗
ペプチド抗体を生成するための免疫化中にキャリアとして働く、より大きなポリ
ペプチドと融合され得る。エピトープ保有ペプチドはまた、公知の化学合成方法
を用いて合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチド（例えば
、少なくとも４週間で調製され、そして特徴付けられた（ＥＬＩＳＡ型結合研究
によって）ＨＡ１ポリペプチドの単一アミノ酸改変体のセグメントを提示する１
０〜２０ｍｇの２４８種の１３残基ペプチド）の合成のための単純方法を記載し
ている。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「同時複数ペプチド合
成（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｒ
ｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ））」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６
）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々の
ペプチドの固相合成のための個々のレジンは、溶媒浸透性パケット（ｓｏｌｖｅ
ｎｔ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐａｃｋｅｔ）中に含まれ、これは、固相方法に関
連した多数の同一反復工程の最適な使用を可能とする。完全な説明書手順は、同
時に行われる５００〜１００以上の合成を可能にする。Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前
出、５１３４頁。
用いて組み換え手段を含むペプチドまたはポリペプチドを生成するための任意の
従来手段によって生成され得る。（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）、さらに米国
特許第４，６３１，２１１号において記載される、を参照のこと）。例えば、短
いエピトープ保有アミノ酸配列は、組換え生成および組換え精製中、ならびに抗
ペプチド抗体を生成するための免疫化中にキャリアとして働く、より大きなポリ
ペプチドと融合され得る。エピトープ保有ペプチドはまた、公知の化学合成方法
を用いて合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチド（例えば
、少なくとも４週間で調製され、そして特徴付けられた（ＥＬＩＳＡ型結合研究
によって）ＨＡ１ポリペプチドの単一アミノ酸改変体のセグメントを提示する１
０〜２０ｍｇの２４８種の１３残基ペプチド）の合成のための単純方法を記載し
ている。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「同時複数ペプチド合
成（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｒ
ｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ））」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６
）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々の
ペプチドの固相合成のための個々のレジンは、溶媒浸透性パケット（ｓｏｌｖｅ
ｎｔ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐａｃｋｅｔ）中に含まれ、これは、固相方法に関
連した多数の同一反復工程の最適な使用を可能とする。完全な説明書手順は、同
時に行われる５００〜１００以上の合成を可能にする。Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前
出、５１３４頁。
【０１５６】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。この方法としては、インビボ免疫、インビトロ
免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。
例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉｔｔ
ｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５）を
参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し
得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリ
ンペットヘモシアニン（ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）または破傷風トキソ
イド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイ
ン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その
一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を
用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は
、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エ
マルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイン
トアジュバントもしくは免疫応答を刺激すると公知の任意の他のアジュバントを
含む）の腹腔内注射ならびに／または皮内注射により免疫される。いくつかのブ
ースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２
週間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離
のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来
の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野
で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出
による）により上昇し得る。
を誘導するために使用され得る。この方法としては、インビボ免疫、インビトロ
免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。
例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉｔｔ
ｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５）を
参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し
得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリ
ンペットヘモシアニン（ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）または破傷風トキソ
イド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイ
ン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その
一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を
用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は
、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エ
マルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイン
トアジュバントもしくは免疫応答を刺激すると公知の任意の他のアジュバントを
含む）の腹腔内注射ならびに／または皮内注射により免疫される。いくつかのブ
ースター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２
週間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離
のペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来
の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野
で周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出
による）により上昇し得る。
【０１５７】
当業者に理解されるように、上記の本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチ
ドおよびそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常
ドメインの部分と融合され得、その結果、キメラポリペプチドを生じる。このよ
うな融合タンパク質は、精製を容易にし得、結果そしてインビボでの半減期を増
大させ得る。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメイ
ンおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメイ
ンからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰ ３９４，８２７；Ｔ
ｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８））。Ｉ
ｇＧ部分に起因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた
、単量体のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質またはタンパク質のフラグメント単
独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であり得る（Ｆｏｕｎ
ｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１
９９５））。
ドおよびそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常
ドメインの部分と融合され得、その結果、キメラポリペプチドを生じる。このよ
うな融合タンパク質は、精製を容易にし得、結果そしてインビボでの半減期を増
大させ得る。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメイ
ンおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメイ
ンからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰ ３９４，８２７；Ｔ
ｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８））。Ｉ
ｇＧ部分に起因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた
、単量体のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質またはタンパク質のフラグメント単
独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であり得る（Ｆｏｕｎ
ｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１
９９５））。
【０１５８】
本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＴ１Ｒ様
リガンドＩＩポリペプチド配列を含むこのタンパク質について提供する。
リガンドＩＩポリペプチド配列を含むこのタンパク質について提供する。
【０１５９】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは、単量体または多量体（すなわ
ち、二量体、三量体、四量体およびより高度の多量体）であり得る。従って、本
発明は、単量体および多量体の本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、そ
れらの調製物ならびにそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に関する
。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三量体また
は四量体である。さらなる実施形態では、本発明の多量体は、少なくとも二量体
、少なくとも三量体、または少なくとも四量体である。
ち、二量体、三量体、四量体およびより高度の多量体）であり得る。従って、本
発明は、単量体および多量体の本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、そ
れらの調製物ならびにそれらを含む組成物（好ましくは薬学的組成物）に関する
。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三量体また
は四量体である。さらなる実施形態では、本発明の多量体は、少なくとも二量体
、少なくとも三量体、または少なくとも四量体である。
【０１６０】
本発明によって含まれる多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本
明細書中で用いられる場合、用語ホモマーとは、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
タンパク質（本明細書中に記載されるようなＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質、
フラグメント、改変体、スプライス改変体および融合タンパク質を含む）のみを
含む多量体をいう。これらのホモマーは、同一または異なるポリペプチド配列を
有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を含み得る。特定の実施形態では、本発
明のホモマーは、同一のポリペプチド配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパ
ク質のみを含む多量体である。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、
異なるポリペプチド配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を含む多量体
である。特定の実施形態では、本発明の多量体は、ホモ二量体（例えば、同一ま
たは異なるポリペプチド配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を含む）
あるいはホモ三量体（例えば、同一および／または異なるポリペプチド配列を有
するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を含む）である。さらなる実施形態では、
本発明のホモマー性多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体ま
たは少なくともホモ四量体である。
明細書中で用いられる場合、用語ホモマーとは、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
タンパク質（本明細書中に記載されるようなＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質、
フラグメント、改変体、スプライス改変体および融合タンパク質を含む）のみを
含む多量体をいう。これらのホモマーは、同一または異なるポリペプチド配列を
有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を含み得る。特定の実施形態では、本発
明のホモマーは、同一のポリペプチド配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパ
ク質のみを含む多量体である。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、
異なるポリペプチド配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を含む多量体
である。特定の実施形態では、本発明の多量体は、ホモ二量体（例えば、同一ま
たは異なるポリペプチド配列を有するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を含む）
あるいはホモ三量体（例えば、同一および／または異なるポリペプチド配列を有
するＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を含む）である。さらなる実施形態では、
本発明のホモマー性多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体ま
たは少なくともホモ四量体である。
【０１６１】
本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩタンパク質に加えて異種タンパク質（すなわち、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺
伝子によってコードされるポリペプチド配列に対応しないポリペプチド配列のみ
を含むタンパク質）を含む多量体をいう。特定の実施形態では、本発明の多量体
は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態
では、本発明のヘテロマー性多量体は、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘ
テロ三量体または少なくともヘテロ四量体である。
ドＩＩタンパク質に加えて異種タンパク質（すなわち、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺
伝子によってコードされるポリペプチド配列に対応しないポリペプチド配列のみ
を含むタンパク質）を含む多量体をいう。特定の実施形態では、本発明の多量体
は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態
では、本発明のヘテロマー性多量体は、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘ
テロ三量体または少なくともヘテロ四量体である。
【０１６２】
本発明の多量体は、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合的な
結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接連結
され得る。従って、１つの実施形態では、本発明の多量体（例えば、ホモ二量体
またはホモ三量体など）は、本発明のタンパク質が溶液中で互いに接触する場合
に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロ多量体（例えば、ヘテロ三量
体またはヘテロ四量体など）は、本発明のタンパク質が、溶液中で本発明のポリ
ペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列
に対する抗体を含む）と接触する場合に形成される。他の実施形態では、本発明
の多量体は、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質との共有結合、および／
または本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質間での共有結合によって形成さ
れる。このような共有結合は、このタンパク質のポリペプチド配列（例えば、配
列番号２に示されたポリペプチド配列かまたは寄託されたｃＤＮＡプラスミドに
よってコードされたポリペプチドに含まれる）中に含まれる１つ以上のアミノ酸
残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存
在する）ポリペプチドにおいて相互作用するこのタンパク質のポリペプチド配列
内に存在するシステイン残基間での架橋している。別の例では、この共有結合は
、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は
、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含ま
れる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融合タ
ンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５
号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載される
ような）本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配
列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結
合した多量体を形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオプロテゲリン（ｏ
ｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある
（例えば、国際公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明
細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接連結
され得る。従って、１つの実施形態では、本発明の多量体（例えば、ホモ二量体
またはホモ三量体など）は、本発明のタンパク質が溶液中で互いに接触する場合
に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロ多量体（例えば、ヘテロ三量
体またはヘテロ四量体など）は、本発明のタンパク質が、溶液中で本発明のポリ
ペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列
に対する抗体を含む）と接触する場合に形成される。他の実施形態では、本発明
の多量体は、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質との共有結合、および／
または本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質間での共有結合によって形成さ
れる。このような共有結合は、このタンパク質のポリペプチド配列（例えば、配
列番号２に示されたポリペプチド配列かまたは寄託されたｃＤＮＡプラスミドに
よってコードされたポリペプチドに含まれる）中に含まれる１つ以上のアミノ酸
残基を含み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存
在する）ポリペプチドにおいて相互作用するこのタンパク質のポリペプチド配列
内に存在するシステイン残基間での架橋している。別の例では、この共有結合は
、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は
、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列において含ま
れる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は、本発明の融合タ
ンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５
号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細書中に記載される
ような）本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ Ｆｃ融合タンパク質に含まれる異種配
列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結
合した多量体を形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオプロテゲリン（ｏ
ｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある
（例えば、国際公開番号ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容はその全体が本明
細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１６３】
別の実施形態では、２つ以上の本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは
、ペプチドリンカーを通して連結される。例としては、米国特許第５，０７３，
６２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるそれらのペプチド
リンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられた本発明の複数のＴ
１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術
を用いて生成され得る。
、ペプチドリンカーを通して連結される。例としては、米国特許第５，０７３，
６２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるそれらのペプチド
リンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられた本発明の複数のＴ
１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術
を用いて生成され得る。
【０１６４】
本発明の多量体Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを調製するための別の方法
は、ロイシンジッパーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチ
ド配列に融合されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの使用を含む。ロイシン
ジッパードメインおよびイソロイシンジッパードメインは、そのドメインが見出
されるタンパク質の多量体形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパ
ーは元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈ
ｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以
来種々の異なるタンパク質において見出されている。とりわけ公知のロイシンジ
ッパーは、二量体形成または三量体形成をする、天然に存在するペプチドおよび
その誘導体である。本発明の可溶性多量体Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を生
成するために適切なロイシンジッパードメインの例は、本明細書によって参考と
して援用される国際出願公開番号 ＷＯ ９４／１０３０８に記載されるロイシ
ンジッパードメインである。溶液中で二量体形成または三量体形成をするペプチ
ドに融合された可溶性のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを含む組換え融合タ
ンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性多量体Ｔ１Ｒ
様リガンドＩＩは、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。
は、ロイシンジッパーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチ
ド配列に融合されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの使用を含む。ロイシン
ジッパードメインおよびイソロイシンジッパードメインは、そのドメインが見出
されるタンパク質の多量体形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパ
ーは元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈ
ｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以
来種々の異なるタンパク質において見出されている。とりわけ公知のロイシンジ
ッパーは、二量体形成または三量体形成をする、天然に存在するペプチドおよび
その誘導体である。本発明の可溶性多量体Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を生
成するために適切なロイシンジッパードメインの例は、本明細書によって参考と
して援用される国際出願公開番号 ＷＯ ９４／１０３０８に記載されるロイシ
ンジッパードメインである。溶液中で二量体形成または三量体形成をするペプチ
ドに融合された可溶性のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを含む組換え融合タ
ンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性多量体Ｔ１Ｒ
様リガンドＩＩは、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。
【０１６５】
別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩ融合タンパク質中に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列間の相
互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質の会合は
、本発明のＦｌａｇ（登録商標）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ融合タンパク質中に含ま
れる異種ポリペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によ
って会合する。
ＩＩ融合タンパク質中に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列間の相
互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質の会合は
、本発明のＦｌａｇ（登録商標）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ融合タンパク質中に含ま
れる異種ポリペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によ
って会合する。
【０１６６】
本発明の多量体は、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例えば
、本発明の多量体に含まれることが所望されるタンパク質は、当該分野で公知の
リンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋され得る（
例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８
，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明の多量体は、当該分野で公知の技術
を用いて生成されて、多量体に含まれることが所望されるこのタンパク質のポリ
ペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１つ以上の分子間架橋を形成し
得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のタンパク質は、このタンパ
ク質のポリペプチド配列のＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの
付加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１つ以上の
これらの改変されたポリペプチドを含む多量体を生成するために適用され得る（
例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８
，９２５号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明の多量体
中に含まれることが所望されるこのタンパク質の成分を含むリポソームを生成す
るために適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される
、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
、本発明の多量体に含まれることが所望されるタンパク質は、当該分野で公知の
リンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋され得る（
例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８
，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明の多量体は、当該分野で公知の技術
を用いて生成されて、多量体に含まれることが所望されるこのタンパク質のポリ
ペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１つ以上の分子間架橋を形成し
得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のタンパク質は、このタンパ
ク質のポリペプチド配列のＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの
付加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１つ以上の
これらの改変されたポリペプチドを含む多量体を生成するために適用され得る（
例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８
，９２５号を参照のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明の多量体
中に含まれることが所望されるこのタンパク質の成分を含むリポソームを生成す
るために適用され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される
、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１６７】
あるいは、本発明の多量体は、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて生成
され得る。１つの実施形態では、本発明の多量体に含まれるポリペプチドは、本
明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術を用い
て組換え的に生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用され
る、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では、本
発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に連
結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でこのポリペプチ
ドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連結
することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では、
本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、
膜貫通ドメインを含み、そして膜再構成技術によってリポソーム中に組み込まれ
得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体
が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
され得る。１つの実施形態では、本発明の多量体に含まれるポリペプチドは、本
明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技術を用い
て組換え的に生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用され
る、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では、本
発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列に連
結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でこのポリペプチ
ドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連結
することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では、
本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、
膜貫通ドメインを含み、そして膜再構成技術によってリポソーム中に組み込まれ
得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば、本明細書中にその全体
が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１６８】
「ポリペプチドおよびペプチド」におけるこの節で示した各文章の開示は、そ
の全体が、本明細書中において参考として本明細書によって援用される。
の全体が、本明細書中において参考として本明細書によって援用される。
【０１６９】
（融合ポリペプチド）
当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、本発明のポリペ
プチドは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、融合タンパク質はま
た、本発明のポリペプチドの特徴を改良するために操作され得る。例えば、本発
明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定
常ドメインまたはそれらの一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任意
の組合わせおよびそれらの一部と融合され得、キメラポリぺプチドを生じ得る。
これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そしてインビボにおいて半減期が増
大し得る。これは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺
乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなる
キメラタンパク質が示されている。例えば、ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａ
ｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこ
と。上皮の障壁を横切る抗原の免疫系に対して増強された送達は、ＩｇＧまたは
ＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結合パートナーへ結合された抗原（例えば、
インシュリン）について実証された（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４
および同ＷＯ９９／０４８１３を参照のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合
に起因するジスルフィド結合二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、
単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合お
よび中和においてより効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕ
ｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９５
）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（
例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグ（ｆｌａｇ）タグ）とし
て目的の遺伝子と組換えられて、発現されたポリペプチドの検出および精製を補
助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株
中で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅ
ｃｈｔ ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８
：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子はワクシニア組換えプラ
スミドにサブクローン化され、その結果、この遺伝子のオープンリーディングフ
レームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグへ翻訳時に融合される
。このタグは、融合タンパク質についてのマトリクス結合ドメインとしての役割
を果たす。組換えワクシニアウイルスを用いて感染された細胞からの抽出物は、
Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラム上へロードされ、そしてヒスチジンタ
グ化タンパク質は、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
プチドは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、融合タンパク質はま
た、本発明のポリペプチドの特徴を改良するために操作され得る。例えば、本発
明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定
常ドメインまたはそれらの一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任意
の組合わせおよびそれらの一部と融合され得、キメラポリぺプチドを生じ得る。
これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そしてインビボにおいて半減期が増
大し得る。これは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺
乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなる
キメラタンパク質が示されている。例えば、ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａ
ｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこ
と。上皮の障壁を横切る抗原の免疫系に対して増強された送達は、ＩｇＧまたは
ＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結合パートナーへ結合された抗原（例えば、
インシュリン）について実証された（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４
および同ＷＯ９９／０４８１３を参照のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合
に起因するジスルフィド結合二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、
単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合お
よび中和においてより効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕ
ｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９５
）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（
例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグ（ｆｌａｇ）タグ）とし
て目的の遺伝子と組換えられて、発現されたポリペプチドの検出および精製を補
助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株
中で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅ
ｃｈｔ ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８
：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子はワクシニア組換えプラ
スミドにサブクローン化され、その結果、この遺伝子のオープンリーディングフ
レームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグへ翻訳時に融合される
。このタグは、融合タンパク質についてのマトリクス結合ドメインとしての役割
を果たす。組換えワクシニアウイルスを用いて感染された細胞からの抽出物は、
Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラム上へロードされ、そしてヒスチジンタ
グ化タンパク質は、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１７０】
本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
方法を使用して、改変された活性を有するポリペプチド、ならびにこれらのポリ
ペプチドのＴ１Ｒ様リガンドＩＩアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る
。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同
第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，
４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ
ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏ
ｒｅｎｚｏおよびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３
０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々が本明細書によって
その全体が参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配
列番号１に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによって
コードされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る
。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、ポリヌ
クレオチド配列において変化を生じるように所望されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ分
子に２つ以上のＤＮＡセグメントをアセンブルすることを含む。別の実施形態に
おいて、本発明のポリヌクレオチドまたはそのコードされるポリペプチドは、組
換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチ
ド挿入または他の方法による、ランダム変異誘発に供されることによって改変さ
れ得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドの１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメン
トなどは、１つ以上の異種分子の、１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部
分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施形態において
、異種分子は、ＩＬ−１Ｒファミリーのメンバー（例えば、ＩＬ−１ＲＩ、ＩＬ
−１ＲＩＩ，およびｓＩＬ−１ＲＩＩ）である。
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
方法を使用して、改変された活性を有するポリペプチド、ならびにこれらのポリ
ペプチドのＴ１Ｒ様リガンドＩＩアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る
。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同
第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，
４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ
ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏ
ｒｅｎｚｏおよびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３
０８−１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々が本明細書によって
その全体が参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配
列番号１に対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによって
コードされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る
。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、ポリヌ
クレオチド配列において変化を生じるように所望されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ分
子に２つ以上のＤＮＡセグメントをアセンブルすることを含む。別の実施形態に
おいて、本発明のポリヌクレオチドまたはそのコードされるポリペプチドは、組
換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチ
ド挿入または他の方法による、ランダム変異誘発に供されることによって改変さ
れ得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドの１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメン
トなどは、１つ以上の異種分子の、１つ以上の成分、モチーフ、セクション、部
分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施形態において
、異種分子は、ＩＬ−１Ｒファミリーのメンバー（例えば、ＩＬ−１ＲＩ、ＩＬ
−１ＲＩＩ，およびｓＩＬ−１ＲＩＩ）である。
【０１７１】
（トランスジェニック動物）
本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、
ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー
）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、トランスジェニック動物を
作製するために用いられ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載される
かまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子治療プロトコルの一部と
して、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のために用いられる。
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、
ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー
）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、トランスジェニック動物を
作製するために用いられ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載される
かまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子治療プロトコルの一部と
して、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のために用いられる。
【０１７２】
当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明の核酸）の動
物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕｎｄｅｒ ｌ
ｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェクション（Ｐ
ａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４
０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐ
ｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞系へのレトロ
ウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚
盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌ
ｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーシ
ョン（Ｌｏ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３
））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）；胚性多能
性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞への
この幹細胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅ
ｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれらに限定されな
い。このような技術の総説については、本明細書中にその全体が参考として援用
される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ
．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。
物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕｎｄｅｒ ｌ
ｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェクション（Ｐ
ａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４
０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐ
ｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞系へのレトロ
ウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚
盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌ
ｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレクトロポレーシ
ョン（Ｌｏ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３
））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）；胚性多能
性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞への
この幹細胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅ
ｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれらに限定されな
い。このような技術の総説については、本明細書中にその全体が参考として援用
される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ
．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。
【０１７３】
さらに、この節に示された各文章の内容は、その全体が本明細書において参考
として援用される。
として援用される。
【０１７４】
さらに、当該分野で公知の技術を用いて、導入遺伝子（すなわち、本発明の核
酸）を動物に導入し得る（例えば、米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅ
ｃｃｈｉら、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｅｒｓ）；米国特許第５，６３１，１５３号（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉら、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍ
ｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓ
ｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｋ
ｉｎｇ Ｓａｍｅ）；米国特許第４，７３６，８６６号（Ｌｅｄｅｒら、Ｔｒａ
ｎｓｇｅｎｉｃ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ａｎｉｍａｌｓ）；および米国特許第４
，８７３，１９１号（Ｗａｎｇｎｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｙｇｏｔｅｓ）において記載されるこれらの技術；これら
の各々は、その全体が、本明細書によって参考として援用される）。
酸）を動物に導入し得る（例えば、米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅ
ｃｃｈｉら、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｅｒｓ）；米国特許第５，６３１，１５３号（Ｃ
ａｐｅｃｃｈｉら、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍ
ｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓ
ｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｋ
ｉｎｇ Ｓａｍｅ）；米国特許第４，７３６，８６６号（Ｌｅｄｅｒら、Ｔｒａ
ｎｓｇｅｎｉｃ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ａｎｉｍａｌｓ）；および米国特許第４
，８７３，１９１号（Ｗａｎｇｎｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｙｇｏｔｅｓ）において記載されるこれらの技術；これら
の各々は、その全体が、本明細書によって参考として援用される）。
【０１７５】
当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）これらの各々は
、その全体が本明細書において参考として援用される）。
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７）これらの各々は
、その全体が本明細書において参考として援用される）。
【０１７６】
本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、お
よびいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する動
物（すなわち、モザイク動物またはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、単
一の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭（ｈｅａｄ−ｔｏ−
ｈｅａｄ）タンデム型または頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）タンデム型）
のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子はまた、例えば、
Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定の細胞型に選択
的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異的活性化に必要
とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明
らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染色体部位に組み
込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手短に言えば、こ
のような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ないくつかのヌクレ
オチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介して内在性遺伝
子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機能を破壊するこ
とを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に選択的に導入さ
れ得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１
０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型においてのみ内在性遺伝
子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされる調節配列は、
目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。この節に
示された各文章の内容は、その全体が、本明細書において参考として援用される
。
よびいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する動
物（すなわち、モザイク動物またはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、単
一の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭（ｈｅａｄ−ｔｏ−
ｈｅａｄ）タンデム型または頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）タンデム型）
のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子はまた、例えば、
Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定の細胞型に選択
的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異的活性化に必要
とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明
らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染色体部位に組み
込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手短に言えば、こ
のような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ないくつかのヌクレ
オチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介して内在性遺伝
子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機能を破壊するこ
とを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に選択的に導入さ
れ得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１
０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型においてのみ内在性遺伝
子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされる調節配列は、
目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかである。この節に
示された各文章の内容は、その全体が、本明細書において参考として援用される
。
【０１７７】
一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
【０１７８】
一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配ストラテジーの例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立
するための１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺
伝子の相加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合ト
ランスジェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤ
ＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組
み込み部位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニッ
ク動物の交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々の
ホモ接合系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウン
ド上に導入遺伝子を配置するための交配。
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配ストラテジーの例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立
するための１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺
伝子の相加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合ト
ランスジェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤ
ＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組
み込み部位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニッ
ク動物の交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々の
ホモ接合系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウン
ド上に導入遺伝子を配置するための交配。
【０１７９】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩポリペプチドの生物学的機能の詳述、異常なＴ１Ｒ様リガンドＩＩ発現に
関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのような状態および／また
は障害を寛解させる場合に有効な化合物のスクリーニングにおいて有用な動物モ
デル系を含むが、それらに限定されない用途を有する。
ドＩＩポリペプチドの生物学的機能の詳述、異常なＴ１Ｒ様リガンドＩＩ発現に
関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのような状態および／また
は障害を寛解させる場合に有効な化合物のスクリーニングにおいて有用な動物モ
デル系を含むが、それらに限定されない用途を有する。
【０１８０】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のタンパク質を発現するために遺
伝子操作される細胞、あるいは本発明のタンパク質を発現しないように遺伝子操
作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。このよ
うな細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナーから
入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細
胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞を、
例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入遺伝
子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プラス
ミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームな
どの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポリペ
プチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／または
本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、組換
えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチドの
コード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたはプロ
モーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現および
好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分
泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ全身
的に導入し得る。
伝子操作される細胞、あるいは本発明のタンパク質を発現しないように遺伝子操
作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。このよ
うな細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナーから
入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂肪細
胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞を、
例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入遺伝
子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プラス
ミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームな
どの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポリペ
プチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／または
本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、組換
えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチドの
コード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたはプロ
モーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現および
好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましくは分
泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ全身
的に導入し得る。
【０１８１】
あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０１８２】
投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。
【０１８３】
（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体および抗体療法）
さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の、ポ
リペプチド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号２の改変体、および／
またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（Ｔ
ＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは
、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわ
ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫
グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、
ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブク
ラスであり得る。
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の、ポ
リペプチド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号２の改変体、および／
またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（Ｔ
ＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは
、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわ
ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫
グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、
ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブク
ラスであり得る。
【０１８４】
最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンの
アミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまた
は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内
因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体（下に記載のように、
および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９
８号において記載のような）を含む。
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンの
アミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまた
は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内
因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体（下に記載のように、
および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９
８号において記載のような）を含む。
【０１８５】
本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１８６】
本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、また
は表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープ
またはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本
発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチド
の排除を可能にする抗体を含む。
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、また
は表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープ
またはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本
発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチド
の排除を可能にする抗体を含む。
【０１８７】
本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オーソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた
、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク
質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに
対応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９
５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６
５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知
の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算されるように）を有する
ポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態にお
いて、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原
性または免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性お
よび／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本
発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードさ
れるポリペプチドを結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、
本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化さ
れ得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、
５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、
５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、
５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、
５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未
満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０− １２ Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満
、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数
すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オーソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた
、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク
質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに
対応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９
５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６
５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知
の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算されるように）を有する
ポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態にお
いて、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原
性または免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性お
よび／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本
発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードさ
れるポリペプチドを結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、
本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化さ
れ得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、
５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、
５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、
５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、
５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未
満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０− １２ Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満
、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数
すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。
【０１８８】
本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。
【０１８９】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続いてウェスタンブロット分析（例えば、本明細書中に記載されるような）に
よってその基質を検出することにより、決定され得る。特定の実施形態において
、この抗体の非存在下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少
なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少
なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０
％阻害する抗体が提供される。
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続いてウェスタンブロット分析（例えば、本明細書中に記載されるような）に
よってその基質を検出することにより、決定され得る。特定の実施形態において
、この抗体の非存在下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少
なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少
なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０
％阻害する抗体が提供される。
【０１９０】
本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
いレセプター特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し
、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結
合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合す
ることを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体
を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例
えば、レセプターの二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性
化の生物学的活性化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性
化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物
学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆ア
ゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法
を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第
５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９
８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６
８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４
）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８
（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９
７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１
９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１
２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４
）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（
９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（これらは、全て、その全体が参考とし
て本明細書中で援用される）を参照のこと。
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
いレセプター特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し
、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結
合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合す
ることを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体
を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例
えば、レセプターの二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性
化の生物学的活性化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性
化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物
学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆ア
ゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法
を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第
５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９
８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６
８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４
）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８
（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９
７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１
９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１
２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４
）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（
９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（これらは、全て、その全体が参考とし
て本明細書中で援用される）を参照のこと。
【０１９１】
本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。
【０１９２】
本明細書中でさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他
の組成物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、Ｎ末端
でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、あるいはポ
リペプチドまたは他の組成物へ化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む
）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な
分子および異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェク
ター分子へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／
０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３
１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
の組成物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、Ｎ末端
でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、あるいはポ
リペプチドまたは他の組成物へ化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む
）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な
分子および異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェク
ター分子へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／
０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３
１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１９３】
本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１９４】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメッ
ト−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのよう
な潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このよう
なアジュバントはまた、当該分野で周知である。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメッ
ト−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのよう
な潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このよう
なアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１９５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、それが生成され
る方法のことではない。
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、それが生成され
る方法のことではない。
【０１９６】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される（例え
ば、実施例１６）。非限定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチ
ドまたはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応
答が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）
と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の
技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株
ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択お
よびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチド
に結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッ
セイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ
）が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することによって、産
生され得る。
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される（例え
ば、実施例１６）。非限定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチ
ドまたはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応
答が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）
と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の
技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株
ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択お
よびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチド
に結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッ
セイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ
）が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することによって、産
生され得る。
【０１９７】
従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。
【０１９８】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１９９】
例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリ
ーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウス）か
ら発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結
合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定さ
れ得る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉
された抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的
には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク
質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化さ
れたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合
ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。
本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例とし
ては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅ
ｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５
８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；
Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９
１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０
４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９
８２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同
第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７
号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，
０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５
１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第
５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明
細書中でその全体が参考として援用される）。
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリ
ーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウス）か
ら発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結
合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定さ
れ得る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉
された抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的
には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク
質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化さ
れたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合
ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。
本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例とし
ては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅ
ｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５
８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；
Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９
１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０
４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９
８２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同
第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７
号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，
０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５
１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第
５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明
細書中でその全体が参考として援用される）。
【０２００】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、本明細書
中に詳細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および
細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’
およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当
該分野で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される
：ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、
ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全
体が参考として援用される）。
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、本明細書
中に詳細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および
細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’
およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当
該分野で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される
：ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、
ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全
体が参考として援用される）。
【０２０１】
単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号
を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）
。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒ
ト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合
する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内
のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるため（好ましくは改善させるた
めに）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらフレームワークの
置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフ
レームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用
のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定す
るための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０
８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を
参照のこと（これらはそれらの全体が参考として本明細書中に援用される）。）
抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例え
ば、ＣＲ−移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９
６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第
５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフ
ェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５
１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）
；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、および
チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，
５６５，３３２号）。
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号
を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）
。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒ
ト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合
する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内
のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるため（好ましくは改善させるた
めに）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらフレームワークの
置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフ
レームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用
のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定す
るための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０
８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を
参照のこと（これらはそれらの全体が参考として本明細書中に援用される）。）
抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例え
ば、ＣＲ−移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９
６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第
５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフ
ェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５
１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）
；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、および
チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，
５６５，３３２号）。
【０２０２】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、お
よびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書
中に援用される）もまた参照のこと。
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、お
よびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書
中に援用される）もまた参照のこと。
【０２０３】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る
。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ
細胞分化の間に再構成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異
を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体
、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産
生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびに
そのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０
９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，
４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同
第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６
号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，
７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆ
ｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の
ような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト
抗体を提供することに従事し得る。
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る
。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ
細胞分化の間に再構成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異
を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体
、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産
生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびに
そのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０
９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，
４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同
第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６
号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，
７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆ
ｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の
ような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト
抗体を提供することに従事し得る。
【０２０４】
選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０２０５】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競
合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
に結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競
合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
に結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
【０２０６】
本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、本明細書中に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチド
と特異的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドを含む。
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、本明細書中に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチド
と特異的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドを含む。
【０２０７】
ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
【０２０８】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０２０９】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
【０２１０】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０２１１】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。本明細書中に記載されるように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に
由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリ
ンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。本明細書中に記載されるように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に
由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリ
ンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０２１２】
あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０２１３】
本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によっ
て、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産
生され得る。
て、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産
生され得る。
【０２１４】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
【０２１５】
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、本明細書中に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿
主細胞中に同時発現され得る。
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、本明細書中に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿
主細胞中に同時発現され得る。
【０２１６】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要即時性初期（ｍａ
ｊｏｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメン
トのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（Ｃ
ＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃ
ｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要即時性初期（ｍａ
ｊｏｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメン
トのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（Ｃ
ＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃ
ｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０２１７】
細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍ
ｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１
９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９
（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させる
ために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そし
て溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着お
よび結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され
得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は
、ＧＳＴ部分から放出され得る。
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍ
ｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１
９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９
（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させる
ために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そし
て溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着お
よび結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され
得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は
、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０２１８】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２１９】
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２２０】
さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。
【０２２１】
組換えタンパク質の長期の高収率の産生のために、安定した発現が好ましい。
例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起
点を含む発現ベクターの使用よりも、むしろ宿主細胞は、適切な発現制御エレメ
ント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリ
アデニル化部位など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転
換され得る。外因性ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、濃縮された培地
中で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に切り換えられる。組換えプラスミ
ド中の選択マーカーは、選択への耐性を与え、そして細胞がプラスミドをそれら
の染色体に安定に組み込むことを可能とし、そして増殖し、次いで細胞株にクロ
ーニングおよび増殖され得る病巣を形成する。この方法を用いて、抗体分子を発
現する細胞株を有利に操作し得る。このような操作された細胞株は、抗体分子と
直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において
特に有用であり得る。
例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起
点を含む発現ベクターの使用よりも、むしろ宿主細胞は、適切な発現制御エレメ
ント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリ
アデニル化部位など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転
換され得る。外因性ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、濃縮された培地
中で１〜２日間増殖され得、次いで選択培地に切り換えられる。組換えプラスミ
ド中の選択マーカーは、選択への耐性を与え、そして細胞がプラスミドをそれら
の染色体に安定に組み込むことを可能とし、そして増殖し、次いで細胞株にクロ
ーニングおよび増殖され得る病巣を形成する。この方法を用いて、抗体分子を発
現する細胞株を有利に操作し得る。このような操作された細胞株は、抗体分子と
直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において
特に有用であり得る。
【０２２２】
多くの選択系が使用され得、それらには、それぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−
細胞、またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポ
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ
およびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
４８：２０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））遺伝子が挙げられる
が、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の
基礎として使用され得る：メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇ
ｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；
Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５
２７（１９８１））；ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇ
ａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：
２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ
（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷ
ｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅ
ｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５
９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３
２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月，Ｔ
ＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）；ならびにハイグロマイシンへ
の耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１
９８４））。当該分野で一般に公知である組換えＤＮＡ技術の方法は、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇ
ａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、
これらはその全体が本明細書において参考として援用される。
細胞、またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポ
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ
およびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
４８：２０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））遺伝子が挙げられる
が、これらに限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の
基礎として使用され得る：メトトレキサートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇ
ｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；
Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５
２７（１９８１））；ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇ
ａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：
２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ
（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷ
ｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅ
ｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５
９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３
２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月，Ｔ
ＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５）；ならびにハイグロマイシンへ
の耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１
９８４））。当該分野で一般に公知である組換えＤＮＡ技術の方法は、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇ
ａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、
これらはその全体が本明細書において参考として援用される。
【０２２３】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加され得る（総説について
は、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，第３巻
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７を参照のこと）
）。抗体を発現するベクター系においてマーカーが増幅できる場合、宿主細胞の
培養液中に存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの
数を増加する。この増幅された領域が抗体遺伝子と結合するため、この抗体の産
生もまた、増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５
７（１９８３））。
は、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ
ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，第３巻
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７を参照のこと）
）。抗体を発現するベクター系においてマーカーが増幅できる場合、宿主細胞の
培養液中に存在するインヒビターのレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの
数を増加する。この増幅された領域が抗体遺伝子と結合するため、この抗体の産
生もまた、増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５
７（１９８３））。
【０２２４】
その宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコ
ードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベク
ター）で同時トランスフェクトされ得る。この２つのベクターは、重鎖および軽
鎖のポリペプチドの等しい発現を可能とする同一の選択マーカーを含み得る。あ
るいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの両方をコードし、発現し得る単一のベ
クターが使用され得る。このような状況において、この軽鎖は、過剰の有毒な遊
離重鎖を避けるために、重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ
、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽
鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
ードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベク
ター）で同時トランスフェクトされ得る。この２つのベクターは、重鎖および軽
鎖のポリペプチドの等しい発現を可能とする同一の選択マーカーを含み得る。あ
るいは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの両方をコードし、発現し得る単一のベ
クターが使用され得る。このような状況において、この軽鎖は、過剰の有毒な遊
離重鎖を避けるために、重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ
、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽
鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０２２５】
一旦、本発明の抗体分子が、動物、化学合成、または組換え発現によって産生
されると、この抗体分子は、免疫グロブリン分子の精製についての当該分野で公
知の任意の方法によって（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティー（特にタンパク質Ａの後の特異的抗原へのア
フィニティーによる）クロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグ
ラフィー）、遠心分離、差示的溶解度によって、またはタンパク質の精製につい
ての他の任意の標準的な技術によって）精製され得る。さらに、本発明の抗体ま
たはそのフラグメントは、精製が容易になるように、本明細書に記載されている
か、そうでなければ当該分野で公知の異種ポリペプチド配列を融合し得る。
されると、この抗体分子は、免疫グロブリン分子の精製についての当該分野で公
知の任意の方法によって（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティー（特にタンパク質Ａの後の特異的抗原へのア
フィニティーによる）クロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグ
ラフィー）、遠心分離、差示的溶解度によって、またはタンパク質の精製につい
ての他の任意の標準的な技術によって）精製され得る。さらに、本発明の抗体ま
たはそのフラグメントは、精製が容易になるように、本明細書に記載されている
か、そうでなければ当該分野で公知の異種ポリペプチド配列を融合し得る。
【０２２６】
本発明は、融合タンパク質を作製するために、本発明のポリペプチド（または
その一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸のポリペプチド）と
組換え的に融合したか、あるいは化学的に結合（共有結合および非共有結合の両
方を含む）した抗体を含む。この融合は、必ずしも直接的である必要はないが、
リンカー配列を介して起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（または
その一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸のポリペプチド）以
外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体を用いて、インビトロまたはインビ
ボのいずれかで、特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に、本発明のポリペ
プチドを、融合させるかまたは結合させることによって、本発明のポリペプチド
を特定の細胞型に標的化し得る。本発明のポリペプチドに融合されたかまたは結
合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用してインビトロでのイムノア
ッセイおよび精製方法にて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出および
ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／２１２３２；ＥＰ ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ
ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５
，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２
（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２
（１９９１）（これらは、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
その一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸のポリペプチド）と
組換え的に融合したか、あるいは化学的に結合（共有結合および非共有結合の両
方を含む）した抗体を含む。この融合は、必ずしも直接的である必要はないが、
リンカー配列を介して起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（または
その一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５
０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸のポリペプチド）以
外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体を用いて、インビトロまたはインビ
ボのいずれかで、特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に、本発明のポリペ
プチドを、融合させるかまたは結合させることによって、本発明のポリペプチド
を特定の細胞型に標的化し得る。本発明のポリペプチドに融合されたかまたは結
合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用してインビトロでのイムノア
ッセイおよび精製方法にて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出および
ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／２１２３２；ＥＰ ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａ
ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５
，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２
（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２
（１９９１）（これらは、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０２２７】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合さ
れた本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチド
は、抗体のＦｃ領域、あるいはその一部に融合または結合され得る。本発明のポ
リペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、
ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそれらのドメイン全体または
その部分の任意の組合せを含み得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分
に融合または結合し、多量体を形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドと融
合したＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る
。より高次な多量体形態は、このポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融
合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または
結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，
３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同
第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６
号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ ９６／０
４３８８；ＷＯ ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；
Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）
；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９；１
１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、その全体が参考として
援用される）を参照のこと。
れた本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチド
は、抗体のＦｃ領域、あるいはその一部に融合または結合され得る。本発明のポ
リペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、
ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそれらのドメイン全体または
その部分の任意の組合せを含み得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体部分
に融合または結合し、多量体を形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドと融
合したＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る
。より高次な多量体形態は、このポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融
合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または
結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，
３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同
第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６
号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ ９６／０
４３８８；ＷＯ ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；
Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）
；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９；１
１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、その全体が参考として
援用される）を参照のこと。
【０２２８】
本明細書において、上記で議論されたように、配列番号２のポリペプチド、ポ
リペプチドフラグメント、または改変体に対応するポリペプチドは、上記の抗体
部分と融合または結合され得、このポリペプチドのインビボの半減期を増加する
か、または当該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用される
。さらに、配列番号２に対応するポリペプチドは、精製を容易にするために、上
記の抗体部分に融合または結合され得る。１つの報告された実施例は、ヒトＣＤ
４ポリペプチドの第１の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖も
しくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。
（ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８
４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結した二量体構造（ＩｇＧに起因する
）を有する抗体に融合または結合した本発明のポリペプチドはまた、単量体分泌
タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子との結合および
中和においてより効率的であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合において
、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、
例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る。（ＥＰ Ａ ２３２，２６
２）。あるいは、融合タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分
の欠損は、好ましい。例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、このＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物の開発にお
いて、例えば、ヒトタンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴ
ニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のため
に、Ｆｃタンパク質と融合された。（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照
のこと）。
リペプチドフラグメント、または改変体に対応するポリペプチドは、上記の抗体
部分と融合または結合され得、このポリペプチドのインビボの半減期を増加する
か、または当該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用される
。さらに、配列番号２に対応するポリペプチドは、精製を容易にするために、上
記の抗体部分に融合または結合され得る。１つの報告された実施例は、ヒトＣＤ
４ポリペプチドの第１の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖も
しくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。
（ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８
４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結した二量体構造（ＩｇＧに起因する
）を有する抗体に融合または結合した本発明のポリペプチドはまた、単量体分泌
タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子との結合および
中和においてより効率的であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合において
、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、
例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る。（ＥＰ Ａ ２３２，２６
２）。あるいは、融合タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分
の欠損は、好ましい。例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、このＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物の開発にお
いて、例えば、ヒトタンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴ
ニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のため
に、Ｆｃタンパク質と融合された。（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照
のこと）。
【０２２９】
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、このマー
カーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．，９
２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）
において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それらの
多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘ
キサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他
のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピト
ープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９
８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
のような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、このマー
カーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．，９
２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）
において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それらの
多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘ
キサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他
のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピト
ープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９
８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３０】
本発明はさらに、診断剤、または治療剤に結合する抗体またはそのフラグメン
トを含む。この抗体は、例えば、臨床試験の手順の一部（例えば、所定の治療レ
ジメの有効性を決定するための）として、腫瘍の発生または進行をモニターする
ために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングす
ることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補
欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子射出
断層撮影法を使用する陽電子射出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げ
られる。この検出可能な物質は、当該分野で公知の技術を用いる、この抗体（ま
たはそのフラグメント）と直接的にか、または媒介物（例えば、当該分野で公知
のリンカーなど）を介する間接的にかのいずれかで、カップリングされ得るかま
たは決尾具され得る。本発明に従う診断薬として使用するための抗体に結合され
得る金属イオンとしては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこ
と。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ
；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよび
アビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロ
ン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロ
ロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリト
リンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質
の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；
適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または、９９ｍＴｃが挙
げられる。
トを含む。この抗体は、例えば、臨床試験の手順の一部（例えば、所定の治療レ
ジメの有効性を決定するための）として、腫瘍の発生または進行をモニターする
ために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングす
ることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補
欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子射出
断層撮影法を使用する陽電子射出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げ
られる。この検出可能な物質は、当該分野で公知の技術を用いる、この抗体（ま
たはそのフラグメント）と直接的にか、または媒介物（例えば、当該分野で公知
のリンカーなど）を介する間接的にかのいずれかで、カップリングされ得るかま
たは決尾具され得る。本発明に従う診断薬として使用するための抗体に結合され
得る金属イオンとしては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこ
と。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ
；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよび
アビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロ
ン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロ
ロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリト
リンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質
の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；
適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または、９９ｍＴｃが挙
げられる。
【０２３１】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制剤ま
たは細胞破壊剤）、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−エミッタ（例
えば、２１３Ｂｉ））のような治療的な部分と結合され得る。細胞毒または細胞
毒性の薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル、
サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマ
イシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、
ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシ
アントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ
、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイ
ン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシンならびにそれらのアナ
ログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メ
トトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−
フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チ
オエパ（ｔｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮ
Ｕ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓ
ｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン
（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロ
ジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（ａｎｔ
ｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、
およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アク
チノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（
ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビン
クリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
たは細胞破壊剤）、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−エミッタ（例
えば、２１３Ｂｉ））のような治療的な部分と結合され得る。細胞毒または細胞
毒性の薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル、
サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマ
イシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、
ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシ
アントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ
、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイ
ン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシンならびにそれらのアナ
ログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メ
トトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−
フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チ
オエパ（ｔｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮ
Ｕ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓ
ｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン
（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロ
ジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（ａｎｔ
ｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、
およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アク
チノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（
ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビン
クリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３２】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答の改変のために使用され得、この治療
剤または薬物部分は、古典的な化学治療剤に制限されると解釈されるべきではな
い。例えば、この薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質または
ポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因
子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来
増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシスの試薬（例えば、Ｔ
ＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９を参照
のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１を参照のこと）、
Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５
６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開番号ＷＯ９９／２３１０５
）、血栓剤または抗血管形成剤（例えば、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａ
ｔｉｎ）またはエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ））のようなタンパク質
；あるいは、生物学的応答改変剤（例えば、リンホカイン、インターロイキン−
１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキ
ン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−Ｃ
ＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子な
どが挙げられ得る。
剤または薬物部分は、古典的な化学治療剤に制限されると解釈されるべきではな
い。例えば、この薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質または
ポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因
子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来
増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシスの試薬（例えば、Ｔ
ＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９を参照
のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１を参照のこと）、
Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５
６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開番号ＷＯ９９／２３１０５
）、血栓剤または抗血管形成剤（例えば、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａ
ｔｉｎ）またはエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ））のようなタンパク質
；あるいは、生物学的応答改変剤（例えば、リンホカイン、インターロイキン−
１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキ
ン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−Ｃ
ＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子な
どが挙げられ得る。
【０２３３】
抗体はまた、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固体支持体に
付着され得る。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリル
アミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロリドまたはポリプロピレンが
挙げられるが、これらに限定されない。
付着され得る。このような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリル
アミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロリドまたはポリプロピレンが
挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃｎａｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）およびＴｈｏｒｐｅら、
「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃｎａｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）およびＴｈｏｒｐｅら、
「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２３５】
あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。
【０２３６】
単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。
【０２３７】
本発明の抗体は、細胞株の免疫表現型および生物学的サンプルに対して用いら
れ得る。本発明の遺伝子の翻訳産物は、細胞特異的なマーカーとしてか、あるい
は特定の細胞型の分化および／または変異の種々の段階で差別的に発現される細
胞のより特異的なマーカーとして有用であり得る。特定のエピトープ、またはエ
ピトープの組合せに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現す
る細胞集団のスクリーニングを可能とする。モノクローナル抗体を用いる種々の
技術を使用して、マーカー（単数または複数）を発現している細胞集団をスクリ
ーニングし得、そして種々の技術としては、抗体コート化磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に接着する抗体を用いる「パニ
ング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、およびフローサイトメトリー（例えば、米国特許第
５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，９６：７３７−
７４９（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。
れ得る。本発明の遺伝子の翻訳産物は、細胞特異的なマーカーとしてか、あるい
は特定の細胞型の分化および／または変異の種々の段階で差別的に発現される細
胞のより特異的なマーカーとして有用であり得る。特定のエピトープ、またはエ
ピトープの組合せに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現す
る細胞集団のスクリーニングを可能とする。モノクローナル抗体を用いる種々の
技術を使用して、マーカー（単数または複数）を発現している細胞集団をスクリ
ーニングし得、そして種々の技術としては、抗体コート化磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に接着する抗体を用いる「パニ
ング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、およびフローサイトメトリー（例えば、米国特許第
５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，９６：７３７−
７４９（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。
【０２３８】
これらの技術は、特定の細胞集団のスクリーニングを可能にする（例えば、血
液の悪性疾患（すなわち、急性白血病患者の最小残留疾患（ＭＲＤ））、および
対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を防ぐための移植における「非自己」細胞を見出
し得る）。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血中に見出され得るような、増
殖および／または分化の能力を有する造血幹細胞および前駆体細胞のスクリーニ
ングを可能にする。
液の悪性疾患（すなわち、急性白血病患者の最小残留疾患（ＭＲＤ））、および
対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を防ぐための移植における「非自己」細胞を見出
し得る）。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血中に見出され得るような、増
殖および／または分化の能力を有する造血幹細胞および前駆体細胞のスクリーニ
ングを可能にする。
【０２３９】
本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、以下のような
技術を用いる競合アッセイおよび非競合アッセイが挙げられるが、以下に限定さ
れない：少しだけ名称を挙げるとすれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノア
ッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッ
セイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝
集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プ
ロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッ
セイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的で
あり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参
考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的
な免疫アッセイが、本明細書中に簡潔に記載される（しかし、これらを限定する
ことを目的とする意図はない）。
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、以下のような
技術を用いる競合アッセイおよび非競合アッセイが挙げられるが、以下に限定さ
れない：少しだけ名称を挙げるとすれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノア
ッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッ
セイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝
集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プ
ロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッ
セイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的で
あり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参
考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的
な免疫アッセイが、本明細書中に簡潔に記載される（しかし、これらを限定する
ことを目的とする意図はない）。
【０２４０】
免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃にてインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／
またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間
以上４℃にてインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、
およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の
抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によ
り、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そし
てバックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セフ
ァロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認識
し得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃にてインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／
またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間
以上４℃にてインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、
およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の
抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によ
り、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そし
てバックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セフ
ァロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認識
し得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０２４１】
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に転写する工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱
脂粉乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中
で希釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄
緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質
（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるい
は放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合体化された二次抗体（一
次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程
、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工
程を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバッ
クグラウンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認識
し得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例え
ば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓ
ｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に転写する工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱
脂粉乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中
で希釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄
緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質
（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるい
は放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合体化された二次抗体（一
次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程
、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工
程を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバッ
クグラウンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認識
し得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例え
ば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓ
ｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０２４２】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原を用いてコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物
に結合体化された目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベ
ートする工程、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡに
おいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わ
り、検出可能な化合物に結合体化された第二の抗体（目的の抗体を認識する）が
、ウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、
抗体がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合体化
された第二の抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて
、添加され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得
るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーション
に関して、認識し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、
Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
ウェルをその抗原を用いてコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物
に結合体化された目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベ
ートする工程、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡに
おいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わ
り、検出可能な化合物に結合体化された第二の抗体（目的の抗体を認識する）が
、ウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、
抗体がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合体化
された第二の抗体が、コーティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて
、添加され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得
るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーション
に関して、認識し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、
Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０２４３】
抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した
抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的
の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含
む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキ
ャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合
はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増
量の非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ
）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した
抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的
の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含
む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキ
ャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合
はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増
量の非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ
）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２４４】
本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ま
しくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それら
のフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体（本明細
書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに
抗イディオタイプ抗体を含む）をコードする核酸が挙げられるがこれらに限定さ
れない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活
性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載する任意の１つ以上の疾
患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置するために使用さ
れ得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患
、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態
に関連した症状を緩和する工程を含むがこれに限定されない。本発明の抗体は、
当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容
可能な組成物中に提供され得る。
、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ま
しくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それら
のフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体（本明細
書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに
抗イディオタイプ抗体を含む）をコードする核酸が挙げられるがこれらに限定さ
れない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活
性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載する任意の１つ以上の疾
患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置するために使用さ
れ得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患
、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態
に関連した症状を緩和する工程を含むがこれに限定されない。本発明の抗体は、
当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容
可能な組成物中に提供され得る。
【０２４５】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的に
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）によるか、またはエフェク
ター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により
、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合する工程を含む。これら
のアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供さ
れる教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタ
リングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわ
かる。
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）によるか、またはエフェク
ター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により
、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合する工程を含む。これら
のアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供さ
れる教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタ
リングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわ
かる。
【０２４６】
本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２４７】
本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０２４８】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメ
ント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメン
ト、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性
としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１
０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０− ６ Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０− ９ Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０ −１１ Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ
、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍよ
り小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメ
ント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメン
ト、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性
としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１
０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０− ６ Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０− ９ Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０ −１１ Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ
、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍよ
り小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２４９】
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２５０】
（遺伝子治療）
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２５１】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２５２】
好ましい局面において、化合物はＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、抗体、
アンタゴニスト、アゴニスト、またはそのフラグメントもしくはその改変体をコ
ードする核酸配列を含有し、上記核酸配列は、適切な宿主において、Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリペプチド、抗体、またはそのフラグメントもしくはその改変体を
発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列は、このコード
領域に作動可能に連結したプロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性であ
るかまたは構成性であり、そして必要に応じて組織特異的である。別の特定の実
施形態においては、このコード配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所
望の部位での相同組換えを促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それに
よりこのコード核酸の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔ
ｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−
８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−
４３８（１９８９））。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体
であるか；あるいはこの核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコード
する配列またはそのフラグメントを含む。
アンタゴニスト、アゴニスト、またはそのフラグメントもしくはその改変体をコ
ードする核酸配列を含有し、上記核酸配列は、適切な宿主において、Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリペプチド、抗体、またはそのフラグメントもしくはその改変体を
発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列は、このコード
領域に作動可能に連結したプロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性であ
るかまたは構成性であり、そして必要に応じて組織特異的である。別の特定の実
施形態においては、このコード配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所
望の部位での相同組換えを促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それに
よりこのコード核酸の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔ
ｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−
８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−
４３８（１９８９））。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体
であるか；あるいはこの核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコード
する配列またはそのフラグメントを含む。
【０２５３】
核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝露される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビト
ロで核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。こ
れらの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝
子治療としてそれぞれ公知である。
ーに直接的に曝露される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビト
ロで核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。こ
れらの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝
子治療としてそれぞれ公知である。
【０２５４】
特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の
多数の方法のいずれかにより（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部
として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与することによってか（例え
ば、欠損性もしくは弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米
国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは
、裸のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、
遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質も
しくは細胞表面のレセプターでコーティングするか、またはトランスフェクトす
る試薬（リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプセル化）に
よってか、あるいは、それらを核に進入することが公知であるペプチドと結合さ
せて投与することによってか、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリ
ガンドとそれを結合させて投与することなどにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこ
と）（レセプターを特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る）
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする
。さらに別の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすること
により、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；
同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２
０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして相
同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅ
ｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ
３４２：４３５−４３８（１９８９））。
酸配列は発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の
多数の方法のいずれかにより（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部
として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与することによってか（例え
ば、欠損性もしくは弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米
国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは
、裸のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、
遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質も
しくは細胞表面のレセプターでコーティングするか、またはトランスフェクトす
る試薬（リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプセル化）に
よってか、あるいは、それらを核に進入することが公知であるペプチドと結合さ
せて投与することによってか、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリ
ガンドとそれを結合させて投与することなどにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこ
と）（レセプターを特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る）
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする
。さらに別の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすること
により、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；
同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２
０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして相
同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅ
ｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ
３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０２５５】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む
ウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得
る（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１
９９３）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノ
ムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要
な構成要素を含む。遺伝子治療において使用されるこのポリペプチドをコードす
る核酸配列は、一つ以上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺
伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂ
ｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これ
は、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子を造血性
幹細胞に送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出さ
れ得る。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考
文献は、以下である。：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：
６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４
７３（１９９４）；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓ
ｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａ
ｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）。
ウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得
る（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１
９９３）を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノ
ムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要
な構成要素を含む。遺伝子治療において使用されるこのポリペプチドをコードす
る核酸配列は、一つ以上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺
伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂ
ｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これ
は、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子を造血性
幹細胞に送達するための、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出さ
れ得る。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考
文献は、以下である。：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：
６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４
７３（１９９４）；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓ
ｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａ
ｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）。
【０２５６】
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利
点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ
ｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９
９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を示す。
Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４
）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクター
の使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔ
ｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９
９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実
施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利
点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ
ｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９
９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を示す。
Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４
）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクター
の使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔ
ｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９
９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実
施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２５７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用について提案
されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２
０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２
０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２５８】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を導入する工程を含む。通常、導入の方
法は、選択マーカーの細胞への導入を含む。次いで、細胞は、導入された遺伝子
を取り込みそして発現している細胞を単離するために選沢下に置かれる。それら
の細胞は次いで、患者に送達される。
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を導入する工程を含む。通常、導入の方
法は、選択マーカーの細胞への導入を含む。次いで、細胞は、導入された遺伝子
を取り込みそして発現している細胞を単離するために選沢下に置かれる。それら
の細胞は次いで、患者に送達される。
【０２５９】
この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない
：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染
、細胞融合、染色体媒介の遺伝子導入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒
介の遺伝子導入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入につい
ては、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒお
よびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３
）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９
９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８
５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機
能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞
への安定した導入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞により発現可
能であり、そして好ましくは、遺伝性であり、そしてその細胞の子孫により発現
可能である。ＣＤ３４＋細胞が特に好ましい。
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない
：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染
、細胞融合、染色体媒介の遺伝子導入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒
介の遺伝子導入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入につい
ては、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒお
よびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３
）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９
９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８
５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機
能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞
への安定した導入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞により発現可
能であり、そして好ましくは、遺伝性であり、そしてその細胞の子孫により発現
可能である。ＣＤ３４＋細胞が特に好ましい。
【０２６０】
得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、そして当業者により決定され得る。
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、そして当業者により決定され得る。
【０２６１】
遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮
細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；種
々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨
髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮
細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；種
々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨
髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２６２】
好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
己である。
【０２６３】
遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与さ
れる。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビト
ロで単離され得、そしてインビトロで保存され得る任意の幹細胞および／または
前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、Ｐ
ＣＴ公開番号 ＷＯ９４／０８５９８：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ
，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋ
ｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１
９８６）を参照のこと）。
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与さ
れる。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビト
ロで単離され得、そしてインビトロで保存され得る任意の幹細胞および／または
前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、Ｐ
ＣＴ公開番号 ＷＯ９４／０８５９８：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ
，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋ
ｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１
９８６）を参照のこと）。
【０２６４】
特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域
に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は
、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能である
。
に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は
、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能である
。
【０２６５】
（アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト））
特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩに含まれる配列またはその相補鎖に対応する核酸および／またはＡＴＣＣ寄
託番号９７６５５の寄託されたプラスミドに含まれるヌクレオチド配列に対応す
る核酸である。１つの実施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内
部で生成され、別の実施形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（
例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）お
よびＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照のこと）。アンチセ
ンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３
重らせんの形成を通して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば
、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄ
ｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃ
ａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察される。３重らせん形成は、例えば、
Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１
９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；お
よびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において
考察される。これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチ
ドの結合に基づく。
ＩＩに含まれる配列またはその相補鎖に対応する核酸および／またはＡＴＣＣ寄
託番号９７６５５の寄託されたプラスミドに含まれるヌクレオチド配列に対応す
る核酸である。１つの実施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内
部で生成され、別の実施形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（
例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）お
よびＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照のこと）。アンチセ
ンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３
重らせんの形成を通して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば
、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄ
ｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃ
ａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察される。３重らせん形成は、例えば、
Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１
９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；お
よびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において
考察される。これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチ
ドの結合に基づく。
【０２６６】
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。
【０２６７】
１つの実施形態において、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩアンチセンス核酸は
、外来の配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはそ
の一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このよう
なベクターは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩアンチセンス核酸をコードする配列を含む
。このようなベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し
得る限り、エピソームを保持し得るか、または染色体に組込まれ得る。このよう
なベクターは、当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され
得る。ベクターは、脊椎動物細胞において複製および発現のために使用される、
当該分野で公知のプラスミド、ウイルスなどであり得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
をコードする配列またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト
細胞において作用する、当該分野で公知の任意のプロモーターにより得る。この
ようなプロモーターは、誘導性または構成性であり得る。このようなプロモータ
ーは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ
、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの
３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２
：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−
１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅ
ｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、
これらに限定されない。
、外来の配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはそ
の一部が転写され、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このよう
なベクターは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩアンチセンス核酸をコードする配列を含む
。このようなベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し
得る限り、エピソームを保持し得るか、または染色体に組込まれ得る。このよう
なベクターは、当該分野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され
得る。ベクターは、脊椎動物細胞において複製および発現のために使用される、
当該分野で公知のプラスミド、ウイルスなどであり得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
をコードする配列またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト
細胞において作用する、当該分野で公知の任意のプロモーターにより得る。この
ようなプロモーターは、誘導性または構成性であり得る。このようなプロモータ
ーは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ
、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの
３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２
：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅ
ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−
１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅ
ｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２（１９８２））などが挙げられるが、
これらに限定されない。
【０２６８】
本発明のアンチセンス核酸は、少なくともＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子のＲＮ
Ａ転写物の一部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ま
しいが、必要ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相
補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な
二重鎖を形成する配列を意味し；従って、本発明の二本鎖Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
アンチセンス核酸の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、ま
たは三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度
およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズす
る核酸が長いほど、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩＲＮＡ配列とのより多くの塩基ミスマ
ッチを含み得、これは、安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み
得、そしてなお形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定する
ために標準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る
。
Ａ転写物の一部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ま
しいが、必要ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相
補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な
二重鎖を形成する配列を意味し；従って、本発明の二本鎖Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
アンチセンス核酸の場合において、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、ま
たは三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度
およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズす
る核酸が長いほど、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩＲＮＡ配列とのより多くの塩基ミスマ
ッチを含み得、これは、安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得る）を含み
得、そしてなお形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定する
ために標準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る
。
【０２６９】
メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（１９９
４）を参照のこと。従って、図１に示されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ配列の５’−
または３’−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは
、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。ｍ
ＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの
相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従っ
て使用され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩｍＲＮＡの５’−領域、３’−領域また
はコード領域にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アン
チセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好まし
くは６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面
において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくと
も１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレ
オチドである。
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（１９９
４）を参照のこと。従って、図１に示されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ配列の５’−
または３’−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは
、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。ｍ
ＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの
相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従っ
て使用され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩｍＲＮＡの５’−領域、３’−領域また
はコード領域にハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アン
チセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好まし
くは６〜約５０ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面
において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくと
も１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレ
オチドである。
【０２７０】
本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡま
たはそのキメラ混合物または誘導体または修飾バージョンであり得る。オリゴヌ
クレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されて、例えば、分
子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善し得る。オリゴヌクレオチドは
、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボで宿主細胞レセプター
を標的化するために）または細胞膜を横切る輸送を容易にするための薬剤（例え
ば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４．６４８−６５２（１９８７）
；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照
のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（
１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーションによって
誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９
５８−９７６（１９８８）を参照のこと）または挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉ
ｎｇ）薬剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９
８８）を参照のこと）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、
別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される架橋
剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断剤など）と結合体
化され得る。
たはそのキメラ混合物または誘導体または修飾バージョンであり得る。オリゴヌ
クレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されて、例えば、分
子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善し得る。オリゴヌクレオチドは
、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボで宿主細胞レセプター
を標的化するために）または細胞膜を横切る輸送を容易にするための薬剤（例え
ば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４．６４８−６５２（１９８７）
；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照
のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（
１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーションによって
誘発される切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９
５８−９７６（１９８８）を参照のこと）または挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉ
ｎｇ）薬剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９
８８）を参照のこと）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、
別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される架橋
剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断剤など）と結合体
化され得る。
【０２７１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含む群から選択されるがこれらに
限定されない、少なくとも１つの修飾塩基部分を含み得る：５−フルオロウラシ
ル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサ
ンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチ
ル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カ
ルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシ
ルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニ
ン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２
−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン
、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ
メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシ
カルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イ
ソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（
ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシト
シン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、
５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５
−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−
Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジア
ミノプリン。
限定されない、少なくとも１つの修飾塩基部分を含み得る：５−フルオロウラシ
ル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサ
ンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチ
ル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カ
ルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシ
ルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニ
ン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２
−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン
、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ
メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシ
カルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イ
ソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（
ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシト
シン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、
５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５
−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−
Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジア
ミノプリン。
【０２７２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビ
ノース、キシルロース、およびヘキソースから選択されるがこれらに限定されな
い、少なくとも１つの修飾された糖部分を含む。
ノース、キシルロース、およびヘキソースから選択されるがこれらに限定されな
い、少なくとも１つの修飾された糖部分を含む。
【０２７３】
なお別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート
、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、
およびホルムアセタールまたはそれらのアナログを含む群から選択されるがこれ
らに限定されない、少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。
オエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート
、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、
およびホルムアセタールまたはそれらのアナログを含む群から選択されるがこれ
らに限定されない、少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。
【０２７４】
なお別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマ
ー性オリゴヌクレオチドである。α−アノマー性オリゴヌクレオチドは、相補的
ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβユニットとは反
対に、その鎖は互いに平行に走る（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。そのオリゴヌクレオチドは
、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．
Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ
アナログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９
８７））である。
ー性オリゴヌクレオチドである。α−アノマー性オリゴヌクレオチドは、相補的
ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβユニットとは反
対に、その鎖は互いに平行に走る（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。そのオリゴヌクレオチドは
、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．
Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ
アナログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９
８７））である。
【０２７５】
本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法によって（例え
ば、自動ＤＮＡシンセサイザー（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているようなもの）の使用によって）
合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉ
ｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８））の方法に
よって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御されたポア
のガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用によって
調製され得る。
ば、自動ＤＮＡシンセサイザー（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているようなもの）の使用によって）
合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉ
ｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８））の方法に
よって合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御されたポア
のガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用によって
調製され得る。
【０２７６】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが
使用され得るが、転写された非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
使用され得るが、転写された非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【０２７７】
本発明に従う潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。部
位特異的な認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムはＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
ｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用
が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を
形成する隣接境域によって指示される位置においてｍＲＮＡを切断する。唯一の
要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列を有することである：５’−ＵＧ
−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および作製は、当該分野において周
知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ ３３
４：５８５−５９１（１９８８）においてより十分に記載される。Ｔ１Ｒ様リガ
ンドＩＩ（図１（配列番号１））のヌクレオチド配列中において、多数の潜在的
なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、リボザイムは
、切断認識部位がＴ１Ｒ様リガンドＩＩ ｍＲＮＡの５’末端の近傍に位置する
ように；すなわち、効率を増大させ、そして非機能的なＲＮＡ転写物の細胞内蓄
積を最小化するように操作される。
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。部
位特異的な認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムはＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
ｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用
が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を
形成する隣接境域によって指示される位置においてｍＲＮＡを切断する。唯一の
要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列を有することである：５’−ＵＧ
−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および作製は、当該分野において周
知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ ３３
４：５８５−５９１（１９８８）においてより十分に記載される。Ｔ１Ｒ様リガ
ンドＩＩ（図１（配列番号１））のヌクレオチド配列中において、多数の潜在的
なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、リボザイムは
、切断認識部位がＴ１Ｒ様リガンドＩＩ ｍＲＮＡの５’末端の近傍に位置する
ように；すなわち、効率を増大させ、そして非機能的なＲＮＡ転写物の細胞内蓄
積を最小化するように操作される。
【０２７８】
アンチセンスアプローチにおけるのと同様に、本発明のリボザイムは、修飾さ
れたオリゴヌクレオチドから構成され得（例えば、安定性の改善、標的化などの
ために）、そしてインビボでＴ１Ｒ様リガンドＩＩを発現する細胞に送達される
べきである。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアン
チセンスの導入についての上記と同様の様式で細胞に導入され得る。送達の好ま
しい方法は、強力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーターま
たはｐｏｌＩＩプロモーター）の制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構
築物を使用して、その結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性のＴ１Ｒ様
リガンドＩＩメッセージを破壊し、そして翻訳を妨害するのに十分な量のリボザ
イムを産生することを包含する。このようなリボザイムは、アンチセンス分子と
は違って触媒性であり、より低い細胞内濃度が効率のために必要である。
れたオリゴヌクレオチドから構成され得（例えば、安定性の改善、標的化などの
ために）、そしてインビボでＴ１Ｒ様リガンドＩＩを発現する細胞に送達される
べきである。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアン
チセンスの導入についての上記と同様の様式で細胞に導入され得る。送達の好ま
しい方法は、強力な構成的プロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーターま
たはｐｏｌＩＩプロモーター）の制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構
築物を使用して、その結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性のＴ１Ｒ様
リガンドＩＩメッセージを破壊し、そして翻訳を妨害するのに十分な量のリボザ
イムを産生することを包含する。このようなリボザイムは、アンチセンス分子と
は違って触媒性であり、より低い細胞内濃度が効率のために必要である。
【０２７９】
内因性遺伝子発現はまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子および／またはそのプ
ロモーターを、標的化された相同組換えを用いて、不活性化または「ノックアウ
トする」ことによって減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈ
ｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）（これらの各々は、その全体が参考とし
て本明細書中で援用される）を参照のこと）。例えば、内因性ポリヌクレオチド
配列（その遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡと隣
接する、本発明の変異体、非機能的ポリヌクレオチド（または完全に関連しない
ＤＮＡ配列）が、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーとともに
、またはこれらの選択マーカーなしで使用され、インビボで本発明のポリペプチ
ドを発現する細胞をトランスフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野
において公知の技術が使用されて、目的の遺伝子を含むがその遺伝子を発現しな
い、細胞中でノックアウトを生成する。標的化された相同組換えを介するＤＮＡ
構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、研
究分野および農業分野において特に適しており、ここでは胚性幹細胞への改変が
不活性な標的された遺伝子を有する動物子孫を生成するために使用され得る（例
えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７ならびにＴｈｏｍｐｓｏ
ｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは、組換えＤＮＡ
構築物が、当業者に明らかである適切なウイルスベクターを使用して、インビボ
で必要とされる部位に直接的に投与されるかまたは標的化されるならば、ヒトに
おける使用に慣用的に適合され得る。この段落に引用される文書のそれぞれの内
容は、その全体が参考として本明細書中で援用される。
ロモーターを、標的化された相同組換えを用いて、不活性化または「ノックアウ
トする」ことによって減少され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１７：２３０−２３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈ
ｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９）（これらの各々は、その全体が参考とし
て本明細書中で援用される）を参照のこと）。例えば、内因性ポリヌクレオチド
配列（その遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡと隣
接する、本発明の変異体、非機能的ポリヌクレオチド（または完全に関連しない
ＤＮＡ配列）が、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーとともに
、またはこれらの選択マーカーなしで使用され、インビボで本発明のポリペプチ
ドを発現する細胞をトランスフェクトし得る。別の実施形態において、当該分野
において公知の技術が使用されて、目的の遺伝子を含むがその遺伝子を発現しな
い、細胞中でノックアウトを生成する。標的化された相同組換えを介するＤＮＡ
構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化を生じる。このようなアプローチは、研
究分野および農業分野において特に適しており、ここでは胚性幹細胞への改変が
不活性な標的された遺伝子を有する動物子孫を生成するために使用され得る（例
えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７ならびにＴｈｏｍｐｓｏ
ｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは、組換えＤＮＡ
構築物が、当業者に明らかである適切なウイルスベクターを使用して、インビボ
で必要とされる部位に直接的に投与されるかまたは標的化されるならば、ヒトに
おける使用に慣用的に適合され得る。この段落に引用される文書のそれぞれの内
容は、その全体が参考として本明細書中で援用される。
【０２８０】
他の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉの可溶形態（例えば、図２（配列番号２）に示されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
フラグメントであり、これは全長レセプターの細胞外領域からのリガンド結合ド
メインを含む）を含む。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのこのような可溶形態（これは、
天然に存在し得、または合成性であり得る）は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ媒介シグ
ナルを、レセプターの細胞表面結合形態と拮抗することにより、Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩに対する結合について遮断する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）。本発明のアン
タゴニストはまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩＦｃ融合タンパク質を包含する。
Ｉの可溶形態（例えば、図２（配列番号２）に示されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
フラグメントであり、これは全長レセプターの細胞外領域からのリガンド結合ド
メインを含む）を含む。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのこのような可溶形態（これは、
天然に存在し得、または合成性であり得る）は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ媒介シグ
ナルを、レセプターの細胞表面結合形態と拮抗することにより、Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩに対する結合について遮断する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）。本発明のアン
タゴニストはまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩＦｃ融合タンパク質を包含する。
【０２８１】
本発明に従う抗体はまた、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩレセプター免疫源を
用いる任意の種々の標準的方法によって調製され得る。このようなＴ１Ｒ様リガ
ンドＩＩレセプター免疫原は、図１（配列番号２）に示したＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉタンパク質（これは、リーダー配列を含んでも含まなくてもよい）、およびレ
セプターのポリペプチドフラグメント（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩにおける、リガン
ド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインまたは、そ
れらの任意の組み合わせからなる）が挙げられる。
用いる任意の種々の標準的方法によって調製され得る。このようなＴ１Ｒ様リガ
ンドＩＩレセプター免疫原は、図１（配列番号２）に示したＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉタンパク質（これは、リーダー配列を含んでも含まなくてもよい）、およびレ
セプターのポリペプチドフラグメント（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩにおける、リガン
ド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインまたは、そ
れらの任意の組み合わせからなる）が挙げられる。
【０２８２】
本発明に従う、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のアゴニストま
たはアンタゴニストは、本明細書中に開示される方法および／または当該分野で
公知の方法（例えば、ＴａｒｔａｇｌｉａおよびＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌ
ｉａら、Ｃｅｌｌ ７３：２１３−２１６（１９９３）、ならびにＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ ９４／０９１３７（これらの３つの適用の各々の内容は、その全体が参考と
して本明細書中に援用される）に記載される方法）に従って惹起され得、そして
好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドに特異的
である。
たはアンタゴニストは、本明細書中に開示される方法および／または当該分野で
公知の方法（例えば、ＴａｒｔａｇｌｉａおよびＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌ
ｉａら、Ｃｅｌｌ ７３：２１３−２１６（１９９３）、ならびにＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ ９４／０９１３７（これらの３つの適用の各々の内容は、その全体が参考と
して本明細書中に援用される）に記載される方法）に従って惹起され得、そして
好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドに特異的
である。
【０２８３】
（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ関連疾患の診断）
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ関連疾患について、「標準的な」Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
遺伝子発現レベル（すなわち、このような障害を有していない個体から採取した
組織または体液中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現レベル）に対して，実質的
に変化した（増加した、または減少した）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の発現レ
ベルは、このような障害を有する個体から採取した組織または他の細胞または体
液（例えば、血清、血漿、尿素、滑液また髄液）の中で、検出し得ると考えられ
ている。従って、本発明は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ関連障害の診断の間、有用な
診断的な方法を提供し、この方法は、個体由来の組織、または他の細胞または体
液中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、
および測定した遺伝子発現レベルを標準的なＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現レ
ベルと比較し、これにより、標準と比較した遺伝子発現レベルにおける増加また
は減少がＴ１Ｒ様リガンドＩＩ関連障害を表示する工程を含む。
遺伝子発現レベル（すなわち、このような障害を有していない個体から採取した
組織または体液中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現レベル）に対して，実質的
に変化した（増加した、または減少した）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の発現レ
ベルは、このような障害を有する個体から採取した組織または他の細胞または体
液（例えば、血清、血漿、尿素、滑液また髄液）の中で、検出し得ると考えられ
ている。従って、本発明は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ関連障害の診断の間、有用な
診断的な方法を提供し、この方法は、個体由来の組織、または他の細胞または体
液中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、
および測定した遺伝子発現レベルを標準的なＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現レ
ベルと比較し、これにより、標準と比較した遺伝子発現レベルにおける増加また
は減少がＴ１Ｒ様リガンドＩＩ関連障害を表示する工程を含む。
【０２８４】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ関連障害は、以下を含むがこれらに限定されないと考え
られている：白血病、リンパ腫、動脈硬化、自己免疫疾患、炎症性疾患、アルツ
ハイマー疾患、眼の疾患、アポトーシス、子宮内成長遅延（ｉｎｔｒａｕｔｅｒ
ｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）、子かん前症、天疱瘡、およ
び乾癬。
られている：白血病、リンパ腫、動脈硬化、自己免疫疾患、炎症性疾患、アルツ
ハイマー疾患、眼の疾患、アポトーシス、子宮内成長遅延（ｉｎｔｒａｕｔｅｒ
ｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）、子かん前症、天疱瘡、およ
び乾癬。
【０２８５】
個体により、哺乳動物個体、好ましくはヒト個体が意図される。「Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩをコードしている遺伝子の発現レベルを測定する工程」で、直接的（
例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡのレベルを決定また推定する
ことにより）または相対的（第二の生物学的サンプル中の、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較することにより）のいず
れかで、第一の生物学的サンプル中における、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質
のレベルまたは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベ
ルを、定性的または定量的に、測定もしくは推定する工程を意図する。好ましく
は、第一の生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質レベルまたは
ｍＲＮＡレベルが測定または推測され、そして標準的なＴ１Ｒ様リガンドＩＩタ
ンパク質レベルまたは、ｍＲＮＡレベルに対して比較されるが、この標準は、障
害を有しない個体から得た第２の生物学的サンプルから得られるか、または障害
を有しない個体群からレベルの平均を出すことにより決定される。当該分野で理
解されるように、一旦標準的Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質レベル、またはＲ
ＮＡレベルが既知になると、これを比較目的で標準として繰返し使用し得る。
ガンドＩＩをコードしている遺伝子の発現レベルを測定する工程」で、直接的（
例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡのレベルを決定また推定する
ことにより）または相対的（第二の生物学的サンプル中の、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較することにより）のいず
れかで、第一の生物学的サンプル中における、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質
のレベルまたは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベ
ルを、定性的または定量的に、測定もしくは推定する工程を意図する。好ましく
は、第一の生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質レベルまたは
ｍＲＮＡレベルが測定または推測され、そして標準的なＴ１Ｒ様リガンドＩＩタ
ンパク質レベルまたは、ｍＲＮＡレベルに対して比較されるが、この標準は、障
害を有しない個体から得た第２の生物学的サンプルから得られるか、または障害
を有しない個体群からレベルの平均を出すことにより決定される。当該分野で理
解されるように、一旦標準的Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質レベル、またはＲ
ＮＡレベルが既知になると、これを比較目的で標準として繰返し使用し得る。
【０２８６】
「生物学的サンプル」により、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質またはｍＲＮ
Ａを含む、個体、体液、細胞株、組織培養物、または他の供給源由来の、任意の
生物学的サンプルを意図する。指摘されるように、生物学的サンプルは、分泌さ
れた成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を発現し
ている組織供給源を含む体液（例えば、血清、血漿、尿素、滑液および髄液）を
包含する。組織生検材料および体液を哺乳動物から得る方法は、当該分野で周知
である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検材料は好ましい供給
源である。
Ａを含む、個体、体液、細胞株、組織培養物、または他の供給源由来の、任意の
生物学的サンプルを意図する。指摘されるように、生物学的サンプルは、分泌さ
れた成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質を発現し
ている組織供給源を含む体液（例えば、血清、血漿、尿素、滑液および髄液）を
包含する。組織生検材料および体液を哺乳動物から得る方法は、当該分野で周知
である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検材料は好ましい供給
源である。
【０２８７】
総ての細胞中ＲＮＡは、一工程（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ）グアニジニウム−
チオシアネート−フェニル−クロロホルム法（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳ
ａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）
）のような任意の適切な技術を使用して、生物学的サンプルから単離され得る。
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩをコードするｍＲＮＡレベルは、次いで、任意の適切な方
法を用いてアッセイされる。これらには、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレア
ーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応を組
合せて用いる逆転転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応を組合せて用
いる逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が挙げられる。
チオシアネート−フェニル−クロロホルム法（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳ
ａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）
）のような任意の適切な技術を使用して、生物学的サンプルから単離され得る。
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩをコードするｍＲＮＡレベルは、次いで、任意の適切な方
法を用いてアッセイされる。これらには、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレア
ーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応を組
合せて用いる逆転転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応を組合せて用
いる逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が挙げられる。
【０２８８】
ノーザンブロット分析は、Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ ６３：３０３−３１２
（１９９０）に記載されるように行われ得る。手短には、総ＲＮＡは、上記の
ように生物学的サンプルから調製される。ノーザンブロットのために、ＲＮＡは
、適切な緩衝液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナト
リウム緩衝液）において変性され、アガロースゲル電気泳動に供され、そしてニ
トロセルロースフィルター上に移される。ＲＮＡがＵＶリンカーによってフィル
ターに連結された後、フィルターは、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハルト溶液、
変性サケ精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中でプレハイ
ブリダイズされる。任意の適切な方法（例えば、３２ＰマルチプライムＤＮＡ標
識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って標識された、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
タンパク質ｃＤＮＡは、プローブとして使用される。一晩のハイブリダイゼーシ
ョンの後、フィルターは、洗浄され、そしてｘ線フィルムに曝される。本発明に
従ってプローブとして使用するためのｃＤＮＡは、上記のセクションに記載され
、そして好ましくは少なくとも１５ｂｐ長である。
（１９９０）に記載されるように行われ得る。手短には、総ＲＮＡは、上記の
ように生物学的サンプルから調製される。ノーザンブロットのために、ＲＮＡは
、適切な緩衝液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナト
リウム緩衝液）において変性され、アガロースゲル電気泳動に供され、そしてニ
トロセルロースフィルター上に移される。ＲＮＡがＵＶリンカーによってフィル
ターに連結された後、フィルターは、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハルト溶液、
変性サケ精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液中でプレハイ
ブリダイズされる。任意の適切な方法（例えば、３２ＰマルチプライムＤＮＡ標
識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従って標識された、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
タンパク質ｃＤＮＡは、プローブとして使用される。一晩のハイブリダイゼーシ
ョンの後、フィルターは、洗浄され、そしてｘ線フィルムに曝される。本発明に
従ってプローブとして使用するためのｃＤＮＡは、上記のセクションに記載され
、そして好ましくは少なくとも１５ｂｐ長である。
【０２８９】
Ｓ１マッピングは、Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ ４９：３５７−３６７（１９
８７）に記載されるように行われ得る。Ｓ１マッピングにおいて使用するための
プローブＤＮＡを調製するために、上記ｃＤＮＡのセンス鎖は、標識アンチセン
スＤＮＡを合成するためにテンプレートとして使用される。次いで、アンチセン
スＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化されて、所望の長さの
さらなるＤＮＡプローブが作製され得る。このようなアンチセンスプローブは、
標的ｍＲＮＡ（すなわち、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードするｍＲＮ
Ａ）に対応する保護されたバンドを可視化するために有用である。ノーザンブロ
ット分析は上記のように行われ得る。
８７）に記載されるように行われ得る。Ｓ１マッピングにおいて使用するための
プローブＤＮＡを調製するために、上記ｃＤＮＡのセンス鎖は、標識アンチセン
スＤＮＡを合成するためにテンプレートとして使用される。次いで、アンチセン
スＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化されて、所望の長さの
さらなるＤＮＡプローブが作製され得る。このようなアンチセンスプローブは、
標的ｍＲＮＡ（すなわち、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードするｍＲＮ
Ａ）に対応する保護されたバンドを可視化するために有用である。ノーザンブロ
ット分析は上記のように行われ得る。
【０２９０】
好ましくは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベル
は、Ｍａｋｉｎｏら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ２：２９５−３０１（１９９０）に
記載されるＲＴ−ＰＣＲ法を用いてアッセイされる。この方法によって、ポリア
クリルアミドゲルバンドにおける「アンプリコン」の放射能は、標的ｍＲＮＡの
初期濃度に正比例する。手短には、この方法は、生物学的サンプルから単離され
た総ＲＮＡをＲＴプライマーおよび適切な緩衝液を含有する反応混合物中に添加
することを含む。プライマーアニーリングのためのインキュベーションの後、混
合物は、ＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビターおよび逆転写
酵素を補充され得る。ＲＮＡの逆転写を達成するためのインキュベーションの後
、次いで、ＲＴ産物を、標識プライマーを用いるＰＣＲに供する。あるいは、プ
ライマーを標識しないで、ＰＣＲ反応混合物に標識ｄＮＴＰが含まれ得る。ＰＣ
Ｒ増幅は、従来技術に従ってＤＮＡサーマルサイクラーにおいて行われ得る。増
幅を達成するための適切な回数の後、ＰＣＲ反応混合物は、ポリアクリルアミド
ゲル上に電気泳動される。ゲルを乾燥させた後、適切なバンド（Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩタンパク質をコードするｍＲＮＡに対応する）の放射能が、イメージング
アナライザーを用いて定量される。ＲＴおよびＰＣＲ反応成分ならびに条件、試
薬およびゲル濃度、ならびに標識方法は、当該分野で周知である。ＲＴ−ＰＣＲ
法における改変は、当業者に明らかである。
は、Ｍａｋｉｎｏら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ２：２９５−３０１（１９９０）に
記載されるＲＴ−ＰＣＲ法を用いてアッセイされる。この方法によって、ポリア
クリルアミドゲルバンドにおける「アンプリコン」の放射能は、標的ｍＲＮＡの
初期濃度に正比例する。手短には、この方法は、生物学的サンプルから単離され
た総ＲＮＡをＲＴプライマーおよび適切な緩衝液を含有する反応混合物中に添加
することを含む。プライマーアニーリングのためのインキュベーションの後、混
合物は、ＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビターおよび逆転写
酵素を補充され得る。ＲＮＡの逆転写を達成するためのインキュベーションの後
、次いで、ＲＴ産物を、標識プライマーを用いるＰＣＲに供する。あるいは、プ
ライマーを標識しないで、ＰＣＲ反応混合物に標識ｄＮＴＰが含まれ得る。ＰＣ
Ｒ増幅は、従来技術に従ってＤＮＡサーマルサイクラーにおいて行われ得る。増
幅を達成するための適切な回数の後、ＰＣＲ反応混合物は、ポリアクリルアミド
ゲル上に電気泳動される。ゲルを乾燥させた後、適切なバンド（Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩタンパク質をコードするｍＲＮＡに対応する）の放射能が、イメージング
アナライザーを用いて定量される。ＲＴおよびＰＣＲ反応成分ならびに条件、試
薬およびゲル濃度、ならびに標識方法は、当該分野で周知である。ＲＴ−ＰＣＲ
法における改変は、当業者に明らかである。
【０２９１】
逆転写された標的ｍＲＮＡを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーの任意の
セットが使用され得、そして上記のセクションに記載されるように設計され得る
。
セットが使用され得、そして上記のセクションに記載されるように設計され得る
。
【０２９２】
生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩレベルをアッセイすることは、任
意の当該分野で公知の方法を用いて起こり得る。生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様
リガンドＩＩレベルをアッセイするために好ましいのは、抗体ベース技術である
。例えば、組織におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ発現は、古典的な免疫組織学的方
法で研究され得る。これらにおいて、特異的認識は、一次抗体（ポリクローナル
またはモノクローナル）によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、ま
たは他の結合した二次抗体を利用し得る。結果として、病理学的調査のための組
織切片の免疫組織学的染色が得られる。組織は、例えば、ウエスタンブロットま
たはドット／スロットアッセイ用のＴ１Ｒ様リガンドＩＩの遊離のために、例え
ば、尿素および中性界面活性剤を用いて抽出され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．
ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋ
ａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１
９８７））。この技術において、これは、カチオン性固相の使用に基づき、Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩの定量は、標準として単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩを用い
て達成され得る。この技術はまた、体液に適用され得る。これらのサンプルを用
いて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのモル濃度は、異なる体液（例えば、血清、血漿、
尿、滑液、髄液など）についてのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ含量の標準値を設定する
ことを補助する。次いで、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ量の正常な出現は、健常な個体
からの値を用いて設定され得る。これは、試験被験体から得られるものと比較さ
れ得る。
意の当該分野で公知の方法を用いて起こり得る。生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様
リガンドＩＩレベルをアッセイするために好ましいのは、抗体ベース技術である
。例えば、組織におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ発現は、古典的な免疫組織学的方
法で研究され得る。これらにおいて、特異的認識は、一次抗体（ポリクローナル
またはモノクローナル）によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、ま
たは他の結合した二次抗体を利用し得る。結果として、病理学的調査のための組
織切片の免疫組織学的染色が得られる。組織は、例えば、ウエスタンブロットま
たはドット／スロットアッセイ用のＴ１Ｒ様リガンドＩＩの遊離のために、例え
ば、尿素および中性界面活性剤を用いて抽出され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．
ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋ
ａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１
９８７））。この技術において、これは、カチオン性固相の使用に基づき、Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩの定量は、標準として単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩを用い
て達成され得る。この技術はまた、体液に適用され得る。これらのサンプルを用
いて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのモル濃度は、異なる体液（例えば、血清、血漿、
尿、滑液、髄液など）についてのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ含量の標準値を設定する
ことを補助する。次いで、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ量の正常な出現は、健常な個体
からの値を用いて設定され得る。これは、試験被験体から得られるものと比較さ
れ得る。
【０２９３】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現を検出するための有用な他の抗体ベース法は
、免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ））を含む。例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的モ
ノクローナル抗体は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩを検出および定量するための免疫吸
着剤および酵素標識プローブの両方として使用され得る。サンプル中に存在する
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを用いて標
準調製物中に存在する量と比較して計算され得る。腫瘍の抗原を検出するための
、このようなＥＬＩＳＡについては、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １１：１９−３
０（１９８８）に記載されている。別のＥＬＩＳＡアッセイにおいて、２つの個
々の特異的なモノクローナル抗体が、体液中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩを検出する
ために使用され得る。このアッセイにおいて、一方の抗体は免疫吸着剤として、
そして他方の抗体は酵素標識プローブとして使用される。
、免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ））を含む。例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的モ
ノクローナル抗体は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩを検出および定量するための免疫吸
着剤および酵素標識プローブの両方として使用され得る。サンプル中に存在する
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを用いて標
準調製物中に存在する量と比較して計算され得る。腫瘍の抗原を検出するための
、このようなＥＬＩＳＡについては、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １１：１９−３
０（１９８８）に記載されている。別のＥＬＩＳＡアッセイにおいて、２つの個
々の特異的なモノクローナル抗体が、体液中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩを検出する
ために使用され得る。このアッセイにおいて、一方の抗体は免疫吸着剤として、
そして他方の抗体は酵素標識プローブとして使用される。
【０２９４】
上記の技術は、本質的に「１工程」または「２工程」アッセイとして行われ得
る。「１工程」アッセイは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩと固定化抗体とを接触させる
工程および、洗浄せずに、その混合物と標識抗体とを接触させる工程を含む。「
２工程」アッセイは、混合物と標識抗体とを接触させる前に洗浄する工程を含む
。他の従来の方法もまた、適切に使用され得る。通常、支持体上にアッセイ系の
１つの成分を固定化することが望ましく、それによって、系の他の成分が、その
成分との接触にもたらされ、そしてサンプルから容易に除去される。
る。「１工程」アッセイは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩと固定化抗体とを接触させる
工程および、洗浄せずに、その混合物と標識抗体とを接触させる工程を含む。「
２工程」アッセイは、混合物と標識抗体とを接触させる前に洗浄する工程を含む
。他の従来の方法もまた、適切に使用され得る。通常、支持体上にアッセイ系の
１つの成分を固定化することが望ましく、それによって、系の他の成分が、その
成分との接触にもたらされ、そしてサンプルから容易に除去される。
【０２９５】
適切な酵素標識は、例えば、オキシダーゼ群由来のものを含み、これらは、基
質と反応することによって過酸化水素の産生を触媒する。グルコースオキシダー
ゼは、それが良好な安定を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手可
能であるので特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体／基質反
応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得
る。酵素の他に、他の適切な標識としては、放射性同位体（例えば、ヨウ素（１ ２５ Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、
インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ））、および蛍光
標識（例えば、蛍光およびローダミン、およびビオチン）を含む。
質と反応することによって過酸化水素の産生を触媒する。グルコースオキシダー
ゼは、それが良好な安定を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手可
能であるので特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体／基質反
応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得
る。酵素の他に、他の適切な標識としては、放射性同位体（例えば、ヨウ素（１ ２５ Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、
インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ））、および蛍光
標識（例えば、蛍光およびローダミン、およびビオチン）を含む。
【０２９６】
生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルをアッセイすることに加
えて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩはまた、画像化によりインビボで検出され得る。Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩのインビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ
線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のた
めに適切な標識は、放射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、
これは検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。
ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有
するマーカー（例えば、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのた
めの栄養分を標識することにより抗体中に取り込まれ得る。
えて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩはまた、画像化によりインビボで検出され得る。Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩのインビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ
線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のた
めに適切な標識は、放射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、
これは検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。
ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有
するマーカー（例えば、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのた
めの栄養分を標識することにより抗体中に取り込まれ得る。
【０２９７】
適当な検出可能である画像化部分（ｉｍａｇｅｉｎｇ ｍｏｅｔｉｅｓ）（例
えば、放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不
透過性物質、または核磁気共鳴により検出される物質）により標識されたＡＴ１
Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体または抗体フラグメントは、疾患について調べるた
めに哺乳動物に導入される（例えば、非経口的、皮下的、腹腔内的に）。これは
、被験体のサイズおよび使用される画像化システムが、診断画像を生成するため
に必要な画像化部分の量を決定すると、当該分野で理解される。放射性同位体部
分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量は、通常は９９ｍＴｃの
約５〜２０ミリキュリーの範囲である。標識化された抗体または抗体フラグメン
トは、従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩを含む細胞の位置に優先的に蓄積する。イ
ンビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈ
ａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａ
ｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ、Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ、Ｂ
．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）におい
て、記載される。 本発明の使用のためのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体は、
インタクト（ｉｎｔａｃｔ）なＴ１Ｒ様リガンドＩＩまたはこれらの抗体ポリペ
プチドフラグメント（これらはキャリアタンパク質（例えば、アルブミン）と一
緒に、または十分に長い場合（少なくとも２５アミノ酸残基）は、キャリアなし
で、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に提示される）に対して惹起される
。
えば、放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不
透過性物質、または核磁気共鳴により検出される物質）により標識されたＡＴ１
Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体または抗体フラグメントは、疾患について調べるた
めに哺乳動物に導入される（例えば、非経口的、皮下的、腹腔内的に）。これは
、被験体のサイズおよび使用される画像化システムが、診断画像を生成するため
に必要な画像化部分の量を決定すると、当該分野で理解される。放射性同位体部
分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量は、通常は９９ｍＴｃの
約５〜２０ミリキュリーの範囲である。標識化された抗体または抗体フラグメン
トは、従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩを含む細胞の位置に優先的に蓄積する。イ
ンビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈ
ａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａ
ｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ、Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ、Ｂ
．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）におい
て、記載される。 本発明の使用のためのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体は、
インタクト（ｉｎｔａｃｔ）なＴ１Ｒ様リガンドＩＩまたはこれらの抗体ポリペ
プチドフラグメント（これらはキャリアタンパク質（例えば、アルブミン）と一
緒に、または十分に長い場合（少なくとも２５アミノ酸残基）は、キャリアなし
で、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に提示される）に対して惹起される
。
【０２９８】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル
抗体」（Ｍａｂ）は、特異的にＴ１Ｒ様リガンドＩＩに結合し得るインタクトな
分子ならびに抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメ
ントのような）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメン
トはインタクトな抗体が有しているＦｃフラグメントを欠いており、循環から迅
速に除去され、また、インタクトな抗体のより少ない非特異的組織結合を持ち得
ることを意味する（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５
（１９８３））。従って、これらの部分が好ましい。
抗体」（Ｍａｂ）は、特異的にＴ１Ｒ様リガンドＩＩに結合し得るインタクトな
分子ならびに抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメ
ントのような）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメン
トはインタクトな抗体が有しているＦｃフラグメントを欠いており、循環から迅
速に除去され、また、インタクトな抗体のより少ない非特異的組織結合を持ち得
ることを意味する（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５
（１９８３））。従って、これらの部分が好ましい。
【０２９９】
本発明の抗体は、任意の様々な方法により調製され得る。例えば、Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩまたはこれらの抗原性フラグメントを発現する細胞が、ポリクローナ
ル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法に
おいて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の調製は、上に記載のように、調製さ
れ、そして精製されて、実質的に天然の夾雑物を無くする。このような調製は、
従って、より大きい比活性のポリクローナル抗血清を産生するために、動物に対
して誘導される。
ガンドＩＩまたはこれらの抗原性フラグメントを発現する細胞が、ポリクローナ
ル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法に
おいて、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の調製は、上に記載のように、調製さ
れ、そして精製されて、実質的に天然の夾雑物を無くする。このような調製は、
従って、より大きい比活性のポリクローナル抗血清を産生するために、動物に対
して誘導される。
【０３００】
最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（または、そ
れらのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ結合フラグメント）である。このようなモノクロー
ナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製され得る（Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０−１９９６）；Ｈａ
ｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８），６〜９章、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓ
ｕｂｅｌ、前出、１１章、これら全体が本明細書中で参考として援用される）。
一般には、このような手順は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗原または、より好ましく
は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ発現細胞を用いて動物（好ましくは、マウス）を免疫
する工程を包含する。適切な細胞は、それらが抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体に結
合する能力により、認識され得る。これらの細胞は、任意の適切な組織培養培地
で培養され得る；しかし、１０％ウシ胎仔血清（５６℃で非働化した）を補充し
、そして約１０μｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、
および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した、Ｅａｒｌｅ改変イ
ーグル培地にて細胞を培養することが好ましい。このようなマウスのこれらの脾
細胞は抽出されて、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄
腫細胞株は、本発明に関して用いられ得る；しかしながら、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）から入手可能な、親（ｐａｒｅｎｔ）骨髄
種細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合後、結果として生じたハイ
ブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いで、上に記載（Ｇ
ａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１）；Ｈａｒ
ｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、７章）の限界希釈によりクローン化する。このよ
うな選択を通して得られたハイブリドーマ細胞は、次いで、アッセイされ、Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩ抗原に結合が可能な抗体を分泌するクローンが同定される。
れらのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ結合フラグメント）である。このようなモノクロー
ナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製され得る（Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０−１９９６）；Ｈａ
ｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８），６〜９章、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓ
ｕｂｅｌ、前出、１１章、これら全体が本明細書中で参考として援用される）。
一般には、このような手順は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗原または、より好ましく
は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ発現細胞を用いて動物（好ましくは、マウス）を免疫
する工程を包含する。適切な細胞は、それらが抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体に結
合する能力により、認識され得る。これらの細胞は、任意の適切な組織培養培地
で培養され得る；しかし、１０％ウシ胎仔血清（５６℃で非働化した）を補充し
、そして約１０μｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、
および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した、Ｅａｒｌｅ改変イ
ーグル培地にて細胞を培養することが好ましい。このようなマウスのこれらの脾
細胞は抽出されて、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨髄
腫細胞株は、本発明に関して用いられ得る；しかしながら、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）から入手可能な、親（ｐａｒｅｎｔ）骨髄
種細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合後、結果として生じたハイ
ブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いで、上に記載（Ｇ
ａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１）；Ｈａｒ
ｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出、７章）の限界希釈によりクローン化する。このよ
うな選択を通して得られたハイブリドーマ細胞は、次いで、アッセイされ、Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩ抗原に結合が可能な抗体を分泌するクローンが同定される。
【０３０１】
あるいは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗原に結合し得るさらなる抗体は、抗イディ
オタイプ抗体の使用を通して、二段階工程の手順において産生され得る。このよ
うな方法は、抗体それ自体が抗原であり、そして、それゆえに第二の抗体に結合
する抗体を得ることが可能であるという事実を使用する。この方法に従って、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体を使用して、動物、好ましくはマウスを免疫する
。このような動物の脾細胞は、従って、ハイブリドーマ細胞の産生に使用され、
そしてこのハイブリドーマ細胞は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体に結合する
能力がＴ１Ｒ様リガンドＩＩ抗原でブロックされ得る抗体を産生するクローンを
同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉ特異的抗体についての抗イディオタイプ抗体を含み、そして、この抗体は動物
を免疫し、そしてさらなるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体の形成を誘導するた
めに使用し得る。
オタイプ抗体の使用を通して、二段階工程の手順において産生され得る。このよ
うな方法は、抗体それ自体が抗原であり、そして、それゆえに第二の抗体に結合
する抗体を得ることが可能であるという事実を使用する。この方法に従って、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体を使用して、動物、好ましくはマウスを免疫する
。このような動物の脾細胞は、従って、ハイブリドーマ細胞の産生に使用され、
そしてこのハイブリドーマ細胞は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体に結合する
能力がＴ１Ｒ様リガンドＩＩ抗原でブロックされ得る抗体を産生するクローンを
同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉ特異的抗体についての抗イディオタイプ抗体を含み、そして、この抗体は動物
を免疫し、そしてさらなるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体の形成を誘導するた
めに使用し得る。
【０３０２】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明の抗体の他のフラグメントが、本
明細書中で開示された方法に従って使用され得ることを十分理解される。代表的
には、このようなフラグメントが、パパイン（Ｆａｂフラグメント産生のため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント産生のため）酵素を用いたタンパ
ク質分解性切断（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）により産生され
る。あるいは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用
を通して、または合成化学を通して、産生され得る インビボでの画像化を使用して、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの増強したレベルを、
ヒトの診断のために検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用
することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用することにより産生
され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知である。総説につ
いては、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；
Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌ
ｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１
４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｗ
Ｏ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉ
ａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
明細書中で開示された方法に従って使用され得ることを十分理解される。代表的
には、このようなフラグメントが、パパイン（Ｆａｂフラグメント産生のため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント産生のため）酵素を用いたタンパ
ク質分解性切断（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）により産生され
る。あるいは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用
を通して、または合成化学を通して、産生され得る インビボでの画像化を使用して、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの増強したレベルを、
ヒトの診断のために検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用
することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用することにより産生
され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知である。総説につ
いては、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；
Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌ
ｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１
４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｗ
Ｏ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉ
ａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０３０３】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ特異的抗体についての、さらに適切な標識は本
明細書中で提供される。適切な酵素標識の例は、以下を含む：リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵
母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ（ａｌ
ｐｈａ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、
リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６‐リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ。
明細書中で提供される。適切な酵素標識の例は、以下を含む：リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵
母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ（ａｌ
ｐｈａ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、
リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６‐リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ。
【０３０４】
適切な放射性同位体標識は、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ
、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５ ２ Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、 １０９ Ｐｄなどが挙げられる。ここでインビボの画像化で使用する場合、１１１ Ｉｎが好ましい同位体である。なぜならば、肝臓による１２５Ｉおよび１３１Ｉ
で標識化したモノクローナル抗体の脱ハロゲン化（ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏ
ｎ）問題を回避するからである。さらに、この放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、画像化のためのより好ましいγ放射エネルギーを持
つ（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ １０：２９６−３０１
（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８
１−２８７（１９８７））。例えば、１−（イソチオシアナトベンジル）−ＤＰ
ＴＡを用いたモノクローナル抗体へ結合した１１１Ｉｎは、非腫瘍性組織、特に
肝臓、における取込はほとんど見られず、それゆえ腫瘍位置についての特異性を
増強する（Ｅｓｔｅｂａｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０（
１９８７））。
、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５ ２ Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、 １０９ Ｐｄなどが挙げられる。ここでインビボの画像化で使用する場合、１１１ Ｉｎが好ましい同位体である。なぜならば、肝臓による１２５Ｉおよび１３１Ｉ
で標識化したモノクローナル抗体の脱ハロゲン化（ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏ
ｎ）問題を回避するからである。さらに、この放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、画像化のためのより好ましいγ放射エネルギーを持
つ（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ １０：２９６−３０１
（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８
１−２８７（１９８７））。例えば、１−（イソチオシアナトベンジル）−ＤＰ
ＴＡを用いたモノクローナル抗体へ結合した１１１Ｉｎは、非腫瘍性組織、特に
肝臓、における取込はほとんど見られず、それゆえ腫瘍位置についての特異性を
増強する（Ｅｓｔｅｂａｎら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０（
１９８７））。
【０３０５】
適切な非放射性同位元素標識の例として、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ
、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅが挙げられる。
、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅが挙げられる。
【０３０６】
適切な蛍光性標識の例は、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシ
アネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、
アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）標識、ｏ−フタアルデ
ヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｙｄｅ）標識およびフルオレサミン標識。
アネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、
アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）標識、ｏ−フタアルデ
ヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｙｄｅ）標識およびフルオレサミン標識。
【０３０７】
適切な毒素標識の例は、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素を含む。
【０３０８】
化学発光標識の例は、ルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）標識、イソルミナール（
ｉｓｏｌｕｍｉｎａｌ）標識、芳香族アクリジニウムエステル（ａｒｏｍａｔｉ
ｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）標識、イミダゾール標識、アクリジニ
ウム塩（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）標識、ショウ酸エステル標識、ルシフェリン標
識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識およびを含む。
ｉｓｏｌｕｍｉｎａｌ）標識、芳香族アクリジニウムエステル（ａｒｏｍａｔｉ
ｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）標識、イミダゾール標識、アクリジニ
ウム塩（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）標識、ショウ酸エステル標識、ルシフェリン標
識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識およびを含む。
【０３０９】
核磁気共鳴対比剤（ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の例は、Ｇｄ、Ｍ
ｎおよびＦｅのような重金属核が挙げられる。
ｎおよびＦｅのような重金属核が挙げられる。
【０３１０】
上に記載した標識を抗体に結合させる代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃ
ｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１−３１（１９７６））およびＳｃｈｕｒ
ｓらに（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ８１：１−４０（１９７７））より提供
される。後者に述べられた結合技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法
、ジマレイミド（ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ）法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−
ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｙｌ−
Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）法、これらの全ての方法は、本
明細書中で参考として援用される。
ｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１−３１（１９７６））およびＳｃｈｕｒ
ｓらに（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ８１：１−４０（１９７７））より提供
される。後者に述べられた結合技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法
、ジマレイミド（ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ）法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−
ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｙｌ−
Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）法、これらの全ての方法は、本
明細書中で参考として援用される。
【０３１１】
（染色体アッセイ）
本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダイズ
し得る。さらに、染色体における特定の部位を同定することへの必要性が現在存
在する。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在
、染色体位置をマークするのにはほとんど利用可能ではない。本発明に従う染色
体へのＤＮＡのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づ
けることにおいて重要な第一段階である。
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダイズ
し得る。さらに、染色体における特定の部位を同定することへの必要性が現在存
在する。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在
、染色体位置をマークするのにはほとんど利用可能ではない。本発明に従う染色
体へのＤＮＡのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づ
けることにおいて重要な第一段階である。
【０３１２】
この点における特定の実施形態において、本明細書中で開示されたｃＤＮＡを
使用して、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングする。 これは、一般的に市販されている、種々の周知の技術およびライブラリーを用い
て達成され得る。この目的のための周知の技術を用いて、インサイチュ染色体マ
ッピングのためにゲノムＤＮＡが用られる。典型的には、染色体マッピングのた
めの慣用的手順に従って、良好なインサイチュハイブリダイゼーションシグナル
を与えるゲノムプローブを同定するために、いくつかの試行錯誤が必要とされ得
る。
使用して、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングする。 これは、一般的に市販されている、種々の周知の技術およびライブラリーを用い
て達成され得る。この目的のための周知の技術を用いて、インサイチュ染色体マ
ッピングのためにゲノムＤＮＡが用られる。典型的には、染色体マッピングのた
めの慣用的手順に従って、良好なインサイチュハイブリダイゼーションシグナル
を与えるゲノムプローブを同定するために、いくつかの試行錯誤が必要とされ得
る。
【０３１３】
さらに、いくつかの場合、配列は、このｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ま
しくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体へマッピングされ得る。
この配列の３’非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおい
て１つより多くのエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、従って増
幅プロセスを複雑にする。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を
含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。このプライマー
に対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅された部位を産
生する。
しくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体へマッピングされ得る。
この配列の３’非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおい
て１つより多くのエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、従って増
幅プロセスを複雑にする。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を
含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。このプライマー
に対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅された部位を産
生する。
【０３１４】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは特定のＤＮＡを特定の染色体に対応
させるための迅速な手順である。同様のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
本発明を使用し、準局在化（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色
体由来部分のパネルまたは同類の手法における大きいゲノムクローンのプールで
達成され得る。その染色体にマッピングするために同様に用いられ得る他のマッ
ピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソー
ト（ｌａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング
、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼー
ションによる前選択を含む。
させるための迅速な手順である。同様のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
本発明を使用し、準局在化（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色
体由来部分のパネルまたは同類の手法における大きいゲノムクローンのプールで
達成され得る。その染色体にマッピングするために同様に用いられ得る他のマッ
ピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソー
ト（ｌａｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング
、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼー
ションによる前選択を含む。
【０３１５】
中期染色体展開物へのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼー
ション（「ＦＩＳＨ」）を用いて、１つの工程で正確な染色体位置を提供し得る
。この技術は、５０または６０ｂｐ程度の短さのｃＤＮＡ由来のプローブととも
に使用される。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこ
と。
ション（「ＦＩＳＨ」）を用いて、１つの工程で正確な染色体位置を提供し得る
。この技術は、５０または６０ｂｐ程度の短さのｃＤＮＡ由来のプローブととも
に使用される。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこ
と。
【０３１６】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
的な位置は、遺伝地図データと相関づけられ得る。このようなデータは、例えば
、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ
Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）に見出され
る。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係が、
連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）によって同定される。
的な位置は、遺伝地図データと相関づけられ得る。このようなデータは、例えば
、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ
Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）に見出され
る。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係が、
連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）によって同定される。
【０３１７】
次に、罹患個体と非罹患個体との間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列における差
異を決定することが必要である。変異がいくつかまたは全ての罹患個体において
認められるが、いずれの正常個体にも認められない場合、その変異は、疾患の原
因因子である可能性が高い。
異を決定することが必要である。変異がいくつかまたは全ての罹患個体において
認められるが、いずれの正常個体にも認められない場合、その変異は、疾患の原
因因子である可能性が高い。
【０３１８】
物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の解像度であれば、疾患
と関連する染色体領域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在
的な原因遺伝子の１つであり得る（これは、１メガベースマッピング解像度およ
び２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する）。
と関連する染色体領域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在
的な原因遺伝子の１つであり得る（これは、１メガベースマッピング解像度およ
び２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定する）。
【０３１９】
（薬学的組成物および治療的投与）
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用のために、連邦規制当局もしくは州政府により承認されたか、または米国
薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用語
「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤
、またはビヒクルをいう。このような薬学的キャリアは、水および油（石油起源
、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、
鉱油、ごま油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的組
成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、
ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な溶
液に対して、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、
デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦
粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセ
ロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥した脱脂乳、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用のために、連邦規制当局もしくは州政府により承認されたか、または米国
薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用語
「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤
、またはビヒクルをいう。このような薬学的キャリアは、水および油（石油起源
、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、
鉱油、ごま油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的組
成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、
ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な溶
液に対して、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、
デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦
粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセ
ロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥した脱脂乳、グリセロール、プロピレン、
グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【０３２０】
組成物はまた、所望される場合、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩
衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセ
ル剤、散剤、持続放出処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合
剤およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。
経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン
酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの
ような標準的なキャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍ
ａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、治療有効量の化合物を
、好ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への
適切な投与のための形態を提供する。処方物は、投与の様式に適するべきである
。
衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセ
ル剤、散剤、持続放出処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合
剤およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。
経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン
酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの
ような標準的なキャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍ
ａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、治療有効量の化合物を
、好ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への
適切な投与のための形態を提供する。処方物は、投与の様式に適するべきである
。
【０３２１】
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単位投薬形態と一緒に混
合されてのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（
ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような気密容器中の乾燥した凍結粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単位投薬形態と一緒に混
合されてのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（
ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような気密容器中の乾燥した凍結粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０３２２】
本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩の
ようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩のような
カチオンとともに形成される塩が挙げられる。
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩の
ようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩のような
カチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０３２３】
本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の処置、抑制および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイを使用して、必
要に応じて、最適な投薬量の範囲を同定するのを補助し得る。処方物において使
用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに
依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである
。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線か
ら外挿され得る。
障害の処置、抑制および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイを使用して、必
要に応じて、最適な投薬量の範囲を同定するのを補助し得る。処方物において使
用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに
依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである
。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線か
ら外挿され得る。
【０３２４】
種々の送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中でのカプセル化、この
化合物の発現が可能な組み換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例え
ば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（
１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての
核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻
腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物ま
たは組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射に
より、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および鞘内注射を包
含する；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中でのカプセル化、この
化合物の発現が可能な組み換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例え
ば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（
１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての
核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻
腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物ま
たは組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射に
より、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および鞘内注射を包
含する；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０３２５】
特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料である）によ
り達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、
タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない
。
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料である）によ
り達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、
タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない
。
【０３２６】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０３２７】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された放出系にお
いて送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：
５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５
７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
系は、治療標的、即ち、脳に近接して配置され得、それにより、全身用量の一部
のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
いて送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：
５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５
７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
系は、治療標的、即ち、脳に近接して配置され得、それにより、全身用量の一部
のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０３２８】
他の制御された徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
ｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０３２９】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ組成物はまた、持続性徐放系によって適切に投
与される。持続性徐放組成物の適切な例としては、適切な重合体材料（例えば、
形作られた物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過ポ
リマーマトリックス、適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油中の乳濁液）ま
たはイオン交換樹脂、および溶けにくい誘導体（例えば、溶けにくい塩）が挙げ
られる。
与される。持続性徐放組成物の適切な例としては、適切な重合体材料（例えば、
形作られた物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過ポ
リマーマトリックス、適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油中の乳濁液）ま
たはイオン交換樹脂、および溶けにくい誘導体（例えば、溶けにくい塩）が挙げ
られる。
【０３３０】
持続性徐放マトリックスとしては、ポリラクチド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ）
（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸と
γ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙ
ｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル
メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．
１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ
．12：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇ
ｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，
９８８）が挙げられる。
（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸と
γ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙ
ｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル
メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．
１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ
．12：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇ
ｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，
９８８）が挙げられる。
【０３３１】
持続性徐放組成物としてはまた、本発明のリポソームに包括された組成物が挙
げられる（一般的に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５
３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅ
ｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，３１７〜３２７頁および３５３〜３６５頁（１９８９）を参照
のこと）。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを含むリポソームは、それ自体で
公知の方法によって調製され得る：ＤＥ ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６
９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ ５２，３２２；ＥＰ
３６，６７６；ＥＰ ８８，０４６；ＥＰ １４３，９４９；ＥＰ １４２，６
４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号お
よび同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ １０２，３２４。本来、リポソー
ムは、小さな（約２００〜８００オングストローム）の単層型であり、この中で
、脂質含量は、約３０ｍｏｌ％コレステロールより大きく、選択された部分は、
最適なＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド治療のために調節されている。
げられる（一般的に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５
３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅ
ｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，３１７〜３２７頁および３５３〜３６５頁（１９８９）を参照
のこと）。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを含むリポソームは、それ自体で
公知の方法によって調製され得る：ＤＥ ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６
９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ ５２，３２２；ＥＰ
３６，６７６；ＥＰ ８８，０４６；ＥＰ １４３，９４９；ＥＰ １４２，６
４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号お
よび同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ １０２，３２４。本来、リポソー
ムは、小さな（約２００〜８００オングストローム）の単層型であり、この中で
、脂質含量は、約３０ｍｏｌ％コレステロールより大きく、選択された部分は、
最適なＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド治療のために調節されている。
【０３３２】
本発明の化合物がポリペプチド、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、タンパ
ク質あるいはそれらのフラグメントまたは改変体をコードする核酸である、具体
的な実施形態において、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部とし
て構成し、そしてそれが細胞内になるように投与することにより（例えば、レト
ロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこ
と）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子
銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細
胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、
または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与す
ること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、その
コードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。ある
いは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿
主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
ク質あるいはそれらのフラグメントまたは改変体をコードする核酸である、具体
的な実施形態において、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部とし
て構成し、そしてそれが細胞内になるように投与することにより（例えば、レト
ロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこ
と）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子
銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細
胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、
または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与す
ること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、その
コードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。ある
いは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿
主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０３３３】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、アン
タゴニスト、アゴニストあるいはそれらのフラグメントまたは改変体は、以下を
含むがこれらに限定されない当該分野において公知の任意の方法を用いて投与さ
れ得る：送達部位での直接針注射、静脈注射、局所投与、カテーテル注入、微粒
子銃注射器、粒子加速器、ゲルフォーム（ｇｅｌｆｏａｍ）のスポンジ貯蔵物、
他の市販の貯蔵材料、浸透圧ポンプ、経口または座薬（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｉ
ａｌ）の固体の薬学的処方物、手術の間のデカンティング（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ
）または全身適用、エアロゾル送達。このような方法は、当該分野において公知
である。本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ分子は、本明細書中でより詳細に記載さ
れる、薬学的組成物の一部分として投与され得る。本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉ分子を投与する方法は、当該分野において公知であり、そして本明細書中でよ
り詳細に記載される。
タゴニスト、アゴニストあるいはそれらのフラグメントまたは改変体は、以下を
含むがこれらに限定されない当該分野において公知の任意の方法を用いて投与さ
れ得る：送達部位での直接針注射、静脈注射、局所投与、カテーテル注入、微粒
子銃注射器、粒子加速器、ゲルフォーム（ｇｅｌｆｏａｍ）のスポンジ貯蔵物、
他の市販の貯蔵材料、浸透圧ポンプ、経口または座薬（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｉ
ａｌ）の固体の薬学的処方物、手術の間のデカンティング（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ
）または全身適用、エアロゾル送達。このような方法は、当該分野において公知
である。本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ分子は、本明細書中でより詳細に記載さ
れる、薬学的組成物の一部分として投与され得る。本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉ分子を投与する方法は、当該分野において公知であり、そして本明細書中でよ
り詳細に記載される。
【０３３４】
本発明の薬学的組成物は、例えば、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、
経皮、または頬経路によって投与され得る。あるいは、または併用的に、投与は
経口であり得る。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康および体重、あ
る場合は、併用処置の種類、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存する。
経皮、または頬経路によって投与され得る。あるいは、または併用的に、投与は
経口であり得る。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康および体重、あ
る場合は、併用処置の種類、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存する。
【０３３５】
本発明の範囲内の組成物は、全ての組成物を含み、ここで、Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニストある
いはそれらの改変体またはフラグメントは、その意図される目的を達成するのに
有効な量で含まれる。個々の必要性は変化するが、各成分の有効量の最適な範囲
の決定は、当該分野の技術内である。有効な用量は、個々のＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、ある
いはそれらのフラグメントまたは改変体、組み合わされた治療薬（本明細書を参
照）の存在および性質、患者および患者の臨床状態の関数であり、そして約１０
ｎｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重で変化し得る。好ましい用量は、０．
１〜10ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニストある
いはそれらの改変体またはフラグメントは、その意図される目的を達成するのに
有効な量で含まれる。個々の必要性は変化するが、各成分の有効量の最適な範囲
の決定は、当該分野の技術内である。有効な用量は、個々のＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、ある
いはそれらのフラグメントまたは改変体、組み合わされた治療薬（本明細書を参
照）の存在および性質、患者および患者の臨床状態の関数であり、そして約１０
ｎｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重で変化し得る。好ましい用量は、０．
１〜10ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【０３３６】
非経口投与のための（例えば、画像処理のための検出可能に標識された形態で
の、あるいは治療のための遊離形態または組み合わされた形態での）Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニス
ト、あるいはそれらのフラグメントまたは改変体の調製物としては、無菌の水溶
性溶液または非水系溶液、懸濁液、および乳濁液が挙げられる。非水溶媒の例は
、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ
油）および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水溶
性キャリアとしては、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液（生理的食
塩水および緩衝化培地、非経口ビヒクル（塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ
糖、ブドウ糖および塩化ナトリウムを含む）、乳化リンガー溶液、または不揮発
油を含む）が挙げられる。静脈ビヒクルとしては、流体および栄養素補給器（例
えば、リンガーブドウ糖に基づくもの）などが挙げられる。防腐剤および他の添
加物（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性なガスなど）が
また、存在し得る。例えば、一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０を参照のこと。
の、あるいは治療のための遊離形態または組み合わされた形態での）Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニス
ト、あるいはそれらのフラグメントまたは改変体の調製物としては、無菌の水溶
性溶液または非水系溶液、懸濁液、および乳濁液が挙げられる。非水溶媒の例は
、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ
油）および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水溶
性キャリアとしては、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液（生理的食
塩水および緩衝化培地、非経口ビヒクル（塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ
糖、ブドウ糖および塩化ナトリウムを含む）、乳化リンガー溶液、または不揮発
油を含む）が挙げられる。静脈ビヒクルとしては、流体および栄養素補給器（例
えば、リンガーブドウ糖に基づくもの）などが挙げられる。防腐剤および他の添
加物（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性なガスなど）が
また、存在し得る。例えば、一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０を参照のこと。
【０３３７】
一般的提案として、１用量あたりで非経口投与されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
総薬学的有効量は、患者の体重の約０．０１ｎｇ／ｋｇ／日〜１０μｇ／ｋｇ／
日の範囲であるが、上記のように、これは治療的自由裁量に供される。より好ま
しくは、この用量は、少なくとも１．０ｎｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくは
ヒトについて、約１．０ｎｇ／ｋｇ／日と１００ｎｇ／ｋｇ／日との間である。
連続的に与えられる場合、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、代表的には、約０．０１ｎ
ｇ／ｋｇ／時間〜約１００ｎｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１〜４回
の注射、または例えば、ミニポンプを用いる連続的皮下注入のいずれかにより投
与される。静脈内バック溶液もまた用いられ得る。
総薬学的有効量は、患者の体重の約０．０１ｎｇ／ｋｇ／日〜１０μｇ／ｋｇ／
日の範囲であるが、上記のように、これは治療的自由裁量に供される。より好ま
しくは、この用量は、少なくとも１．０ｎｇ／ｋｇ／日、そして最も好ましくは
ヒトについて、約１．０ｎｇ／ｋｇ／日と１００ｎｇ／ｋｇ／日との間である。
連続的に与えられる場合、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、代表的には、約０．０１ｎ
ｇ／ｋｇ／時間〜約１００ｎｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１〜４回
の注射、または例えば、ミニポンプを用いる連続的皮下注入のいずれかにより投
与される。静脈内バック溶液もまた用いられ得る。
【０３３８】
抗体について、患者に投与される用量は、代表的に、患者の体重の０．１ｍｇ
／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される用量は、患者
の体重の０．１ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは、患者の体
重の１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。通常、ヒト抗体は、異種ポリペプチ
ドに対する免疫応答に起因して、他の種由来の抗体より長い半減期をヒトの体内
で有する。従って、ヒト抗体のより少ない用量およびより頻度の少ない投与が、
しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の用量および頻度は、例えば
、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような改変によって、抗体の取り込みおよ
び組織浸透（例えば、脳への）を増強することによって減少され得る。
／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される用量は、患者
の体重の０．１ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは、患者の体
重の１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。通常、ヒト抗体は、異種ポリペプチ
ドに対する免疫応答に起因して、他の種由来の抗体より長い半減期をヒトの体内
で有する。従って、ヒト抗体のより少ない用量およびより頻度の少ない投与が、
しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の用量および頻度は、例えば
、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような改変によって、抗体の取り込みおよ
び組織浸透（例えば、脳への）を増強することによって減少され得る。
【０３３９】
免疫系に影響を与えるＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド処置の過程は、特定
の最小限の日数（マウスの場合、７日）より長く続ける場合、最適らしい。変化
を観察するために必要とされる処置および起こるべき応答のための処置に続く間
欠期の長さは、所望の効果に依存して変化するようである。
の最小限の日数（マウスの場合、７日）より長く続ける場合、最適らしい。変化
を観察するために必要とされる処置および起こるべき応答のための処置に続く間
欠期の長さは、所望の効果に依存して変化するようである。
【０３４０】
非経口の投与のために、１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリ
ペプチドは、通常、所望の程度の純度でそれを混合することによって、一回の注
射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（
すなわち、利用される投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、そして
その処方物の他の成分と適合可能であるもの）と共に処方される。例えば、処方
物は，好ましくは、酸化剤またはポリペプチドにとって有害であることが知られ
ている他の化合物を含まない。
ペプチドは、通常、所望の程度の純度でそれを混合することによって、一回の注
射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（
すなわち、利用される投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、そして
その処方物の他の成分と適合可能であるもの）と共に処方される。例えば、処方
物は，好ましくは、酸化剤またはポリペプチドにとって有害であることが知られ
ている他の化合物を含まない。
【０３４１】
用語「非経口的」とは本明細書中において使用される場合、静脈内、筋肉内、
腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０３４２】
通常、処方物は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドと液体キャリアまたは細
かく分割された固体キャリア、あるいは両方とを均一かつ密接に接触することに
よって調製される。次いで、必要ならば、生成物は所望の処方物へと形作られる
。好ましくは、キャリアは、非経口キャリア、より好ましくは、レシピエントの
血液と等張な溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理
的食塩水、リンガー溶液およびブドウ糖溶液が挙げられる。不揮発油のような非
水系ビヒクルおよびリポソームのようなオレイン酸エチルはまた、本明細書中で
使用される。
かく分割された固体キャリア、あるいは両方とを均一かつ密接に接触することに
よって調製される。次いで、必要ならば、生成物は所望の処方物へと形作られる
。好ましくは、キャリアは、非経口キャリア、より好ましくは、レシピエントの
血液と等張な溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理
的食塩水、リンガー溶液およびブドウ糖溶液が挙げられる。不揮発油のような非
水系ビヒクルおよびリポソームのようなオレイン酸エチルはまた、本明細書中で
使用される。
【０３４３】
キャリアは、少量の添加物（等張性および化学的安定性を増強する物質）を適
切に含む。このような物質は、利用される投与量および濃度でレシピエントに有
毒でなく、そして以下が挙げられる：緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、
コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはその塩）；酸化防止剤（例えば、ア
スコルビン酸）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチ
ンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）
；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニ
ン）；単糖類、二糖類および他の糖質（セルロースまたはその誘導体、グルコー
ス、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ
）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例
えば、ナトリウム）；および／または非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベ
ート、ポロクサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはＰＥＧ）。
切に含む。このような物質は、利用される投与量および濃度でレシピエントに有
毒でなく、そして以下が挙げられる：緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、
コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはその塩）；酸化防止剤（例えば、ア
スコルビン酸）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチ
ンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）
；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニ
ン）；単糖類、二糖類および他の糖質（セルロースまたはその誘導体、グルコー
ス、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ
）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例
えば、ナトリウム）；および／または非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベ
ート、ポロクサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）またはＰＥＧ）。
【０３４４】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、代表的に、子のようなビヒクル中で、約０．００１
ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、０．１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で
、約３〜８のｐＨで処方される。前述の賦形剤、キャリアまたは安定剤の特定の
使用は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ塩の処方を生じることが理解される。
ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、０．１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で
、約３〜８のｐＨで処方される。前述の賦形剤、キャリアまたは安定剤の特定の
使用は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ塩の処方を生じることが理解される。
【０３４５】
治療的投与のために使用されるべきＴ１Ｒ様リガンドＩＩは、無菌でなくては
ならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通じる濾過に
よって容易に達成される。治療的Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ組成物は、通常、滅菌ア
クセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ）または皮下組織の注射
針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルの中に置かれる。
ならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通じる濾過に
よって容易に達成される。治療的Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ組成物は、通常、滅菌ア
クセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ）または皮下組織の注射
針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルの中に置かれる。
【０３４６】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、本来、一回または複数用量の容器（例えば、密封さ
れたアンプルまたはバイアル）中に、水溶液として、または再構成のための凍結
乾燥された処方物として貯蔵される。凍結乾燥された処方物の例として、１０ｍ
ｌのバイアルは、５ｍｌの滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
水溶液によって充填され、そして得られた混合物は、凍結乾燥される。この注入
溶液は、静菌性注射用蒸留水を用いて凍結乾燥したＴ１Ｒ様リガンドＩＩを再構
成することによって調製される。
れたアンプルまたはバイアル）中に、水溶液として、または再構成のための凍結
乾燥された処方物として貯蔵される。凍結乾燥された処方物の例として、１０ｍ
ｌのバイアルは、５ｍｌの滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
水溶液によって充填され、そして得られた混合物は、凍結乾燥される。この注入
溶液は、静菌性注射用蒸留水を用いて凍結乾燥したＴ１Ｒ様リガンドＩＩを再構
成することによって調製される。
【０３４７】
例えば、満足する結果が、一回投与されるか、または分割した用量で１日に１
〜４回投与される、おおよそ０．０５〜５０００ｎｇ／ｋｇ／日、好ましくは、
０．１〜１０００ｎｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、１０〜１００ｎｇ／ｋｇ／
日での投与量でＴ１Ｒ様リガンドＩＩ活性を有するポリペプチドの経口投与によ
って得られる。非経口投与（例えば、静脈内点滴または注射）の際、おおよそ０
．０１〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．０５〜１００ｎｇ／ｋｇ／日
、より好ましくは、０．１〜５０ｎｇ／ｋｇ／日での投与量が用いられ得る。従
って、患者への適切な毎日の投与量は、２．５ｎｇ〜２５０μｇ経口、好ましく
は、おおよそ５ｎｇ〜５０μｇ経口、より好ましくは、５０ｎｇ〜１２．５μｇ
経口であり、あるいは、おおよそ０．５ｎｇ〜２５μｇ静脈内、好ましくは、お
およそ２．５ｎｇ〜５００μｇ静脈内、そしてより好ましくは、５ｎｇ〜２．５
μｇ静脈内である。
〜４回投与される、おおよそ０．０５〜５０００ｎｇ／ｋｇ／日、好ましくは、
０．１〜１０００ｎｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、１０〜１００ｎｇ／ｋｇ／
日での投与量でＴ１Ｒ様リガンドＩＩ活性を有するポリペプチドの経口投与によ
って得られる。非経口投与（例えば、静脈内点滴または注射）の際、おおよそ０
．０１〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．０５〜１００ｎｇ／ｋｇ／日
、より好ましくは、０．１〜５０ｎｇ／ｋｇ／日での投与量が用いられ得る。従
って、患者への適切な毎日の投与量は、２．５ｎｇ〜２５０μｇ経口、好ましく
は、おおよそ５ｎｇ〜５０μｇ経口、より好ましくは、５０ｎｇ〜１２．５μｇ
経口であり、あるいは、おおよそ０．５ｎｇ〜２５μｇ静脈内、好ましくは、お
およそ２．５ｎｇ〜５００μｇ静脈内、そしてより好ましくは、５ｎｇ〜２．５
μｇ静脈内である。
【０３４８】
本発明の組成物は、単独でか、または他の治療薬剤と組み合わせて投与され得
る。本発明の組成物と組み合わされて投与され得る治療薬剤としては、ＩＬ−１
，ＩＬ−１ＲまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩファミリーの他のメンバー、化学療法
薬剤、抗ウイルス剤、抗生物質、ステロイドならびに非ステロイド抗炎症性の従
来の免疫療法薬剤、サイトカイン、ケモカインおよび／または増殖因子が挙げら
れるが、これらに限定されない。組み合わせは、同時にか（例えば、混合物とし
て、別々だが同時にか、あるいは連続して）か、または連続してかのいずれかで
投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が一緒に治療混合物として投与され
る提示を含み、そして組み合わされた薬剤が別々に、しかし同時に投与される手
順（例えば、同じ個体の別の静脈を介して）もまた含む。「組み合わされた」投
与は、さらに、初めに与えられる１つの化合物または薬剤、続いて第２の化合物
または薬剤の、別個の投与を含む。
る。本発明の組成物と組み合わされて投与され得る治療薬剤としては、ＩＬ−１
，ＩＬ−１ＲまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩファミリーの他のメンバー、化学療法
薬剤、抗ウイルス剤、抗生物質、ステロイドならびに非ステロイド抗炎症性の従
来の免疫療法薬剤、サイトカイン、ケモカインおよび／または増殖因子が挙げら
れるが、これらに限定されない。組み合わせは、同時にか（例えば、混合物とし
て、別々だが同時にか、あるいは連続して）か、または連続してかのいずれかで
投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が一緒に治療混合物として投与され
る提示を含み、そして組み合わされた薬剤が別々に、しかし同時に投与される手
順（例えば、同じ個体の別の静脈を介して）もまた含む。「組み合わされた」投
与は、さらに、初めに与えられる１つの化合物または薬剤、続いて第２の化合物
または薬剤の、別個の投与を含む。
【０３４９】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド（
および／もしくはそれらのアゴニストまたはアンタゴニスト）を他の提案された
造血剤または従来の造血剤を混合することを包含する。従って、例えば、本発明
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（および／もしくはそれらのア
ゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で赤血球新生刺激効果を示す化合物（
例えば、エリトロポイエチン、テストステロン、前駆体細胞刺激薬、インスリン
様増殖因子、プロスタグランジン、セロトニン、サイクリックＡＭＰ、プロラク
チンおよびトリヨードチゾニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｚｏｎｉｎｅ））と混合
され得る。本発明の化合物と、通常、再生不良性貧血を処置するために使用され
る化合物（例えば、メテノロン、スタノゾロール、およびナンドロロン）；鉄欠
乏性貧血を処置するために使用される化合物（例えば、鉄調製物）；悪性貧血を
処置するために使用される化合物（例えば、ビタミンＢ１２および／または葉酸
）；ならびに溶血性貧血を処置するために使用される化合物（例えば、副腎皮質
ステロイド（例えば、コルチコイド））との組合せも包含される。例えば、Ｒｅ
ｓｅｇｏｔｔｉら、Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ Ｍｅｄｉｃａ、２３：２４３−２４
８（１９８１）；Ｋｕｒｔｚ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４ａ：１０５−１
０８（１９８２）；ＭｃＧｏｎｉｇｌｅら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．２５：４３
７−４４４（１９８４）；およびＰａｖｌｏｖｉｃ−Ｋａｎｔｅｒａ、Ｅｘｐｔ
．Ｈｅｍａｔｏｌ．、８（補遺８）２８３−２９１（１９８０）（これらの各々
の内容は、本明細書によって、その全体が参考として援用される）を参照のこと
。
および／もしくはそれらのアゴニストまたはアンタゴニスト）を他の提案された
造血剤または従来の造血剤を混合することを包含する。従って、例えば、本発明
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（および／もしくはそれらのア
ゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で赤血球新生刺激効果を示す化合物（
例えば、エリトロポイエチン、テストステロン、前駆体細胞刺激薬、インスリン
様増殖因子、プロスタグランジン、セロトニン、サイクリックＡＭＰ、プロラク
チンおよびトリヨードチゾニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｚｏｎｉｎｅ））と混合
され得る。本発明の化合物と、通常、再生不良性貧血を処置するために使用され
る化合物（例えば、メテノロン、スタノゾロール、およびナンドロロン）；鉄欠
乏性貧血を処置するために使用される化合物（例えば、鉄調製物）；悪性貧血を
処置するために使用される化合物（例えば、ビタミンＢ１２および／または葉酸
）；ならびに溶血性貧血を処置するために使用される化合物（例えば、副腎皮質
ステロイド（例えば、コルチコイド））との組合せも包含される。例えば、Ｒｅ
ｓｅｇｏｔｔｉら、Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ Ｍｅｄｉｃａ、２３：２４３−２４
８（１９８１）；Ｋｕｒｔｚ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４ａ：１０５−１
０８（１９８２）；ＭｃＧｏｎｉｇｌｅら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．２５：４３
７−４４４（１９８４）；およびＰａｖｌｏｖｉｃ−Ｋａｎｔｅｒａ、Ｅｘｐｔ
．Ｈｅｍａｔｏｌ．、８（補遺８）２８３−２９１（１９８０）（これらの各々
の内容は、本明細書によって、その全体が参考として援用される）を参照のこと
。
【０３５０】
エリスロポエチンとの効果または相乗作用を増強する化合物はまた、本明細書
中でアジュバントとして有用であり、そして以下が挙げられるが、これらに限定
されない：アドレナリン様アゴニスト、甲状腺ホルモン、アンドロゲン、肝臓エ
リスロポエチン剤、エリトロトロピン（ｅｒｙｔｈｒｏｔｒｏｐｉｎ）およびエ
リトロゲニン（ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎｉｎ）。例えば、Ｄｕｎｎ、「Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９
８３）；Ｋａｌｍａｎｉ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、２２：３８３−３９１（１
９８２）；Ｓｈａｈｉｄｉ、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２８９：７２−８
０（１９７３）；Ｕｒａｂｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４９：１３１４−１
３２５（１９７９）；Ｂｉｌｌａｔら、Ｅｘｐｔ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１０：１
３３−１４０（１９８２）；Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔ、６
９：１７１−１７９（１９８３）；Ｃｏｇｎｏｔｅら、要約 ３６４、Ｐｒｏｄ
ｅｅｄｉｎｇｓ ７ｔｈ Ｉｎｔｌ．Ｃｏｎｇ．ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ（Ｑｕｅｂｅｃ Ｃｉｔｙ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｊｕｌｙ １−７，１９８４）
；およびＲｏｔｈｍａｎら、１９８２、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．、２０：１
０５−１０８（１９８２）を参照のこと。造血を刺激するための方法は、本発明
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（および／またはそれらのアゴ
ニストまたはアンタゴニスト）を含む薬学的組成物の造血的に有効な量（すなわ
ち、血球の形成に影響を与える量）を、患者に投与することを包含する。本発明
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドおよび／もしくはそれらのアゴ
ニストまたはアンタゴニストは、任意の技術（非経口、舌下、全身、肺内および
鼻内を含むが、これらに限定されない）ならびに本明細書中でさらに議論される
技術によって患者に投与される。薬学的組成物は、必要に応じて、以下からなる
群の１以上のメンバーを含む：エリスロポエチン、テストステロン、前駆体細胞
刺激薬、インスリン様増殖因子、プロスタグランジン、セロトニン、サイクリッ
クＡＭＰ、プロラクチン、トリヨードチゾニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｚｏｎｉ
ｎｅ）、メテノロン、スタノロゾールおよびナンドドロン、鉄調製物、ビタミン
Ｂ１２、葉酸、副腎皮質ステロイド。
中でアジュバントとして有用であり、そして以下が挙げられるが、これらに限定
されない：アドレナリン様アゴニスト、甲状腺ホルモン、アンドロゲン、肝臓エ
リスロポエチン剤、エリトロトロピン（ｅｒｙｔｈｒｏｔｒｏｐｉｎ）およびエ
リトロゲニン（ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎｉｎ）。例えば、Ｄｕｎｎ、「Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９
８３）；Ｋａｌｍａｎｉ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、２２：３８３−３９１（１
９８２）；Ｓｈａｈｉｄｉ、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２８９：７２−８
０（１９７３）；Ｕｒａｂｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４９：１３１４−１
３２５（１９７９）；Ｂｉｌｌａｔら、Ｅｘｐｔ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１０：１
３３−１４０（１９８２）；Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔ、６
９：１７１−１７９（１９８３）；Ｃｏｇｎｏｔｅら、要約 ３６４、Ｐｒｏｄ
ｅｅｄｉｎｇｓ ７ｔｈ Ｉｎｔｌ．Ｃｏｎｇ．ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ（Ｑｕｅｂｅｃ Ｃｉｔｙ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｊｕｌｙ １−７，１９８４）
；およびＲｏｔｈｍａｎら、１９８２、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．、２０：１
０５−１０８（１９８２）を参照のこと。造血を刺激するための方法は、本発明
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（および／またはそれらのアゴ
ニストまたはアンタゴニスト）を含む薬学的組成物の造血的に有効な量（すなわ
ち、血球の形成に影響を与える量）を、患者に投与することを包含する。本発明
のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドおよび／もしくはそれらのアゴ
ニストまたはアンタゴニストは、任意の技術（非経口、舌下、全身、肺内および
鼻内を含むが、これらに限定されない）ならびに本明細書中でさらに議論される
技術によって患者に投与される。薬学的組成物は、必要に応じて、以下からなる
群の１以上のメンバーを含む：エリスロポエチン、テストステロン、前駆体細胞
刺激薬、インスリン様増殖因子、プロスタグランジン、セロトニン、サイクリッ
クＡＭＰ、プロラクチン、トリヨードチゾニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｚｏｎｉ
ｎｅ）、メテノロン、スタノロゾールおよびナンドドロン、鉄調製物、ビタミン
Ｂ１２、葉酸、副腎皮質ステロイド。
【０３５１】
さらなる好ましい実施形態において、本明細書中の組成物は、造血増殖因子と
組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る造血増殖因子とし
ては、ＬＥＵＫＩＮＥ（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭＴＭ）およびＮＥＵＰＯＧＥ
Ｎ（ＦＩＬＧＲＡＳＴＩＭＴＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る造血増殖因子とし
ては、ＬＥＵＫＩＮＥ（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭＴＭ）およびＮＥＵＰＯＧＥ
Ｎ（ＦＩＬＧＲＡＳＴＩＭＴＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５２】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ１様ファミリーおよびＩＬ
１Ｒ様ファミリーの他のメンバーと組み合わせて投与される。本発明の組成物と
共に投与され得る分子としては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲおよびＩ
Ｌ１−Ｒａが挙げられるが、これらに限定されない。
１Ｒ様ファミリーの他のメンバーと組み合わせて投与される。本発明の組成物と
共に投与され得る分子としては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲおよびＩ
Ｌ１−Ｒａが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５３】
本発明の組成物と組み合わせて投与され得る従来の非特異的な免疫抑制剤とし
ては、ステロイド、シクロスポリン、スウロスポリンアナログ、シクロホスファ
ミドメチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５
−デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、およびＴ細胞
に応答する機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが
、これらに限定されない。
ては、ステロイド、シクロスポリン、スウロスポリンアナログ、シクロホスファ
ミドメチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５
−デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、およびＴ細胞
に応答する機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが
、これらに限定されない。
【０３５４】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗ウイルス剤と組み合わせて
投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗ウイルス剤としては、アシク
ロビル、リバビリン、アマンタジンおよびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎ
ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗ウイルス剤としては、アシク
ロビル、リバビリン、アマンタジンおよびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎ
ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５５】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗生剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物と共に投与され得る抗生剤としては、以下が挙げられるが
、これらに限定されない：アモキシリン、アミノ配糖体、β−ラクタム（糖ペプ
チド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン（Ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、ク
ロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、シプロフロキサ
シン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生物質、メト
ロニダゾル、ペニシリン、キノロン類、リファンピン、ストレプトマイシン、ス
ルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファ
ントキサゾール（ｓｕｌｆａｍｔｈｏｘａｚｏｌｅ）およびバンコマイシン。
れる。本発明の組成物と共に投与され得る抗生剤としては、以下が挙げられるが
、これらに限定されない：アモキシリン、アミノ配糖体、β−ラクタム（糖ペプ
チド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン（Ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、ク
ロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、シプロフロキサ
シン、エリスロマイシン、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生物質、メト
ロニダゾル、ペニシリン、キノロン類、リファンピン、ストレプトマイシン、ス
ルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファ
ントキサゾール（ｓｕｌｆａｍｔｈｏｘａｚｏｌｅ）およびバンコマイシン。
【０３５６】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。
み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。
【０３５７】
別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の組成物とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。
れる。本発明の組成物とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０３５８】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。
投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ
２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３
、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられ
るが、これらに限定されない。
【０３５９】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上のケモカインと組合せ
て投与される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群よ
り選択されるα（ＣｘＣ）ケモカインまたはγ−インターフェロン誘導タンパク
質−１０（γＩＰ−１０）、インタロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板第４因子
（ＰＦ４）、好中球活性化因子（ＮＡＰ−２）、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲ
Ｏ−γ、好中球活性化ペプチド（ＥＮＡ−７８）、顆粒球化学誘導タンパク質−
２（ＧＣＰ−２）および間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１、すなわち前Ｂ細胞
刺激因子（ＰＢＳＦ）（ｐｒｅ−Ｂ−ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａ
ｃｔｏｒ））からなる群より選択されるαケモカインをコードする核酸；および
／またはβ（ＣＣ）ケモカインもしくは以下からなる群より選択されるβケモカ
インをコードする核酸：ＲＡＮＴＥＳ（活性化の際にレギュレートされ、正常な
Ｔ発現され、そして分泌される）、マクロファージ炎症タンパク質−１α（ＭＩ
Ｐ−１α）、マクロファージ炎症タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）、単球走化
タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、単球走化タンパク質−２（ＭＣＰ−２）、単球
走化タンパク質−３（ＭＣＰ−３）、単吸走化タンパク質−４（ＭＣＰ−４）、
マクロファージ炎症タンパク質−１γ（ＭＩＰ−１γ）、マクロファージ炎症タ
ンパク質−３α（ＭＩＰ−３α）、マクロファージ炎症タンパク質−３β（ＭＩ
Ｐ−３β）、マクロファージ炎症タンパク質−４（ＭＩＰ−４／ＤＣ−ＣＫ−１
／ＰＡＲＣ）、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）、ＥｘｏｄｕｓおよびＩ−３０
９；および／またはγ（Ｃ）ケモカイン、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃ
ｔｉｎ）と組合せて投与される。
て投与される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群よ
り選択されるα（ＣｘＣ）ケモカインまたはγ−インターフェロン誘導タンパク
質−１０（γＩＰ−１０）、インタロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板第４因子
（ＰＦ４）、好中球活性化因子（ＮＡＰ−２）、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲ
Ｏ−γ、好中球活性化ペプチド（ＥＮＡ−７８）、顆粒球化学誘導タンパク質−
２（ＧＣＰ−２）および間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１、すなわち前Ｂ細胞
刺激因子（ＰＢＳＦ）（ｐｒｅ−Ｂ−ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａ
ｃｔｏｒ））からなる群より選択されるαケモカインをコードする核酸；および
／またはβ（ＣＣ）ケモカインもしくは以下からなる群より選択されるβケモカ
インをコードする核酸：ＲＡＮＴＥＳ（活性化の際にレギュレートされ、正常な
Ｔ発現され、そして分泌される）、マクロファージ炎症タンパク質−１α（ＭＩ
Ｐ−１α）、マクロファージ炎症タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）、単球走化
タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、単球走化タンパク質−２（ＭＣＰ−２）、単球
走化タンパク質−３（ＭＣＰ−３）、単吸走化タンパク質−４（ＭＣＰ−４）、
マクロファージ炎症タンパク質−１γ（ＭＩＰ−１γ）、マクロファージ炎症タ
ンパク質−３α（ＭＩＰ−３α）、マクロファージ炎症タンパク質−３β（ＭＩ
Ｐ−３β）、マクロファージ炎症タンパク質−４（ＭＩＰ−４／ＤＣ−ＣＫ−１
／ＰＡＲＣ）、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）、ＥｘｏｄｕｓおよびＩ−３０
９；および／またはγ（Ｃ）ケモカイン、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃ
ｔｉｎ）と組合せて投与される。
【０３６０】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、抗原性タンパク質と組み合わ
せて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗原性タンパク質として
は以下が挙げられるがこれらに限定されない：欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６
に記載の、神経膠腫由来増殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１
０に記載の血小板由来因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３
１７に記載の、血小板由来因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号９２／０６
１９４に記載の血小板増殖因子（Ｐ１ＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ，４：２５９〜２６８（１９９３）に記載の血小板増殖因子−２
（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９に記載の血管内皮増殖因
子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４７７に記載の血管内皮増殖因子−
Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５に記載の血管内皮増殖
因子−２；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６に記載の血管内皮増殖因子Ｂ−１
８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３に記載の血管
内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２に記載
の血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、およびドイツ特許番号ＤＥ１９６３
９６０１に記載の血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）。上記の参考文献は、
本明細書において参考として援用されている。
せて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗原性タンパク質として
は以下が挙げられるがこれらに限定されない：欧州特許番号ＥＰ−３９９８１６
に記載の、神経膠腫由来増殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−６８２１１
０に記載の血小板由来因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許番号ＥＰ−２８２３
１７に記載の、血小板由来因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号９２／０６
１９４に記載の血小板増殖因子（Ｐ１ＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ，４：２５９〜２６８（１９９３）に記載の血小板増殖因子−２
（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９に記載の血管内皮増殖因
子（ＶＥＧＦ）；欧州特許番号ＥＰ−５０６４７７に記載の血管内皮増殖因子−
Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５に記載の血管内皮増殖
因子−２；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６に記載の血管内皮増殖因子Ｂ−１
８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３に記載の血管
内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２に記載
の血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、およびドイツ特許番号ＤＥ１９６３
９６０１に記載の血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）。上記の参考文献は、
本明細書において参考として援用されている。
【０３６１】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、線維芽細胞増殖因子と組み合
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。
わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子と
しては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧ
Ｆ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、
ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０３６２】
さらに、本発明の組成物は、単独で、または放射線療法を含むがこれに限定さ
れない、他の治療レジメンと組み合わせて投与され得る。このような併用療法は
、連続してまたは同時に投与され得る。
れない、他の治療レジメンと組み合わせて投与され得る。このような併用療法は
、連続してまたは同時に投与され得る。
【０３６３】
（診断キット）
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で充填された１つ以上
の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。必要に応じて、このよう
な容器と関連する注記が、薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販
売を管理する政府機関によって指示される。この注意書きは、ヒト投与のための
製造、使用、または販売の機関による承認を反映している。
の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。必要に応じて、このよう
な容器と関連する注記が、薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販
売を管理する政府機関によって指示される。この注意書きは、ヒト投与のための
製造、使用、または販売の機関による承認を反映している。
【０３６４】
目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０３６５】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。
【０３６６】
本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１ ２１ Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム
（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）；発光標識（例えば、ルミノ
ール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、なら
びにビオチンが挙げられる。
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１ ２１ Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム
（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）；発光標識（例えば、ルミノ
ール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、なら
びにビオチンが挙げられる。
【０３６７】
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０３６８】
被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断の画像を産生するた
めに必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解
される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量
は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化
抗体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優
先的に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、
「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅ
ｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（
Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌおよび
Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１
９８２）において、記載される。
めに必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解
される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量
は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化
抗体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優
先的に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、
「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅ
ｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（
Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌおよび
Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１
９８２）において、記載される。
【０３６９】
使用する標識の型および投与の様式を含む、いくつかの変動に依存して、標識
化分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合
していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の
時間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別
の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間で
ある。
化分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合
していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の
時間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別
の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間で
ある。
【０３７０】
１つの実施形態において、疾患および障害をモニターすることは、疾患または
障害（ｄｉｓｅａｓｅ）を診断するための方法を繰り返すことによって実施され
る（例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断か
ら１年後、など）。
障害（ｄｉｓｅａｓｅ）を診断するための方法を繰り返すことによって実施され
る（例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断か
ら１年後、など）。
【０３７１】
標識化分子の存在は、インビボスキャニングについての当該分野で公知の方法
を使用して患者中で検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を決定するための適切な方法を決定することができ
る。本発明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスは、コンピュー
タ連動断層撮影法（ＣＴ）、体全体のスキャン（例えば、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ）放射断層撮影法（ＰＥＴ））、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波診
断法を含むが、これらに限定されない。
を使用して患者中で検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を決定するための適切な方法を決定することができ
る。本発明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスは、コンピュー
タ連動断層撮影法（ＣＴ）、体全体のスキャン（例えば、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ）放射断層撮影法（ＰＥＴ））、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波診
断法を含むが、これらに限定されない。
【０３７２】
特定の実施形態において、分子を放射性同位体で標識し、そして放射応答外科
的機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）
を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を蛍光化合物で標識
し、そして蛍光応答スキャニング機器を使用して患者中で検出する。別の実施形
態において、分子を陽電子射出金属で標識し、そして陽電子射出断層撮影法を使
用して患者中で検出する。さらに別の実施形態において、分子を常磁性標識で標
識し、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。
的機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）
を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を蛍光化合物で標識
し、そして蛍光応答スキャニング機器を使用して患者中で検出する。別の実施形
態において、分子を陽電子射出金属で標識し、そして陽電子射出断層撮影法を使
用して患者中で検出する。さらに別の実施形態において、分子を常磁性標識で標
識し、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。
【０３７３】
本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出す
るための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化
合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、ま
たは一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出す
るための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化
合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、ま
たは一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０３７４】
本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。
【０３７５】
より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着された固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポ
ーター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原
への抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
ド抗原が付着された固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポ
ーター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原
への抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０３７６】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血
清をスクリーニングする際に使用するための、診断キットを含む。この診断キッ
トは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応する実
質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポ
リペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において
、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノク
ロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、二次標識化モノクロナール
抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原を
含み得る。
清をスクリーニングする際に使用するための、診断キットを含む。この診断キッ
トは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応する実
質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポ
リペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において
、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノク
ロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、二次標識化モノクロナール
抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原を
含み得る。
【０３７７】
１つの診断構成において、試験血清を、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応させる。特定の抗原抗体とこの試薬との結合、およ
び洗浄することによる結合していない血清成分の除去の後、この試薬をレポータ
ー標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に
比例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合
していない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決
定する。代表的に、レポーターは酵素であり、この酵素は、適切な蛍光性基質、
発光性基質または比色用基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下
で固相をインキュベートすることにより検出される。
抗原を有する固相試薬と反応させる。特定の抗原抗体とこの試薬との結合、およ
び洗浄することによる結合していない血清成分の除去の後、この試薬をレポータ
ー標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に
比例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合
していない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決
定する。代表的に、レポーターは酵素であり、この酵素は、適切な蛍光性基質、
発光性基質または比色用基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下
で固相をインキュベートすることにより検出される。
【０３７８】
上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（
例えば、高分子ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材
料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法として
は、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化
学的に活性な基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアル
デヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎ
ｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプ
トアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得
る。
例えば、高分子ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材
料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法として
は、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化
学的に活性な基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアル
デヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎ
ｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプ
トアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得
る。
【０３７９】
従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供
する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト
抗体を備える。
する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト
抗体を備える。
【０３８０】
（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ障害の処置）
本発明は、本発明の化合物または薬学的組成物の有効量の被験体への投与によ
る、処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、この化合
物は、実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない
副作用を生じる物質を実質的に含まない）。被験体は好ましくはウシ、ブタ、ウ
マ、ニワトリ、ネコ、イヌなどのような動物を含むがこれに限定されない動物で
あり、好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
る、処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、この化合
物は、実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない
副作用を生じる物質を実質的に含まない）。被験体は好ましくはウシ、ブタ、ウ
マ、ニワトリ、ネコ、イヌなどのような動物を含むがこれに限定されない動物で
あり、好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０３８１】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは、インターロイキンＩ（ＩＬ−
１）およびＴ１Ｒリガンドと生物学的活性を共有すると、本発明者らは考えてい
る。従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、抗体、アンタゴニスト、アゴ
ニスト、タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体は、個体の細胞、組
織、または身体に外因性に適用され、治療効果を生じ得る。詳細には、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩタンパク質活性の標準レベルの低下によって生じる障害は、本発明
のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたはアゴニストの有効量を投与すること
によって処置され得る。好ましくは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質活性を増
大するのに有効な量の本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたはアゴニ
ストを含む薬学的組成物が投与される。このような治療が有効である障害は、上
記および本明細書において考察されている。
１）およびＴ１Ｒリガンドと生物学的活性を共有すると、本発明者らは考えてい
る。従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、抗体、アンタゴニスト、アゴ
ニスト、タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体は、個体の細胞、組
織、または身体に外因性に適用され、治療効果を生じ得る。詳細には、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩタンパク質活性の標準レベルの低下によって生じる障害は、本発明
のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたはアゴニストの有効量を投与すること
によって処置され得る。好ましくは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質活性を増
大するのに有効な量の本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたはアゴニ
ストを含む薬学的組成物が投与される。このような治療が有効である障害は、上
記および本明細書において考察されている。
【０３８２】
実施例１８に示されるように、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、ＣＤ３４＋細胞の増
殖を刺激する。従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、他の造血幹細胞および造血幹
細胞に起源する細胞を刺激すると期待される。
殖を刺激する。従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、他の造血幹細胞および造血幹
細胞に起源する細胞を刺激すると期待される。
【０３８３】
造血幹細胞は、造血組織または血液形成組織において見出される発生的に多能
性の幹細胞である。この細胞は、系等特異的因子と複数の増殖因子との間の相乗
作用を通じて、成熟血球に成熟する能力を有している。造血細胞を含む組織は、
例えば、骨髄、脾臓および胸腺を含む種々の身体位置で見出される。造血のプロ
セスにおいて、前駆細胞の異なる集団がより原始的で未分化の幹細胞かた生じる
。引き続く発達は最終的に、前駆細胞から、成熟したクラスの血球（例えば、顆
粒球、単球、好酸球、巨核球、および肥満細胞）の分化を生じる。
性の幹細胞である。この細胞は、系等特異的因子と複数の増殖因子との間の相乗
作用を通じて、成熟血球に成熟する能力を有している。造血細胞を含む組織は、
例えば、骨髄、脾臓および胸腺を含む種々の身体位置で見出される。造血のプロ
セスにおいて、前駆細胞の異なる集団がより原始的で未分化の幹細胞かた生じる
。引き続く発達は最終的に、前駆細胞から、成熟したクラスの血球（例えば、顆
粒球、単球、好酸球、巨核球、および肥満細胞）の分化を生じる。
【０３８４】
当業者は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、ア
ンタゴニスト、アゴニスト、またはそのフラグメントもしくは改変体の有効量が
、このような投与が指示されるいずれの状態についても経験的に決定され得るこ
とを理解する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ活性を有するポリペプチド、あるいはこの
ような活性を調節する抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、またはそのフラグメ
ントもしくは改変体は、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、およ
び／または賦形剤を組み合わせて、薬学的組成物中で投与され得る。ヒト患者に
っ投与される場合、本発明の薬学的組成物の毎日の総使用量が信頼できる医学的
判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解される。任意の特定の患者
についての特定の治療上の有効量は、以下を含む種々の因子に依存する：達成さ
れるべき反応の型および程度；特定の組成物および他の因子（用いられる場合）
；患者の年齢、体重、健康状態、性別および食事；組成物の投与時間、投与経路
、および排泄速度；処置の期間；特定の組成物と組み合わせて、または同時に用
いられる薬物（例えば、化学療法剤）；および医療分野で周知の同様の因子。
ンタゴニスト、アゴニスト、またはそのフラグメントもしくは改変体の有効量が
、このような投与が指示されるいずれの状態についても経験的に決定され得るこ
とを理解する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ活性を有するポリペプチド、あるいはこの
ような活性を調節する抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、またはそのフラグメ
ントもしくは改変体は、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、およ
び／または賦形剤を組み合わせて、薬学的組成物中で投与され得る。ヒト患者に
っ投与される場合、本発明の薬学的組成物の毎日の総使用量が信頼できる医学的
判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解される。任意の特定の患者
についての特定の治療上の有効量は、以下を含む種々の因子に依存する：達成さ
れるべき反応の型および程度；特定の組成物および他の因子（用いられる場合）
；患者の年齢、体重、健康状態、性別および食事；組成物の投与時間、投与経路
、および排泄速度；処置の期間；特定の組成物と組み合わせて、または同時に用
いられる薬物（例えば、化学療法剤）；および医療分野で周知の同様の因子。
【０３８５】
治療で用いるべきＴ１Ｒ様リガンドＩＩ組成物はまた、個々の患者の臨床状態
（特にＴ１Ｒ様リガンドＩＩ単独での処置の副作用）、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ組
成物の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、および医師に公知の他の因子
を考慮して優良医学基準を用いて同時に処方および投与される。従って、本明細
書における目的のためのＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの「有効量」は、こ
のような考慮によって決定される。この組成物は、所望の場合、少量の湿潤剤も
しくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤
、乳剤（エマルジョン）、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物など
の形態を取り得る。
（特にＴ１Ｒ様リガンドＩＩ単独での処置の副作用）、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ組
成物の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、および医師に公知の他の因子
を考慮して優良医学基準を用いて同時に処方および投与される。従って、本明細
書における目的のためのＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの「有効量」は、こ
のような考慮によって決定される。この組成物は、所望の場合、少量の湿潤剤も
しくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤
、乳剤（エマルジョン）、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物など
の形態を取り得る。
【０３８６】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、効果
的な量または不十分な量のＴ１Ｒ様リガンドＩＩによって、（直接または間接的
に）媒介される任意の障害についての処置を開発するのに有用であり得る。Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは、このような障害に罹患している患者（例えば
、哺乳動物、好ましくはヒト）に投与され得る。あるいは、遺伝子治療アプロー
チは、このような障害を処置するために適用され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩヌ
クレオチド配列の本明細書における開示により、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の
欠損の検出、および正常なＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード遺伝子でのその置換が可
能になる。欠損遺伝子は、インビトロ診断アッセイにおいて、およびこの遺伝子
の欠損が疑われる患者由来のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の配列と、本明細書に
開示されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩヌクレオチド配列の比較によって、検出され得
る。
的な量または不十分な量のＴ１Ｒ様リガンドＩＩによって、（直接または間接的
に）媒介される任意の障害についての処置を開発するのに有用であり得る。Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは、このような障害に罹患している患者（例えば
、哺乳動物、好ましくはヒト）に投与され得る。あるいは、遺伝子治療アプロー
チは、このような障害を処置するために適用され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩヌ
クレオチド配列の本明細書における開示により、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の
欠損の検出、および正常なＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード遺伝子でのその置換が可
能になる。欠損遺伝子は、インビトロ診断アッセイにおいて、およびこの遺伝子
の欠損が疑われる患者由来のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の配列と、本明細書に
開示されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩヌクレオチド配列の比較によって、検出され得
る。
【０３８７】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、異なる細胞型において、Ｔ１Ｒ
様リガンドＩＩリガンド相互作用を阻害することから生じる生物学的効果を研究
するための検索ツールとして用いられる。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは
また、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩリガンドもしくはその
相互作用を検出するためのインビトロアッセイにおいて使用され得る。
様リガンドＩＩリガンド相互作用を阻害することから生じる生物学的効果を研究
するための検索ツールとして用いられる。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは
また、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩリガンドもしくはその
相互作用を検出するためのインビトロアッセイにおいて使用され得る。
【０３８８】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ−ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴ１
Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分
化、もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することにより、免疫系の疾患
、障害および／または状態を、処置、予防、および／または診断するのに有用で
あり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発達し、多能性幹細胞
から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）およびリンパ
系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これら免疫疾患、障害およ
び／または障害の病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌また
はいくつかの自己免疫性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による
）または感染的であり得る。さらに、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ−ポリヌクレオチド
もしくはポリペプチド、またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストもしくはアン
タゴニストは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（ｄｅ
ｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、造血起点の細胞
（例えば、骨髄細胞（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）および
リンパ系細胞（ＢおよびＴリンパ細胞））の増殖および／または分化を刺激する
と考えられている。以下に示されるように、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド
は、ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激するために使用され得る。
Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分
化、もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することにより、免疫系の疾患
、障害および／または状態を、処置、予防、および／または診断するのに有用で
あり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発達し、多能性幹細胞
から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）およびリンパ
系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これら免疫疾患、障害およ
び／または障害の病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌また
はいくつかの自己免疫性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による
）または感染的であり得る。さらに、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ−ポリヌクレオチド
もしくはポリペプチド、またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストもしくはアン
タゴニストは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（ｄｅ
ｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、造血起点の細胞
（例えば、骨髄細胞（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）および
リンパ系細胞（ＢおよびＴリンパ細胞））の増殖および／または分化を刺激する
と考えられている。以下に示されるように、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド
は、ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激するために使用され得る。
【０３８９】
本発明によって、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質活性の増強レベルによって
生じる障害は、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの有効量のアンタゴ
ニストを投与することによって処置され得る。従って、本発明のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩポリペプチドと結合する、抗体フラグメントまたは抗体（好ましくは、モ
ノクローナル）は、細胞外ドメインのような可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパ
ク質（これは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩレセプターと結合するインタクトなタンパ
ク質と競合する）である場合、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ障害を処置するのに有用で
ある。このような抗体および／または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は
、好ましくは、薬学的に受容可能な組成物中で提供される。
生じる障害は、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの有効量のアンタゴ
ニストを投与することによって処置され得る。従って、本発明のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩポリペプチドと結合する、抗体フラグメントまたは抗体（好ましくは、モ
ノクローナル）は、細胞外ドメインのような可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパ
ク質（これは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩレセプターと結合するインタクトなタンパ
ク質と競合する）である場合、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ障害を処置するのに有用で
ある。このような抗体および／または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質は
、好ましくは、薬学的に受容可能な組成物中で提供される。
【０３９０】
本明細書中に記載される抗体は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体
、またはリンホカインもしくは造血増殖因子などと組合せて有利に利用され得、
これにより、この抗体と相互作用する効果細胞の数または活性を増加させるのに
役立つ。
、またはリンホカインもしくは造血増殖因子などと組合せて有利に利用され得、
これにより、この抗体と相互作用する効果細胞の数または活性を増加させるのに
役立つ。
【０３９１】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ−ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴ１
Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストもしくはアンタゴニストは、造血細胞の欠損もし
くは障害を処置もしくは検出するのに有用であり得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ−
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニ
ストもしくはアンタゴニストは、造血細胞（多能性幹細胞を含む）の分化および
増殖を増加させるために使用され得、特定（多数）の型の造血細胞の減少と関係
する障害を処置するのに有効である。免疫欠損症候群の例としては、血液タンパ
ク質の疾患、障害および／または状態（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガ
ンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・
ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、
リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィ
スコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン尿症が
挙げられるが、それらに限定されない。
Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストもしくはアンタゴニストは、造血細胞の欠損もし
くは障害を処置もしくは検出するのに有用であり得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ−
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニ
ストもしくはアンタゴニストは、造血細胞（多能性幹細胞を含む）の分化および
増殖を増加させるために使用され得、特定（多数）の型の造血細胞の減少と関係
する障害を処置するのに有効である。免疫欠損症候群の例としては、血液タンパ
ク質の疾患、障害および／または状態（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガ
ンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・
ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、
リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィ
スコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン尿症が
挙げられるが、それらに限定されない。
【０３９２】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプ
チドならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、この
ような増加（すなわち、造血素治療）の必要な個体において、血液細胞の濃度を
増加させるために使用され得る。本発明の組成物を投与することによって緩和さ
れ得る状態としては、好中球減少症、貧血、および血小板減少が挙げられるが、
これらに限定されない。
チドならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、この
ような増加（すなわち、造血素治療）の必要な個体において、血液細胞の濃度を
増加させるために使用され得る。本発明の組成物を投与することによって緩和さ
れ得る状態としては、好中球減少症、貧血、および血小板減少が挙げられるが、
これらに限定されない。
【０３９３】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプ
チド（ならびに／あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト）は、エリトロ
ポイエチン治療において使用され、この治療は、血液の酸素保持能力を補充する
ことに関する。本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（ならび
に／あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト）は、例えば以下のような、
一般に輸血を必要とする患者における疾患または状態を処置または予防するため
に使用され得る：外傷犠牲者、手術患者、透析患者および様々な血液成分障害疾
患（例えば、血友病、嚢胞性線維症、妊娠、月経障害、未熟児の早期貧血、脊髄
損傷、加齢、様々な腫瘍性疾患状態など）を有する患者。血液の酸素運搬能力の
補充を必要とし、本発明の範囲内である患者の状態の例には、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：低いまたは不完全な赤血球細胞産生により特徴付け
られる血液障害の処置、慢性腎不全に関連する貧血、網状赤血球応答の刺激、鉄
動態効果（例えば、血漿鉄交換効果および骨髄移行時間効果）の発生、赤血球の
質量変化、ヘモグロビンＣ合成の刺激、脊椎動物における増加したレベルのヘマ
クリット。本発明はまた、個体（例えば、低酸素環境の状態に遭遇している個体
）の酸素運搬能力を増強するための処置を提供する。
チド（ならびに／あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト）は、エリトロ
ポイエチン治療において使用され、この治療は、血液の酸素保持能力を補充する
ことに関する。本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（ならび
に／あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト）は、例えば以下のような、
一般に輸血を必要とする患者における疾患または状態を処置または予防するため
に使用され得る：外傷犠牲者、手術患者、透析患者および様々な血液成分障害疾
患（例えば、血友病、嚢胞性線維症、妊娠、月経障害、未熟児の早期貧血、脊髄
損傷、加齢、様々な腫瘍性疾患状態など）を有する患者。血液の酸素運搬能力の
補充を必要とし、本発明の範囲内である患者の状態の例には、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：低いまたは不完全な赤血球細胞産生により特徴付け
られる血液障害の処置、慢性腎不全に関連する貧血、網状赤血球応答の刺激、鉄
動態効果（例えば、血漿鉄交換効果および骨髄移行時間効果）の発生、赤血球の
質量変化、ヘモグロビンＣ合成の刺激、脊椎動物における増加したレベルのヘマ
クリット。本発明はまた、個体（例えば、低酸素環境の状態に遭遇している個体
）の酸素運搬能力を増強するための処置を提供する。
【０３９４】
本明細書中にさらに記載されるように、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオ
チド、アゴニスト、またはアンタゴニストを使用して、他のサイトカインと組み
合わせて使用した場合または単独で使用した場合のいずれかで、造血細胞および
骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
チド、アゴニスト、またはアンタゴニストを使用して、他のサイトカインと組み
合わせて使用した場合または単独で使用した場合のいずれかで、造血細胞および
骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
【０３９５】
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはそ
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストはまた、造血細胞の増加および分化
を阻害するために使用され得、従って、化学治療法の間に、化学療法剤から骨髄
幹細胞を保護するために利用され得る。この抗増殖効果は、化学療法剤の高度な
用量の投与を可能にし、従って、より効果的な化学療法治療を可能にし得る。
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストはまた、造血細胞の増加および分化
を阻害するために使用され得、従って、化学治療法の間に、化学療法剤から骨髄
幹細胞を保護するために利用され得る。この抗増殖効果は、化学療法剤の高度な
用量の投与を可能にし、従って、より効果的な化学療法治療を可能にし得る。
【０３９６】
本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはそ
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、未熟な造血前駆細胞、例えば顆
粒球、マクロファージまたは単核細胞の分化を一時的に防ぐことによって、それ
らを拡大するために用いられ得る。これらの骨髄細胞は、インビトロで培養され
得る。このように、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、ポリヌクレオチド、ま
たはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストは、骨髄移植および／または遺
伝子治療の目的でインビトロにおいて造血幹細胞のモジュレータとして有用であ
り得る。幹細胞は、まれであり、遺伝子療法のために遺伝子を導入するに最も有
用であるので、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、幹細胞の富化された集団を単離するた
めに使用され得る。分裂している細胞を迅速に殺傷する５−Ｆｕのような細胞毒
の存在下で、細胞を培養することによって、幹細胞は富化され得る。一方、幹細
胞は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩによって保護される。これらの幹細胞は、骨髄移植
患者に戻され得るかまたは次に遺伝子治療のための所望の遺伝子のトランスフェ
クションのために用いられ得る。さらに、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、動物の骨髄
から末梢血液への幹細胞の放出を生じる動物に注射され得る。これらの幹細胞は
、遺伝子治療のための自家骨髄移植または操作の目的で単離され得る。患者が化
学療法または放射線療法の処置を終えた後、単離された幹細胞は患者に戻され得
る。
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、未熟な造血前駆細胞、例えば顆
粒球、マクロファージまたは単核細胞の分化を一時的に防ぐことによって、それ
らを拡大するために用いられ得る。これらの骨髄細胞は、インビトロで培養され
得る。このように、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、ポリヌクレオチド、ま
たはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストは、骨髄移植および／または遺
伝子治療の目的でインビトロにおいて造血幹細胞のモジュレータとして有用であ
り得る。幹細胞は、まれであり、遺伝子療法のために遺伝子を導入するに最も有
用であるので、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、幹細胞の富化された集団を単離するた
めに使用され得る。分裂している細胞を迅速に殺傷する５−Ｆｕのような細胞毒
の存在下で、細胞を培養することによって、幹細胞は富化され得る。一方、幹細
胞は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩによって保護される。これらの幹細胞は、骨髄移植
患者に戻され得るかまたは次に遺伝子治療のための所望の遺伝子のトランスフェ
クションのために用いられ得る。さらに、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、動物の骨髄
から末梢血液への幹細胞の放出を生じる動物に注射され得る。これらの幹細胞は
、遺伝子治療のための自家骨髄移植または操作の目的で単離され得る。患者が化
学療法または放射線療法の処置を終えた後、単離された幹細胞は患者に戻され得
る。
【０３９７】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩはまた、小胞輸送において役割を有し得、従って、異常
な小胞輸送の障害（内分泌障害、分泌障害、炎症障害、および胃腸障害を含む）
、ならびに特に、分泌組織および胃腸組織を含む癌の発達に関連し得る。
な小胞輸送の障害（内分泌障害、分泌障害、炎症障害、および胃腸障害を含む）
、ならびに特に、分泌組織および胃腸組織を含む癌の発達に関連し得る。
【０３９８】
従って、１実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、抗体、あんたゴニストおよび／またはフラグメントあるいはそれらの
改変体が、異常な小胞輸送と関連する障害を処置するために被験体に投与され得
る。このような障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グ
ルコース−ガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、尿崩症、高血
糖症および低血糖症、甲状腺腫、クッシング病；胃腸障害（潰瘍性大腸炎、胃潰
瘍、十二指腸潰瘍）；およびアレルギーを含む、異常な小胞輸送に関連する他の
状態（枯草熱；変形性関節症；およびＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群）
。
ペプチド、抗体、あんたゴニストおよび／またはフラグメントあるいはそれらの
改変体が、異常な小胞輸送と関連する障害を処置するために被験体に投与され得
る。このような障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：グ
ルコース−ガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、尿崩症、高血
糖症および低血糖症、甲状腺腫、クッシング病；胃腸障害（潰瘍性大腸炎、胃潰
瘍、十二指腸潰瘍）；およびアレルギーを含む、異常な小胞輸送に関連する他の
状態（枯草熱；変形性関節症；およびＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群）
。
【０３９９】
癌細胞は、過剰な量のホルモンまたは他の生物学的に活性なペプチドを分泌す
る。従って、別の実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのポリヌクレオチド
、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニストおよび／またはフラグメン
トあるいはそれらの改変体が、癌を処置または予防するために被験体に投与され
得、この癌には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：腺、組織、およ
び分泌もしくは吸収に関する器官（前立腺、膵臓、肺、舌、脳、乳房、膀胱、副
腎、甲状腺、肝臓、子宮、腎臓、精巣）ならびに胃腸管の器官（小腸、結腸、直
腸、および胃）の癌。特に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩに対して特異的な抗体は、直
接的に、アンタゴニストとして、または間接的に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩを発現
する細胞もしくは組織に薬学的薬剤を提供するための標的機構もしくは送達機構
として使用され得る。
る。従って、別の実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのポリヌクレオチド
、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニストおよび／またはフラグメン
トあるいはそれらの改変体が、癌を処置または予防するために被験体に投与され
得、この癌には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：腺、組織、およ
び分泌もしくは吸収に関する器官（前立腺、膵臓、肺、舌、脳、乳房、膀胱、副
腎、甲状腺、肝臓、子宮、腎臓、精巣）ならびに胃腸管の器官（小腸、結腸、直
腸、および胃）の癌。特に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩに対して特異的な抗体は、直
接的に、アンタゴニストとして、または間接的に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩを発現
する細胞もしくは組織に薬学的薬剤を提供するための標的機構もしくは送達機構
として使用され得る。
【０４００】
本発明のさらに好ましい実施形態としては、以下の適用において、Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびその機能的アゴニストの使
用が挙げられるが、これらに限定されない。
ガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびその機能的アゴニストの使
用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０１】
１つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）の量の増加
を産生するための免疫系をブーストするための、より高い親和性抗体の産生（例
えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導するための、そして／また
は免疫応答を増加させるための、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハム
スター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ラク
ダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、およびヒト（
最も好ましくはヒト）への投与。
を産生するための免疫系をブーストするための、より高い親和性抗体の産生（例
えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導するための、そして／また
は免疫応答を増加させるための、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハム
スター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ラク
ダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、およびヒト（
最も好ましくはヒト）への投与。
【０４０２】
機能性内因性抗体分子を産生し得るか、またはそうでなければ弱められた内因
性免疫系を有し得るが、別の動物から再構成されたかまたは部分的に再構成され
た免疫系によってヒト免疫グロブリン分子を産生し得る動物（上記に列挙された
動物を含むが、これらに限定されず、またトランスジェニック動物を含む）への
投与（例えば、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２４８９８３、ＷＯ／９６３４０
９６、ＷＯ／９６３３７３５、およびＷＯ／９１１０７４１を参照のこと）。
性免疫系を有し得るが、別の動物から再構成されたかまたは部分的に再構成され
た免疫系によってヒト免疫グロブリン分子を産生し得る動物（上記に列挙された
動物を含むが、これらに限定されず、またトランスジェニック動物を含む）への
投与（例えば、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２４８９８３、ＷＯ／９６３４０
９６、ＷＯ／９６３３７３５、およびＷＯ／９１１０７４１を参照のこと）。
【０４０３】
特定の抗原に対する免疫応答性を高めるワクチンアジュバント。特定の実施形
態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記載されたポリペプチドで
ある。別の特定の実施形態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記
載されたポリヌクレオチドである（すなわち、ポリヌクレオチドが遺伝子ワクチ
ンアジュバントである）。本明細書中に議論されるように、ポリヌクレオチドは
、リポソーム送達、組換えベクター送達、裸のＤＮＡの注入、および遺伝子銃（
ｇｅｎｅ ｇｕｎ）送達を含むが、これらには限定されない、当該分野で公知の
技術を使用して投与され得る。
態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記載されたポリペプチドで
ある。別の特定の実施形態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記
載されたポリヌクレオチドである（すなわち、ポリヌクレオチドが遺伝子ワクチ
ンアジュバントである）。本明細書中に議論されるように、ポリヌクレオチドは
、リポソーム送達、組換えベクター送達、裸のＤＮＡの注入、および遺伝子銃（
ｇｅｎｅ ｇｕｎ）送達を含むが、これらには限定されない、当該分野で公知の
技術を使用して投与され得る。
【０４０４】
腫瘍特異的免疫応答を高めるためのアジュバント。
【０４０５】
抗ウイルス免疫応答を高めるためのアジュバント。アジュバントとして本発明
の組成物を使用して高められ得る抗ウイルス免疫応答は、本明細書中に記載され
るかまたはそうでなければ当該分野で公知のウイルスおよびウイルス関連疾患ま
たは症状を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の組成
物は、以下からなる群から選択されるウイルス、疾患、または症状に対する免疫
応答を高めるためのアジュバントとして使用される：ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング
熱、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。別の特定の実施形態では、本発
明の組成物は、以下からなる群から選択されるウイルス、疾患、または症状に対
する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ
、ＲＳウイルス、デング熱、ロタウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエン
ザＢ型、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、アルゼン
チン出血熱（Ｊｕｎｉｎ）、チングニヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバ
レー熱、単純ヘルペス、および黄熱病。別の特定の実施形態では、本発明の組成
物は、ＨＩＶ ｇｐ１２０抗原に対する免疫応答を高めるためのアジュバントと
して使用される。
の組成物を使用して高められ得る抗ウイルス免疫応答は、本明細書中に記載され
るかまたはそうでなければ当該分野で公知のウイルスおよびウイルス関連疾患ま
たは症状を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の組成
物は、以下からなる群から選択されるウイルス、疾患、または症状に対する免疫
応答を高めるためのアジュバントとして使用される：ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング
熱、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。別の特定の実施形態では、本発
明の組成物は、以下からなる群から選択されるウイルス、疾患、または症状に対
する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ
、ＲＳウイルス、デング熱、ロタウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエン
ザＢ型、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、アルゼン
チン出血熱（Ｊｕｎｉｎ）、チングニヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバ
レー熱、単純ヘルペス、および黄熱病。別の特定の実施形態では、本発明の組成
物は、ＨＩＶ ｇｐ１２０抗原に対する免疫応答を高めるためのアジュバントと
して使用される。
【０４０６】
抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答を高めるためのアジュバント。アジュバ
ントとして本発明の組成物を使用して高められ得る抗細菌免疫応答または抗真菌
免疫応答は、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野で公知の
細菌または真菌および細菌関連疾患または症状あるいは真菌関連疾患または症状
を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群から選択
される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を高めるためのアジュ
バントとして使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および髄膜炎
Ｂ型。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群から選
択される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を高めるためのアジ
ュバントとして使用される：Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ
ｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂ群ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉ
ｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、およびＰｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ（マラリア）。
ントとして本発明の組成物を使用して高められ得る抗細菌免疫応答または抗真菌
免疫応答は、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野で公知の
細菌または真菌および細菌関連疾患または症状あるいは真菌関連疾患または症状
を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群から選択
される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を高めるためのアジュ
バントとして使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および髄膜炎
Ｂ型。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群から選
択される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を高めるためのアジ
ュバントとして使用される：Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ
ｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂ群ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉ
ｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、およびＰｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ（マラリア）。
【０４０７】
抗寄生生物免疫応答を高めるためのアジュバント。アジュバントとして本発明
の組成物を使用して高められ得る抗寄生生物免疫応答は、本明細書中に記載され
るかまたはそうでなければ当該分野で公知の寄生生物および寄生生物関連疾患ま
たは症状を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、寄生生物に対す
る免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態
において、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）に対する免疫
応答を高めるためのアジュバントとして使用される。
の組成物を使用して高められ得る抗寄生生物免疫応答は、本明細書中に記載され
るかまたはそうでなければ当該分野で公知の寄生生物および寄生生物関連疾患ま
たは症状を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、寄生生物に対す
る免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態
において、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）に対する免疫
応答を高めるためのアジュバントとして使用される。
【０４０８】
病原体に対するＢ細胞応答の刺激剤として。
【０４０９】
免疫抑制治療を受ける前に個体の免疫状態を高める試薬として。
【０４１０】
より高い親和性の抗体を誘導するための試薬として。
【０４１１】
血清免疫グロブリン濃度を増加するための試薬として。
【０４１２】
免疫無防備状態の個体の回復を促進するための試薬として。
【０４１３】
老齢の集団間の免疫応答性をブーストするための試薬として。
【０４１４】
骨髄移植および／または他の移植の前、その間、またはその後の免疫系エンハ
ンサーとして（例えば、同種器官移植または異種器官移植）。移植に関して本発
明の組成物は、移植の前に、移植と同時に、そして／または移植の後に投与され
得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回
復の開始の前に投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、移植
の後、Ｔ細胞集団の回復の開始の後で、しかしＢ細胞集団の完全な回復の前に最
初に投与される。
ンサーとして（例えば、同種器官移植または異種器官移植）。移植に関して本発
明の組成物は、移植の前に、移植と同時に、そして／または移植の後に投与され
得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回
復の開始の前に投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、移植
の後、Ｔ細胞集団の回復の開始の後で、しかしＢ細胞集団の完全な回復の前に最
初に投与される。
【０４１５】
免疫不全の個体の免疫応答をブーストするための薬剤として。本発明のポリヌ
クレオチドまたはポリペプチド、および／またはそのアゴニストを投与すること
により回復されるかまたは処置され得るＢ細胞免疫不全としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：重篤な複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、Ｓ
ＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガン
マグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ病、先天性無ガンマグロブリン
血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成
人発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマ
グロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、一過性乳児低ガンマグロブリン血症
、非特異的低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫
不全（ＣＶＩ）（後天性）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、
過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的
ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正
常なＩｇまたは上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖
欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫欠
損、退縮無ガンマグロブリン血症（Ｓｗｉｓｓ型）、網様発育不全、新生児好中
球減少症、重篤な先天性白血球減少症、免疫欠損を伴う胸腺リンパ形成不全症−
発育不全症または形成異常症、毛細血管拡張性運動失調、短肢（ｓｈｏｒｔ ｌ
ｉｍｂｅｄ）小人症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロ
フ症候群複合免疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、Ｍ
ＨＣクラスＩＩ欠失（不全リンパ球症候群）および重症複合型免疫不全。特定の
実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそ
のアゴニストは、選択的ＩｇＡ欠損を処置または回復させるのに投与される。別
の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あ
るいはそのアゴニストは、毛細管拡張性運動失調を処置または回復させるために
投与される。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド、あるいはそのアゴニストは、分類不能型免疫不全を処置または回復
させるために投与される。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド
またはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストは、Ｘ連結無ガンマグロブリ
ン血症を処置または回復さえるために投与される。別の特定の実施形態において
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストは、
重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を処置または回復させるために投与される。別
の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あ
るいはそのアゴニストは、ヴィスコット−オールドリッチ症候群を処置または回
復させるために投与される。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストは、重症複合型免疫不全（
ＳＣＩＤ）を処置または回復させるために投与される。別の特定の実施形態にお
いて、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニスト
は、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損を処置または回復させるために投与される
。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストを投
与することによって回復または処置され得る、Ｔ細胞免疫欠損としては、以下が
挙げられるがこれらに限定されない：例えば、ディジョージ奇形、胸腺発育不全
、第３および第４咽頭嚢症候群、２２ｑ１１．２欠損、慢性粘膜皮膚カンジダ症
、ナチュラルキラー細胞欠損（ＮＫ）、特発性ＣＤ４＋ Ｔリンパ球減少、顕著
なＴ細胞欠損を伴う免疫欠損（不特定）、および細胞媒介免疫の不特定の免疫欠
損。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストを
投与することによって回復または処置され得る、貧食細胞障害関連免疫欠損とし
ては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：高ＩｇＥ症候群（ＨＩＥ）
、白血球接着不全１型、慢性肉芽腫症、好中性Ｇ６ＰＤ損傷、Ｃｈｅｄｉａｋ−
Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、膵性欠損症候群、およびミエロペルオキシダーゼ欠損。
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストを投与
することによって回復または処置され得る、補体障害関連免疫欠損は、ｌｑ欠損
、Ｃ１−Ｃ９欠損、およびＣ２欠損。
クレオチドまたはポリペプチド、および／またはそのアゴニストを投与すること
により回復されるかまたは処置され得るＢ細胞免疫不全としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：重篤な複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、Ｓ
ＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガン
マグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ病、先天性無ガンマグロブリン
血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成
人発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマ
グロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、一過性乳児低ガンマグロブリン血症
、非特異的低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫
不全（ＣＶＩ）（後天性）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、
過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的
ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うかまたは伴わない）、正
常なＩｇまたは上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖
欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫欠
損、退縮無ガンマグロブリン血症（Ｓｗｉｓｓ型）、網様発育不全、新生児好中
球減少症、重篤な先天性白血球減少症、免疫欠損を伴う胸腺リンパ形成不全症−
発育不全症または形成異常症、毛細血管拡張性運動失調、短肢（ｓｈｏｒｔ ｌ
ｉｍｂｅｄ）小人症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロ
フ症候群複合免疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、Ｍ
ＨＣクラスＩＩ欠失（不全リンパ球症候群）および重症複合型免疫不全。特定の
実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそ
のアゴニストは、選択的ＩｇＡ欠損を処置または回復させるのに投与される。別
の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あ
るいはそのアゴニストは、毛細管拡張性運動失調を処置または回復させるために
投与される。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド、あるいはそのアゴニストは、分類不能型免疫不全を処置または回復
させるために投与される。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド
またはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストは、Ｘ連結無ガンマグロブリ
ン血症を処置または回復さえるために投与される。別の特定の実施形態において
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストは、
重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を処置または回復させるために投与される。別
の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あ
るいはそのアゴニストは、ヴィスコット−オールドリッチ症候群を処置または回
復させるために投与される。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストは、重症複合型免疫不全（
ＳＣＩＤ）を処置または回復させるために投与される。別の特定の実施形態にお
いて、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニスト
は、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損を処置または回復させるために投与される
。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストを投
与することによって回復または処置され得る、Ｔ細胞免疫欠損としては、以下が
挙げられるがこれらに限定されない：例えば、ディジョージ奇形、胸腺発育不全
、第３および第４咽頭嚢症候群、２２ｑ１１．２欠損、慢性粘膜皮膚カンジダ症
、ナチュラルキラー細胞欠損（ＮＫ）、特発性ＣＤ４＋ Ｔリンパ球減少、顕著
なＴ細胞欠損を伴う免疫欠損（不特定）、および細胞媒介免疫の不特定の免疫欠
損。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストを
投与することによって回復または処置され得る、貧食細胞障害関連免疫欠損とし
ては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：高ＩｇＥ症候群（ＨＩＥ）
、白血球接着不全１型、慢性肉芽腫症、好中性Ｇ６ＰＤ損傷、Ｃｈｅｄｉａｋ−
Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、膵性欠損症候群、およびミエロペルオキシダーゼ欠損。
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそのアゴニストを投与
することによって回復または処置され得る、補体障害関連免疫欠損は、ｌｑ欠損
、Ｃ１−Ｃ９欠損、およびＣ２欠損。
【０４１６】
Ｂ細胞および／またはＴ細胞の機能の後天的欠損を有する個体間で免疫応答性
をブーストするための薬剤として。本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオ
チド、またはそのアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得
る、Ｂ細胞機能の後天的欠損を生じる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨
髄移植、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これら
に限定されない。
をブーストするための薬剤として。本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオ
チド、またはそのアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得
る、Ｂ細胞機能の後天的欠損を生じる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨
髄移植、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これら
に限定されない。
【０４１７】
一時的な免疫不全を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤とし
て。本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはそのアンタゴニス
トを投与することによって寛解または処置され得る、一時的な免疫不全を生じる
状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調
に関連する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関連する状態
、麻疹からの回復、輸血からの回復、手術からの回復が挙げられるが、これらに
限定されない。
て。本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはそのアンタゴニス
トを投与することによって寛解または処置され得る、一時的な免疫不全を生じる
状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調
に関連する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関連する状態
、麻疹からの回復、輸血からの回復、手術からの回復が挙げられるが、これらに
限定されない。
【０４１８】
単球、樹状細胞および／またはＢ細胞による抗原提示のレギュレーターとして
。１つの実施形態において、ポリペプチド（溶解形態、膜結合形態または膜貫通
形態）またはポリヌクレオチドは、インビトロまたはインビボで抗原提示を増強
するかまたは抗原提示をアンタゴナイズする。さらに、関連する実施形態におい
て、この抗原提示の増強またはアンタゴナイズは、抗腫瘍処置としてかまたは免
疫系を調節するために有用であり得る。
。１つの実施形態において、ポリペプチド（溶解形態、膜結合形態または膜貫通
形態）またはポリヌクレオチドは、インビトロまたはインビボで抗原提示を増強
するかまたは抗原提示をアンタゴナイズする。さらに、関連する実施形態におい
て、この抗原提示の増強またはアンタゴナイズは、抗腫瘍処置としてかまたは免
疫系を調節するために有用であり得る。
【０４１９】
個体の免疫系を、ＴＨ１細胞性応答とは反対に、体液性応答（すなわち、ＴＨ
２）の発生に指向するための薬剤として。
２）の発生に指向するための薬剤として。
【０４２０】
腫瘍増殖を誘導し、従って、腫瘍を抗腫瘍性薬剤に対してより感受性にするた
めの手段として。例えば、多発性骨髄腫は、緩慢な細胞分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ
）の疾患であり、従って、実質的に全ての抗腫瘍性レジメンに対して不応性であ
る。これらの細胞は、より迅速に増殖させた場合、これらの感受性プロフィール
は、おそらく変化するであろう。
めの手段として。例えば、多発性骨髄腫は、緩慢な細胞分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ
）の疾患であり、従って、実質的に全ての抗腫瘍性レジメンに対して不応性であ
る。これらの細胞は、より迅速に増殖させた場合、これらの感受性プロフィール
は、おそらく変化するであろう。
【０４２１】
細胞成長の特定の活性化剤またはインヒビターが結合し得る、Ｂ細胞、単球細
胞、および／またはＴ細胞特異的結合タンパク質。この結果は、正常、疾患、ま
たは腫瘍細胞集団上の活性化剤またはインヒビターに注目すべきである。
胞、および／またはＴ細胞特異的結合タンパク質。この結果は、正常、疾患、ま
たは腫瘍細胞集団上の活性化剤またはインヒビターに注目すべきである。
【０４２２】
ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害および／または分類不能性免疫不全症（Ｃｏｍｍ
ｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような病理に
おけるＢ細胞の産生の刺激因子として。
ｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような病理に
おけるＢ細胞の産生の刺激因子として。
【０４２３】
手術、外傷または遺伝的欠陥後のリンパ組織の生成および／または再生のため
の治療として。
の治療として。
【０４２４】
ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全を生じる遺伝性の障害のための
遺伝子ベースの治療として。
遺伝子ベースの治療として。
【０４２５】
Ｔ１Ｒ−様リガンドＩＩ媒介応答を阻害または増強するための抗体を生成する
ための抗原として。
ための抗原として。
【０４２６】
単球に影響を及ぼす寄生生物疾患（リーシュマニア属（Ｌｅｓｈｍａｎｉａ）
）に対して防御するために単球／マクロファージを活性化する手段として。
）に対して防御するために単球／マクロファージを活性化する手段として。
【０４２７】
移植前の骨髄サンプルの前処理として。このような処理は、Ｂ細胞提示および
／またはＴ細胞提示を増加し、従って回復を加速する。
／またはＴ細胞提示を増加し、従って回復を加速する。
【０４２８】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩによって誘発される分泌サイトカインを調節する手段と
して。
して。
【０４２９】
インビボまたはインビトロにおいてＩｇＥ濃度を調節する手段として。さらに
、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリ
ヌクレオチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＥ媒介アレルギー応答を
処置または予防するために使用され得る。このようなアレルギー反応としては、
ぜん息、鼻炎および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。
、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリ
ヌクレオチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＥ媒介アレルギー応答を
処置または予防するために使用され得る。このようなアレルギー反応としては、
ぜん息、鼻炎および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３０】
上記の適用の全ては、獣医学的医療に適用され得る。
【０４３１】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩアンタゴニストとしては、例えば、結合および／または
阻害性の抗体、アンチセンス核酸、リボザイムまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの可
溶性形態が挙げられる。これらは、上記のリガンドの活性の多くを無効にし、そ
して以下のような臨床的または実用的な適用を見い出すことが予測される。
阻害性の抗体、アンチセンス核酸、リボザイムまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの可
溶性形態が挙げられる。これらは、上記のリガンドの活性の多くを無効にし、そ
して以下のような臨床的または実用的な適用を見い出すことが予測される。
【０４３２】
外来因子または自己に対する種々の局面の免疫応答をブロックする手段として
。例としては、狼瘡および関節炎のような自己免疫障害、ならびに皮膚アレルギ
ー、炎症、腸疾患、損傷および病原体に対する免疫応答が挙げられる。
。例としては、狼瘡および関節炎のような自己免疫障害、ならびに皮膚アレルギ
ー、炎症、腸疾患、損傷および病原体に対する免疫応答が挙げられる。
【０４３３】
自己免疫疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス
およびＭＳ）に関連するＢ細胞増殖および／またはＩｇ分泌を妨げるための治療
として。
およびＭＳ）に関連するＢ細胞増殖および／またはＩｇ分泌を妨げるための治療
として。
【０４３４】
対宿主性移植片病または移植片拒絶のインヒビターとして。
【０４３５】
ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、プラスマ
細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫およびＥＢＶ変換性（ＥＢＶ−ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍｅｄ）疾患のようなＢ細胞および／またはＴ細胞の悪性疾患のた
めの治療。
細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫およびＥＢＶ変換性（ＥＢＶ−ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍｅｄ）疾患のようなＢ細胞および／またはＴ細胞の悪性疾患のた
めの治療。
【０４３６】
未定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃ
ａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、関連する特発性単一クロ
ーン性高ガンマグロブリン血症、およびプラスマ細胞腫のような疾患における、
慢性の高ガンマグロブリン血症事象のための治療。
ｌｇａｍｍｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃ
ａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、関連する特発性単一クロ
ーン性高ガンマグロブリン血症、およびプラスマ細胞腫のような疾患における、
慢性の高ガンマグロブリン血症事象のための治療。
【０４３７】
ラージＢ細胞リンパ腫の細胞増殖を減少するための治療。
【０４３８】
慢性骨髄性白血病に関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少する手段。
【０４３９】
免疫抑制剤。
【０４４０】
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはアンタ
ゴニストは、インビボまやはインビトロにおけるＩｇＥを調節するのに使用され
る。本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはアン
タゴニストの投与は、ぜん息、鼻炎および湿疹を含むがこれらに限定されない、
ＩｇＥ媒介アレルギー反応を処置または予防するために使用され得る。
ゴニストは、インビボまやはインビトロにおけるＩｇＥを調節するのに使用され
る。本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはアン
タゴニストの投与は、ぜん息、鼻炎および湿疹を含むがこれらに限定されない、
ＩｇＥ媒介アレルギー反応を処置または予防するために使用され得る。
【０４４１】
上記で引用される適用は、広範な種々の宿主において使用されている。そのよ
うな宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、
マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワト
リ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられる
が、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまた
はネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ま
しい実施形態において、宿主は、ヒトである。
うな宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、
マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワト
リ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられる
が、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまた
はネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ま
しい実施形態において、宿主は、ヒトである。
【０４４２】
アゴニストおよびアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、
上記のような）とともに組成物において使用される。
上記のような）とともに組成物において使用される。
【０４４３】
アンタゴニストは、特定の自己免疫疾患および慢性炎症疾患および感染性疾患
における、マクロファージおよびその前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリ
ンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化Ｔ細胞およびＣＤ８
細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー細胞）の、ポリペプチド走化性およ
び活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬
化症およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。アンタゴニストはまた、単核
食細胞の補充および活性化を妨げることによって、珪肺症、サルコイドーシス、
特発性肺線維症を含む、感染性疾患を処置するために使用され得る。これらはま
た、好酸球の産生および遊走を妨げることによって、特発性好酸球増多症候群を
処置するために使用され得る。内毒性のショックはまた、マクロファージの遊走
および本発明のポリペプチドの産生の防止によって、アンタゴニストよって処置
され得る。アンタゴニストはまた、例えば、動脈壁における単球浸潤を妨げるこ
とによって、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。アンタゴ
ニストは、ヒスタミン媒介アレルギー反応、ならびに後期アレルギー反応、慢性
じんま疹、およびケモカイン誘導化肥満細胞、および好塩基球の脱顆粒およびヒ
スタミンの放出の阻害によるアトピー性皮膚炎を含む免疫学的な疾患の処置に使
用され得る。アレルギー性喘息、鼻炎および湿疹といったＩｇＥ媒介アレルギー
反応はまた、処置され得る。アンタゴニストはまた、創傷領域への単球の誘引の
防止によって慢性炎症および急性炎症の処置に使用され得る。慢性炎症肺疾患お
よび急性炎症肺疾患は、肺における単核食細胞の壊死に関連するので、それらは
また、正常肺マクロファージ集団の制御に使用され得る。アンタゴニストはまた
、患者の接合部における滑液への単球の誘引を防止することによってリウマチ性
動脈炎の治療に使用され得る。単球の流入および活性化は、脱顆粒動脈症および
炎症動脈症の両方の病原において有意な役割を担っている。アンタゴニストは、
主に、ＩＬ−１およびＴＮＦに起因する有毒なカスケードの干渉に使用される。
これは、タンパク質の炎症サイトカインの生合成を妨げる。このように、アンタ
ゴニストは、炎症の防止に使用され得る。アンタゴニストはまた、アンタゴニス
トによって誘導されるピロスタングランジン独立発熱の防止に使用され得る。ア
ンタゴニストはまた、例えば、再生不良性貧血、および脊髄形成異常症候群とい
った骨髄の症例の処置に使用され得る。アンタゴニストはまた、肺における好酸
球累積の防止によって喘息およびアレルギーの処置に使用され得る。アンタゴニ
ストはまた、喘息性肺の顕著な特徴である上皮下底膜線維症（ｓｕｂｅｐｉｔｈ
ｅｌｉａｌ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の処置
に使用され得る。アンタゴニストはまた、リンパ腫（例えば、本明細書中で挙げ
られるリンパ腫に限らず、１つ以上の広範なリンパ腫）の処置に使用され得る。
における、マクロファージおよびその前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリ
ンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化Ｔ細胞およびＣＤ８
細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー細胞）の、ポリペプチド走化性およ
び活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬
化症およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。アンタゴニストはまた、単核
食細胞の補充および活性化を妨げることによって、珪肺症、サルコイドーシス、
特発性肺線維症を含む、感染性疾患を処置するために使用され得る。これらはま
た、好酸球の産生および遊走を妨げることによって、特発性好酸球増多症候群を
処置するために使用され得る。内毒性のショックはまた、マクロファージの遊走
および本発明のポリペプチドの産生の防止によって、アンタゴニストよって処置
され得る。アンタゴニストはまた、例えば、動脈壁における単球浸潤を妨げるこ
とによって、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。アンタゴ
ニストは、ヒスタミン媒介アレルギー反応、ならびに後期アレルギー反応、慢性
じんま疹、およびケモカイン誘導化肥満細胞、および好塩基球の脱顆粒およびヒ
スタミンの放出の阻害によるアトピー性皮膚炎を含む免疫学的な疾患の処置に使
用され得る。アレルギー性喘息、鼻炎および湿疹といったＩｇＥ媒介アレルギー
反応はまた、処置され得る。アンタゴニストはまた、創傷領域への単球の誘引の
防止によって慢性炎症および急性炎症の処置に使用され得る。慢性炎症肺疾患お
よび急性炎症肺疾患は、肺における単核食細胞の壊死に関連するので、それらは
また、正常肺マクロファージ集団の制御に使用され得る。アンタゴニストはまた
、患者の接合部における滑液への単球の誘引を防止することによってリウマチ性
動脈炎の治療に使用され得る。単球の流入および活性化は、脱顆粒動脈症および
炎症動脈症の両方の病原において有意な役割を担っている。アンタゴニストは、
主に、ＩＬ−１およびＴＮＦに起因する有毒なカスケードの干渉に使用される。
これは、タンパク質の炎症サイトカインの生合成を妨げる。このように、アンタ
ゴニストは、炎症の防止に使用され得る。アンタゴニストはまた、アンタゴニス
トによって誘導されるピロスタングランジン独立発熱の防止に使用され得る。ア
ンタゴニストはまた、例えば、再生不良性貧血、および脊髄形成異常症候群とい
った骨髄の症例の処置に使用され得る。アンタゴニストはまた、肺における好酸
球累積の防止によって喘息およびアレルギーの処置に使用され得る。アンタゴニ
ストはまた、喘息性肺の顕著な特徴である上皮下底膜線維症（ｓｕｂｅｐｉｔｈ
ｅｌｉａｌ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の処置
に使用され得る。アンタゴニストはまた、リンパ腫（例えば、本明細書中で挙げ
られるリンパ腫に限らず、１つ以上の広範なリンパ腫）の処置に使用され得る。
【０４４４】
さらに、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩのアンタゴニストをまた使用して、止血性活性（出血を止めること）また
は血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活
性を増大させることにより、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、血液
凝固の疾患（例えば、無線維素原血症、因子欠損症）、血液血小板の疾患（例え
ば、血小板減少症）、あるいは外傷、手術または他の原因から生じる創傷を処置
または予防し得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得るＴ１
Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニ
ストもしくはアンタゴニストを使用し、凝血を阻害または溶解し得る。心臓発作
（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の処置または予防において、これら
の分子は重要であり得る。
ポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩのアンタゴニストをまた使用して、止血性活性（出血を止めること）また
は血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活
性を増大させることにより、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、血液
凝固の疾患（例えば、無線維素原血症、因子欠損症）、血液血小板の疾患（例え
ば、血小板減少症）、あるいは外傷、手術または他の原因から生じる創傷を処置
または予防し得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得るＴ１
Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニ
ストもしくはアンタゴニストを使用し、凝血を阻害または溶解し得る。心臓発作
（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の処置または予防において、これら
の分子は重要であり得る。
【０４４５】
自己免疫障害の処置、処置または検出において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌ
クレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストはまた、有用で
あり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって外来性物質として不適切に
自己認識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊をもたらす
免疫応答を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化
性を阻害し得る本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの投与は、自己免
疫障害の防止において効果的な治療であり得る。
クレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストはまた、有用で
あり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって外来性物質として不適切に
自己認識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊をもたらす
免疫応答を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化
性を阻害し得る本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの投与は、自己免
疫障害の防止において効果的な治療であり得る。
【０４４６】
本発明の組成物によって処置、予防および／または検出され得る自己免疫疾患
および障害の例としては、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定されない
：自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑
病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギ
ー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（
例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発
性内分泌腺症、紫斑（例えば、ヘノッホ−シェーンライン（Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓ
ｃｏｅｎｌｅｉｎ）紫斑病）、ライター病、Ｓｔｉｆｆ−Ｍａｎ症候群、自己免
疫肺炎症、自閉症、ギヤン−バレー症候群、インシュリン依存性糖尿病（ｍｅｌ
ｌｉｔｉｓ）、および自己免疫炎症性眼、 本発明の組成物によって処置、予防および／または検出され得るさらなる自己
免疫疾患および障害の例としては、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定
されない：自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎）（
しばしば、例えば、細胞媒介およびヒトの甲状腺細胞傷害によって特徴付けられ
る）、全身性エリテマトーデス（しばしば、例えば、巡回的および局所的発生し
た免疫複合体によって特徴付けられる）、グッドパスチャー症候群（しばしば、
例えば、抗基底膜抗体によって特徴付けられる）、天疱瘡（しばしば、例えば、
表皮性棘融解性抗体によって特徴付けられる）、レセプター自己免疫（例えば、
（ａ）グレーヴズ病（しばしば、例えば、ＴＳＨレセプター抗体によって特徴付
けられる）、（ｂ）重症筋無力症（しばしば、例えば、アセチルコリンレセプタ
ー抗体によって特徴付けられる）、および（ｃ）インシュリン耐性など（しばし
ば、例えば、インシュリンレセプター抗体によって特徴付けられる））、自己免
疫溶血性貧血（しばしば、例えば、抗体感受性ＲＢＣの食細胞よって特徴付けら
れる）、自己免疫血小板減少性紫斑病（しばしば、例えば、抗体感受性血小板の
食細胞よって特徴付けられる）。
および障害の例としては、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定されない
：自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑
病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギ
ー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（
例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発
性内分泌腺症、紫斑（例えば、ヘノッホ−シェーンライン（Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓ
ｃｏｅｎｌｅｉｎ）紫斑病）、ライター病、Ｓｔｉｆｆ−Ｍａｎ症候群、自己免
疫肺炎症、自閉症、ギヤン−バレー症候群、インシュリン依存性糖尿病（ｍｅｌ
ｌｉｔｉｓ）、および自己免疫炎症性眼、 本発明の組成物によって処置、予防および／または検出され得るさらなる自己
免疫疾患および障害の例としては、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定
されない：自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本甲状腺炎）（
しばしば、例えば、細胞媒介およびヒトの甲状腺細胞傷害によって特徴付けられ
る）、全身性エリテマトーデス（しばしば、例えば、巡回的および局所的発生し
た免疫複合体によって特徴付けられる）、グッドパスチャー症候群（しばしば、
例えば、抗基底膜抗体によって特徴付けられる）、天疱瘡（しばしば、例えば、
表皮性棘融解性抗体によって特徴付けられる）、レセプター自己免疫（例えば、
（ａ）グレーヴズ病（しばしば、例えば、ＴＳＨレセプター抗体によって特徴付
けられる）、（ｂ）重症筋無力症（しばしば、例えば、アセチルコリンレセプタ
ー抗体によって特徴付けられる）、および（ｃ）インシュリン耐性など（しばし
ば、例えば、インシュリンレセプター抗体によって特徴付けられる））、自己免
疫溶血性貧血（しばしば、例えば、抗体感受性ＲＢＣの食細胞よって特徴付けら
れる）、自己免疫血小板減少性紫斑病（しばしば、例えば、抗体感受性血小板の
食細胞よって特徴付けられる）。
【０４４７】
本発明の組成物によって処置、予防または検出され得る、さらなる、自己免疫
障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：慢性関節リウマチ（
例えば、関節における免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、抗コラー
ゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）（例えば、核小体抗体およ
び他の核抗体によってしばしば特徴付けられる）、混合結合組織病（例えば、可
溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体によってしばしば特徴付
けられる）、多発性筋炎（例えば、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付け
られる）、悪性貧血（例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によ
ってしばしば特徴付けられる）、特発性アジソン病（例えば、体液および細胞媒
介性副腎細胞傷害性によってしばしば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精
子抗体によってしばしば特徴付けられる）、糸球体腎炎（例えば、糸球体基底膜
抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱性類天疱瘡（例
えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けられる）、シェー
グレン症候群（例えば、多重組織抗体、および／または特定の非ヒストンＡＮＡ
（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例えば、細胞媒介性
および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、ならびにアドレナ
リン作動性薬剤抵抗性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動性薬剤
抵抗性を含む）（例えば、βアドレナリンレセプター抗体によってしばしば特徴
付けられる）。
障害としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：慢性関節リウマチ（
例えば、関節における免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、抗コラー
ゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）（例えば、核小体抗体およ
び他の核抗体によってしばしば特徴付けられる）、混合結合組織病（例えば、可
溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体によってしばしば特徴付
けられる）、多発性筋炎（例えば、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付け
られる）、悪性貧血（例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によ
ってしばしば特徴付けられる）、特発性アジソン病（例えば、体液および細胞媒
介性副腎細胞傷害性によってしばしば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精
子抗体によってしばしば特徴付けられる）、糸球体腎炎（例えば、糸球体基底膜
抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱性類天疱瘡（例
えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けられる）、シェー
グレン症候群（例えば、多重組織抗体、および／または特定の非ヒストンＡＮＡ
（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例えば、細胞媒介性
および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、ならびにアドレナ
リン作動性薬剤抵抗性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動性薬剤
抵抗性を含む）（例えば、βアドレナリンレセプター抗体によってしばしば特徴
付けられる）。
【０４４８】
本発明の組成物を用いて処置、予防、または検出され得る、さらなる自己免疫
性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：慢性活性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、
原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けら
れる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合は、特定の組織抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によってしばし
ば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、脈管壁におけるＩｇおよび補体ならびに
／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例えば、心筋
抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心筋抗体に
よってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗
体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮膚炎（例
えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けら
れる）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってし
ばしば特徴付けられる）、ならびに多くの他の炎症性障害、肉芽種性障害、変性
障害、および萎縮性障害。
性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：慢性活性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、
原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けら
れる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合は、特定の組織抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によってしばし
ば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、脈管壁におけるＩｇおよび補体ならびに
／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例えば、心筋
抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心筋抗体に
よってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗
体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮膚炎（例
えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けら
れる）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってし
ばしば特徴付けられる）、ならびに多くの他の炎症性障害、肉芽種性障害、変性
障害、および萎縮性障害。
【０４４９】
好ましい実施形態においては、自己免疫性疾患および障害ならびに／または上
記に列挙された疾患および障害に関連する状態は、例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉを用いて、処置、予防、および／または診断される。
記に列挙された疾患および障害に関連する状態は、例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉを用いて、処置、予防、および／または診断される。
【０４５０】
同様に、アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）
または他の呼吸障害）はまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ
１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストま
たはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストを用いて、処置、予防および／また
は診断され得る。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー、抗原性分子に対
する過敏性、または血液型不適合を処置、予防および／または診断するために用
いられ得る。
または他の呼吸障害）はまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ
１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストま
たはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストを用いて、処置、予防および／また
は診断され得る。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー、抗原性分子に対
する過敏性、または血液型不適合を処置、予防および／または診断するために用
いられ得る。
【０４５１】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプ
チドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
アンタゴニストをまた使用して、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）
を処置、および／または予防し得る。器官拒絶は、免疫応答を介して宿主免疫細
胞による移植組織の破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにもまた
関与しているが、この場合、外来性の移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫
応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害する、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リ
ガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストの投与は
、器官拒絶またはＧＶＨＤの防止において効果的な治療であり得る。
チドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
アンタゴニストをまた使用して、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）
を処置、および／または予防し得る。器官拒絶は、免疫応答を介して宿主免疫細
胞による移植組織の破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにもまた
関与しているが、この場合、外来性の移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫
応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害する、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リ
ガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストの投与は
、器官拒絶またはＧＶＨＤの防止において効果的な治療であり得る。
【０４５２】
同様に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩのアンタゴニストをもまた使用し、炎症を調節し得る。例えば、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるい
はＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニ
ストは、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子
を使用して、慢性前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎およびマラコプラキア、感染に関
連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身炎症応答症候群（
ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連する炎症、関
節炎に関連する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎
症、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸
疾患に関連する炎症、クローン病に関連する炎症またはサイトカイン（例えば、
ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症を含む、慢性および急性の両
方の状態の炎症状態を処置し得る。
ポリペプチドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩのアンタゴニストをもまた使用し、炎症を調節し得る。例えば、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるい
はＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニ
ストは、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子
を使用して、慢性前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎およびマラコプラキア、感染に関
連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身炎症応答症候群（
ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連する炎症、関
節炎に関連する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎
症、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸
疾患に関連する炎症、クローン病に関連する炎症またはサイトカイン（例えば、
ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症を含む、慢性および急性の両
方の状態の炎症状態を処置し得る。
【０４５３】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプ
チドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
アンタゴニストによって処置および／または検出され得る細胞生存の増大あるい
はアポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５
３変異を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓
腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌
、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細
胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を
含むが、これらに限定されない）；自己免疫性の疾患、障害および／または状態
（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、
ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋
炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマ
チ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよび
アデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移
植片拒絶、が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、および／またはアンタゴニストは、特に上記に列挙さ
れる、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するため
に使用される。
チドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
アンタゴニストによって処置および／または検出され得る細胞生存の増大あるい
はアポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５
３変異を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓
腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌
、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細
胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を
含むが、これらに限定されない）；自己免疫性の疾患、障害および／または状態
（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、
ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋
炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマ
チ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよび
アデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移
植片拒絶、が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、および／またはアンタゴニストは、特に上記に列挙さ
れる、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するため
に使用される。
【０４５４】
従って、好ましい実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド
またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるいはそのアゴニストまたはそのア
ンタゴニストを、使用して、例えば、リンパ性白血病（例えば、ＭＬＬ、および
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）あるいは濾胞性リンパ腫を含む）といった本明細
書中に記載されるが、これに限定されない自己免疫疾患ならび／あるいはガンの
増殖、進行および／または転移の阻害を処置、予防および／または診断をする。
別の実施形態において、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたは
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドが使用され、ガン細胞またはガン組織（例え
ば、癌（例えば、ＣＬＬおよびＢＬＬ）に関連するＢ細胞系列、リンパ性白血病
またはリンパ腫）を活性化、分化または増殖し、その結果、癌治療（化学療法ま
たは放射線治療）に対して細胞をより脆弱にする。
またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドあるいはそのアゴニストまたはそのア
ンタゴニストを、使用して、例えば、リンパ性白血病（例えば、ＭＬＬ、および
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）あるいは濾胞性リンパ腫を含む）といった本明細
書中に記載されるが、これに限定されない自己免疫疾患ならび／あるいはガンの
増殖、進行および／または転移の阻害を処置、予防および／または診断をする。
別の実施形態において、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたは
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドが使用され、ガン細胞またはガン組織（例え
ば、癌（例えば、ＣＬＬおよびＢＬＬ）に関連するＢ細胞系列、リンパ性白血病
またはリンパ腫）を活性化、分化または増殖し、その結果、癌治療（化学療法ま
たは放射線治療）に対して細胞をより脆弱にする。
【０４５５】
さらに、別の実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまた
はＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、および／または本発明のアンタゴニスト
を使用して、特に上記に、および以後の段落で挙げられた、癌の増殖、進行およ
び／または転移を阻害する。
はＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、および／または本発明のアンタゴニスト
を使用して、特に上記に、および以後の段落で挙げられた、癌の増殖、進行およ
び／または転移を阻害する。
【０４５６】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプ
チドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
アンタゴニストによって処置および／または検出され得る細胞生存の増大に関連
するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに
以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急
性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨
髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血
病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、
真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発
性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形
腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨
原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ
）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋
肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、
基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様
癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生
期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌
、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松
果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏ
ｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定
されない）。
チドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
アンタゴニストによって処置および／または検出され得る細胞生存の増大に関連
するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに
以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急
性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨
髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血
病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、
真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発
性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形
腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨
原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ
）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋
肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、
基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様
癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生
期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌
、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松
果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏ
ｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定
されない）。
【０４５７】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプ
チドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
アンタゴニストによって処置および／または検出され得るアポトーシスの増大に
関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性疾患、障害および／
または状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症
、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫
性の疾患、障害および／または状態（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候
群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓ
ｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連
糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不
良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害
によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再
灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）
；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、敗血
症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。従って、好ましい実施形態において、
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポ
リペプチドを使用して、上記される疾患および障害および／またはそのような障
害に関連する医学的な状態の処置、予防および／または診断する。
チドあるいはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアゴニストまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
アンタゴニストによって処置および／または検出され得るアポトーシスの増大に
関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性疾患、障害および／
または状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症
、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫
性の疾患、障害および／または状態（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候
群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓ
ｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連
糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不
良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害
によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再
灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）
；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、敗血
症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。従って、好ましい実施形態において、
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドまたはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポ
リペプチドを使用して、上記される疾患および障害および／またはそのような障
害に関連する医学的な状態の処置、予防および／または診断する。
【０４５８】
本発明は、哺乳動物における癌の検出のために有用である。特に、本発明は、
以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増殖新形成の診断の間に有用
である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前
骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血病、急性巨核球性白血病、
および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨髄性白血病（慢性骨髄単球
性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好ましい哺乳動物としては、有尾
猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサ
ギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒトである。
以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増殖新形成の診断の間に有用
である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前
骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血病、急性巨核球性白血病、
および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨髄性白血病（慢性骨髄単球
性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好ましい哺乳動物としては、有尾
猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサ
ギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒトである。
【０４５９】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドもしくはＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペ
プチド、および／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストは、感染因子を
処置するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特
にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感
染性疾患が処置、予防および／または診断され得る。免疫応答は、既存の免疫応
答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇
され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および
／またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、必ずしも免疫応答を誘発す
ることなく、感染因子を直接阻害し得る。
プチド、および／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストは、感染因子を
処置するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特
にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感
染性疾患が処置、予防および／または診断され得る。免疫応答は、既存の免疫応
答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇
され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および
／またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、必ずしも免疫応答を誘発す
ることなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０４６０】
ウイルスは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置され得る疾患また
は症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下の
ＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定さ
れない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイ
ルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイル
ス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、Ｈ
ＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（
例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガ
ウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻
疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフル
エンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイル
ス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイ
ルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイ
ルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）
、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイ
ルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし
得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチ
ウムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群
、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎Ｂ型、アル
ゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症
（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行
性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感
染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発明のポリ
ペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
を用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置、予防および／または診断され
得る。特定の実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下の処置、予防およ
び／または診断に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎
（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる具体的な実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニス
トは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用
される。さらに具体的な実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳを
処置するために使用される。
および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置され得る疾患また
は症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下の
ＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定さ
れない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイ
ルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイル
ス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、Ｈ
ＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（
例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガ
ウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻
疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフル
エンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイル
ス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイ
ルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイ
ルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）
、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイ
ルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし
得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチ
ウムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群
、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎Ｂ型、アル
ゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症
（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行
性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感
染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発明のポリ
ペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
を用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置、予防および／または診断され
得る。特定の実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下の処置、予防およ
び／または診断に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎
（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる具体的な実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニス
トは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用
される。さらに具体的な実施形態において、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳを
処置するために使用される。
【０４６１】
同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置され
得る、細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性細菌およびグラム陽
性細菌ならびに細菌科および真菌を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆ
ｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば
、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ
、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例
えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ
、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉ
ｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏ
ｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、腸毒素Ｅ．ｃｏｌｉおよび腸出血性Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、およびＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）
、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅ
ｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌ
ａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏ
ｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓ
ｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症
（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、
ＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃ
ｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌならび
にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌科また
は真菌科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得
る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和
見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感
染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライ
ム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、
髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ラ
イ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマ
チ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔ
ｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用い
て、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または検出し得る。特定の実施形態
において、ＴＩＲ様リガンドＩＩのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそ
のアゴニストは、以下を処置するために使用される：破傷風、ジフテリア、ボツ
リヅム、および／またはＢ型髄膜炎。
くはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって処置され
得る、細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性細菌およびグラム陽
性細菌ならびに細菌科および真菌を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆ
ｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば
、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ
、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例
えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ
、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉ
ｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏ
ｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、腸毒素Ｅ．ｃｏｌｉおよび腸出血性Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、およびＳａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）
、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅ
ｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌ
ａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏ
ｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓ
ｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症
（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、
ＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃ
ｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌならび
にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌科また
は真菌科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得
る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和
見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感
染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライ
ム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、
髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ラ
イ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマ
チ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔ
ｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用い
て、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または検出し得る。特定の実施形態
において、ＴＩＲ様リガンドＩＩのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそ
のアゴニストは、以下を処置するために使用される：破傷風、ジフテリア、ボツ
リヅム、および／またはＢ型髄膜炎。
【０４６２】
さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニ
ストにより処置または検出され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症
状としては、以下のファミリーまたはクラスが挙げられるが、これらに限定され
ない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二
核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジ
アルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ
症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症、な
らびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉ
ｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）。これらの寄
生生物は、以下を含むがこれらに限定されない、種々の疾患または症状を引き起
こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジ
ア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マ
ラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意の
これらの症状または疾患を処置または検出し得る。特定の実施形態において、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそのアゴニストは
、マラリアを処置するために使用される。
ストにより処置または検出され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症
状としては、以下のファミリーまたはクラスが挙げられるが、これらに限定され
ない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二
核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジ
アルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ
症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症、な
らびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉ
ｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）。これらの寄
生生物は、以下を含むがこれらに限定されない、種々の疾患または症状を引き起
こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジ
ア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マ
ラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意の
これらの症状または疾患を処置または検出し得る。特定の実施形態において、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそのアゴニストは
、マラリアを処置するために使用される。
【０４６３】
別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（例え
ば、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグを会合したポリペプ
チドまたは抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体を含む組成物）を、標的細胞（例えば、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩレセプターを発現する細胞またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
細胞表面結合形態を発現する細胞のような）に送達する方法を提供する。本発明
のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたは抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体は、異
種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオ
ン性および／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。
ば、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグを会合したポリペプ
チドまたは抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体を含む組成物）を、標的細胞（例えば、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩレセプターを発現する細胞またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
細胞表面結合形態を発現する細胞のような）に送達する方法を提供する。本発明
のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたは抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体は、異
種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオ
ン性および／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。
【０４６４】
１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸に会合した
本発明のポリペプチド（例えば、ポリペプチドまたは抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗
体）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のための方
法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質をその標的化した
細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核
酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細
胞のゲノムに組み込まれ得るかまたはエピソームにて複製し得、そして転写され
得る、ＤＮＡ）を、その標的化した細胞に送達するための方法を提供する。
本発明のポリペプチド（例えば、ポリペプチドまたは抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗
体）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のための方
法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質をその標的化した
細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核
酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細
胞のゲノムに組み込まれ得るかまたはエピソームにて複製し得、そして転写され
得る、ＤＮＡ）を、その標的化した細胞に送達するための方法を提供する。
【０４６５】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合
した本発明のポリペプチド（例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたは
抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体）を投与することによる、細胞の特異的破壊（例え
ば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
した本発明のポリペプチド（例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドまたは
抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体）を投与することによる、細胞の特異的破壊（例え
ば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０４６６】
特定の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会
合した抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体および／または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
を投与することによる、Ｂ細胞系統（例えば、Ｂ細胞関連白血病またはリンパ腫
）の細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
合した抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体および／または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
を投与することによる、Ｂ細胞系統（例えば、Ｂ細胞関連白血病またはリンパ腫
）の細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
【０４６７】
特定の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会
合した抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体および／または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
を投与することによる、Ｔ細胞系統（例えば、Ｔ細胞関連白血病またはリンパ腫
）の細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
合した抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体および／または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
を投与することによる、Ｔ細胞系統（例えば、Ｔ細胞関連白血病またはリンパ腫
）の細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
【０４６８】
別の特定の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグ
と会合した抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体および／または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩを投与することによる、単球系統（例えば、単球性白血病またはリンパ腫）
の細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
と会合した抗Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗体および／または可溶性Ｔ１Ｒ様リガンド
ＩＩを投与することによる、単球系統（例えば、単球性白血病またはリンパ腫）
の細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
【０４６９】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素
（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の
条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の
分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に
従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：当該分野で公知の放射性同位体、固有または誘導性の内因性の細胞傷害性エフ
ェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固定）
、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブ
リン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジ
ン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヨウシュヤマゴボウ抗
ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「細胞
傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害性化
合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され
得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグル
タミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンア
ラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド
誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の
条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の
分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に
従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：当該分野で公知の放射性同位体、固有または誘導性の内因性の細胞傷害性エフ
ェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固定）
、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブ
リン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジ
ン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヨウシュヤマゴボウ抗
ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「細胞
傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害性化
合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され
得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグル
タミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンア
ラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド
誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７０】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストによ
って処置され得るさらなる状態、疾患または症状は、骨髄炎である。
って処置され得るさらなる状態、疾患または症状は、骨髄炎である。
【０４７１】
好ましくは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
、またはアゴニストを使用する処置は、患者に有効量のポリペプチドを投与する
ことによってか、または患者から細胞を取り出して、ポリヌクレオチドをこの細
胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）ことによって
かの、いずれかによるものであり得る。さらに、本明細書中でさらに議論するよ
うに、このポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、ワクチン中のアジュバント
として用い、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
、またはアゴニストを使用する処置は、患者に有効量のポリペプチドを投与する
ことによってか、または患者から細胞を取り出して、ポリヌクレオチドをこの細
胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）ことによって
かの、いずれかによるものであり得る。さらに、本明細書中でさらに議論するよ
うに、このポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、ワクチン中のアジュバント
として用い、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０４７２】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
を使用して、移植前の器官を維持し得るか、または初代組織の細胞培養を支持す
るために使用し得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストま
たはアンタゴニストをまた使用して、中胚葉期限の組織を初期胚において分化す
るのを誘導する。
を使用して、移植前の器官を維持し得るか、または初代組織の細胞培養を支持す
るために使用し得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストま
たはアンタゴニストをまた使用して、中胚葉期限の組織を初期胚において分化す
るのを誘導する。
【０４７３】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた使用して、先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化も
しくは増殖を増加または減少し得る。
をまた使用して、先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化も
しくは増殖を増加または減少し得る。
【０４７４】
ＴＨ１細胞応答とは反対に、個体の免疫系を、体液性応答（すなわち、ＴＨ２
）の発生に指向するための薬剤として。
）の発生に指向するための薬剤として。
【０４７５】
（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの予期された多面発現性の生物学的効果）
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは、以下の表３に示されるような
多くの効果を含む、多面発現性の生物学的効果を有することが予測される。類似
の生物学的効果は、ＩＬ−１について示されている（特に、以下に関連する効果
：膵臓内分泌組織（Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｔ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ ５：１８５（１９９３））、甲状腺（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ａ．Ｋ．，Ａｕ
ｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：１４１（１９９３））、視床下部−下垂体−副腎
軸（Ｆａｎｔｕｚｚｉ，Ｇ．およびＧｈｅｚｚｉ，Ｐ．，Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｉ
ｎｆｌａｍｍ．２：２６３（１９９３）；Ｒｉｖｉｅｒ，Ｃ．，Ａｎｎ．ＮＹ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９７：９７（１９９３）；Ｒｉｖｉｅｒ，Ｃ．，およびＲ
ｉｖｅｓｔ，Ｓ．，Ｃｉｂａ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１７２：２０４（１９９
３））、熱（Ｃｏｃｅａｎｉ，ｆ．，「Ｆｅｖｅｒ：Ｂａｓｉｃ Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｒａｖ
ｅｎ（１９９１）５９頁）、骨代謝（Ｔａｋａｋｉｓ，Ｄ．Ｎ．，Ｊ．Ｐｅｒｉ
ｄｏｎｔｏｌ ６４：４１６（１９９３））、慢性関節リウマチの病状における
軟骨の破壊（Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ．およびＤａｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ａｒｔｈｒｉ
ｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３３：３０５（１９９０）；Ｋｒａｎｅ，Ｓ．Ｍ．ら、Ａ
ｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５８０：３４０（１９９０））、子宮着床（Ｌ
ｅｗｉｓ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｌａｃｅｎｔａ １５：１３（１９９４））および除
脂肪体重の減少（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
９３：２３７９（１９９４））。
多くの効果を含む、多面発現性の生物学的効果を有することが予測される。類似
の生物学的効果は、ＩＬ−１について示されている（特に、以下に関連する効果
：膵臓内分泌組織（Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｔ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ ５：１８５（１９９３））、甲状腺（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ａ．Ｋ．，Ａｕ
ｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：１４１（１９９３））、視床下部−下垂体−副腎
軸（Ｆａｎｔｕｚｚｉ，Ｇ．およびＧｈｅｚｚｉ，Ｐ．，Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｉ
ｎｆｌａｍｍ．２：２６３（１９９３）；Ｒｉｖｉｅｒ，Ｃ．，Ａｎｎ．ＮＹ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９７：９７（１９９３）；Ｒｉｖｉｅｒ，Ｃ．，およびＲ
ｉｖｅｓｔ，Ｓ．，Ｃｉｂａ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１７２：２０４（１９９
３））、熱（Ｃｏｃｅａｎｉ，ｆ．，「Ｆｅｖｅｒ：Ｂａｓｉｃ Ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｒａｖ
ｅｎ（１９９１）５９頁）、骨代謝（Ｔａｋａｋｉｓ，Ｄ．Ｎ．，Ｊ．Ｐｅｒｉ
ｄｏｎｔｏｌ ６４：４１６（１９９３））、慢性関節リウマチの病状における
軟骨の破壊（Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ．およびＤａｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ａｒｔｈｒｉ
ｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３３：３０５（１９９０）；Ｋｒａｎｅ，Ｓ．Ｍ．ら、Ａ
ｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５８０：３４０（１９９０））、子宮着床（Ｌ
ｅｗｉｓ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｌａｃｅｎｔａ １５：１３（１９９４））および除
脂肪体重の減少（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
９３：２３７９（１９９４））。
【０４７６】
表３．Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの可能性のある生物学的効果
【０４７７】
【表３】
使用したアッセイ：膵臓内分泌組織（Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｔ．ら
、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５：１８５（１９９３））、甲状腺（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ
，Ａ．Ｋ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：１４１（１９９３））、視床下
部−下垂体−副腎軸（Ｆａｎｔｕｚｚｉ，Ｇ．およびＧｈｅｚｚｉ，Ｐ．，Ｍｅ
ｄｉａｔｏｒ Ｉｎｆｌａｍｍ．２：２６３（１９９３）；Ｒｉｖｉｅｒ，Ｃ．
，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９７：９７（１９９３）；Ｒｉｖｉｅｒ
，Ｃ．，およびＲｉｖｅｓｔ，Ｓ．，Ｃｉｂａ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１７２
：２０４（１９９３））、熱（Ｃｏｃｅａｎｉ，ｆ．，「Ｆｅｖｅｒ：Ｂａｓｉ
ｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，ＮＹ，Ｒａｖｅｎ（１９９１）５９頁）、骨代謝（Ｔａｋａｋｉｓ，Ｄ．Ｎ
．，Ｊ．Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏｌ ６４：４１６（１９９３））、慢性関節リウマ
チの病状における軟骨の破壊（Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ．およびＤａｙｅｒ，Ｊ．Ｍ
．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３３：３０５（１９９０）；Ｋｒａｎｅ
，Ｓ．Ｍ．ら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５８０：３４０（１９９０）
）、子宮着床（Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｌａｃｅｎｔａ １５：１３（１９
９４））および除脂肪体重の減少（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：２３７９（１９９４））。
、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５：１８５（１９９３））、甲状腺（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ
，Ａ．Ｋ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：１４１（１９９３））、視床下
部−下垂体−副腎軸（Ｆａｎｔｕｚｚｉ，Ｇ．およびＧｈｅｚｚｉ，Ｐ．，Ｍｅ
ｄｉａｔｏｒ Ｉｎｆｌａｍｍ．２：２６３（１９９３）；Ｒｉｖｉｅｒ，Ｃ．
，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９７：９７（１９９３）；Ｒｉｖｉｅｒ
，Ｃ．，およびＲｉｖｅｓｔ，Ｓ．，Ｃｉｂａ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１７２
：２０４（１９９３））、熱（Ｃｏｃｅａｎｉ，ｆ．，「Ｆｅｖｅｒ：Ｂａｓｉ
ｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，ＮＹ，Ｒａｖｅｎ（１９９１）５９頁）、骨代謝（Ｔａｋａｋｉｓ，Ｄ．Ｎ
．，Ｊ．Ｐｅｒｉｄｏｎｔｏｌ ６４：４１６（１９９３））、慢性関節リウマ
チの病状における軟骨の破壊（Ａｒｅｎｄ，Ｗ．Ｐ．およびＤａｙｅｒ，Ｊ．Ｍ
．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３３：３０５（１９９０）；Ｋｒａｎｅ
，Ｓ．Ｍ．ら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５８０：３４０（１９９０）
）、子宮着床（Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｌａｃｅｎｔａ １５：１３（１９
９４））および除脂肪体重の減少（Ｒｏｕｂｅｎｏｆｆ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：２３７９（１９９４））。
【０４７８】
本発明を一般に記載してきたが、同じことが、本発明は、以下の実施例を参照
してより容易に理解される。これらの実施例は、例示目的で提供され、限定する
ものとして意図されない。
してより容易に理解される。これらの実施例は、例示目的で提供され、限定する
ものとして意図されない。
【０４７９】
（実施例）
（実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴ１Ｒ様リガンドの発現および精製）
寄託ｃＤＮＡクローンにおけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩの成熟細胞外可溶性部分
をコードするＤＮＡ配列を、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのアミノ末端配列に特異的な
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよびこの遺伝子の３’側のベクター配列
に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。クローニ
ングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドが、それぞれ、こ
の５’および３’配列に付加されている。
をコードするＤＮＡ配列を、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのアミノ末端配列に特異的な
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーおよびこの遺伝子の３’側のベクター配列
に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。クローニ
ングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドが、それぞれ、こ
の５’および３’配列に付加されている。
【０４８０】
当業者は、全長の成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質（配列番号２のアミノ
酸およそ１〜およそ２０３）が、適切な５’および３’オリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され得ることを理解する。
酸およそ１〜およそ２０３）が、適切な５’および３’オリゴヌクレオチドプラ
イマーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され得ることを理解する。
【０４８１】
寄託クローンにおける全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの細胞外ドメインをコードす
るｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用して増幅する。この５’プライマーは、配列５’Ｃ
ＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣ３’（配列番号４）を含
み、これは、下線を付したＮｃｏＩ部位、およびシグナルペプチドの直後で開始
する、図１（配列番号１）におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質コード配列
の１７ヌクレオチド（ヌクレオチド１３１〜１４７）を含む。
るｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用して増幅する。この５’プライマーは、配列５’Ｃ
ＧＣＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣ３’（配列番号４）を含
み、これは、下線を付したＮｃｏＩ部位、およびシグナルペプチドの直後で開始
する、図１（配列番号１）におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質コード配列
の１７ヌクレオチド（ヌクレオチド１３１〜１４７）を含む。
【０４８２】
３’プライマーは、配列５’ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧ
ＴＴＧＣＴＴＴＣ３’（配列番号５）を有し、これは、ＨｉｎｄＩＩ部位、およ
びそれに続く、終止コドン、ならびに図１（配列番号１）におけるＴ１Ｒ様リガ
ンドＩＩタンパク質コード配列のヌクレオチド６１９〜６３６に対して逆方向か
つ相補的な１８ヌクレオチドを含む。
ＴＴＧＣＴＴＴＣ３’（配列番号５）を有し、これは、ＨｉｎｄＩＩ部位、およ
びそれに続く、終止コドン、ならびに図１（配列番号１）におけるＴ１Ｒ様リガ
ンドＩＩタンパク質コード配列のヌクレオチド６１９〜６３６に対して逆方向か
つ相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０４８３】
これらの制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ６０における制限酵素部位に都
合よく、このベクターは、これらの実施例において、Ｍ１５／ｒｅｐ４宿主細胞
における細菌発現に使用される（Ｏｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔ
ｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐ ｒ 」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモ
ーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部
位を含む。
合よく、このベクターは、これらの実施例において、Ｍ１５／ｒｅｐ４宿主細胞
における細菌発現に使用される（Ｏｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔ
ｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐ ｒ 」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモ
ーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグおよび制限酵素部
位を含む。
【０４８４】
増幅したＴ１Ｒ様リガンドＩＩ ＤＮＡおよびベクターｐＱＥ６０の両方を、
ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで、これらの消化したＤＮＡを、
共に連結する。制限処理したｐＱＥ６０ベクターへのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ Ｄ
ＮＡの挿入は、このベクターのＩＰＴＧ誘導性プロモーターの下流にかつ作動可
能に連結するように、かつＴ１Ｒ様リガンドＩＩの翻訳のために適切に位置され
る開始ＡＵＧとインフレームに、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩコード領域を配置する。
ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで、これらの消化したＤＮＡを、
共に連結する。制限処理したｐＱＥ６０ベクターへのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ Ｄ
ＮＡの挿入は、このベクターのＩＰＴＧ誘導性プロモーターの下流にかつ作動可
能に連結するように、かつＴ１Ｒ様リガンドＩＩの翻訳のために適切に位置され
る開始ＡＵＧとインフレームに、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩコード領域を配置する。
【０４８５】
この連結混合物を、標準的な手順を使用してコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に
形質転換する。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される。プラスミ
ドｐＲＥＰ４（これは、ｌａｃリプレッサーを発現しかつカナマイシン耐性（「
Ｋａｎｒ」）を付与する）の複数のコピーを含むＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ
１４を、本明細書中に記載した例示的実施例を行うにおいて使用する。この株（
これは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの発現に適切な多くの株のうちのほんの１つであ
る）は、Ｑｉａｇｅｎから市販されている。
形質転換する。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される。プラスミ
ドｐＲＥＰ４（これは、ｌａｃリプレッサーを発現しかつカナマイシン耐性（「
Ｋａｎｒ」）を付与する）の複数のコピーを含むＥ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ
１４を、本明細書中に記載した例示的実施例を行うにおいて使用する。この株（
これは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの発現に適切な多くの株のうちのほんの１つであ
る）は、Ｑｉａｇｅｎから市販されている。
【０４８６】
形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で
増殖する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し
、そしてこのクローニングしたＤＮＡの正体を、制限分析によって確かめた。
増殖する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し
、そしてこのクローニングしたＤＮＡの正体を、制限分析によって確かめた。
【０４８７】
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中での液体培養で、一
晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。
ナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中での液体培養で、一
晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。
【０４８８】
このＯ／Ｎ培養物を使用して、約１：１００〜１：２５０の希釈度で、大量培
養物に播種する。これらの細胞を、０．４〜０．６の間の６００ｎｍでの吸光度
（「ＯＤ６００」）までに増殖させる。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、１ｍＭの最終濃度で添加し、ｌａｃＩリ
プレッサーの不活性化による、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転
写を誘導する。その後、細胞を、３〜４時間さらにインキュベートした。次いで
、細胞を、遠心分離によって回収し、そして標準的な方法によって破壊する。封
入体を、慣用的な収集技術を使用して、この破壊した細胞から精製し、そしてタ
ンパク質を、この封入体から８Ｍ尿素に可溶化する。この可溶化されたタンパク
質を含む８Ｍ尿素溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中のＰＤ
−１０カラムに通過させ、これによって、尿素を除去し、緩衝液を交換し、そし
てこのタンパク質をフォールディングさせる。このタンパク質を、さらなるクロ
マトグラフィー工程によって精製し、内毒素を除去する。次いで、このタンパク
質を、滅菌濾過する。この滅菌濾過したタンパク質調製物を、２×ＰＢＳ中で保
存する。
養物に播種する。これらの細胞を、０．４〜０．６の間の６００ｎｍでの吸光度
（「ＯＤ６００」）までに増殖させる。次いで、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、１ｍＭの最終濃度で添加し、ｌａｃＩリ
プレッサーの不活性化による、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転
写を誘導する。その後、細胞を、３〜４時間さらにインキュベートした。次いで
、細胞を、遠心分離によって回収し、そして標準的な方法によって破壊する。封
入体を、慣用的な収集技術を使用して、この破壊した細胞から精製し、そしてタ
ンパク質を、この封入体から８Ｍ尿素に可溶化する。この可溶化されたタンパク
質を含む８Ｍ尿素溶液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中のＰＤ
−１０カラムに通過させ、これによって、尿素を除去し、緩衝液を交換し、そし
てこのタンパク質をフォールディングさせる。このタンパク質を、さらなるクロ
マトグラフィー工程によって精製し、内毒素を除去する。次いで、このタンパク
質を、滅菌濾過する。この滅菌濾過したタンパク質調製物を、２×ＰＢＳ中で保
存する。
【０４８９】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準的方法によるこの調製物の分析は、こ
の調製物が、約２６ｋＤａの予測された分子量を有する、約９５％のモノマーＴ
１Ｒ様リガンドＩＩを含むことを示す。
の調製物が、約２６ｋＤａの予測された分子量を有する、約９５％のモノマーＴ
１Ｒ様リガンドＩＩを含むことを示す。
【０４９０】
（実施例２：バキュロウイルス発現系におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩのクロー
ニングおよび発現） 寄託クローンにおける全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩをコードするｃＤＮＡ配列を
、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して増幅する。
ニングおよび発現） 寄託クローンにおける全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩをコードするｃＤＮＡ配列を
、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して増幅する。
【０４９１】
５’プライマーは、配列５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＧ
ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧ３’（配列番号６）を有し、これは、下線を付したＢａ
ｍＨＩ制限酵素部位、およびそれに続く、図１（配列番号１）におけるＴ１Ｒ様
リガンドＩＩタンパク質の配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド５５〜７２）
を含む。本明細書中に記載のように、発現ベクターに挿入した場合に、このＴ１
Ｒ様リガンドＩＩをコードする増幅フラグメントの５’末端は、効果的なシグナ
ルペプチドを提供する。Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９
４７−９５０（１９８７）によって記載されるような、真核生物細胞における翻
訳開始のための効果的なシグナルは、この構築物のこのベクター部分に適切に配
置される。
ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧ３’（配列番号６）を有し、これは、下線を付したＢａ
ｍＨＩ制限酵素部位、およびそれに続く、図１（配列番号１）におけるＴ１Ｒ様
リガンドＩＩタンパク質の配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド５５〜７２）
を含む。本明細書中に記載のように、発現ベクターに挿入した場合に、このＴ１
Ｒ様リガンドＩＩをコードする増幅フラグメントの５’末端は、効果的なシグナ
ルペプチドを提供する。Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９
４７−９５０（１９８７）によって記載されるような、真核生物細胞における翻
訳開始のための効果的なシグナルは、この構築物のこのベクター部分に適切に配
置される。
【０４９２】
３’プライマーは、配列５’ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＡＡＴＧＴＴＡＣＧ
ＴＡＣＴＣＴＡＧ３’（配列番号７）を有し、これは、下線を付したＡｓｐ７１
８制限部位、およびそれに続く、終止コドン、ならびに図１（配列番号１）に示
されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌクレオチド７５４〜７７１に対して
逆方向かつ相補的な１８ヌクレオチドを含む。
ＴＡＣＴＣＴＡＧ３’（配列番号７）を有し、これは、下線を付したＡｓｐ７１
８制限部位、およびそれに続く、終止コドン、ならびに図１（配列番号１）に示
されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌクレオチド７５４〜７７１に対して
逆方向かつ相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０４９３】
寄託クローンにおける全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの細胞外ドメインをコードす
るｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用して増幅する。
るｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用して増幅する。
【０４９４】
５’プライマーは、配列５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＧ
ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧ３’（配列番号６）を有し、これは、下線を付したＢａ
ｍＨＩ制限酵素部位、およびそれに続く、図１（配列番号１）に示されるＴ１Ｒ
様リガンドＩＩタンパク質をコードする配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド
５５〜７２）を含む。本明細書中に記載のように、発現ベクターに挿入した場合
に、このＴ１Ｒ様リガンドＩＩをコードする増幅フラグメントの５’末端は、効
果的なシグナルペプチドを提供する。Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．１９６：９４７−９５０（１９８７）によって記載されるような、真核生物細
胞における翻訳開始のための効果的なシグナルは、この構築物のこのベクター部
分に適切に配置される。
ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧ３’（配列番号６）を有し、これは、下線を付したＢａ
ｍＨＩ制限酵素部位、およびそれに続く、図１（配列番号１）に示されるＴ１Ｒ
様リガンドＩＩタンパク質をコードする配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド
５５〜７２）を含む。本明細書中に記載のように、発現ベクターに挿入した場合
に、このＴ１Ｒ様リガンドＩＩをコードする増幅フラグメントの５’末端は、効
果的なシグナルペプチドを提供する。Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．１９６：９４７−９５０（１９８７）によって記載されるような、真核生物細
胞における翻訳開始のための効果的なシグナルは、この構築物のこのベクター部
分に適切に配置される。
【０４９５】
３’プライマーは、配列５’ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧ
ＴＴＧＣＴＴＴＣ３’（配列番号８）を有し、これは、下線を付したＡｓｐ７１
８制限部位、およびそれに続く、終止コドン、ならびに図１（配列番号１）に示
されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌクレオチド６１９〜６３６に対して
相補的かつ逆方向の１８ヌクレオチドを含む。
ＴＴＧＣＴＴＴＣ３’（配列番号８）を有し、これは、下線を付したＡｓｐ７１
８制限部位、およびそれに続く、終止コドン、ならびに図１（配列番号１）に示
されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌクレオチド６１９〜６３６に対して
相補的かつ逆方向の１８ヌクレオチドを含む。
【０４９６】
増幅したフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲル
から単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で
消化し、そして再度、１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントを、
本明細書中でＦ２と称する。
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲル
から単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で
消化し、そして再度、１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントを、
本明細書中でＦ２と称する。
【０４９７】
ベクターｐＡ２を使用して、バキュロウイルス発現系において全長Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの細胞外ドメインを発現させる。これは
、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａ
ｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｅｘｐｒｅｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５
５（１９８７）に記載のような、標準的方法を使用する。このｐＡ２ベクターは
、シグナルペプチドコード領域を含まない。従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩシグ
ナルペプチドに依存する（配列番号１のヌクレオチド５５〜１３２；配列番号２
のアミノ酸−２６〜−１）。
ガンドＩＩおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの細胞外ドメインを発現させる。これは
、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａ
ｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｅｘｐｒｅｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５
５（１９８７）に記載のような、標準的方法を使用する。このｐＡ２ベクターは
、シグナルペプチドコード領域を含まない。従って、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩシグ
ナルペプチドに依存する（配列番号１のヌクレオチド５５〜１３２；配列番号２
のアミノ酸−２６〜−１）。
【０４９８】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩシグナルペプチドが、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質
の有効な発現を引き起こさない場合、ｐＡ２−ＧＰベクターは、ｐＡ２ベクター
の代わりに使用され得る。ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６７のシグナルペプチド（Ｎ末端
メチオニンを含む）は、ＢａｍＨＩ部位のちょうど上流に位置する。当業者は、
ｐＡ２−ＧＰ発現ベクターが使用される場合、使用される５’オリゴヌクレオチ
ドは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩシグナルペプチドをコードする配列を含むべきでは
ないことを理解する。代わりに、５’オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１３
１で始まるべきである。
の有効な発現を引き起こさない場合、ｐＡ２−ＧＰベクターは、ｐＡ２ベクター
の代わりに使用され得る。ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６７のシグナルペプチド（Ｎ末端
メチオニンを含む）は、ＢａｍＨＩ部位のちょうど上流に位置する。当業者は、
ｐＡ２−ＧＰ発現ベクターが使用される場合、使用される５’オリゴヌクレオチ
ドは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩシグナルペプチドをコードする配列を含むべきでは
ないことを理解する。代わりに、５’オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１３
１で始まるべきである。
【０４９９】
ｐＡ２とｐＡ２−ＧＰ発現ベクターの両方は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ
）の強力な多角体病プロモーター、続いて都合の良い制限酵素部位（例えば、Ｂ
ａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８）を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）
のポリアデニル化部位は、有効なポリアデニル化のために使用される。組換えウ
イルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
が、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターと同じ配向で挿入され
、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが挿入される。ホリヘド
リン配列は、クローン化されたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルス
を生成するために、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのための
ウイルス配列と両方の側で隣接する。
ｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ
）の強力な多角体病プロモーター、続いて都合の良い制限酵素部位（例えば、Ｂ
ａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８）を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）
のポリアデニル化部位は、有効なポリアデニル化のために使用される。組換えウ
イルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
が、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターと同じ配向で挿入され
、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが挿入される。ホリヘド
リン配列は、クローン化されたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルス
を生成するために、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのための
ウイルス配列と両方の側で隣接する。
【０５００】
他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、輸送などのために適切に配置されたシグナル（例えば、必要とされる場合、
インフレームなＡＵＧおよびシグナルペプチドを含む）を提供する限りにおいて
、ｐＡ２またはｐＡ２−ＧＰのベクターの代わりに使用され得る。このようなベ
クターは、特に、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１
９８９）に記載される。
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、輸送などのために適切に配置されたシグナル（例えば、必要とされる場合、
インフレームなＡＵＧおよびシグナルペプチドを含む）を提供する限りにおいて
、ｐＡ２またはｐＡ２−ＧＰのベクターの代わりに使用され得る。このようなベ
クターは、特に、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１
９８９）に記載される。
【０５０１】
このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次いで、
当該分野において公知の慣用的手な順を使用して、仔ウシ腸ホスファターゼを用
いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａ．）を使用してＤＮＡを１％アガロ
ースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ１」と称する
。
当該分野において公知の慣用的手な順を使用して、仔ウシ腸ホスファターゼを用
いて脱リン酸化する。次いで、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａ．）を使用してＤＮＡを１％アガロ
ースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ１」と称する
。
【０５０２】
フラグメントＦ２および脱リン酸したプラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼを用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を、連結混合物で形
質転換し、そして培養プレート上に拡げる。ＰＣＲ法を使用してヒトＴ１Ｒ様リ
ガンドＩＩ遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７
１８と用いて個々のコロニーからＤＮＡを消化し、次いでゲル電気泳動法によっ
て消化産物を分析することによって、同定する。クローン化されたフラグメント
の配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認される。このプラスミドは、本明細書中
でｐＢａｃＴ１Ｒ様リガンドＩＩと称する。
ゼを用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を、連結混合物で形
質転換し、そして培養プレート上に拡げる。ＰＣＲ法を使用してヒトＴ１Ｒ様リ
ガンドＩＩ遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７
１８と用いて個々のコロニーからＤＮＡを消化し、次いでゲル電気泳動法によっ
て消化産物を分析することによって、同定する。クローン化されたフラグメント
の配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認される。このプラスミドは、本明細書中
でｐＢａｃＴ１Ｒ様リガンドＩＩと称する。
【０５０３】
５μｇのプラスミドｐＢａｃＴ１Ｒ様リガンドＩＩを、 Ｆｅｌｇｎｅｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７
（１９８７）によって記載されたリポフェクチン法を使用して、１．０μｇの市
販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．
）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイ
ルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＴ１Ｒ様リガンドＩＩを、５０μ
ｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含む、マイクロタイタープレートの滅菌したウェル
中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培地
を加え、混合し、そして室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランス
フェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プ
レートに播種したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加
える。このプレートを前後に揺らして新たに添加した溶液を混合する。次いで、
このプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェク
ション溶液をそのプレートから除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１
ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。このプレートをインキュベーターに戻し、
そして培養を２７℃で４日間継続する。
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７
（１９８７）によって記載されたリポフェクチン法を使用して、１．０μｇの市
販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭ ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．
）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイ
ルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＴ１Ｒ様リガンドＩＩを、５０μ
ｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含む、マイクロタイタープレートの滅菌したウェル
中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌグレース培地
を加え、混合し、そして室温で１５分間インキュベートする。次いで、トランス
フェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プ
レートに播種したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加
える。このプレートを前後に揺らして新たに添加した溶液を混合する。次いで、
このプレートを２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェク
ション溶液をそのプレートから除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１
ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。このプレートをインキュベーターに戻し、
そして培養を２７℃で４日間継続する。
【０５０４】
４日後、上清を収集し、そして上記のＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈによっ
て記載されたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むア
ガロースゲルを、ｇａｌ発現クローン（青色に着色したプラークを生ずる）の容
易な同定および単離を可能にするために使用する（この型の「プラークアッセイ
」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロウイル
ス学のための使用者ガイドの中の９−１０頁に見出され得る）。
て記載されたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むア
ガロースゲルを、ｇａｌ発現クローン（青色に着色したプラークを生ずる）の容
易な同定および単離を可能にするために使用する（この型の「プラークアッセイ
」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロウイル
ス学のための使用者ガイドの中の９−１０頁に見出され得る）。
【０５０５】
連続希釈後４日目に、ウイルスを細胞に添加する。適切なインキュベーション
の後、青色に染色したプラークを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆのチップで拾う。次いで
、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むＥｐｐｅｎｄ
ｏｒｆチューブ中で再懸濁させる。寒天を短時間の遠心分離によって除去し、そ
して組換えバキュロウイルスを含む上清を使用して、３５ｍｍディッシュに播種
したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し
、次いでこれらを４℃で貯蔵する。適切に挿入されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩを含
むクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含むＤＮＡ分析によって同定す
る。これを、本明細書中でＶ−Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩと称する。
の後、青色に染色したプラークを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆのチップで拾う。次いで
、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含むＥｐｐｅｎｄ
ｏｒｆチューブ中で再懸濁させる。寒天を短時間の遠心分離によって除去し、そ
して組換えバキュロウイルスを含む上清を使用して、３５ｍｍディッシュに播種
したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し
、次いでこれらを４℃で貯蔵する。適切に挿入されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩを含
むクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含むＤＮＡ分析によって同定す
る。これを、本明細書中でＶ−Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩと称する。
【０５０６】
１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で、Ｓｆ９細胞を増殖させる
。この細胞を、約２（約１〜約３）の感染効率（「ＭＯＩ」）で、このポリヌク
レオチドを含む組換えバキュロウイルスＶ−Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩで感染させる
。６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ
９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇから入手可能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ
−メチオニンおよび５μＣｉの３５Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手
可能）を添加する。この細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで遠心分
離によって採集し、溶解し、そして標識したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラジオグラフィーによって可視化する。
。この細胞を、約２（約１〜約３）の感染効率（「ＭＯＩ」）で、このポリヌク
レオチドを含む組換えバキュロウイルスＶ−Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩで感染させる
。６時間後に培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ
９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇから入手可能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ
−メチオニンおよび５μＣｉの３５Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手
可能）を添加する。この細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで遠心分
離によって採集し、溶解し、そして標識したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラジオグラフィーによって可視化する。
【０５０７】
（実施例３：哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現）
哺乳動物細胞におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質遺伝子配列の一過性発
現のために使用されるベクターのほとんどは、複製のＳＶ４０起点を保有するべ
きである。これは、ウイルスＤＮＡ合成の開始のために必要とされるＴ抗原を発
現する細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）において高コピー数までベクターの複製を可
能にする。任意の他の哺乳動物細胞はまた、この目的のために使用され得る。
現のために使用されるベクターのほとんどは、複製のＳＶ４０起点を保有するべ
きである。これは、ウイルスＤＮＡ合成の開始のために必要とされるＴ抗原を発
現する細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）において高コピー数までベクターの複製を可
能にする。任意の他の哺乳動物細胞はまた、この目的のために使用され得る。
【０５０８】
代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリ
アデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コ
ザック（Ｋｏｚａｋ）配列、ならびに、ＲＮＡスプライシングのためのドナー部
位およびアクセプター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、
ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、
ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成され得る。しかし、細胞内シグ
ナル（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。本発明を実
施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、およびｐＢＣ
１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターを含む。使用され得る哺乳
動物宿主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２８３細胞、Ｈ９細胞およびジャ
ーカット細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞
、Ｃｏｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、アフリカミドリザル細胞、ウズラのＱＣ１
−３細胞、マウスのＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられ
る。
ターエレメント、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリ
アデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コ
ザック（Ｋｏｚａｋ）配列、ならびに、ＲＮＡスプライシングのためのドナー部
位およびアクセプター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、
ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、
ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成され得る。しかし、細胞内シグ
ナル（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。本発明を実
施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、およびｐＢＣ
１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターを含む。使用され得る哺乳
動物宿主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２８３細胞、Ｈ９細胞およびジャ
ーカット細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞
、Ｃｏｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、アフリカミドリザル細胞、ウズラのＱＣ１
−３細胞、マウスのＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられ
る。
【０５０９】
あるいは、この遺伝子は、染色体に組み込まれた遺伝子を含む、安定な細胞株
中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、またはハイグロマイシン
のような選択可能マーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフェ
クトされた細胞の同定および単離を可能にする。
中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、またはハイグロマイシン
のような選択可能マーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフェ
クトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０５１０】
トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用なマ
ーカーである。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）
である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９
９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６
９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択
培地中で増殖させ、そしてもっとも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの
細胞株は、染色体に組み込まれた、増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用なマ
ーカーである。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）
である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９
９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６
９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択
培地中で増殖させ、そしてもっとも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの
細胞株は、染色体に組み込まれた、増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０５１１】
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４
４７（１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エ
ンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５
））のフラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１
８の制限酵素切断部位を有するマルチプルクローニング部位は、目的の遺伝子の
クローニングを容易にする。このベクターはまた、３’イントロン、ラットプレ
プロインスリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび終止シグナルを含む。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４
４７（１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エ
ンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５
））のフラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１
８の制限酵素切断部位を有するマルチプルクローニング部位は、目的の遺伝子の
クローニングを容易にする。このベクターはまた、３’イントロン、ラットプレ
プロインスリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび終止シグナルを含む。
【０５１２】
（実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現）
発現プラスミドを、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩをコードするｃＤＮＡを、発現ベク
ターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．より入手
可能）にクローニングすることによって、作製する。
ターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．より入手
可能）にクローニングすることによって、作製する。
【０５１３】
発現ベクターｐｃＤＮＡ／ａｍｐは、（Ｄｏｗｅｒ，Ｃｏｌｏｔｔａ，Ｆ．ら
、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １５；５６２（１９９４）Ｅ．ｃｏｌｉおよび
ほかの原核細胞生物において増殖に有効な複製のＥ．ｃｏｌｉ起点；（Ｇｒｅｅ
ｆｅｄｅｒ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３７５７（１９
９５））プラスミドを含む原核生物細胞の選択に対するアンピシリン耐性遺伝子
；（Ｐｏｌａｎ，Ｍ．Ｌ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１７
０：１０００（１９９４））真核生物細胞における増殖のための複製のＳＶ４０
起点；（Ｃａｒｉｎｃｉ，Ｍｏｒａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．
Ｒｅｓ．３４９：２０５（１９９０））ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、Ｓ
Ｖ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナル（これらは、ｃＤＮＡがＣＭＶ
プロモーターの発現制御下で配置され得、そしてポリリンカーに置ける制限部位
によってＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結さ
れ得るように配置される）を含む。
、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １５；５６２（１９９４）Ｅ．ｃｏｌｉおよび
ほかの原核細胞生物において増殖に有効な複製のＥ．ｃｏｌｉ起点；（Ｇｒｅｅ
ｆｅｄｅｒ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３７５７（１９
９５））プラスミドを含む原核生物細胞の選択に対するアンピシリン耐性遺伝子
；（Ｐｏｌａｎ，Ｍ．Ｌ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１７
０：１０００（１９９４））真核生物細胞における増殖のための複製のＳＶ４０
起点；（Ｃａｒｉｎｃｉ，Ｍｏｒａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．
Ｒｅｓ．３４９：２０５（１９９０））ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、Ｓ
Ｖ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナル（これらは、ｃＤＮＡがＣＭＶ
プロモーターの発現制御下で配置され得、そしてポリリンカーに置ける制限部位
によってＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結さ
れ得るように配置される）を含む。
【０５１４】
完全Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ前駆体をコードするＤＮＡフラグメントおよびその
３’末端にインフレームで融合されたＨＡタグを、ベクターのポリリンカー領域
中にクローン化し、その結果、組換えタンパク質発現を、ＣＭＶプロモーターに
よって指向する。このＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（
１９８４）によって記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエ
ピトープに対応する。標的タンパク質に対するＨＡタグの融合は、ＨＡエピトー
プを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にす
る。
３’末端にインフレームで融合されたＨＡタグを、ベクターのポリリンカー領域
中にクローン化し、その結果、組換えタンパク質発現を、ＣＭＶプロモーターに
よって指向する。このＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（
１９８４）によって記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエ
ピトープに対応する。標的タンパク質に対するＨＡタグの融合は、ＨＡエピトー
プを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にす
る。
【０５１５】
プラスミド構築のストラテジーは、以下のとおりである。
【０５１６】
寄託されたクローンのＴ１Ｒ様リガンドＩＩｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉでのＴ
１Ｒ様リガンドＩＩの発現のための発現ベクターの構築に関して、上記に記載さ
れるような都合よい制限部位を含有するプライマーを使用して増幅する。発現Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩの検出、精製および特徴付けを容易にするために、このプラ
イマーのうちの１つは、上記のように、赤血球凝集素タグ（「ＨＡタグ」）を含
む。
１Ｒ様リガンドＩＩの発現のための発現ベクターの構築に関して、上記に記載さ
れるような都合よい制限部位を含有するプライマーを使用して増幅する。発現Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩの検出、精製および特徴付けを容易にするために、このプラ
イマーのうちの１つは、上記のように、赤血球凝集素タグ（「ＨＡタグ」）を含
む。
【０５１７】
当業者は、全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質（配列番号２のアミノ酸約−
２６〜約２０３）は、適切な５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーを用
いてＣＯＳ細胞に発現され得ることを理解する。
２６〜約２０３）は、適切な５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーを用
いてＣＯＳ細胞に発現され得ることを理解する。
【０５１８】
寄託されたクローンの全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの細胞外ドメインをコードす
るＤＮＡ配列は、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて増幅される。５’プライマーは以下の配列：
るＤＮＡ配列は、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて増幅される。５’プライマーは以下の配列：
【０５１９】
【化４】
（配列番号６）を有し、下線部のＢａｍＨＩ部位、および図１（配列番号１）に
記載されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列の１８ヌクレオチドを含む。
記載されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列の１８ヌクレオチドを含む。
【０５２０】
３’プライマーは以下の配列：
【０５２１】
【化５】
（配列番号９）を有し、下線部のＸｂａ Ｉ部位、終止コドン、ＨＡタグ、およ
び図１（配列番号１）に記載されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌクレオ
チド６１９−６３９に逆方向および相補的な１８ヌクレオチドを含む。
び図１（配列番号１）に記載されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌクレオ
チド６１９−６３９に逆方向および相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０５２２】
ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、
ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、次いで連結する。この連結混合物を
、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ、１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、そして形質転
換した培養物をアンピシリン培地プレート上にプレーティングし、次に、インキ
ュベートして、アンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐
性コロニーから単離し、そしてＴ１Ｒ様リガンドＩＩコードフラグメントの存在
について制限分析およびゲルサイズ決定によって試験する。
ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、次いで連結する。この連結混合物を
、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ、１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、そして形質転
換した培養物をアンピシリン培地プレート上にプレーティングし、次に、インキ
ュベートして、アンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐
性コロニーから単離し、そしてＴ１Ｒ様リガンドＩＩコードフラグメントの存在
について制限分析およびゲルサイズ決定によって試験する。
【０５２３】
組換えＴ１Ｒ様リガンドＩＩの発現のために、上記のように、例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に
記載されるように、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使用して、ＣＯＳ細胞を発現ベ
クターでトランスフェクトする。細胞をベクターによるＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
発現のための条件下でインキュベートする。
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に
記載されるように、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使用して、ＣＯＳ細胞を発現ベ
クターでトランスフェクトする。細胞をベクターによるＴ１Ｒ様リガンドＩＩの
発現のための条件下でインキュベートする。
【０５２４】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ−ＨＡ融合タンパク質の発現を、放射能標識および免疫
沈降（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される方法を使用する）によって検出する。この
目的のために、トランスフェクションの２日後、この細胞を３５Ｓ−システイン
を含有する培地中で８時間インキュベーションすることによって標識する。この
細胞および培地を収集し、そして細胞を洗浄し、そして界面活性剤含有ＲＩＰＡ
緩衝液（上記に引用されるＷｉｌｓｏｎらに記載されるように、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％
ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５）を用いて溶解する。タンパク質を
細胞溶解物、および培養培地から、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を使用して沈
殿する。次に、沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオ
グラフィーによって分析する。予想されたサイズの発現産物が細胞溶解物中に見
出される。この予想されたサイズの発現産物は、ネガティブコントロール中では
見られない。
沈降（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される方法を使用する）によって検出する。この
目的のために、トランスフェクションの２日後、この細胞を３５Ｓ−システイン
を含有する培地中で８時間インキュベーションすることによって標識する。この
細胞および培地を収集し、そして細胞を洗浄し、そして界面活性剤含有ＲＩＰＡ
緩衝液（上記に引用されるＷｉｌｓｏｎらに記載されるように、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％
ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５）を用いて溶解する。タンパク質を
細胞溶解物、および培養培地から、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を使用して沈
殿する。次に、沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオ
グラフィーによって分析する。予想されたサイズの発現産物が細胞溶解物中に見
出される。この予想されたサイズの発現産物は、ネガティブコントロール中では
見られない。
【０５２５】
（実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現）
ベクターｐＣ４をＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質の発現のために使用する。
プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１
４６）の誘導体である。両方のプラスミドが、ＳＶ４０初期プロモーターの制御
下のマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされ
た、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞を
、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）において細胞を増
殖することによって選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）耐性の細胞中のＤ
ＨＦＲ遺伝子の増幅が、十分に証明されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋ
ｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＢｅｒｔｉｎｏ，Ｊ
．Ｒ．、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０；Ｈ
ａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１０７−１４３；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およ
びＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９巻
：６４−６８を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸ中の細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝
子の増幅の結果として、標的酵素であるＤＨＦＲの過剰産生による薬物の耐性を
もたらす。第２の遺伝子が、ＤＨＦＲ遺伝子と連結している場合、その遺伝子は
、通常、同時に増幅され、そして過剰発現される。１，０００コピーを超える増
幅した遺伝子のコピーを保有する細胞株を開発することは、技術水準である。引
き続いて、メトトレキサートが取り除かれた場合、細胞株は、染色体に組み込ま
れた増幅された遺伝子を含有する。
プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１
４６）の誘導体である。両方のプラスミドが、ＳＶ４０初期プロモーターの制御
下のマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされ
た、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞を
、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）において細胞を増
殖することによって選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）耐性の細胞中のＤ
ＨＦＲ遺伝子の増幅が、十分に証明されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋ
ｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＢｅｒｔｉｎｏ，Ｊ
．Ｒ．、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０；Ｈ
ａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１０７−１４３；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およ
びＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９巻
：６４−６８を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸ中の細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝
子の増幅の結果として、標的酵素であるＤＨＦＲの過剰産生による薬物の耐性を
もたらす。第２の遺伝子が、ＤＨＦＲ遺伝子と連結している場合、その遺伝子は
、通常、同時に増幅され、そして過剰発現される。１，０００コピーを超える増
幅した遺伝子のコピーを保有する細胞株を開発することは、技術水準である。引
き続いて、メトトレキサートが取り除かれた場合、細胞株は、染色体に組み込ま
れた増幅された遺伝子を含有する。
【０５２６】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長
末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １９８５年３月：４３８
−４４７）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハ
ンサーより単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２
１〜５３０、１９８５）を含有する。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込み
を可能とする以下の単一の制限酵素切断部位である：ＢａｍＨＩ、Ｐｖｕｌｌお
よびＮｒｕｌ。これらのクローニング部位の後に、このプラスミドは、３つの読
み取り枠全ての翻訳終止コドンを含み、続いて、ラットプレプロインシュリン遺
伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモータ
ーもまた、発現のために使用され得る（例えば、ヒトβ−アクチンプロモーター
、ＳＶ４０初期プロモーターまたは後期プロモーター、あるいは他のレトロウイ
ルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）。ｍＲＮＡのポリ
アデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来の他
のシグナルもまた同様に使用され得る。
末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １９８５年３月：４３８
−４４７）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハ
ンサーより単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２
１〜５３０、１９８５）を含有する。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込み
を可能とする以下の単一の制限酵素切断部位である：ＢａｍＨＩ、Ｐｖｕｌｌお
よびＮｒｕｌ。これらのクローニング部位の後に、このプラスミドは、３つの読
み取り枠全ての翻訳終止コドンを含み、続いて、ラットプレプロインシュリン遺
伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモータ
ーもまた、発現のために使用され得る（例えば、ヒトβ−アクチンプロモーター
、ＳＶ４０初期プロモーターまたは後期プロモーター、あるいは他のレトロウイ
ルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）。ｍＲＮＡのポリ
アデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来の他
のシグナルもまた同様に使用され得る。
【０５２７】
染色体中に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株もまた、ｇｐｔ
、Ｇ４１８またはハイグロマイシンのような選択可能マーカーを用いる同時トラ
ンスフェクションの際に選択され得る。最初は、１つより多い選択可能マーカー
（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有利である。
、Ｇ４１８またはハイグロマイシンのような選択可能マーカーを用いる同時トラ
ンスフェクションの際に選択され得る。最初は、１つより多い選択可能マーカー
（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが有利である。
【０５２８】
プラスミドｐＣ４を制限酵素ＢａｍＨＩを用いて消化し、次いで、当該分野に
おいて公知の手順によって、仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する
。次いで、このベクターを１％アガロースゲルより単離する。
おいて公知の手順によって、仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する
。次いで、このベクターを１％アガロースゲルより単離する。
【０５２９】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩタンパク質のアミノ末端配列および遺伝子のベクター配列３’に特異的な
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。クローニングを容易
にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ、５’および３
’配列に加える。
ドＩＩタンパク質のアミノ末端配列および遺伝子のベクター配列３’に特異的な
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。クローニングを容易
にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ、５’および３
’配列に加える。
【０５３０】
寄託されたクローンにおいて全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩをコードするｃＤＮＡ
配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、配列
配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、配列
【０５３１】
【化６】
（配列番号６）を有し、下線部のＢａｍＨＩ部位、続いて、図１（配列番号１）
のＴ１Ｒ様リガンドＩＩの配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド５５〜７２）
を含む。本明細書中に記載されるように、発現ベクターへ挿入されると、Ｔ１Ｒ
様リガンドＩＩをコードする増幅したフラグメントの５’末端は、有効なシグナ
ルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始のための有効なシグナ
ルは、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１
９８７）に記載されるように、構築物のベクター部分に適切に位置する。
のＴ１Ｒ様リガンドＩＩの配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド５５〜７２）
を含む。本明細書中に記載されるように、発現ベクターへ挿入されると、Ｔ１Ｒ
様リガンドＩＩをコードする増幅したフラグメントの５’末端は、有効なシグナ
ルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始のための有効なシグナ
ルは、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１
９８７）に記載されるように、構築物のベクター部分に適切に位置する。
【０５３２】
３’プライマーは、配列
【０５３３】
【化７】
（配列番号７）を有し、下線部のＡｓｐ７１８制限酵素部位、続いて、終止コド
ンおよび図１（配列番号１）に記載されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌ
クレオチド７５４−７７１に逆方向および相補的な１８ヌクレオチドを含む。こ
の制限部位は、ＣＨＯ発現ベクターＰＣ−４のおいて制限酵素部位に近い。
ンおよび図１（配列番号１）に記載されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌ
クレオチド７５４−７７１に逆方向および相補的な１８ヌクレオチドを含む。こ
の制限部位は、ＣＨＯ発現ベクターＰＣ−４のおいて制限酵素部位に近い。
【０５３４】
寄託されたクローンにおいて全長Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの細胞外ドメインをコ
ードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。
ードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。
【０５３５】
５’プライマーは、配列
【０５３６】
【化８】
（配列番号６）を有し、下線部のＢａｍＨＩ部位、および図１（配列番号１）の
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド５５〜７２
）を含む。本明細書中に記載されるように、発現ベクターへ挿入されると、Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩをコードする増幅したフラグメントの５’末端は、有効なシグ
ナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始のための有効なシグ
ナルは、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（
１９８７）に記載されるように、構築物のベクター部分に適切に位置する。
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列の１８ヌクレオチド（ヌクレオチド５５〜７２
）を含む。本明細書中に記載されるように、発現ベクターへ挿入されると、Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩをコードする増幅したフラグメントの５’末端は、有効なシグ
ナルペプチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始のための有効なシグ
ナルは、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（
１９８７）に記載されるように、構築物のベクター部分に適切に位置する。
【０５３７】
３’プライマーは、配列
【０５３８】
【化９】
（配列番号８）を有し、下線部のＡｓｐ７１８制限酵素部位、続いて、終止コド
ンおよび図１（配列番号１）に記載されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌ
クレオチド６１９−６３６に逆方向および相補的な１８ヌクレオチドを含む。
ンおよび図１（配列番号１）に記載されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩコード配列のヌ
クレオチド６１９−６３６に逆方向および相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０５３９】
増幅されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＡｓ
ｐ７１８で消化する。ベクターｐＣ４を、ＢａｍＨＩで消化し、次いで、消化し
たＤＮＡを一緒に連結する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化し
たベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク
質ＤＮＡのＢａｍＨＩ制限されたベクターへの挿入は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタ
ンパク質コード領域をベクタープロモーターの下流に配置し、そしてベクタープ
ロモーターに作動可能に連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形
質転換し、そして制限酵素ＢａｍＨＩを用いて正しい配向に挿入したプライマー
ｐＣ４を含む細菌を同定する。この連結混合物を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されるような標準
的手順を用いて、成分Ｅ．ｃｏｌｉ細胞へと形質転換する。この形質転換した培
養物を、アンピシリン培地プレート上にプレーティングし、次いでアンピシリン
耐性コロニーを増殖させるためにインキュベートする。プラスミドＤＮＡを耐性
コロニーから単離し、そしてＴ１Ｒ様リガンドＩＩコードフラグメントの存在に
ついて制限分析およびゲルサイズ決定によって試験する。
ｐ７１８で消化する。ベクターｐＣ４を、ＢａｍＨＩで消化し、次いで、消化し
たＤＮＡを一緒に連結する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化し
たベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク
質ＤＮＡのＢａｍＨＩ制限されたベクターへの挿入は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタ
ンパク質コード領域をベクタープロモーターの下流に配置し、そしてベクタープ
ロモーターに作動可能に連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形
質転換し、そして制限酵素ＢａｍＨＩを用いて正しい配向に挿入したプライマー
ｐＣ４を含む細菌を同定する。この連結混合物を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されるような標準
的手順を用いて、成分Ｅ．ｃｏｌｉ細胞へと形質転換する。この形質転換した培
養物を、アンピシリン培地プレート上にプレーティングし、次いでアンピシリン
耐性コロニーを増殖させるためにインキュベートする。プラスミドＤＮＡを耐性
コロニーから単離し、そしてＴ１Ｒ様リガンドＩＩコードフラグメントの存在に
ついて制限分析およびゲルサイズ決定によって試験する。
【０５４０】
（実施例３（ｃ）：ＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞のトランスフェクション）
活性なＤＨＦＲ酵素を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランス
フェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェク
チング方法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳ
Ｖｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。このプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ
は優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵素をコ
ードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８
を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、この細胞をトリプシン処理し
、ハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）
に播種し、１０〜１４日培養する。この期間の後、単一のクローンをトリプシン
処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎ
Ｍ、２００ｎＭ、４００ｎＭ）を使用して、６ウェルペトリ皿に播種する。次い
で、最高濃度のメトトレキサートで増殖したクローンを、さらにより高濃度のメ
トトレキサート（５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）を含む新たな６ウェル
プレートに移す。同じ手順を、１００μＭの濃度でクローンが増殖するまで繰り
返す。
フェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェク
チング方法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳ
Ｖｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。このプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ
は優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵素をコ
ードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８
を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、この細胞をトリプシン処理し
、ハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）
に播種し、１０〜１４日培養する。この期間の後、単一のクローンをトリプシン
処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎ
Ｍ、２００ｎＭ、４００ｎＭ）を使用して、６ウェルペトリ皿に播種する。次い
で、最高濃度のメトトレキサートで増殖したクローンを、さらにより高濃度のメ
トトレキサート（５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）を含む新たな６ウェル
プレートに移す。同じ手順を、１００μＭの濃度でクローンが増殖するまで繰り
返す。
【０５４１】
所望の遺伝子産物の発現を、ウエスタンブロット分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分析する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ融合タンパク質の発現を、放射能標識
および免疫沈澱反応によって、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に記載される方法を用いて検出
する。この終わりに、トランスフェクションの２日後、細胞を３５Ｓ−システイ
ンを含む培地中で８時間インキュベーションすることによって標識する。この細
胞および培地を収集し、そして細胞を洗浄して、そしてＷｉｌｓｏｎら（上記）
によって記載されるように、海面活性剤を含むＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％
ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５に溶解させる。タンパク質を細胞溶解
産物から、および培養培地から、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて沈殿さ
せる。次いで、沈殿したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジ
オグラフィによって分析する。予期されるサイズの発現産物は、細胞溶解産物に
おいて見い出され、これは、ネガティブコントロールにおいては見い出されない
。
によって分析する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ融合タンパク質の発現を、放射能標識
および免疫沈澱反応によって、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に記載される方法を用いて検出
する。この終わりに、トランスフェクションの２日後、細胞を３５Ｓ−システイ
ンを含む培地中で８時間インキュベーションすることによって標識する。この細
胞および培地を収集し、そして細胞を洗浄して、そしてＷｉｌｓｏｎら（上記）
によって記載されるように、海面活性剤を含むＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％
ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５に溶解させる。タンパク質を細胞溶解
産物から、および培養培地から、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて沈殿さ
せる。次いで、沈殿したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジ
オグラフィによって分析する。予期されるサイズの発現産物は、細胞溶解産物に
おいて見い出され、これは、ネガティブコントロールにおいては見い出されない
。
【０５４２】
（実施例４：Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現の組織分布）
ノーザンブロット分析を行って、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）によっ
て記載される方法を用いて、ヒト組織におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の発
現レベルを調べた。全Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩヌクレオチド配列（配列番号１）を
含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ標識システム（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って用いて３ ２ Ｐで標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００ＴＭカ
ラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造者のプ
ロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って用いて精製する。次いで、精製した標識
プローブを用いて、種々のヒト組織をＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の発現につい
て調べる。
て記載される方法を用いて、ヒト組織におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の発
現レベルを調べた。全Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩヌクレオチド配列（配列番号１）を
含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ ＤＮＡ標識システム（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って用いて３ ２ Ｐで標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００ＴＭカ
ラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造者のプ
ロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って用いて精製する。次いで、精製した標識
プローブを用いて、種々のヒト組織をＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子の発現につい
て調べる。
【０５４３】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む複数組織のノーザ
ン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓ
ＨｙｂＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロト
コル番号ＰＴ１１９０−１に従って用いて標識プローブを用いて調べる。ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−７０℃にて一
晩フィルムに曝し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
ン（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓ
ＨｙｂＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロト
コル番号ＰＴ１１９０−１に従って用いて標識プローブを用いて調べる。ハイブ
リダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−７０℃にて一
晩フィルムに曝し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０５４４】
本発明は、前述の説明および実施例において特に記載される以外に実施され得
ることが明らかである。
ることが明らかである。
【０５４５】
本発明の多くの改変およびバリエーションが、上の教示を考慮して可能であり
、従って、添付される特許請求の範囲の範囲内にある。
、従って、添付される特許請求の範囲の範囲内にある。
【０５４６】
本明細書中に引用される全ての特許、特許出願、および出版物の開示は、本明
細書によって全体が参考として援用される。 （実施例５：内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子を用いる遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の方法は、例えば、１９９７年６月２４日に発行され
た米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公
開第ＷＯ ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第Ｗ
Ｏ ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒ
ａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）に記載されるように
、相同組換えによって、内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ配列をプロモーターに作動
可能に連結する工程を包含する。この方法は、標的細胞に存在するが、細胞には
発現しない、または所望より低いレベルで発現する遺伝子の活性化を包含する。
プロモーターおよび標的配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製し、これは、
プロモーターに隣接する内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの５’非コード配列に相同
である。標的配列は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの５’末端に十分近く、そのため、
プロモーターは、相同組換え時に内因性配列に作動可能に連結する。プロモータ
ーおよび標的配列を、ＰＣＲを用いて増幅する。好ましくは、増幅したプロモー
ターは、５’および３’末端に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の
標的配列の３’末端は、増幅されたプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位
を含み、そして第２の標的配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端
と同じ制限酵素部位を含む。
細書によって全体が参考として援用される。 （実施例５：内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子を用いる遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の方法は、例えば、１９９７年６月２４日に発行され
た米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公
開第ＷＯ ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第Ｗ
Ｏ ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒ
ａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）に記載されるように
、相同組換えによって、内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ配列をプロモーターに作動
可能に連結する工程を包含する。この方法は、標的細胞に存在するが、細胞には
発現しない、または所望より低いレベルで発現する遺伝子の活性化を包含する。
プロモーターおよび標的配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製し、これは、
プロモーターに隣接する内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの５’非コード配列に相同
である。標的配列は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの５’末端に十分近く、そのため、
プロモーターは、相同組換え時に内因性配列に作動可能に連結する。プロモータ
ーおよび標的配列を、ＰＣＲを用いて増幅する。好ましくは、増幅したプロモー
ターは、５’および３’末端に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の
標的配列の３’末端は、増幅されたプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位
を含み、そして第２の標的配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端
と同じ制限酵素部位を含む。
【０５４７】
増幅したプロモーターおよび増幅した標的配列を、適切な制限酵素で消化し、
そして引き続いて子ウシの腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーター
および消化した標的配列を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に添加した。得
られた混合物を、この２つのフラグメントの連結のために適切な条件下で保持す
る。この構築物を、アガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出お
よびエタノール沈殿によって精製する。
そして引き続いて子ウシの腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーター
および消化した標的配列を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に添加した。得
られた混合物を、この２つのフラグメントの連結のために適切な条件下で保持す
る。この構築物を、アガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出お
よびエタノール沈殿によって精製する。
【０５４８】
この実施例において、ポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーションに
よって裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、ポリヌクレオチド構築物
をまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム）ウイルス配列、ウ
イルス粒子、沈殿剤などと共に投与し得る。このような送達方法は、当該分野に
おいて公知である。
よって裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、ポリヌクレオチド構築物
をまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム）ウイルス配列、ウ
イルス粒子、沈殿剤などと共に投与し得る。このような送達方法は、当該分野に
おいて公知である。
【０５４９】
一旦細胞をトランスフェクトすると、相同な組換えが起こり、これは、内因性
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ配列に作動可能に連結しているプロモーターを生じる。こ
れは、細胞に内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの発現を引き起こす。発現を、免疫学
的染色、または当該分野において公知の任意の他の方法によって検出し得る。
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ配列に作動可能に連結しているプロモーターを生じる。こ
れは、細胞に内因性Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩの発現を引き起こす。発現を、免疫学
的染色、または当該分野において公知の任意の他の方法によって検出し得る。
【０５５０】
繊維芽細胞を、皮膚生検によって被験体から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ
＋１０％ウシ胎仔血清中におく。対数増殖期または初期安定期の繊維芽細胞を、
トリプシン処理し、そして栄養培地でプラスチック表面からリンスする。細胞懸
濁液のアリコートをカウンティングのために除去し、そして残りの細胞を遠心分
離に供する。上清を吸引し、そしてペレットをエレクトロポレーション緩衝液（
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、
０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭ ブドウ糖）５ｍｌに再懸濁させる。細胞
を再び遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞を１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ウシ
血清アルブミンを含むエレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁させる。最終の
細胞懸濁液は、約３×１０６細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションは、再
懸濁後すぐに行われるべきである。
＋１０％ウシ胎仔血清中におく。対数増殖期または初期安定期の繊維芽細胞を、
トリプシン処理し、そして栄養培地でプラスチック表面からリンスする。細胞懸
濁液のアリコートをカウンティングのために除去し、そして残りの細胞を遠心分
離に供する。上清を吸引し、そしてペレットをエレクトロポレーション緩衝液（
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、
０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭ ブドウ糖）５ｍｌに再懸濁させる。細胞
を再び遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞を１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ウシ
血清アルブミンを含むエレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁させる。最終の
細胞懸濁液は、約３×１０６細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションは、再
懸濁後すぐに行われるべきである。
【０５５１】
プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、Ｔ１Ｒ様リガン
ドＩＩ遺伝子座をに対する標的のためのプラスミドを構築するために、プラスミ
ドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、ＰＣＲによって、５’末端上のＸ
ｂａＩ部位および３’末端上のＢａｍＨＩ部位で増幅する。２つのＴ１Ｒ様リガ
ンドＩＩ非コード配列を、ＰＣＲによって増幅し：１つのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
非コード配列（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメント１）を、５’末端のＨｉｎｄ
ｉＩＩＩ部位および３’末端のＸｂａ部位で増幅し：もう一方のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩ非コード配列（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメント２）を、５’末端のＢ
ａｍＨＩ部位および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位で増幅する。ＣＭＶプロモー
ターおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメントを適切な酵素（ＣＭＶプロモータ
ー−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメント１−Ｘｂａ
Ｉ；Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、そして共に
連結する。得られた連結産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。
ドＩＩ遺伝子座をに対する標的のためのプラスミドを構築するために、プラスミ
ドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、ＰＣＲによって、５’末端上のＸ
ｂａＩ部位および３’末端上のＢａｍＨＩ部位で増幅する。２つのＴ１Ｒ様リガ
ンドＩＩ非コード配列を、ＰＣＲによって増幅し：１つのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
非コード配列（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメント１）を、５’末端のＨｉｎｄ
ｉＩＩＩ部位および３’末端のＸｂａ部位で増幅し：もう一方のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩ非コード配列（Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメント２）を、５’末端のＢ
ａｍＨＩ部位および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位で増幅する。ＣＭＶプロモー
ターおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメントを適切な酵素（ＣＭＶプロモータ
ー−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメント１−Ｘｂａ
Ｉ；Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩフラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、そして共に
連結する。得られた連結産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ
で消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。
【０５５２】
プラスミドＤＮＡを０．４ｃｍの電極ギャップで、滅菌キュベットに加える（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。最終のＤＮＡ濃度は、通常、少なくとも１２０μｇ／ｍｌで
ある。次いで、細胞懸濁液０．５ｍｌ（約１．５×１０６細胞を含む）を、キュ
ベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液とＤＮＡの溶液を穏やかに混合する。エ
レクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用
いて行う。容量および電圧を、それぞれ、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに
設定する。電圧が上がると、細胞の生存は減少するが、導入されたＤＮＡをその
ゲノムに安定して取り込む生存細胞の割合は劇的に増加する。これらのパラメー
ターを考慮して、おおよそ１４〜２０ミリ秒のパルス時間が観察されるべきであ
る。
Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。最終のＤＮＡ濃度は、通常、少なくとも１２０μｇ／ｍｌで
ある。次いで、細胞懸濁液０．５ｍｌ（約１．５×１０６細胞を含む）を、キュ
ベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液とＤＮＡの溶液を穏やかに混合する。エ
レクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用
いて行う。容量および電圧を、それぞれ、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに
設定する。電圧が上がると、細胞の生存は減少するが、導入されたＤＮＡをその
ゲノムに安定して取り込む生存細胞の割合は劇的に増加する。これらのパラメー
ターを考慮して、おおよそ１４〜２０ミリ秒のパルス時間が観察されるべきであ
る。
【０５５３】
エレクトロポレートされた細胞を室温で約５分間保持し、次いでキュベットの
中身を滅菌移動ピペットで穏やかに除去する。細胞を１０ｃｍ皿内の予め温めら
れた培養液（１５％子ウシ血清を含むＤＭＥＭ）１０ｍｌに直接添加し、そして
３７℃でインキュベートする。翌日、培地を吸引し、そして新鮮な培地１０ｍｌ
と交換し、そしてさらに１６〜２４時間インキュベートする。
中身を滅菌移動ピペットで穏やかに除去する。細胞を１０ｃｍ皿内の予め温めら
れた培養液（１５％子ウシ血清を含むＤＭＥＭ）１０ｍｌに直接添加し、そして
３７℃でインキュベートする。翌日、培地を吸引し、そして新鮮な培地１０ｍｌ
と交換し、そしてさらに１６〜２４時間インキュベートする。
【０５５４】
次いで、操作された繊維芽細胞を、単独でか、またはｃｙｔｏｄｅｘ３マイク
ロキャリアビーズ上にコンフルエントまで増殖させた後かのいずれかで、宿主に
注入する。ここで、繊維芽細胞はタンパク質産物を産生する。次いで、繊維芽細
胞を、上記のように、患者に導入し得る。
ロキャリアビーズ上にコンフルエントまで増殖させた後かのいずれかで、宿主に
注入する。ここで、繊維芽細胞はタンパク質産物を産生する。次いで、繊維芽細
胞を、上記のように、患者に導入し得る。
【０５５５】
（実施例６：Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのタンパク質融合物）
本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチドは、必要に応じて他のタンパク質
に動作可能に融合される。これらの融合タンパク質は、種々の適用のために使用
され得る。例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタ
グ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合タンパク質への融合
は、精製を容易にする（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと）。同様に、Ｉｇ
Ｇ−１、ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大
させる。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タ
ンパク質を特定の細胞内局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーま
たはホモダイマーは、融合タンパク質の活性を増大または減少し得る。融合タン
パク質はまた、１つより多い機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融
合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および
／または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型は、当該分野
で公知の技術を使用するか、またはポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を概説す
る以下のプロトコルを使用するかまたは慣用的に改変することによって作製され
得る。
に動作可能に融合される。これらの融合タンパク質は、種々の適用のために使用
され得る。例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタ
グ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合タンパク質への融合
は、精製を容易にする（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、
Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと）。同様に、Ｉｇ
Ｇ−１、ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大
させる。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タ
ンパク質を特定の細胞内局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーま
たはホモダイマーは、融合タンパク質の活性を増大または減少し得る。融合タン
パク質はまた、１つより多い機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融
合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および
／または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型は、当該分野
で公知の技術を使用するか、またはポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を概説す
る以下のプロトコルを使用するかまたは慣用的に改変することによって作製され
得る。
【０５５６】
簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、本明細書中に記載される配列の５’
および３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプ
ライマーはまた、好ましくは、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクタ
ー）へのクローニングを容易にする都合の良い制限酵素部位を含む。
および３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプ
ライマーはまた、好ましくは、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクタ
ー）へのクローニングを容易にする都合の良い制限酵素部位を含む。
【０５５７】
例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）発現ベクターが使用される場合
、ヒトＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨ
Ｉ部位が破壊されることに注意のこと。次いで、ヒトＦｃ部分を含むベクターが
、ＢａｍＨＩで再制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載するＰ
ＣＲプロトコルによって単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドが、
このＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドが、終止コドンなしに
クローン化され、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意す
ること。
、ヒトＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨ
Ｉ部位が破壊されることに注意のこと。次いで、ヒトＦｃ部分を含むベクターが
、ＢａｍＨＩで再制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載するＰ
ＣＲプロトコルによって単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドが、
このＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドが、終止コドンなしに
クローン化され、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意す
ること。
【０５５８】
天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、このベクターは、異種シグナル配列を含
むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
合、ｐＣ４は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、このベクターは、異種シグナル配列を含
むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０５５９】
【化１０】
（実施例７：ｓｃＦｖｓのライブラリーからの本発明のポリぺプチドに対する
抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、本発明のポリペプチドに
対する反応性を含む抗体フラグメントの大きなライブラリーに構築する。このポ
リペプチドには、ドナーが曝露されていてもよいし、曝露されていなくてもよい
（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書中
に援用される）を参照のこと）。
抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、本発明のポリペプチドに
対する反応性を含む抗体フラグメントの大きなライブラリーに構築する。このポ
リペプチドには、ドナーが曝露されていてもよいし、曝露されていなくてもよい
（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書中
に援用される）を参照のこと）。
【０５６０】
（ライブラリーのレスキュー）
ＷＯ ９２／０１０４７号に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖ
ｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキュ
ーするため、ファージミドを保有する約１０９ Ｅ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍ
ｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に播種し、そして振盪しながら０．８のＯ．
Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ
−ＧＬＵに播種し、２×１０８ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパーファージ（Ｍ１３Δ遺
伝子ＩＩＩ、ＷＯ９２／０１０４７号を参照のこと）を添加し、そして培養物を
振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４
５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心
分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増
殖させる。ファージをＷＯ９２／０１０４７号に記載のように調製する。
ｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレスキュ
ーするため、ファージミドを保有する約１０９ Ｅ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍ
ｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に播種し、そして振盪しながら０．８のＯ．
Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ
−ＧＬＵに播種し、２×１０８ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパーファージ（Ｍ１３Δ遺
伝子ＩＩＩ、ＷＯ９２／０１０４７号を参照のこと）を添加し、そして培養物を
振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃で４
５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心
分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そして一晩増
殖させる。ファージをＷＯ９２／０１０４７号に記載のように調製する。
【０５６１】
Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原へのより大きい結合アビデ
ィティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供
給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させる
ことにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なしで
３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時間イ
ンキュベートする。細胞をペレット（ｐｅｌｌｅｔ）（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ
８，４００ｒｅｖｓ／分で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよ
び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ
−ＫＡＮ）３００ｍｌ中に再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させ
た。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）によ
り培養培地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５
μｍのフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過さ
せ、約１０１３形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を
得る。
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原へのより大きい結合アビデ
ィティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供
給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖させる
ことにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪なしで
３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時間イ
ンキュベートする。細胞をペレット（ｐｅｌｌｅｔ）（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ
８，４００ｒｅｖｓ／分で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよ
び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ
−ＫＡＮ）３００ｍｌ中に再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させ
た。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）によ
り培養培地から精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５
μｍのフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過さ
せ、約１０１３形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を
得る。
【０５６２】
（ライブラリーのパニング）
Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリぺプチドの１００ｍｇ
／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのファージをそのチューブに適
用し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次
いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２
０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルア
ミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージ
を溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７
．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０
分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中
期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、そのＥ．ｃｏｌｉを１％グル
コースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレ
ーティングする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子
ＩＩＩヘルパーファージでレスキューし、引き続く回の選択のためのファージを
調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復
し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
で２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。
／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのファージをそのチューブに適
用し、そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次
いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２
０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルア
ミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージ
を溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７
．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０
分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中
期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、そのＥ．ｃｏｌｉを１％グル
コースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレ
ーティングする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子
ＩＩＩヘルパーファージでレスキューし、引き続く回の選択のためのファージを
調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復
し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
で２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。
【０５６３】
（結合剤の特徴付け）
第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリぺプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタ
イタープレートを用いてＥＬＩＳＡを行う。ＥＬＩＳＡに陽性なクローンをＰＣ
Ｒフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７号を参照のこと）
、次いで配列決定することによりさらに特徴付ける。
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリぺプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタ
イタープレートを用いてＥＬＩＳＡを行う。ＥＬＩＳＡに陽性なクローンをＰＣ
Ｒフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７号を参照のこと）
、次いで配列決定することによりさらに特徴付ける。
【０５６４】
（実施例８：抗体の産生）
（ハイブリドーマ技術）
本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む
血清の産生を誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、Ｔ１Ｒ
様リガンドＩＩポリペプチドの調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾
雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、より大きな比活性のポリクロー
ナル抗血清を生成するために、このような調製物は、動物に導入される。
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む
血清の産生を誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、Ｔ１Ｒ
様リガンドＩＩポリペプチドの調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾
雑物を実質的に含まないようにされる。次いで、より大きな比活性のポリクロー
ナル抗血清を生成するために、このような調製物は、動物に導入される。
【０５６５】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２
５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：
２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくは
、マウス）をＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチドで免疫するか、またはより好ま
しくは、分泌Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチド発現細胞で免疫する。このよう
なポリペプチド発現細胞を、任意の適切な組織培養培地（好ましくは、１０％ウ
シ胎仔血清（約５６℃で不活性化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須
アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのス
トレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地）において培養する。
ハイブリドーマ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２
５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：
２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくは
、マウス）をＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチドで免疫するか、またはより好ま
しくは、分泌Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチド発現細胞で免疫する。このよう
なポリペプチド発現細胞を、任意の適切な組織培養培地（好ましくは、１０％ウ
シ胎仔血清（約５６℃で不活性化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須
アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのス
トレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地）において培養する。
【０５６６】
このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切なミエローマ細胞株と融合す
る。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、
ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好まし
い。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持
し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−
２３２（１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。次いで、このような選択を介して得られるハイブリドーマ細胞を、本発明の
ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイす
る。
る。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、
ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好まし
い。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持
し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−
２３２（１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。次いで、このような選択を介して得られるハイブリドーマ細胞を、本発明の
ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイす
る。
【０５６７】
あるいは、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、
抗イディオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このよ
うな方法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を
得ることが可能であるという事実を使用する。この方法に従って、タンパク質特
異的抗体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このよ
うな動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハ
イブリドーマ細胞を、抗体のタンパク質特異的抗体に結合する能力がＴ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリぺプチドによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同
定するためにスクリーニングする。このような抗体は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗
体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＴ１Ｒ
様リガンドＩＩタンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
抗イディオタイプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このよ
うな方法は、抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を
得ることが可能であるという事実を使用する。この方法に従って、タンパク質特
異的抗体を使用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このよ
うな動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハ
イブリドーマ細胞を、抗体のタンパク質特異的抗体に結合する能力がＴ１Ｒ様リ
ガンドＩＩポリぺプチドによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同
定するためにスクリーニングする。このような抗体は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ抗
体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＴ１Ｒ
様リガンドＩＩタンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
【０５６８】
ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体を「ヒト化」する。このよう
な抗体を、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する
遺伝的構築物を使用することによって産生し得る。キメラ抗体およびヒト化抗体
を産生するための方法は当該分野で公知であり、本明細書中に記載される（総説
については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５
）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉ
ｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １
７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら
、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕ
ｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
な抗体を、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する
遺伝的構築物を使用することによって産生し得る。キメラ抗体およびヒト化抗体
を産生するための方法は当該分野で公知であり、本明細書中に記載される（総説
については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５
）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉ
ｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １
７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら
、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕ
ｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０５６９】
（実施例９：Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子における変化の決定方法）
目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者からＲＮ
Ａを単離する。次いで、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分野で公知
のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。次いで、
このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを用いる
ＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用する、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；お
よび７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルから構成される。
Ａを単離する。次いで、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分野で公知
のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。次いで、
このｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを用いる
ＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用する、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；お
よび７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルから構成される。
【０５７０】
次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い
、それらの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを使
用して配列決定する。（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩの選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定
し、そしてゲノムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いで、疑わしい
変異を有するＰＣＲ産物をクローン化し、そして配列決定し、直接配列決定の結
果を確認する。
、それらの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを使
用して配列決定する。（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩの選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定
し、そしてゲノムＰＣＲ産物を分析してその結果を確認する。次いで、疑わしい
変異を有するＰＣＲ産物をクローン化し、そして配列決定し、直接配列決定の結
果を確認する。
【０５７１】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．ＡおよびＧｒａｈ
ａｍ，Ｍ．Ｗ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１
５６（１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、Ｔ７ポリメ
ラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定す
る。罹患した個体を、罹患していない個体には存在しないＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
における変異により同定する。
ａｍ，Ｍ．Ｗ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１
５６（１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン化し、Ｔ７ポリメ
ラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で配列決定す
る。罹患した個体を、罹患していない個体には存在しないＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
における変異により同定する。
【０５７２】
ゲノム再配置もまた、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子における変化を決定する方
法として観察される。当該分野で公知の技術を使用して単離したゲノムクローン
を、ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏ
ｎ，Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９
９１）に記載のようにＦＩＳＨを行う。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩゲノムの遺伝子座
への特異的ハイブリダイゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡ
を用いて標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う。
法として観察される。当該分野で公知の技術を使用して単離したゲノムクローン
を、ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏ
ｎ，Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：７３−９９（１９
９１）に記載のようにＦＩＳＨを行う。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩゲノムの遺伝子座
への特異的ハイブリダイゼーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡ
を用いて標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う。
【０５７３】
染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルターとを組み合わせて用いて得る。（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａ
ｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉ
ｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、イメージ収集、分析および
染色体部分長測定を行う。（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのゲノム領域の染色体変化（プロ
ーブによりハイブリダイズされる）を、挿入、欠失および転座として同定する。
これらのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列イメージを、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメ
ラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィ
ルターとを組み合わせて用いて得る。（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａ
ｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉ
ｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、イメージ収集、分析および
染色体部分長測定を行う。（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのゲノム領域の染色体変化（プロ
ーブによりハイブリダイズされる）を、挿入、欠失および転座として同定する。
これらのＴ１Ｒ様リガンドＩＩ変化を関連疾患の診断マーカーとして使用する。
【０５７４】
（実施例１０：生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩの異常レベルを検
出する方法） Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そし
てＴ１Ｒ様リガンドＩＩの上昇または低下が検出される場合、このポリペプチド
は、特定の表現型についてのマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそ
れ故、当業者は以下のアッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し
得ることが理解される。
出する方法） Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そし
てＴ１Ｒ様リガンドＩＩの上昇または低下が検出される場合、このポリペプチド
は、特定の表現型についてのマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそ
れ故、当業者は以下のアッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し
得ることが理解される。
【０５７５】
例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、サンプル中、好ましくは、
生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩを検出する。マイクロタイタープレ
ートのウェルを、最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌにおけるＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉに対して特異的な抗体でコーティングする。この抗体は、モノクローナルまた
はポリクローナルのいずれかであって、そして当該分野で公知の技術を使用して
産生される。ウェルに対するＴ１Ｒ様リガンドＩＩの非特異的結合が減少するよ
うに、このウェルをブロックする。
生物学的サンプル中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩを検出する。マイクロタイタープレ
ートのウェルを、最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌにおけるＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉに対して特異的な抗体でコーティングする。この抗体は、モノクローナルまた
はポリクローナルのいずれかであって、そして当該分野で公知の技術を使用して
産生される。ウェルに対するＴ１Ｒ様リガンドＩＩの非特異的結合が減少するよ
うに、このウェルをブロックする。
【０５７６】
次に、コーティングしたウェルを、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ含有サンプルを用い
て室温で２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの段階希釈
を使用して結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水
で３回洗浄し、非結合Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩを除去する。
て室温で２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの段階希釈
を使用して結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水
で３回洗浄し、非結合Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩを除去する。
【０５７７】
次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、そして室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イ
オン水または蒸留水で３回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
ｇの濃度で加え、そして室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イ
オン水または蒸留水で３回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０５７８】
４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートして基質と蛍光とを切断する。蛍光をマイクロタイタープレートリーダ
ーにより測定する。コントロールサンプルの段階希釈からの実験結果を使用して
標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数スケール）にポリペプチド濃度を、そして
Ｙ軸（直線スケール）に蛍光または吸光度をプロットする。次いで、このサンプ
ルの測定された蛍光に基づいた標準曲線を用いてサンプル中のＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリペプチド濃度を補間する。
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートして基質と蛍光とを切断する。蛍光をマイクロタイタープレートリーダ
ーにより測定する。コントロールサンプルの段階希釈からの実験結果を使用して
標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数スケール）にポリペプチド濃度を、そして
Ｙ軸（直線スケール）に蛍光または吸光度をプロットする。次いで、このサンプ
ルの測定された蛍光に基づいた標準曲線を用いてサンプル中のＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリペプチド濃度を補間する。
【０５７９】
（実施例１１：アンタゴニストを使用してＴ１Ｒ様リガンドＩＩのレベル上昇
を処置する方法） 本発明は、体内におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩの生物学的活性のレベルを増大
させる必要のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程
を包含する。本発明における使用のために好ましいアンタゴニストは、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩ特異的抗体およびアンチセンスポリヌクレオチドである。
を処置する方法） 本発明は、体内におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩの生物学的活性のレベルを増大
させる必要のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程
を包含する。本発明における使用のために好ましいアンタゴニストは、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩ特異的抗体およびアンチセンスポリヌクレオチドである。
【０５８０】
アンチセンス技術を使用してＴ１Ｒ様リガンドＩＩの産生を阻害する。この技
術は、癌のような様々な病因に起因するＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、好
ましくは可溶および／または分泌形態のポリペプチドのレベルを低下させる方法
の１つの例である。
術は、癌のような様々な病因に起因するＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチド、好
ましくは可溶および／または分泌形態のポリペプチドのレベルを低下させる方法
の１つの例である。
【０５８１】
例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのレベルが異常に上昇したと診断された患者に
、アンチセンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３
．０ｍｇ／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性
があれば、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。
、アンチセンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３
．０ｍｇ／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性
があれば、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。
【０５８２】
例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのレベルが増加した患者は、ポリ
ペプチドを、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好まし
くは、ポリペプチドは可溶および／または分泌形態である。
ペプチドを、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好まし
くは、ポリペプチドは可溶および／または分泌形態である。
【０５８３】
（実施例１２：Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのレベル低下を処置する方法）
本発明は、体内におけるＴ１Ｒ様リガンドＩＩの生物学的活性のレベルを増大
させる必要のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程
を包含する。本発明における使用のために好ましいアンタゴニストは、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩ特異的抗体である。
させる必要のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程
を包含する。本発明における使用のために好ましいアンタゴニストは、Ｔ１Ｒ様
リガンドＩＩ特異的抗体である。
【０５８４】
例えば、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリ
ペプチドを、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好まし
くは、ポリペプチドは可溶および／または分泌形態である。
ペプチドを、１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好まし
くは、ポリペプチドは可溶および／または分泌形態である。
【０５８５】
（実施例１３：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ）
遺伝子治療の１つの方法は、可溶性および／または成熟Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線
維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養培地
中に配置し、小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き
、約１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉め、そし
て室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラ
スコの底に固定させたままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニ
シリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。
次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移植する方法である。一般に、線
維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる。得られた組織を組織培養培地
中に配置し、小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き
、約１０片を各フラスコに置く。このフラスコを倒置し、しっかりと閉め、そし
て室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラ
スコの底に固定させたままにし、そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニ
シリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。
次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
【０５８６】
この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後、単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてさ
らに大きなフラスコにスケールアップする。
培養した後、単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてさ
らに大きなフラスコにスケールアップする。
【０５８７】
Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。
【０５８８】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩをコードするｃＤＮＡを、それぞれ５’および３’末端
配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プラ
イマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を
含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅したＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で
一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントの連結に適切な条件下で維
持する。次に、連結混合物を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換する
。次に、それを、カナマイシン含有寒天上にプレーティングし、ベクターが適切
に挿入されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩを有することを確認する。
配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’プラ
イマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を
含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅したＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で
一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントの連結に適切な条件下で維
持する。次に、連結混合物を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換する
。次に、それを、カナマイシン含有寒天上にプレーティングし、ベクターが適切
に挿入されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩを有することを確認する。
【０５８９】
アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子を含むＭＳＶベクター
を培地に加え、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき
、パッケージング細胞はＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子
を産生する（ここで、パッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子を含むＭＳＶベクター
を培地に加え、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき
、パッケージング細胞はＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子
を産生する（ここで、パッケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０５９０】
形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過して、はがれ
たプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して、線維芽細胞を感染
させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そして
プロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽
細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈ
ｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必
要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩタンパク質が産生されているか否かを決定する。
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過して、はがれ
たプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を使用して、線維芽細胞を感染
させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そして
プロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽
細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈ
ｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必
要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、Ｔ１
Ｒ様リガンドＩＩタンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０５９１】
次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する
。
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する
。
【０５９２】
（実施例１４：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ）
本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリペプチドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ
、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ配列
の導入に関する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドは、プロモーター、ま
たは標的組織によるＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの発現に必要な任意の他
の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療および
送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９
２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１
号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａ Ｈ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒ
ｅｓ．３５：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏ Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．Ｒｅｓ．３５：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．，Ｎ
ｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：４０５−４１１（１９９６）
；Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４：３２８１−３２９
０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリペプチドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ
、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ配列
の導入に関する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドは、プロモーター、ま
たは標的組織によるＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの発現に必要な任意の他
の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療および
送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９
２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１
号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａ Ｈ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒ
ｅｓ．３５：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏ Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．Ｒｅｓ．３５：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．，Ｎ
ｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：４０５−４１１（１９９６）
；Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４：３２８１−３２９
０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０５９３】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細
胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など
）の間隙空間への注入）によって送達され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌク
レオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得
る。
胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など
）の間隙空間への注入）によって送達され得る。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌク
レオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得
る。
【０５９４】
用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドはま
た、当業者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅ
ｌｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２
：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ ８５（１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドはま
た、当業者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅ
ｌｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２
：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ ８５（１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
【０５９５】
この遺伝子治療方法において使用されるＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチ
ドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にす
る配列も含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、
ＤＮＡの発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、
裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリ
ヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細
胞に導入されて、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得るこ
とが示された。
ドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にす
る配列も含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、
ＤＮＡの発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、
裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリ
ヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細
胞に導入されて、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得るこ
とが示された。
【０５９６】
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚
、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎
臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織
を包含する）の間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組
織の細網線維間のムコ多糖マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線
維性組織のコラーゲン線維、あるいは筋肉細胞を囲む結合組織内の同じマトリク
ス（ｔｈａｔ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）または骨の裂孔中の結合組織内の同じ
マトリクス（ｔｈａｔ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）を含む。これは、同様に、循
環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉
組織の間隙空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、
これらの細胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、
好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において
発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細
胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。イン
ビボで、筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能
力において、特に適格である。
、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎
臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織
を包含する）の間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組
織の細網線維間のムコ多糖マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線
維性組織のコラーゲン線維、あるいは筋肉細胞を囲む結合組織内の同じマトリク
ス（ｔｈａｔ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）または骨の裂孔中の結合組織内の同じ
マトリクス（ｔｈａｔ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）を含む。これは、同様に、循
環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉
組織の間隙空間への送達は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、
これらの細胞を含む組織への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、
好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において
発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細
胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。イン
ビボで、筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能
力において、特に適格である。
【０５９７】
裸のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの有効投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲に
ある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋ
ｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇで
ある。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従
って変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定
され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路
は、組織の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経
路（例えば、特に肺もしくは気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のため
のエアロゾル処方物の吸入）もまた用いられ得る。さらに、裸のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の間に、この手順において用いら
れるカテーテルによって動脈に送達され得る。
Ａの有効投薬量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲に
ある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋ
ｇであり、そしてより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇで
ある。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従
って変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定
され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路
は、組織の間隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経
路（例えば、特に肺もしくは気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達のため
のエアロゾル処方物の吸入）もまた用いられ得る。さらに、裸のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩポリヌクレオチド構築物が、血管形成術の間に、この手順において用いら
れるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０５９８】
インビボで筋肉に注入されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチドの用量応
答効果を、以下のようにして決定する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコ
ードするｍＲＮＡの生成のための適切なＴ１Ｒ様リガンドＩＩ鋳型ＤＮＡを、標
準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線
状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと
複合体化するかのいずれかである。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型
ＤＮＡを注入する。
答効果を、以下のようにして決定する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドをコ
ードするｍＲＮＡの生成のための適切なＴ１Ｒ様リガンドＩＩ鋳型ＤＮＡを、標
準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線
状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして使用するか、またはリポソームと
複合体化するかのいずれかである。次いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型
ＤＮＡを注入する。
【０５９９】
５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ鋳型ＤＮＡ
を、０．１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分
間にわたって、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２
ｃｍの深さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、
そしてその皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩ鋳型ＤＮＡ
を、０．１ｍｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分
間にわたって、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２
ｃｍの深さで注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、
そしてその皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。
【０６００】
適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質発現について組織化学的に染色する。Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩタンパク質発現についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭
を異なる時間で採取すること以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中の
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩＤＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコントロールマ
ウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分
析によって決定し得る。マウスにおける上記実験の結果を、裸のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処
置パラメーターを外挿するために使用し得る。
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質発現について組織化学的に染色する。Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩタンパク質発現についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭
を異なる時間で採取すること以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中の
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩＤＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコントロールマ
ウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分
析によって決定し得る。マウスにおける上記実験の結果を、裸のＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処
置パラメーターを外挿するために使用し得る。
【０６０１】
（実施例１５：造血前駆細胞および／または分化に対するＴ１Ｒ様リガンドＩ
Ｉの効果についてのバイオアッセイ） マウスの骨髄細胞を標的細胞として使用して、造血前駆細胞および／または分
化に対する本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの効果を試験する。手短
に言えば、まず、分別されていない骨髄細胞を、無血清のＩＭＤＭで２回洗浄す
る。このＩＭＤＭは、１０％（Ｖ／Ｖ）ＢＩＴ（ウシ血清アルブミン、インスリ
ンおよびトランスフェリン剤（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａより入手））を補充する。次いで、この洗
浄した細胞を、同じ増殖培地に再懸濁し、そしてサイトカインおよびＴ１Ｒ様リ
ガンドＩＩの存在または非存在下の０．２ｍｌの上記の培地における９６ウェル
組織培養プレート（５×１０４細胞／ウェル）にプレーティングする。幹細胞因
子（ＳＣＦ）およびＩＬ−３を、細胞増殖の陽性メディエータとして含める。細
胞を、低酸素環境（５％ＣＯ２、７％Ｏ２および８８％Ｎ２）の組織培養インキ
ュベーターにおいて、６日間増殖させる。６日目に、０．５μＣｉのトリチウム
化チミジンを各々のウェルに添加し、そしてインキュベーションを、さらに１６
〜１８時間続け、この時点で、細胞を収集する。細胞性ＤＮＡに取り込まれた放
射能のレベルを、シンチレーション分光測定法によって決定し、そしてこれは、
細胞増殖数を反映する。
Ｉの効果についてのバイオアッセイ） マウスの骨髄細胞を標的細胞として使用して、造血前駆細胞および／または分
化に対する本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドの効果を試験する。手短
に言えば、まず、分別されていない骨髄細胞を、無血清のＩＭＤＭで２回洗浄す
る。このＩＭＤＭは、１０％（Ｖ／Ｖ）ＢＩＴ（ウシ血清アルブミン、インスリ
ンおよびトランスフェリン剤（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａより入手））を補充する。次いで、この洗
浄した細胞を、同じ増殖培地に再懸濁し、そしてサイトカインおよびＴ１Ｒ様リ
ガンドＩＩの存在または非存在下の０．２ｍｌの上記の培地における９６ウェル
組織培養プレート（５×１０４細胞／ウェル）にプレーティングする。幹細胞因
子（ＳＣＦ）およびＩＬ−３を、細胞増殖の陽性メディエータとして含める。細
胞を、低酸素環境（５％ＣＯ２、７％Ｏ２および８８％Ｎ２）の組織培養インキ
ュベーターにおいて、６日間増殖させる。６日目に、０．５μＣｉのトリチウム
化チミジンを各々のウェルに添加し、そしてインキュベーションを、さらに１６
〜１８時間続け、この時点で、細胞を収集する。細胞性ＤＮＡに取り込まれた放
射能のレベルを、シンチレーション分光測定法によって決定し、そしてこれは、
細胞増殖数を反映する。
【０６０２】
本実施例において記載される研究は、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプ
チドの活性を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｔ１Ｒ様リガ
ンドＩＩのアゴニストおよび／またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストの
活性を試験し得る。潜在的なアゴニストは、このアッセイにおいて、ＳＣＦおよ
び／またはＩＬ３の存在下において造血細胞の増殖を阻害し、そして／あるいは
サイトカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の阻害を増
大することが期待される。潜在的なアンタゴニストは、このアッセイにおいて、
サイトカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の阻害を減
少することが期待される。
チドの活性を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｔ１Ｒ様リガ
ンドＩＩのアゴニストおよび／またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストの
活性を試験し得る。潜在的なアゴニストは、このアッセイにおいて、ＳＣＦおよ
び／またはＩＬ３の存在下において造血細胞の増殖を阻害し、そして／あるいは
サイトカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の阻害を増
大することが期待される。潜在的なアンタゴニストは、このアッセイにおいて、
サイトカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の阻害を減
少することが期待される。
【０６０３】
（実施例１６：ＩＬ−３およびＳＣＦで刺激された、造血前駆細胞の増殖およ
び分化に対するＴ１Ｒ様リガンドＩＩの効果についてのバイオアッセイ） 本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドが、特定の造血系統を阻害するか
否かを決定するために、まず、マウスの骨髄細胞を、無血清のＩＭＤＭで２回洗
浄する。このＩＭＤＭは、１０％（Ｖ／Ｖ）ＢＩＴ（ウシ血清アルブミン、イン
スリンおよびトランスフェリン剤（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａより入手））を補充する。次いで、こ
の洗浄した細胞を、同じ増殖培地に再懸濁し、そしてＴ１Ｒ様リガンドＩＩを含
むかまたは含まない、ＩＬ−３（１ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（５ｎｇ／ｍｌ）
の存在下の０．２ｍｌの上記の培地における９６ウェル組織培養プレート（５×
１０４細胞／ウェル）にプレーティングする。細胞を、低酸素環境（５％ＣＯ２ 、７％Ｏ２および８８％Ｎ２）の組織培養インキュベーターにおいて増殖させ、
そして７日後に、種々のモノクローナル抗体およびＦＡＣＳｃａｎを用いた染色
によって、分化抗原の発現について分析する。
び分化に対するＴ１Ｒ様リガンドＩＩの効果についてのバイオアッセイ） 本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチドが、特定の造血系統を阻害するか
否かを決定するために、まず、マウスの骨髄細胞を、無血清のＩＭＤＭで２回洗
浄する。このＩＭＤＭは、１０％（Ｖ／Ｖ）ＢＩＴ（ウシ血清アルブミン、イン
スリンおよびトランスフェリン剤（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａより入手））を補充する。次いで、こ
の洗浄した細胞を、同じ増殖培地に再懸濁し、そしてＴ１Ｒ様リガンドＩＩを含
むかまたは含まない、ＩＬ−３（１ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（５ｎｇ／ｍｌ）
の存在下の０．２ｍｌの上記の培地における９６ウェル組織培養プレート（５×
１０４細胞／ウェル）にプレーティングする。細胞を、低酸素環境（５％ＣＯ２ 、７％Ｏ２および８８％Ｎ２）の組織培養インキュベーターにおいて増殖させ、
そして７日後に、種々のモノクローナル抗体およびＦＡＣＳｃａｎを用いた染色
によって、分化抗原の発現について分析する。
【０６０４】
本実施例において記載される研究は、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプ
チドの活性を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｔ１Ｒ様リガ
ンドＩＩのアゴニストおよび／またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストの
活性を試験し得る。このアッセイにおいて試験される潜在的なアゴニストは、サ
イトカインの存在下において細胞増殖を阻害し、そして／あるいはサイトカイン
およびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の阻害を増大することが
期待される。このアッセイにおいて試験される潜在的なアンタゴニストは、サイ
トカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の阻害を減少す
ることが期待される。
チドの活性を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、
Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、Ｔ１Ｒ様リガ
ンドＩＩのアゴニストおよび／またはＴ１Ｒ様リガンドＩＩのアンタゴニストの
活性を試験し得る。このアッセイにおいて試験される潜在的なアゴニストは、サ
イトカインの存在下において細胞増殖を阻害し、そして／あるいはサイトカイン
およびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の阻害を増大することが
期待される。このアッセイにおいて試験される潜在的なアンタゴニストは、サイ
トカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の阻害を減少す
ることが期待される。
【０６０５】
（実施例１７：ＩＬ−３およびＳＣＦで刺激された、ｌｉｎ−集団（ｌｉｎ−
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の骨髄細胞の増殖および分化に対するＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩの効果） 原始造血前駆体に豊富なマウスの骨髄細胞の集団を、ネガティブ選択手順を使
用して獲得し得る。ここでは、大半の系統の方向付けられた細胞（ｃｏｍｍｉｔ
ｔｅｄ ｃｅｌｌ）を、モノクローナル抗体（抗ｃｄ１１ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、
ＣＤ４５ＲおよびＧｒ−１抗原）のパネルおよび磁気ビーズを使用して除去する
。得られた集団の細胞（系統涸渇細胞（ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｃ
ｅｌｌ））を、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で
補充した増殖培地中に、（一連の濃度における）本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリペプチドの存在または非存在下でプレーティングする（５×１０４細胞／ウ
ェル）。加湿インキュベーター（５％ ＣＯ２、７％ Ｏ２および８８％ Ｎ２ 環境）における３７℃でのインキュベーションの７日後に細胞を収集し、そして
ＨＰＰ−ＣＦＣおよび未成熟な前駆体について分析する。さらに、細胞を、ＦＡ
ＣＳｃａｎによって特定の分化抗原の発現について分析する。コロニーデータを
、コロニーの平均数＋／−ＳＤとして表し、そして各々の集団の細胞について６
つのディッシュにおいて行われたアッセイから得る。
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の骨髄細胞の増殖および分化に対するＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩの効果） 原始造血前駆体に豊富なマウスの骨髄細胞の集団を、ネガティブ選択手順を使
用して獲得し得る。ここでは、大半の系統の方向付けられた細胞（ｃｏｍｍｉｔ
ｔｅｄ ｃｅｌｌ）を、モノクローナル抗体（抗ｃｄ１１ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、
ＣＤ４５ＲおよびＧｒ−１抗原）のパネルおよび磁気ビーズを使用して除去する
。得られた集団の細胞（系統涸渇細胞（ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｃ
ｅｌｌ））を、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で
補充した増殖培地中に、（一連の濃度における）本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ
ポリペプチドの存在または非存在下でプレーティングする（５×１０４細胞／ウ
ェル）。加湿インキュベーター（５％ ＣＯ２、７％ Ｏ２および８８％ Ｎ２ 環境）における３７℃でのインキュベーションの７日後に細胞を収集し、そして
ＨＰＰ−ＣＦＣおよび未成熟な前駆体について分析する。さらに、細胞を、ＦＡ
ＣＳｃａｎによって特定の分化抗原の発現について分析する。コロニーデータを
、コロニーの平均数＋／−ＳＤとして表し、そして各々の集団の細胞について６
つのディッシュにおいて行われたアッセイから得る。
【０６０６】
（実施例１８：Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩは、骨髄ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激す
る） 本アッセイは、ヒトＣＤ３４＋が造血増殖因子の存在下において増殖する能力
に基づき、そして哺乳動物細胞において発現された単離されたＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリペプチドがＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する能力を評価した。
る） 本アッセイは、ヒトＣＤ３４＋が造血増殖因子の存在下において増殖する能力
に基づき、そして哺乳動物細胞において発現された単離されたＴ１Ｒ様リガンド
ＩＩポリペプチドがＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する能力を評価した。
【０６０７】
大半の成熟前駆体のみが、単一のシグナルに応答することが以前に示されてい
る。さらに未成熟な前駆体は、応答に少なくとも２つのシグナルを必要とする。
従って、広範な前駆細胞の造血活性に対するＴ１レセプター様リガンドＩＩポリ
ペプチドの効果を試験するために、アッセイは、他の造血増殖因子の存在または
非存在下においてＴ１Ｒ様リガンドＩＩを含んだ。単離された細胞を、試験した
上清と組み合わせて幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で５日間培養した。ＳＣＦ単
独は、骨髄（ＢＭ）細胞の増殖に対して非常に限定された効果を有し、このよう
な条件において、「生存」因子としてのみ作用する。しかし、これらの細胞（す
なわち、ＩＬ−３）に対して刺激効果を示す任意の因子と組み合わせると、ＳＣ
Ｆは、共同効果を引き起こす。従って、この試験したポリペプチドが、造血前駆
体に対して刺激効果を有する場合、このような活性は、容易に検出され得る。正
常なＢＭ細胞が、低レベルの細胞周期を進行しつつある細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ
ｃｅｌｌ）を有するため、本発明のポリペプチドまたはそのアゴニストもしくは
アンタゴニストのなんらかの阻害効果は、検出されないかもしれないようである
。従って、前駆体に対する阻害効果についてのアッセイを、好ましくは、ＳＣＦ
＋ＩＬ−３でのインビトロ刺激にまず供される細胞において試験し、次いで、こ
のような誘導された増殖の阻害について評価されている化合物と接触させる。
る。さらに未成熟な前駆体は、応答に少なくとも２つのシグナルを必要とする。
従って、広範な前駆細胞の造血活性に対するＴ１レセプター様リガンドＩＩポリ
ペプチドの効果を試験するために、アッセイは、他の造血増殖因子の存在または
非存在下においてＴ１Ｒ様リガンドＩＩを含んだ。単離された細胞を、試験した
上清と組み合わせて幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で５日間培養した。ＳＣＦ単
独は、骨髄（ＢＭ）細胞の増殖に対して非常に限定された効果を有し、このよう
な条件において、「生存」因子としてのみ作用する。しかし、これらの細胞（す
なわち、ＩＬ−３）に対して刺激効果を示す任意の因子と組み合わせると、ＳＣ
Ｆは、共同効果を引き起こす。従って、この試験したポリペプチドが、造血前駆
体に対して刺激効果を有する場合、このような活性は、容易に検出され得る。正
常なＢＭ細胞が、低レベルの細胞周期を進行しつつある細胞（ｃｙｃｌｉｎｇ
ｃｅｌｌ）を有するため、本発明のポリペプチドまたはそのアゴニストもしくは
アンタゴニストのなんらかの阻害効果は、検出されないかもしれないようである
。従って、前駆体に対する阻害効果についてのアッセイを、好ましくは、ＳＣＦ
＋ＩＬ−３でのインビトロ刺激にまず供される細胞において試験し、次いで、こ
のような誘導された増殖の阻害について評価されている化合物と接触させる。
【０６０８】
手短に言えば、ＣＤ３４＋細胞を、当該分野で公知の方法を使用して単離した
。細胞を融解し、そして培地（Ｌ−グルタミンを含むＱＢＳＦ６０無血清培地（
５００ｍｌ）、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、Ｃａｔ番号１６０−２０４−１０１）に再懸濁した。２０
０×ｇでの数回の穏やかな遠心分離工程の後、この細胞を１時間静止させた。次
いで、この細胞数を、２．５×１０５細胞／ｍｌに調整した。この間、１００μ
ｌの滅菌水を、９６ウェルプレートの周縁のウェルに添加した。このアッセイに
おいてＴ１レセプター様リガンドＩＩを用いて試験されたサイトカインは、５０
ｎｇ／ｍｌでｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、
ＭＮ、Ｃａｔ番号２５５−ＳＣ）単独、ならびに３０ｎｇ／ｍｌでｒｈＳＣＦお
よびｒｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、
Ｃａｔ番号２０３−ＭＬ）の組み合わせであった。１時間後、１０μｌの調製サ
イトカイン、５０μｌのＳＩＤ（１：２希釈の上清＝５０μｌ）および２０μｌ
の希釈細胞を培地に添加し、この培地は、ウェルにすでに存在して、最終総容量
は１００μｌであった。次いで、このプレートを、３７℃／５％ＣＯ２インキュ
ベーターに５日間静置した。
。細胞を融解し、そして培地（Ｌ−グルタミンを含むＱＢＳＦ６０無血清培地（
５００ｍｌ）、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、Ｃａｔ番号１６０−２０４−１０１）に再懸濁した。２０
０×ｇでの数回の穏やかな遠心分離工程の後、この細胞を１時間静止させた。次
いで、この細胞数を、２．５×１０５細胞／ｍｌに調整した。この間、１００μ
ｌの滅菌水を、９６ウェルプレートの周縁のウェルに添加した。このアッセイに
おいてＴ１レセプター様リガンドＩＩを用いて試験されたサイトカインは、５０
ｎｇ／ｍｌでｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、
ＭＮ、Ｃａｔ番号２５５−ＳＣ）単独、ならびに３０ｎｇ／ｍｌでｒｈＳＣＦお
よびｒｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、
Ｃａｔ番号２０３−ＭＬ）の組み合わせであった。１時間後、１０μｌの調製サ
イトカイン、５０μｌのＳＩＤ（１：２希釈の上清＝５０μｌ）および２０μｌ
の希釈細胞を培地に添加し、この培地は、ウェルにすでに存在して、最終総容量
は１００μｌであった。次いで、このプレートを、３７℃／５％ＣＯ２インキュ
ベーターに５日間静置した。
【０６０９】
アッセイを収集する１８時間前に、０．５μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジン
を、１０μｌ容量で各々のウェルに添加し、増殖速度を決定した。この実験を、
Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６を用いて、細胞を各々の９６ウェルプレ
ートからフィルターマット（ｆｉｌｔｅｒｍａｔ）に収集することによって終了
した。収集後、このフィルターマットを乾燥させ、整え、そして１つのＯｍｎｉ
Ｆｉｌｔｅｒプレートおよび１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒ ＴｒａｙからなるＯ
ｍｎｉＦｉｌｔｅｒアセンブリに置いた。６０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを、
各々のウェルに添加し、そしてプレートを、ＴｏｐＳｅａｌ−Ａプレスオンシー
リングフィルム（ｐｒｅｓｓ−ｏｎ ｓｅａｌｉｎｇ ｆｉｌｍ）で密閉した。
バーコード１５ステッカーを、計数のために第一のプレートに添付した。次いで
、この密閉したプレートをロードし、そして放射能のレベルを、Ｐａｃｋａｒｄ
Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔを介して決定し、そしてこの印刷されたデータを、分析の
ために収集した。放射能のレベルは、細胞増殖量を反映した。
を、１０μｌ容量で各々のウェルに添加し、増殖速度を決定した。この実験を、
Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６を用いて、細胞を各々の９６ウェルプレ
ートからフィルターマット（ｆｉｌｔｅｒｍａｔ）に収集することによって終了
した。収集後、このフィルターマットを乾燥させ、整え、そして１つのＯｍｎｉ
Ｆｉｌｔｅｒプレートおよび１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒ ＴｒａｙからなるＯ
ｍｎｉＦｉｌｔｅｒアセンブリに置いた。６０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを、
各々のウェルに添加し、そしてプレートを、ＴｏｐＳｅａｌ−Ａプレスオンシー
リングフィルム（ｐｒｅｓｓ−ｏｎ ｓｅａｌｉｎｇ ｆｉｌｍ）で密閉した。
バーコード１５ステッカーを、計数のために第一のプレートに添付した。次いで
、この密閉したプレートをロードし、そして放射能のレベルを、Ｐａｃｋａｒｄ
Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔを介して決定し、そしてこの印刷されたデータを、分析の
ために収集した。放射能のレベルは、細胞増殖量を反映した。
【０６１０】
図４は、哺乳動物細胞において発現された単離されたＴ１Ｒ様リガンドＩＩポ
リペプチドを用いた、１つのこのようなアッセイの結果を示す。値を平均化し、
そして標準偏差をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ９８ Ｅｘｃｅｌを用いて算出した。ヒ
ットを、ＳＩＤ Ｌｉｔｅ上清およびコントロールについての平均値のすべてを
平均化し、そして１ＳＤをこの値に加算することによって決定する。平均値がこ
の値を超える任意のＳＩＤ Ｌｉｔｅ上清を、ヒットとみなす。
リペプチドを用いた、１つのこのようなアッセイの結果を示す。値を平均化し、
そして標準偏差をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ９８ Ｅｘｃｅｌを用いて算出した。ヒ
ットを、ＳＩＤ Ｌｉｔｅ上清およびコントロールについての平均値のすべてを
平均化し、そして１ＳＤをこの値に加算することによって決定する。平均値がこ
の値を超える任意のＳＩＤ Ｌｉｔｅ上清を、ヒットとみなす。
【０６１１】
上記の実施例に記載される研究は、本発明のＴ１Ｒ様リガンドＩＩポリペプチ
ドの活性を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、その抗体、アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニスト、ならびにフラグメントおよび改変体の活
性を試験し得る。非限定的な例として、このアッセイにおいて試験される潜在的
なアンタゴニストは、サイトカインの存在下において細胞増殖を阻害し、そして
／またはサイトカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の
阻害を増大することが期待される。このアッセイにおいて試験される潜在的なア
ゴニストは、サイトカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増
殖の阻害を減少することが期待される。
ドの活性を試験する。しかし、当業者は、例示された研究を容易に改変して、Ｔ
１Ｒ様リガンドＩＩポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、その抗体、アゴ
ニストおよび／またはアンタゴニスト、ならびにフラグメントおよび改変体の活
性を試験し得る。非限定的な例として、このアッセイにおいて試験される潜在的
なアンタゴニストは、サイトカインの存在下において細胞増殖を阻害し、そして
／またはサイトカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増殖の
阻害を増大することが期待される。このアッセイにおいて試験される潜在的なア
ゴニストは、サイトカインおよびＴ１Ｒ様リガンドＩＩの存在下において細胞増
殖の阻害を減少することが期待される。
【配列表】
【図１】
図１は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）
およびＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤＮＡクローンを配列決定する
ことによって同定される推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。そのタンパク
質は、約２６アミノ酸残基のリーダー配列（最初の下線配列）を有し、約１６８
アミノ酸残基の細胞外成熟ドメイン（最初および２番目の下線配列の間の配列）
を有し、約２３アミノ酸残基の膜貫通ドメイン（２番目の下線配列）を有し、約
１２アミノ酸残基の細胞内ドメイン（残りの配列）を有する。
およびＡＴＣＣ寄託番号９７６５５に含まれるｃＤＮＡクローンを配列決定する
ことによって同定される推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。そのタンパク
質は、約２６アミノ酸残基のリーダー配列（最初の下線配列）を有し、約１６８
アミノ酸残基の細胞外成熟ドメイン（最初および２番目の下線配列の間の配列）
を有し、約２３アミノ酸残基の膜貫通ドメイン（２番目の下線配列）を有し、約
１２アミノ酸残基の細胞内ドメイン（残りの配列）を有する。
【図２】
図２は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４
１８０４のタンパク質配列（配列番号３）との間の類似性領域を示し、全体とし
て５６％の同一性を示す。
１８０４のタンパク質配列（配列番号３）との間の類似性領域を示し、全体とし
て５６％の同一性を示す。
【図３】
図３は、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩのアミノ酸配列の分析を示す。α領域、β領域
、ターン領域およびコイル領域；親水性領域および疎水性領域；両親媒性領域；
可撓性領域；抗原性指標および表面確率が示される。
、ターン領域およびコイル領域；親水性領域および疎水性領域；両親媒性領域；
可撓性領域；抗原性指標および表面確率が示される。
【図４】
図４は、ＣＤ３４＋骨髄増殖アッセイにおける上清を含まれるＴ１Ｒ様リガン
ドＩＩの効果を示す。
ドＩＩの効果を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ニ， ジアン
アメリカ合衆国 メリーランド 20853，
ロックビル， マナーフィールド ロー
ド 5502
(72)発明者 ゲンツ， レイナー エル．
アメリカ合衆国 メリーランド 20850，
ロックビル， マウント プロスペクト
ドライブ 13608
(72)発明者 ルーベン， スティーブン エム．
アメリカ合衆国 メリーランド 20832，
オルネイ， ヘリテイジ ヒルズ ドラ
イブ 18528
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02
DA06 EA02 EA04 GA14 HA12
4B065 AA26X AA90X AA91X AA93X
AA93Y AB01 AC14 BA03
BD39 CA24 CA44 CA46
4C084 AA13 AA17 ZB212
4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA40
DA76 DA86 EA20 EA22 EA24
EA50 FA74
Claims (11)
- 【請求項１】 造血起源の細胞の増殖および／または分化を刺激する方法で
あって、該細胞を、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩまたはそのアゴニストと接触させる工
程を包含する、方法。 - 【請求項２】 前記細胞が、以下：骨髄細胞およびリンパ系細胞からなる群
より選択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、さらに以下：サイトカイン
、造血性増殖因子、抗ウイルス剤、抗生物質、抗炎症性薬剤、化学療法剤、ケモ
カイン、脈管形成タンパク質、および線維芽細胞増殖因子からなる群より選択さ
れる化合物、を投与する工程を包含する、方法。 - 【請求項４】 前記接触がインビトロで生じる、請求項１に記載の方法。
- 【請求項５】 前記接触がインビボで生じる、請求項１に記載の方法。
- 【請求項６】 造血起源の細胞の増殖および／または分化を阻害する方法で
あって、該細胞を、Ｔ１Ｒ様リガンドＩＩまたはそのアンタゴニストと接触させ
る工程を包含する、方法。 - 【請求項７】 前記細胞が、以下：骨髄細胞およびリンパ系細胞からなる群
より選択される、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 請求項６に記載の方法であって、さらに以下：サイトカイン
、造血性増殖因子、抗ウイルス剤、抗生物質、抗炎症性薬剤、化学療法剤、ケモ
カイン、脈管形成タンパク質、および線維芽細胞増殖因子からなる群より選択さ
れる化合物、を投与する工程を包含する、方法。 - 【請求項９】 前記接触がインビトロで生じる、請求項６に記載の方法。
- 【請求項１０】 前記接触がインビボで生じる、請求項６に記載の方法。
- 【請求項１１】 障害の診断中に有用な方法であって、以下： （ａ）個体の細胞または体液中のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現レベルを測
定する方法；および （ｂ）該個体のＴ１Ｒ様リガンドＩＩ遺伝子発現レベルと、標準的Ｔ１Ｒ様リ
ガンドＩＩ遺伝子発現レベルを比較し、それによって該標準を上回るＴ１Ｒ様リ
ガンドＩＩ遺伝子発現レベルの増大または減少が、Ｔ１ＲリガンドＩＩ関連障害
を示す、工程、 を包含する、方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16997999P | 1999-12-10 | 1999-12-10 | |
| US60/169,979 | 1999-12-10 | ||
| PCT/US2000/033389 WO2001042506A1 (en) | 1999-12-10 | 2000-12-08 | T1 receptor-like ligand ii and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003516164A true JP2003516164A (ja) | 2003-05-13 |
Family
ID=22618008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001544377A Withdrawn JP2003516164A (ja) | 1999-12-10 | 2000-12-08 | Ｔ１レセプター様リガンドｉｉおよびこれの使用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1240358A4 (ja) |
| JP (1) | JP2003516164A (ja) |
| AU (1) | AU2077801A (ja) |
| CA (1) | CA2392742A1 (ja) |
| WO (1) | WO2001042506A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201013151D0 (en) * | 2010-08-04 | 2010-09-22 | Isis Innovation | Diagnostic method |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU643427B2 (en) * | 1988-10-31 | 1993-11-18 | Immunex Corporation | Interleukin-4 receptors |
| WO1998007754A1 (en) * | 1996-08-23 | 1998-02-26 | Human Genome Sciences, Inc. | T1 receptor-like ligand ii |
-
2000
- 2000-12-08 CA CA002392742A patent/CA2392742A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-08 AU AU20778/01A patent/AU2077801A/en not_active Abandoned
- 2000-12-08 WO PCT/US2000/033389 patent/WO2001042506A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-12-08 EP EP00984100A patent/EP1240358A4/en not_active Withdrawn
- 2000-12-08 JP JP2001544377A patent/JP2003516164A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1240358A1 (en) | 2002-09-18 |
| CA2392742A1 (en) | 2001-06-14 |
| EP1240358A4 (en) | 2005-10-19 |
| WO2001042506A1 (en) | 2001-06-14 |
| WO2001042506A9 (en) | 2002-08-22 |
| AU2077801A (en) | 2001-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7638603B2 (en) | Antibodies against interleukin 17 receptor-like protein | |
| JP5583308B2 (ja) | ２１個のヒト分泌タンパク質 | |
| WO2000055204A1 (en) | Interleukin 17 receptor-like protein | |
| JP2003526330A (ja) | ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αスプライス改変体 | |
| JP2008259504A (ja) | ヒトｇタンパク質ケモカインレセプター（ｃｃｒ５）ｈｄｇｎｒ１０ | |
| CA2399593A1 (en) | Antibodies to ccr5 | |
| US20060147421A1 (en) | Methods and compositions for treating and preventing infection using human interferon regulatory factor 3 | |
| JP2010252803A (ja) | ヒトエンドカインαおよび使用方法 | |
| JP2003507030A (ja) | １８個のヒト分泌タンパク質 | |
| JP2003513622A (ja) | １９個のヒト分泌タンパク質 | |
| JP2003508034A (ja) | サイトカインレセプター共通γ鎖類似体 | |
| US8133734B2 (en) | Kit comprising an antibody to interleukin 17 receptor-like protein | |
| JP2005503116A (ja) | ヒトｇタンパク質ケモカインレセプター（ｃｃｒ５）ｈｄｇｎｒ１０ | |
| JP2003528586A (ja) | ３２個のヒト分泌タンパク質 | |
| WO2000050459A1 (en) | Human tumor necrosis factor receptor-like proteins tr11, tr11sv1, and tr11sv2 | |
| JP2003527841A (ja) | 三つ葉ドメイン含有ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体 | |
| JP2003502287A (ja) | 腫瘍壊死因子レセプター５ | |
| JP2003528580A (ja) | ヒトニューロペプチドレセプター | |
| US20070280903A1 (en) | T1 Receptor-Like Ligand II and Uses Thereof | |
| JP2002542771A (ja) | ヒト腫瘍壊死因子レセプターｔｒ９ | |
| JP2003516164A (ja) | Ｔ１レセプター様リガンドｉｉおよびこれの使用 | |
| JP2003526337A (ja) | ２９個のヒト分泌タンパク質 | |
| JP2003507065A (ja) | Ｐｇｒｐ−ｌポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体 | |
| JP2002533109A (ja) | ヒトＢｒａｉｎｉａｃ−５ | |
| JP2003506087A (ja) | 樹状富化分泌リンパ球活性化分子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080304 |