FI108645B - Tumor necrosis factor alpha and beta receptors - Google Patents
Tumor necrosis factor alpha and beta receptors Download PDFInfo
- Publication number
- FI108645B FI108645B FI20000833A FI20000833A FI108645B FI 108645 B FI108645 B FI 108645B FI 20000833 A FI20000833 A FI 20000833A FI 20000833 A FI20000833 A FI 20000833A FI 108645 B FI108645 B FI 108645B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- tnf
- kuten
- dna
- sequences
- protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
108645108645
Kasvainkuoliotekijä-α- ja kasvainkuoliotekijä-B-resepto-reita Tämä patenttihakemus on jakamalla erotettu patent-5 tihakemuksesta FI 920946.Tumor Necrosis Factor-α and Tumor Necrosis Factor-B Receptors This patent application is distinct from patent application FI 920946.
Keksinnön taustaBackground of the Invention
Esillä oleva keksintö koskee yleisesti sytokiini-reseptoreita ja spesifisemmin kasvainkuoliotekijäresepto-reita.The present invention relates generally to cytokine receptors and more specifically to tumor necrosis factor receptors.
10 Kasvainkuoliotekijä-a (TNF-α, tunnetaan myös ka- kektiinina) ja kasvainkuoliotekijä-β (TNF-β, tunnetaan myös lymfotoksiinina) ovat homologisia nisäkkään endogee-nisiä erittyviä proteiineja, jotka kykenevät indusoimaan laajan valikoiman vaikutuksia suuressa lukumäärässä solu-15 tyyppejä. Suurien samankaltaisuuksien johdosta näiden kahden sytokiinin rakenteellisissa ja funktionaalisissa ominaisuuksissa niitä kutsutaan yhteisnimellä "TNF". Komplementaarisia cDNA-klooneja, jotka koodittavat TNF-a:aa (Pennica et ai., Nature 312 (1984) 724) ja TNF-B:aa (Gray 20 et ai., Nature 312 (1984) 721), on eristetty, mikä mahdollistaa TNF:n rakenteellisten ja biologisten ominaisuuksien lisäkarakterisoinnin.Tumor Necrosis Factor α (TNF-α, also known as catectin) and Tumor Necrosis Factor β (also known as lymphotoxin) are homologous mammalian endogenous secreted proteins capable of inducing a wide variety of cellular effects. Because of their great similarities in structure and function, these two cytokines are collectively referred to as "TNF". Complementary cDNA clones encoding TNF-α (Pennica et al., Nature 312 (1984) 724) and TNF-B (Gray 20 et al., Nature 312 (1984) 721) have been isolated. allows further characterization of the structural and biological properties of TNF.
TNF-proteiinit käynnistävät biologisen vaikutuk-‘ sensa soluihin sitoutumalla spesifisiin TNF-reseptori- • ·’ 25 (TNF-R-) proteiineihin, jotka ilmentyvät TNF:lie respon- siivisen solun plasmamembraanilla. TNF-a:n ja TNF-B:n • · · osoitettiin ensin sitoutuvan yhteiseen reseptoriin ihmisen | » t kohdunkaulasyöpäsolulinjassa ME-180 (Aggarwal et ai., :***: Nature 318 (1985) 665) . Arviot TNF-R:n koosta, joita mää- • · · 30 ritettiin affiniteettileimaustutkimuksilla, vaihtelivat 54:stä 175 kDa:iin (Creasey et ai., Proc.Natl. Acad. Sei.TNF proteins initiate their biological activity in cells by binding to specific TNF-receptor (TNF-R) proteins expressed on the plasma membrane of a TNF-responsive cell. TNF-α and TNF-B were first shown to bind to a common receptor in human | »In the cervical cancer cell line ME-180 (Aggarwal et al., ***: Nature 318 (1985) 665). Estimates of the size of TNF-R as determined by affinity labeling studies ranged from 54 to 175 kDa (Creasey et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA M (1987) 3293, Stauber et al^, J.Biol.Chem. 263 » ‘1’ (1988) 19098; Hohmann et ai., J.Biol.Chem. 264 (1989) · ’ ** 14927) . Vaikka näiden kahden TNF-R:n, joiden molekyylipai- *”'· 35 no on erilainen, keskinäinen suhde on epäselvä, Hohmann et 1 t 108645 2 ai. (J.Biol.Chem. 264 (1989) 14927) raportoivat, että ai nakin kahta erilaista solupintareseptoria TNFrlle esiintyy erilaisilla solutyypeillä. Näiden reseptorien näennäinen molekyylipaino on noin 80 kDa:ta ja vastaavasti noin 55 -5 60 kDa:ta. Missään edeltävistä julkaisuista ei kuitenkaan ole raportoitu solupinta-TNF-reseptorien puhdistamista homogeenisiksi .USA M (1987) 3293, Stauber et al., J. Biol. Chem. 263-1998 (19098); Hohmann et al., J. Biol. Chem. 264 (1989). Although the relationship between the two TNF-Rs with different molecular weights is not clear, Hohmann et al., 108645 2 al. (J. Biol. Chem. 264: 14927 (1989)) report that at least two different cell surface receptors for TNF are expressed in different cell types. These receptors have an apparent molecular weight of about 80 kDa and about 55-5 5 kDa, respectively. However, purification of cell surface TNF receptors to homogeneity has not been reported in any of the preceding publications.
Solupintareseptorien TNFrlle lisäksi on niinikään ihmisen virtsasta identifioitu liukoisia proteiineja, jot-10 ka kykenevät sitoutumaan TNFrään (Peetre et ai., Eur. -J.Haematol. 41 (1988) 414; Seckinger et ai., J.Exp.Med.In addition to cell surface receptors for TNF, soluble proteins have also been identified in human urine that are capable of binding to TNF (Peetre et al., Eur. J. Haematol. 41 (1988) 414; Seckinger et al., J.Exp.Med.
167 (1988) 1511; Seckinger et ai., J.Biol.Chem. 264 (1989) 11966; GB-patenttihakemus 2 218 101 A Seckingerille et ai.; Engelmann et ai., J.Biol.Chem. 264 (1989) 11974) .167: 1511 (1988); Seckinger et al., J. Biol. Chem. 264: 11966 (1989); British Patent Application 2,218,101 to Seckinger et al .; Engelmann et al., J. Biol. Chem. 264: 11974 (1989)).
15 Liukoisen virtsaperäisen TNFrää sitovan proteiinin, joka julkistetaan patenttijulkaisussa GB 2 218 101 A, osittainen N-pään aminohapposekvenssi on Asp-Ser-Val-Cys-Pro-, joka vastaa osittaista sekvenssiä, jonka julkistivat myöhemmin Engelmann et ai. (1989). Edeltävien liukoisten 20 virtsaperäisten sitoutumisproteiinien keskinäistä suhdetta selvitettiin edelleen tämän patenttijulkaisun etuoikeus-hakemuksen jättämisen jälkeen, kun Engelmann et ai. rapor-#V. toivat identifioineensa ja puhdistaneensa toisen erillisen :·/. liukoisen virtsaperäisen TNFrään sitoutuvan proteiinin, ·.·. 25 jonka N-pään aminohapposekvenssi on Val-Ala-Phe-Thr-Pro- 1.!^ (J.Biol.Chem. 265 (1990) 1531) . GB-patenttijulkaisussa 2 218 101 A ja Engelmannin et ai. julkaisussa julkaistujen • · kahden virtsaperäisen proteiinin osoitettiin olevan im- • · '···’ muunikemiallisesti sukua kahdelle ilmeisesti erilliselle 30 solupintaproteiinille sitoutumisproteiinien vastaisen vas- ’F*: taseerumin kyvystä inhiboida TNFrn sitoutumista tiettyihin : soluihin.The partial N-terminal amino acid sequence of the soluble urinary TNF-binding protein disclosed in GB 2 218 101 A is Asp-Ser-Val-Cys-Pro-, which corresponds to the partial sequence disclosed later by Engelmann et al. (1989). The relationship between the above soluble urinary binding proteins was further clarified following the filing of the priority application of this patent when Engelmann et al. # V reporting. brought their identification and purification of another separate: · /. soluble urinary TNF - binding protein,. 25 having the N-terminal amino acid sequence of Val-Ala-Phe-Thr-Pro-1-1 (J. Biol. Chem. 265: 1531 (1990)). British Patent Specification 2 218 101 A and Engelmann et al. the two urinary proteins disclosed in the publication were shown to be immuno-related to two apparently distinct 30 cell surface proteins, the anti-binding protein F *: balance serum's ability to inhibit TNF binding to certain: cells.
‘ . Sittemmin kaksi erillistä ryhmää raportoivat ihmi- . sen 55 kDarn TNF-Rrn molekyylitason kloonauksesta ja il- 35 mentämisestä (Loetscher et ai., Cell. 61 (1990) 351; • » · • · » 108645 3'. Subsequently, two separate groups reported on the human. its 55 kDarn TNF-R molecular cloning and expression (Loetscher et al., Cell. 61: 351 (1990); 108645).
Schall et ai. , Cell 61 (1990) 361). Kummankin ryhmän TNF-R:llä on N-pääaminohapposekvenssi, joka vastaa julkaisuissa GB 2 218 101 A, Engelmann et ai. (1989) ja Engelmann et ai. (1990) julkistetun virtsaperäisen sitoutumisproteiinin 5 osittaista aminohapposekvenssiä.Schall et al. , Cell 61 (1990) 361). TNF-R of each group has the N-major amino acid sequence corresponding to Engelmann et al. In GB 2 218 101 A. (1989) and Engelmann et al. (1990) 5 partial amino acid sequences of the urinary binding protein.
TNF-R:n moninaisten muotojen ja liukoisten virtsa-peräisten TNFrään sitoutuvien proteiinien välisen suhteen selvittämiseksi tai TNF-R:ien rakenteellisten ja biologisten ominaisuuksien sekä sen roolin tutkimiseksi, joka TNF-10 R:illä on erilaisten solupopulaatioiden vasteissa TNFrlle tai muulle sytokiinistimulaatiolle, tai TNF-R:ien tehokkaaksi käyttämiseksi, diagnoosissa tai määrityksissä tarvitaan puhdistettuja TNF-R-koostumuksia. Kuitenkin tällaisia koostumuksia voidaan saada käytännöllisinä saantoina 15 vain kloonaamalla ja ilmentämällä reseptoreita koodittavia geenejä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen. Yrityksiä TNF-R-molekyylin puhdistamiseksi käytettäväksi biokemiallisessa analyysissä tai TNF-R:ää koodittavien nisäkäsgeenien kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi on kuitenkin haitannut 20 reseptoriproteiinin tai mRNA:n sopivan lähteen puuttuminen. Ennen esillä olevaa keksintöä minkään solulinjan ei tiedetty ilmentävän korkeita TNF-R-tasoja konstitutiivi-sesti ja jatkuvasti, mikä sulki pois reseptorin puhdista- • · ;·.·. misen sekventoitavaksi tai geenikirjastojen rakentamisen ... 25 cDNA:n kloonausta silmällä pitäen.To investigate the relationship between multiple forms of TNF-R and soluble urinary TNF-binding proteins, or to study the structural and biological properties of TNF-R and the role that TNF-10 R plays in responding to different cell populations, TNF or other cytokines, Purified TNF-R compositions are required for effective use, diagnosis or assay of TNF-Rs. However, such compositions can only be obtained in practical yields by cloning and expressing the genes encoding the receptors using recombinant DNA technology. However, attempts to purify the TNF-R molecule for use in biochemical analysis or for the cloning and expression of mammalian genes encoding TNF-R have been hampered by the lack of a suitable source of receptor protein or mRNA. Prior to the present invention, no cell line was known to constitutively and continuously express high levels of TNF-R, which excluded the purification of the receptor. or sequencing of gene libraries ... for cloning 25 cDNA.
!.! Yhteenveto keksinnöstä • » \\\ Esillä oleva keksintö koskee puhdistettua, biolo- ’···’ gisesti aktiivista nisäkkään kasvainkuoliotekijäreseptori (TNF-R)-proteiinia, etenkin ihmisen TNF-R:iä. Keksinnön 30 mukainen TNF-R-proteiini käsittää aminohapposekvenssin, joka valitaan kuvion 2 aminohapoista 1-x, jolloin x vali-·’*: taan aminohapoista 163 - 235. Erityisesti keksintö koskee 1 . liukoisia TNF-reseptori-proteiineja.!.! SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a purified, biologically active mammalian tumor necrosis factor receptor (TNF-R) protein, particularly human TNF-R. The TNF-R protein of the present invention comprises an amino acid sequence selected from amino acids 1-x of Figure 2, wherein x is selected from amino acids 163-235. In particular, the invention relates to 1. soluble TNF receptor proteins.
. Kuvataan myös koostumuksia käytettäviksi TNF-R- 35 diagnostiikassa, -määrityksissä, tai TNF-R:n vastaisten ·. : : vasta-aineiden tuotannossa, jotka koostumukset käsittävät 4 1 08645 tehokkaita määriä liukoisia natiiveja reseptoriproteiineja tai yhdistelmä-DNA-reseptoriproteiineja, jotka on valmistettu kantahakemuksessa kuvatuilla menetelmillä.. Compositions for use in diagnostic, assay, or anti-TNF-R formulations are also described. : for the production of antibodies comprising 4,106,645 effective amounts of soluble native receptor proteins or recombinant receptor proteins prepared by the methods described in the parent application.
Koska TNF:n kykenee spesifisesti sitomaan TNF-5 reseptoreita (TNF-R:iä), puhdistetut TNF-R-koostumukset ovat käyttökelpoisia TNF:n diagnostisissa määrityksissä sekä tuotettaessa TNF-reseptorin vastaisia vasta-aineita käytettäviksi diagnostiikassa ja terapiassa.Because TNF is capable of specifically binding TNF-5 receptors (TNF-Rs), purified TNF-R compositions are useful in diagnostic assays for TNF and in the production of anti-TNF receptor antibodies for use in diagnostics and therapy.
Esillä olevan keksinnön muut kohteet ilmenevät 10 oheisista patenttivaatimuksista.Other objects of the present invention will be apparent from the appended claims.
Suppea kuvaus piirroksistaBrief description of the drawings
Kuvio 1 on kaaviollinen esitys erilaisten humaa-ni-ja hiiri-TNF-R:iä koodittavien cDNA-sekvenssien koo-dittavasta alueesta. Johtosekvenssi on vivoviivoitettu ja 15 transmembraanialue on umpinainen.Figure 1 is a schematic representation of the coding region of various cDNA sequences encoding human and mouse TNF-R. The leader sequence is lined and the transmembrane region 15 is closed.
Kuviot 2-3 esittävät humaani-TNF-R-klooni-1:n osittaista cDNA-sekvenssiä ja siitä pääteltyä aminohappo-sekvenssiä. Nukleotidit on numeroitu alkaen 5'-ei-luetusta alueesta. Aminohapot on numeroitu signaalipeptidisekvens-20 sin alusta. Oletettua signaalipeptidisekvenssiä edustavat aminohapot -2 - -1. Kypsän TNF-R-proteiinin N-pääleusiini on alleviivattu asemassa 1. Ennustettu transmembraanialue .'.· : aminohapot 236 - 265 on samoin alleviivattu. Erilaisten liukoisten TNF-R:ien C-päät on merkitty nuolella (pysty-25 nuoli).Figures 2-3 show a partial cDNA sequence of human TNF-R-clone-1 and the deduced amino acid sequence thereof. Nucleotides are numbered starting from the 5 'unread region. The amino acids are numbered from the beginning of the signal peptide sequence-20. Amino acids -2-1 -1 represent the putative signal peptide sequence. N-major leucine of mature TNF-R protein is underlined at position 1. Predicted transmembrane region. ': Amino acids 236-265 are likewise underlined. The C-terminals of various soluble TNF-Rs are indicated by an arrow (vertical-arrow 25).
• * · ,···. Kuviot 4-6 esittävät cDNA-sekvenssiä ja siitä • · pääteltyä aminohapposekvenssiä hiiri-TNF-R-klooni-11: lie.• * ·, ···. Figures 4-6 show the cDNA sequence and its deduced amino acid sequence in murine TNF-R clone-11.
"t Oletettua signaalipeptidisekvenssiä esittävät aminohapot '··’ -22 - -1. Kypsän TNF-R-proteiinin N-päävaliini on allevii- 30 vattu asemassa 1. Ennustettu transmembraanialue aminohapot : ’ 234 - 265 on samoin alleviivattu.The amino acids '··· -22 to -1 representing the putative signal peptide sequence. The N-terminal valine of the mature TNF-R protein is underlined at position 1. The predicted transmembrane region amino acids:' 234-265 are also underlined.
Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä .,..: Määritelmiä * * (-ti; Tässä käytettynä ilmaisuilla "TNF-reseptori" ja 35 i t I » t 108645 5 "TNF-R" tarkoitetaan proteiineja, joilla on aminohappo-sekvenssejä, jotka ovat oleellisesti samankaltaisia kuin natiivin nisäkäs-TNF-reseptorin aminohapposekvenssit, ja jotka ovat biologisesti aktiivisia alla määritellyn mukai-5 sesti sikäli, että ne kykenevät sitoutumaan TNF-molekyy-leihin tai transdusoimaan biologisen signaalin, jonka on käynnistänyt TNF-molekyylin sitoutuminen soluun, tai ris-tireagoimaan anti-TNF-R-vasta-aineiden kanssa, jotka on tuotettu vastaan TNF-R:ää luonnollisista (eli ei-yhdis-10 telmä-DNA-) lähteistä. Kypsä täysimittainen ihmisen TNF-R on glykoproteiini, jonka molekyylipaino on noin 80 kilo-daltonia (kDa). Kautta koko selityksen ilmaisulla "kypsä" tarkoitetaan proteiinia, joka on ilmennetty muodossa, josta puuttuu johtosekvenssi, joka voi esiintyä natiivin gee-15 nin täysimittaisissa kopioissa. Kokeet, joissa käytettiin COS-soluja, jotka oli transfektoitu täysimittaista ihmisen TNF-R:ää koodittavalla cDNA:lla, osoittivat, että TNF-R sitoi 125I-TNF-a:aa näennäisen Ka:n ollessa noin 5 x 109 M" 1 1 o c , ja että TNF-R sitoi I-TNF^:aa näennäisen Ka:n olles- 20 sa noin 2 x 109 M-1. Ilmaisujen "TNF-reseptori" tai "TNF-R" piiriin kuuluvat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta na- tiivien proteiinien analogit tai alayksiköt, joissa on ai- nakin 20 aminohappoa, ja jotka osoittavat ainakin jotain TNF-R:n kanssa yhteistä biologista aktiivisuutta, esimer- ·.·. 25 kiksi liukoiset TNF-R-rakenteet, joista puuttuu transmem- ,···. braanialue (ja jotka erittyvät solusta) , mutta joilla on > » !*.*._ tallella kyky sitoa TNF:ää. Erilaisia bioekvivalentteja proteiini- ja aminohappoanalogeja kuvataan yksityiskohtai-*··’ sesti alla.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION., ..: Definitions * * (-ti; As used herein, the terms "TNF receptor" and 3581086455 "TNF-R" refer to proteins having amino acid sequences substantially similar to those of amino acid sequences of the native mammalian TNF receptor, and which are biologically active as defined below in that they are capable of binding to TNF molecules or transducing a biological signal triggered by TNF molecule binding to a cell, or of cross-reacting with anti- With TNF-R antibodies raised against TNF-R from natural (i.e., non-recombinant) DNA sources, mature full-length human TNF-R is a glycoprotein with a molecular weight of about 80 kilo-daltons. (kDa) Throughout the specification, the term "mature" refers to a protein expressed in a form lacking a leader sequence that can occur in full-length copies of the native gene. Experiments using COS cells transfected with cDNA encoding full-length human TNF-R showed that TNF-R bound 125 I-TNF-α with an apparent K i of about 5 x 10 9 M '. α, and that TNF-R bound I-TNF? with an apparent Ka of about 2 x 10 9 M-1. The terms "TNF receptor" or "TNF-R" include, but are not limited to, analogs or subunits of native proteins having at least 20 amino acids that exhibit at least some biological activity with TNF-R, e.g. ·. ·. 25 soluble TNF-R structures lacking transmem, ···. branial region (and secreted from the cell) but having> »! *. * ._ retention ability to bind TNF. The various bioequivalent protein and amino acid analogs are described in detail below.
30 Tässä käytetty TNF-R-analogien nimeämistapa seuraa “*”* tapaa, jonka mukaan proteiini (esim. TNF-R) nimetään si- ' ten, että sitä edeltää joko hu (ihmis-) tai mu (hiiri-) , ____: ja seuraa delta (osoittamaan deleetion) sekä C-pääamino- * · hapon luku. Esimerkiksi hu-TNF-R-delta-235:11a tarkoite-30 The naming convention of TNF-R analogs used here follows the "*" * way in which a protein (eg TNF-R) is named after either hu (human) or mu (mouse), ____: and follows the delta (to indicate the deletion) and the C-major amino acid number. For example, hu-TNF-R-delta-235
* O -3 C* O -3 C
. 35 taan ihmisen TNF-R:ää, jossa on Asp C-pään aminohappona 108645 6 (eli polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi on 1 - 235 kuviossa 2) . Merkinnän ihmis- tai hiirilajista puuttuessa TNF-R viittaa geneerisesti nisäkäs-TNF-R:ään. Vastaavasti minkään spesifisen merkinnän puuttuessa deleetiomutanteis-5 ta ilmaisulla TNF-R tarkoitetaan kaikkia TNF-R:n muotoja, mukaan lukien mutantit ja analogit, joilla on TNF-R:n biologista aktiivisuutta.. 35 human TNF-R having Asp C-terminal amino acid 1086456 (i.e., a polypeptide having an amino acid sequence of 1 to 235 in Figure 2). In the absence of labeling in human or mouse species, TNF-R generically refers to mammalian TNF-R. Similarly, in the absence of any specific designation, deletion mutants include TNF-R, including all forms of TNF-R, including mutants and analogs having TNF-R biological activity.
Esillä olevan keksinnön yhteydessä käytettyinä "liukoisella TNF-R:llä" tai "sTNF-R:llä" tarkoitetaan pro-10 teiineja, tai oleellisesti samanarvoisia analogeja, joiden aminohapposekvenssi vastaa kokonaisuudessaan tai osittain natiivin TNF-R:n solunulkoista aluetta, esimerkiksi hu-TNF-R-delta-235, hu-TNF-R-delta-185 ja hu-TNF-R-delta-163, tai aminohapposekvenssejä, jotka ovat oleellisesti saman-15 laisia kuviossa 2 esitettyihin, aminohapot 1 - 163, aminohapot 1 - 185, tai aminohapot 1 - 235 käsittäviin nähden, ja jotka ovat biologisesti aktiivisia sikäli, että ne sitoutuvat TNF-ligandiin. Samanarvoisiin liukoisiin TNF-R:iin kuuluu polypeptidejä, jotka poikkeavat näistä sek-20 vensseistä yhdellä tai useammalla substituutiolla, delee-tiolla tai additiolla, ja joilla on tallella kyky sitoutua TNF:ään tai inhiboida TNF-signaalitransduktioaktiivisuus : solupintaan sitoutuneiden TNF-reseptoriproteiinien väli- tyksellä, esimerkiksi hu-TNF-R-delta-x, jossa x valitaan y. 25 ryhmästä, jonka muodostavat mitkä tahansa aminohapoista • · 163 - 235 kuviossa 2. Analogisia deleetioita voidaan tehdä » * TNF-R: ään. TNF-signaalitransduktioaktiivisuuden inhibitio !* voidaan määrittää transfektoimalla soluja yhdistelmä-DNA- TNF-R-DNA-sekvensseillä yhdistelmä-DNA-reseptori-ilmennyk-30 sen saamiseksi. Sitten solut saatetaan kosketuksiin TNF:n ' ' kanssa ja saatuja metabolisia vaikutuksia tutkitaan. Jos saadaan vaikutus, jonka voidaan katsoa johtuvan ligandin toiminnasta, yhdistelmä-DNA-reseptorilla on signaalitrans-. ; duktioaktiivisuutta. Esimerkkimenettelyitä sen määrittämi- . 35 seksi, onko polypeptidillä signaalitransduktioaktiivisuut- 7 1 O 8 6 4 5 ta, julkistavat Idzerda et ai., J.Exp.Med. 171 (1990) 861;As used in the context of the present invention, "soluble TNF-R" or "sTNF-R" refers to pro-10 proteins, or substantially equivalent analogs, whose amino acid sequence corresponds in whole or in part to the extracellular region of native TNF-R, e.g. TNF-R-delta-235, hu-TNF-R-delta-185, and hu-TNF-R-delta-163, or amino acid sequences substantially similar to those shown in Figure 2, amino acids 1-163, amino acids 1- 185, or amino acids 1 to 235, and which are biologically active in that they bind to a TNF ligand. Equivalent soluble TNF-R includes polypeptides that differ from these sequences by one or more substitutions, deletions, or additions, and which retain the ability to bind to TNF or to inhibit TNF signal transduction activity: intercellular binding of TNF receptors such as hu-TNF-R-delta-x, where x is selected from y. Of the 25 groups formed by any of the amino acids • · 163-235 in Figure 2. Analog deletions can be made to * TNF-R. Inhibition of TNF signal transduction activity can be determined by transfecting cells with recombinant TNF-R DNA sequences to obtain recombinant receptor expression. The cells are then contacted with TNF '' and the resulting metabolic effects are studied. If an effect is obtained that can be attributed to ligand function, the recombinant receptor will have a signal transduction. ; duktioaktiivisuutta. Exemplary procedures for determining it. 35 whether the polypeptide has signal transduction activity is disclosed by Idzerda et al., J.Exp.Med. 171: 861 (1990);
Curtis et ai., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 86 (1989) 3045;Curtis et al., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 86: 3045 (1989);
Prywes et ai. , EMBO J. 5 (1986) 2179; ja Chou et ai., J. Biol.Chem. 262 (1987) 1842. Vaihtoehtoisesti voitaisiin 5 myös käyttää primaarisoluja tai solulinjoja, jotka ilmentävät endogeenisen TNF-reseptorin ja joilla on todettava biologinen vaste TNF:lle.Prywes et al. , EMBO J. 5: 2179 (1986); and Chou et al., J. Biol. Chem. 262: 1842 (1987). Alternatively, primary cells or cell lines expressing an endogenous TNF receptor and having a detectable biological response to TNF could also be used.
Ilmaisulla "eristetty" tai "puhdistettu" käytettynä tämän selityksen yhteydessä TNF-R-proteiinin tai 10 proteiinikoostumusten puhtauden määrittelemiseksi tarkoitetaan, että proteiini tai proteiinikoostumus ei oleellisesti sisällä muita alkuperältään luonnollisia tai endo-geenisiä proteiineja ja sisältää alle noin 1 paino-%:n tuotantomenetelmistä jääneitä proteiiniepäpuhtauksia. Täl-15 laiset koostumukset voivat kuitenkin sisältää muita prote iineja, jotka on lisätty stabiloimisaineiksi, kantajiksi tai täyteaineiksi. TNF-R on eristetty, jos se voidaan todeta yksittäisenä proteiininauhana polyakryyliamidigee-lissä hopeavärjäyksellä.The term "isolated" or "purified" as used in this specification to determine the purity of a TNF-R protein or protein composition means that the protein or protein composition is substantially free of other natural or endogenous proteins and contains less than about 1% by weight of production methods. residual protein impurities. However, such compositions may contain other proteins added as stabilizers, carriers or excipients. TNF-R is isolated if it can be detected as a single protein band in a polyacrylamide gel by silver staining.
20 Ilmaisulla "oleellisesti samanlainen" käytettynä joko aminohappo- tai nukleiinihapposekvenssien määrittelemiseksi tarkoitetaan, että nimenomainen kohdesekvenssi, esimerkiksi mutanttisekvenssi, poikkeaa viitesekvenssistä • yhdellä tai useammalla substituutiolla, deleetiolla tai ·.·. 25 additiolla, jolloin summavaikutus tästä on TNF-R-proteii- ,··, nin biologisen aktiivisuuden säilyttäminen, joka voidaan * i !!! määrittää esimerkiksi jollain alla esimerkissä 1 esite- tyistä TNF-R-sitoutumismäärityksistä. Vaihtoehtoisesti • » ’···' nukleiinihappoalayksiköt ja -analogit ovat "oleellisesti 30 samanlaisia" kuin spesifiset tässä julkistetut DNA-sek- » *’ ’ venssit, jos: (a) DNA-sekvenssi on saatu natiivin nisäkäs- ‘ti/ TNF-R-geenin koodialueelta; (b) DNA-sekvenssi kykenee hyb- ridisoitumaan DNA-sekvensseihin (a):sta kohtuullisen anka-rissa olosuhteissa (50 °C, 2x SSC) , ja ne koodittavat bio- ! · . 35 logisesti aktiivisia TNF-R-molekyylejä; tai DNA-sekvens- » » * · 108645 8 : sit, jotka ovat degeneroituneet tuloksena geneettisestä koodista (a):ssa tai (b):ssä määriteltyihin DNA-sekvens-seihin nähden ja jotka koodittavat biologisesti aktiivisia TNF-R-molekyylejä.The term "substantially similar", as used to define either amino acid or nucleic acid sequences, means that a particular target sequence, for example a mutant sequence, deviates from the reference sequence by one or more substitutions, deletions, or. 25 additions, whereby the additive effect here is to maintain the biological activity of TNF-R protein, ···, which can be * i !!! for example, determines one of the TNF-R binding assays shown in Example 1 below. Alternatively, • '' ··· 'nucleic acid subunits and analogs are "substantially 30" similar to the specific DNA sequences disclosed herein, if: (a) the DNA sequence is derived from a native mammalian / TNF-? The coding region of the R gene; (b) The DNA sequence is capable of hybridizing to the DNA sequences from (a) under moderate Ankara conditions (50 ° C, 2x SSC), and they encode a biocl. ·. 35 logically active TNF-R molecules; or DNA sequences which are degenerate as a result of the genetic code relative to the DNA sequences defined in (a) or (b) and which encode biologically active TNF-R molecules.
5 Ilmaisulla "yhdistelmä-DNA" tarkoitetaan tässä käytettynä, että proteiini on saatu yhdistelmä-DNA- (esim. mikrobi- tai nisäkäs-) ilmennyssysteemeistä. "Mikrobiaali-sella" tarkoitetaan yhdistelmä-DNA-proteiineja, jotka on valmistettu bakteeri- tai sieni- (esim. hiiva-) ilmennys-10 systeemeissä. Tuotteena "yhdistelmä-DNA-mikrobiaalinen" määrittelee proteiinin, joka on tuotettu mikrobi-ilmennys-systeemissä, ja joka oleellisesti ei sisällä natiiveja en-dogeenisiä aineita. Useimmissa bakteeriviljelmissä, esim.The term "recombinant DNA" as used herein means that the protein is derived from recombinant (e.g., microbial or mammalian) expression systems. By "microbial" is meant recombinant proteins made in bacterial or fungal (e.g., yeast) expression systems. As a product, "recombinant microbial" defines a protein produced in a microbial expression system and substantially free of native endogenous substances. In most bacterial cultures, e.g.
E. colissa, ilmennetty proteiini ei sisällä glykaania.In E. coli, the expressed protein does not contain glycan.
15 Hiivassa ilmennetyn proteiinin glykosylaatiokuvio mahdollisesti poikkeaa nisäkässoluissa ilmennetystä.The glycosylation pattern of the protein expressed in yeast may be different from that expressed in mammalian cells.
"Biologisesti aktiivisella" käytettynä kautta selityksen TNF-reseptorien ominaisuutena tarkoitetaan, että nimenomaisella molekyylillä on riittävän samanlainen ami-20 nohapposekvenssi tässä julkistettuihin esillä olevan keksinnön mukaisiin suoritusmuotoihin nähden, jotta se kykenee sitomaan todettavia määriä TNF:ää, välittämään TNF-: stimulaatiota soluun, esimerkiksi hybridireseptoriraken- I’·*: teen osana, tai ristireagoimaan anti-TNF-R-vasta-aineiden V. 25 kanssa, jotka on tuotettu vastaan TNF-R:ää luonnollisista (eli ei-yhdistelmä-DNA-) lähteistä. Edullisesti esillä h) olevan keksinnön piiriin kuuluvat biologisesti aktiiviset TNF-reseptorit kykenevät sitomaan enemmän kuin 0,1 nano-’ * moolin (nmol) TNFrää kohden nanomoolia reseptoria, ja edu- 30 llisesti enemmän kuin 0,5 nanomoolia TNFrää kohden nano- ' moolia reseptoria sitoutumisen vakiomäärityksissä (katso alla) .By "biologically active" as used throughout the specification, the property of TNF receptors means that the particular molecule has an amino acid sequence sufficiently similar to the disclosed embodiments of the present invention to bind detectable amounts of TNF, to mediate TNF stimulation, e.g. as part of a hybrid receptor I '*, or to cross-react with anti-TNF-R antibodies produced against natural (i.e. non-recombinant) sources of TNF-R. Preferably, the biologically active TNF receptors encompassed by the present invention are capable of binding more than 0.1 nano-mole (nmol) of TNF per nanomolar receptor, and preferably more than 0.5 nanomolar of TNF per nano-mole. receptor binding assays (see below).
"Eristetyllä DNA-sekvenssillä" tarkoitetaan DNA-polymeeriä erillisen fragmentin muodossa tai suuremman 35 DNA-rakenteen osana, joka on saatu DNArsta, joka on eris- > * i t 9 1 O 8 6 45 ! tetty ainakin kerran oleellisesti puhtaassa muodossa, eli vapaana kontaminoivista endogeenisistä materiaaleista ja määränä tai pitoisuutena, joka mahdollistaa sekvenssin ja sen osanukleotidisekvenssien tunnistuksen, käsittelyn ja 5 talteenoton tavanomaisilla biokemiallisilla menetelmillä, esimerkiksi kloonausvektoria käyttäen. Tällaiset sekvenssit ovat edullisesti avoimen lukualueen muodossa, jota eivät katkaise sisäiset ei-luetut sekvenssit, tai intronit, joita tyypillisesti esiintyy eukaryoottisissa geeneissä.By "isolated DNA sequence" is meant a DNA polymer in the form of a single fragment, or as part of a larger 35 DNA construct derived from DNA that is distinct from the DNA sequence. at least once in substantially pure form, i.e., free from contaminating endogenous materials, and in an amount or concentration that permits the sequence and its partial nucleotide sequences to be identified, processed and recovered by conventional biochemical techniques, for example, using a cloning vector. Such sequences are preferably in the form of an open reading region not interrupted by internal unread sequences, or introns typically found in eukaryotic genes.
' 10 Genomi-DNA:ta, joka sisältää oleelliset sekvenssit, voi taisiin samoin käyttää koodisekvenssien lähteenä. Sekvenssejä ei-luettua DNA:ta voi esiintyä 5'- tai 3'- suuntaan avoimesta lukualueesta, silloin kun ne eivät häiritse koo-dialueiden käsittelyä tai ilmennystä.Genomic DNA containing the essential sequences could likewise be used as a source of coding sequences. Sequences of unread DNA may be present in the 5 'or 3' open reading region when they do not interfere with the processing or expression of the codons.
15 "Nukleotidisekvenssillä" tarkoitetaan deoksiribo- nukleotidien heteropolymeeriä. DNA-sekvenssejä, jotka koodattavat tämän keksinnön käyttöön antamia proteiineja, voidaan koota cDNA-fragmenteista ja lyhyistä oligonukleo-tidiliittäjistä, tai sarjasta oligonukleotideja, synteet-20 tisen geenin saamiseksi, joka kyetään ilmentämään yhdis-telmä-DNA-kopiointiyksikössä.By "nucleotide sequence" is meant a heteropolymer of deoxyribonucleotides. The DNA sequences encoding the proteins provided by this invention may be assembled from cDNA fragments and short oligonucleotide linkers, or a series of oligonucleotides, to obtain a synthetic gene which can be expressed in a recombinant DNA copy unit.
TNF-R:ää koodittavien cDNA-sekvenssien eristäminen : TNF-R:n koodisekvenssi saadaan eristämällä komple- ·'·*: mentaarinen DNA- (cDNA-) sekvenssi, joka koodittaa TNF- y. 25 R:ää, yhdistelmä-cDNA- tai genomi-DNA-kirjastosta. cDNA- I · ,·>·. kirjasto rakennetaan edullisesti hankkimalla polyadeny- -4 loitua mRNActa erityisestä solulinjasta, joka ilmentää ni- säkäs-TNF-R:n, esimerkiksi ihmisen sidekudosmuodostusso-lulinjasta WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1) ja käyttämällä 30 mRNArta templaattina kaksisäikeisen cDNA:n syntetisoimi-• ’ seksi. Kaksisäikeinen cDNA pakataan sitten yhdistelmä-DNA- vektoriin, joka viedään tarkoituksenmukaiseen Ey coli -kantaan, jossa sitä lisäännytetään. Voidaan käyttää myös hiiri- tai muita nisäkässolulinjoja, jotka ilmentävät 35 TNF-R:n. cDNA-kirjaston sisältämät TNF-R-sekvenssit voi- 108645 ίο daan tunnistaa helposti seulomalla kirjasto tarkoituksenmukaisella nukleiinihappokoettimella, joka kykenee hybri-disoitumaan TNF-R-cDNA:han. Vaihtoehtoisesti TNF-R-pro-teiineja koodittavia DNA-sekvenssejä voidaan koota liga-5 toimalla synteettisiä oligonukleotidialayksiköitä, jotka vastaavat kokonaisuudessaan tai osittain sekvenssiä kuvioissa 2-3 tai kuvioissa 4-6, täydellisen koodisek-venssin saamiseksi.Isolation of cDNA sequences encoding TNF-R: The coding sequence for TNF-R is obtained by isolation of the complementary DNA sequence (cDNA) encoding TNF-γ. 25 R from a recombinant cDNA or genomic DNA library. cDNA- I ·, ·> ·. The library is preferably constructed by obtaining polyadenylated mRNA from a specific cell line expressing mammalian TNF-R, for example from human connective tissue formation cell line WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1) and using 30 mRNA as a template for double-stranded cDNA. • 'sex. The double-stranded cDNA is then packaged in a recombinant DNA vector which is introduced into an appropriate E coli strain for propagation. Mouse or other mammalian cell lines expressing 35 TNF-R can also be used. The TNF-R sequences contained in the cDNA library can be readily identified by screening the library with an appropriate nucleic acid probe capable of hybridizing to the TNF-R cDNA. Alternatively, DNA sequences encoding TNF-R proteins may be assembled by Liga-5 by performing synthetic oligonucleotide subunits corresponding, in whole or in part, to the sequence of Figures 2-3 or Figures 4-6 to obtain a complete coding sequence.
Esillä olevan keksinnön yhteydessä kuvatut humaa-10 ni-TNF-reseptori-cDNA:t eristettiin suoran ilmennyskloo- nausmenetelmällä. cDNA-kirjasto rakennettiin eristämällä ensin ihmisen sidekudosmuodostussolulinjan WI-26 VA4 solu-liman mRNA:ta. Polyadenyloitu RNA eristettiin ja sitä käytettiin kaksisäikeisen cDNA:n valmistamiseksi. Puhdistetut 15 cDNA-fragmentit ligatoitiin sitten pCAV/NOT-vektori- DNA:han, joka käyttää säätelysekvenssejä, jotka on saatu pDC201:stä (pMLSV-johdannainen, jota ovat aiemmin kuvanneet Cosman et ai., Nature 312 (1984) 768), SV40:stä ja sytomegalovirus-DNA:sta, joita kuvataan yksityiskohtai-20 sesti alla esimerkissä 2. pCAV/NOT on talletettu talle tuslaitokseen the American Type Culture Collection talle-tusnumerolla ATCC 68014. WI26-VA4-cDNA-fragmentteja sisäl-tävät pCAV/NOT-vektorit transformoitiin E. coli -kantaan * · :V: DH5-a. Transformantit maljaamalla saatiin noin 800 pesä- • * ·.·. 25 kettä maljaa kohden. Saadut pesäkkeet otettiin talteen ja • · ,···. kustakin poolista valmistettiin plasmidi-DNA, joka trans- « i fektoitiin COS-7-soluihin oleellisesti kuten ovat kuvan- • · ;;; neet Cosman et ai. (Nature 312 (1984) 7 68) ja Luthman et I · ’··' ai. (Nucl. Acids Res. 11 (1983) 1295). Biologisesti ak- 30 tiivisia solupinta-TNF-reseptoreita ilmentävät transfor-*”· mäntit tunnistettiin seulomalla niiden kyvyn suhteen sitoa *it/ 125I-TNF:ää. Tässä seulomislähestymistavassa transfektoitu- ja COS-7-soluja inkuboitiin kasvualustassa, joka sisälsi . 125I-TNF:ää, solut pestiin sitoutumatta jääneen leimatun 35 TNF:n poistamiseksi ja soluyksikerrokset saatettiin koske- « » t 11 108645 tuksiin röntgenfilmin kanssa TNF-sitoutumispitoisuuksien toteamiseksi kuten ovat julkistaneet Sims et ai., Science 241 (1988) 585. Tällä tavalla todetut transfektantit näkyvät tummina kohtina vasten suhteellisen vaaleaa taustaa.The human 10n TNF receptor cDNAs described in the context of the present invention were isolated by a direct expression cloning method. The cDNA library was constructed by first isolating mucus mRNA from the human connective tissue formation cell line WI-26 VA4. Polyadenylated RNA was isolated and used to prepare double stranded cDNA. The purified cDNA fragments were then ligated into pCAV / NOT vector DNA which uses regulatory sequences derived from pDC201 (a pMLSV derivative previously described by Cosman et al., Nature 312 (1984) 768), SV40 and cytomegalovirus DNA described in detail below in Example 2. pCAV / NOT has been deposited with the American Type Culture Collection under accession number ATCC 68014. pCAV / NOT containing WI26-VA4 cDNA fragments vectors were transformed into E. coli strain * ·: V: DH5-a. Plating the transformants yielded approximately 800 colonies. 25 kegs per dish. The resulting colonies were harvested and • ·, ···. plasmid DNA was prepared from each pool, which was transfected into COS-7 cells essentially as shown in Figs. neet Cosman et al. (Nature 312 (1984) 7 68) and Luthman et al. (Nucl. Acids Res. 11, 1295 (1983)). Transfor- * ”pines expressing biologically active cell surface TNF receptors were identified by screening for their ability to bind * it / 125 I-TNF. In this screening approach, transfected and COS-7 cells were incubated in medium containing. With 125 I-TNF, cells were washed to remove unbound labeled 35 TNF, and the cell monolayers were contacted with 11,108,645 X-ray films to determine TNF binding levels as disclosed by Sims et al., Science 241: 585 (1988). the detected transfectants appear as dark spots against a relatively light background.
5 Käyttämällä tätä lähestymistapaa noin 240 000 cDNA:ta seulottiin noin 800 cDNA:n pooleina, kunnes yhden transfektanttipoolin määritys osoitti positiivisia kohtia TNF-sitoutumiselle. Jäädytettyä bakteerivarastokantaa tästä positiivisesta poolista kasvettiin viljelmänä ja mal-10 jättiin yksittäisten pesäkkeitten saamiseksi, joita seulottiin kunnes tunnistettiin yksittäinen klooni (klooni-11), joka kykeni ohjaamaan pintaproteiinin synteesiä, jolla oli todettavaa TNF-sitoutumisaktiivisuutta. Edeltävällä menetelmällä eristetyn cDNA-klooni-11:n sekvenssi esite-15 tään kuvioissa 4-6.Using this approach, approximately 240,000 cDNAs were screened as pools of about 800 cDNA until a single transfectant pool assay showed positive sites for TNF binding. Frozen bacterial stock from this positive pool was cultured and mal-10 was left to obtain single colonies which were screened until a single clone (clone-11) was identified that was capable of directing surface protein synthesis with detectable TNF-binding activity. The sequence of cDNA clone-11 isolated by the above method is shown in Figures 4-6.
Lisää cDNA-klooneja voidaan eristää muiden nisäkäslajien cDNA-kirjastoista ristilajihybridisaatiolla. Hybridisaatiossa käytettäväksi TNF-R:ää koodittava DNA voidaan leimata kovalenttisesti todettavalla aineella ku-20 ten fluoresoivalla ryhmällä, radioaktiivisella atomilla tai kemiluminoivalla ryhmällä menetelmillä, jotka ovat alan ammattilaisille tuttuja. Tällaisia koettimia voitai-siin myös käyttää nimenomaisten tilojen jji vitro -diag-noosissa.Further cDNA clones can be isolated from cDNA libraries of other mammalian species by cross-species hybridization. For use in hybridization, DNA encoding TNF-R may be covalently labeled with a detectable agent such as a fluorescent moiety, a radioactive atom, or a chemiluminescent moiety by methods known to those skilled in the art. Such probes could also be used in the in vitro diagnosis of specific conditions.
• ♦ ·,·. 25 Kuten useimpia nisäkäsgeenejä nisäkäs-TNF-resepto- • » * • reita koodattavat oletettavasti monieksonigeenit. Vaih-toehtoisten mRNA-rakenteiden, joiden voidaan katsoa synty- * · vän kopioinnin jälkeisistä erilaisista mRNA-silmukoitumis-’ ·*’ tapahtumista ja joilla on tässä kuvattujen cDNA- 30 sekvenssien kanssa yhteisenä laajoja identtisyys- tai sa- '·"· manlaisuusalueita, katsotaan kuuluvan esillä olevan kek- ‘ ^ sinnön piiriin.• ♦ ·, ·. As with most mammalian genes, mammalian TNF receptor receptors are thought to be encoded by multi-exogenous genes. Alternative mRNA constructs that can be considered to be the result of * · various post-transcriptional mRNA splicing events and which share common identity or identity regions with the cDNA sequences described herein, are considered to be within the scope of the present invention.
Muita nisäkäs-TNF-R-cDNA-sekvenssejä eristetään . käyttämällä tarkoituksenmukaista humaani-TNF-R-DNA-sek- 35 venssiä koettimena nimenomaisen nisäkäs-cDNA-kirjaston 108645 12 seulomiseksi ristilajihybridisaatiolla.Other mammalian TNF-R cDNA sequences are isolated. using the appropriate human TNF-R DNA sequence as a probe for screening a specific mammalian cDNA library 10864512 by cross-species hybridization.
Proteiineja ja analogejaProteins and analogs
Esillä oleva keksintö antaa käyttöön eristettyjä yhdistelmä-DNA-nisäkäs-TNF-R-polypeptidejä. Tämän keksin-5 nön mukaiset eristetyt TNF-R-polypeptidit eivät oleellisesti sisällä muita alkuperältään luonnollisia tai endo-geenisiä kontaminoivia materiaaleja ja ne sisältävät vähemmän kuin noin 1 paino-%:n tuotantomenetelmistä jääneitä proteiiniepäpuhtauksia. Natiivit humaani-TNF-R-molekyylit 10 otetaan talteen solulysaateista glykoproteiineina, joiden näennäinen molekyylipaino SDS-PAGE:n mukaan on noin 80 kilodaltonia (kDa). Tämän keksinnön mukaisista TNF-R-polypeptideistä mahdollisesti puuttuu liittyvä natiivin kuvion mukainen glykosylaatio.The present invention provides isolated recombinant mammalian TNF-R polypeptides. The isolated TNF-R polypeptides of this invention are substantially free of other contaminating materials of natural or endogenous origin and contain less than about 1% by weight of protein impurities from production processes. Native human TNF-R molecules are recovered from cell lysates as glycoproteins having an apparent molecular weight of about 80 kilodaltons (kDa) by SDS-PAGE. The TNF-R polypeptides of this invention may lack the associated native pattern glycosylation.
15 Esillä olevan keksinnön mukaiseen nisäkäs-TNF- R:ään kuuluu esimerkiksi kädellis-, ihmis-, hiiri-, koira-, kissa-, nauta-, lammas-, hevos- ja sika-TNF-R. Nisä-käs-TNF-R:t voidaan saada ristilajihybridisaatiolla käyttäen yksisäikeistä cDNA:ta, joka on saatu humaani-TNF-R-20 DNA-sekvenssistä, hybridisaatiokoettimena TNF-R-cDNA- sekvenssien eristämiseksi nisäkäs-cDNA-kirjastoista.Mammalian TNF-R according to the present invention includes, for example, TNF-R from primates, humans, mice, dogs, cats, bovine animals, sheep, horses and pigs. Mammalian TNF-Rs can be obtained by cross-species hybridization using single-stranded cDNA obtained from the human TNF-R-20 DNA sequence as a hybridization probe to isolate TNF-R cDNA sequences from mammalian cDNA libraries.
Keksinnön piiriin kuuluviin TNF-R-johdannaisiin kuuluu myös primaarisen proteiinin erilaisia rakenteelli- t * I'·'. siä muotoja, joilla on tallella biologinen aktiivisuus.The TNF-R derivatives encompassed by the invention also include various structural * I '·' of the primary protein. forms that retain biological activity.
*.·. 25 Esimerkiksi ionisoituvien amino- ja karboksyyliryhmien * · läsnäolon johdosta TNF-R-proteiini voi olla happamien tai ’’* emäksisten suolojen muodossa, tai se voi olla neutraalissa muodossa. Yksittäisiä aminohappotähteitä voidaan niinikään modifioida hapettamalla tai pelkistämällä.*. ·. For example, due to the presence of ionizable amino and carboxyl groups, the TNF-R protein may be in the form of acidic or '' basic salts, or it may be in neutral form. The individual amino acid residues may also be modified by oxidation or reduction.
30 Primaarista aminohapporakennetta voidaan modifioi- • ‘ da muodostamalla kovalenttisia tai aggregatiivisia konju- ‘t,,: gaatteja muiden kemiallisten ryhmien, kuten glykosyyli- ryhmien, lipidien, fosfaatti-, asetyyliryhmien ja vastaa-vien kanssa, tai luomalla aminohapposekvenssimutantteja.The primary amino acid structure may be modified by formation of covalent or aggregative conjugates with other chemical groups such as glycosyl groups, lipids, phosphate, acetyl groups, and the like, or by creating amino acid sequence mutants.
35 Kovalenttisia johdannaisia valmistetaan liittämällä ni- 108645 13 menomaisia funktionaalisia ryhmiä TNF-R-aminohapposivu-ketjuihin tai N- tai C-päähän. Muita TNF-R-johdannaisia ovat TNF-R:n tai sen fragmenttien kovalenttiset tai aggre-gatiiviset konjugaatit muiden proteiinien tai polypeptidi-5 en kanssa, (jotka muodostetaan) esimerkiksi syntetisoimalla yhdistelmä-DNA-viljelmässä N-pää- tai C-pääfuusioina. Esimerkiksi konjugoitu peptidi voi olla signaali- (tai johto-) polypeptidisekvenssi proteiinin N-pääalueella, joka luennan aikana tai luennan jälkeen ohjaa proteiinin 10 siirtymistä sen synteesipaikasta sen toimintapaikkaan so-lumembraanin tai -seinän sisä- tai ulkopuolella (esim. hiiva-a-tekijäjohtosekvenssi). TNF-R-proteiinifuusiot voivat käsittää peptidejä, jotka on lisätty helpottamaan TNF-R:n puhdistusta tai tunnistusta (esim. poly-His). TNF-15 reseptorin aminohapposekvenssi voidaan myös liittää peptidiin Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et ai., Bio/Technoloqy 6 (1988) 1204). Viimemainittu sekvenssi on erittäin antigeeninen ja käsittää epitoopin, jota sitoo reversiibelisti spesifinen monoklonaalinen vasta-20 aine, mikä mahdollistaa ilmennetyn yhdistelmä-DNA-proteiinin nopean määrityksen ja helpon puhdistuksen. Tätä sekvenssiä pilkkoo niinikään spesifisesti naudan limakal-von enterokinaasi tähteen kohdalta, joka seuraa välittö-mästi Äsp-Lys-paria. Tällä peptidillä salvatut fuusiopro-\\ 25 teiinit voivat niinikään vastustaa solunsisäistä hajoamis- ' ’·, ta L colissa.35 Covalent derivatives are prepared by linking 108645 13 feminine functional groups to the TNF-R amino acid side chains or to the N or C terminus. Other TNF-R derivatives include covalent or aggressive conjugates of TNF-R or fragments thereof with other proteins or polypeptides (which are formed), for example, by synthesis in recombinant culture as N-major or C-major fusions. For example, the conjugated peptide may be a signal (or leader) polypeptide sequence in the N-terminal region of a protein that, during or after translation, directs the transfer of protein 10 from its site of synthesis to its site inside or outside the cell membrane or wall (e.g., yeast? ). TNF-R protein fusions may comprise peptides added to facilitate purification or recognition of TNF-R (e.g., poly-His). The TNF-15 receptor amino acid sequence can also be linked to the Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) peptide (Hopp et al., Bio / Technolqy 6: 1204, 1988). The latter sequence is highly antigenic and comprises an epitope which is reversibly bound by a specific monoclonal antibody, allowing rapid determination and easy purification of the expressed recombinant protein. This sequence is also specifically cleaved by bovine mucosal enterokinase at the residue immediately following the Äsp-Lys pair. Fusion proteins blocked by this peptide can also resist intracellular degradation in L coli.
K'. TNF-R-johdannaisia voidaan myös käyttää reagens- ;;; seinä reseptoripohjaisissa immuunimäärityksissä tai sitou- ’···’ tumisagentteina TNF:n tai muiden sitoutumisligandien affi- 30 niteettipuhdistusmenettelyissä. TNF-R-johdannaisia voidaan myös saada käyttämällä ristikytkemisaineita, kuten M-maleimidobentsoyylisukkiini-imidiesteriä ja N-hydroksisuk-kiini-imidiä, kysteiini- ja lysiinitähteiden kohdalla.K '. TNF-R derivatives may also be used as a reagent ;;; wall in receptor-based immunoassays or as binding agents for affinity purification of TNF or other binding ligands. TNF-R derivatives may also be obtained using cross-linking agents such as M-maleimidobenzoyl succinimide ester and N-hydroxysuccinimide at cysteine and lysine residues.
» I»I
ti. TNF-R-proteiinit voidaan samoin sitoa kovalenttisesti re- » , 35 aktiivisten sivuryhmien välityksellä erilaisiin ei- l· i · • » » < I t t 108645 14 liukoisiin substraatteihin, kuten syaanibromidiaktivoidut, bisoksiraaniaktivoidut, karbonyylidi-imidatsoliaktivoidut tai tosyyliaktivoidut agaroosirakenteet, tai adsorboimalla polyolefiinipintoihin (käyttäen tai käyttämättä glutaa-5 rialdehydiristikytkemistä). Kun TNF-R on sitten sidottu substraattiin, sitä voidaan käyttää anti-TNF-R-vasta- aineiden tai TNF:n selektiiviseksi sitomiseksi (määritys-tai puhdistustarkoituksissa).ti. Similarly, TNF-R proteins can be covalently bound via various active side groups to various non-soluble substrates, such as cyanobromide-activated, bisoxirane-activated, carbonyldiimidazole-activated or carboxyl-imidazole-activated or (with or without glial-5 rialdehyde cross-linking). Once bound to a substrate, TNF-R can be used to selectively bind anti-TNF-R antibodies or TNF (for assay or purification purposes).
Esillä olevaan keksintöön kuuluu myös TNF-R, joka ' 10 käsittää liittyvän natiivin kuvion mukaisen glykosylaation tai ei käsitä sitä. Hiiva- tai -nisäkäsilmennyssysteemeis-sä, esim. COS-7-soluissa, ilmennetyllä TNF-R:llä voi olla samanlaiset tai lievästi erilaiset molekyylipaino ja gly-kosylaatiokuvio kuin natiiveilla molekyyleillä ilmennys- 15 systeemistä riippuen. Ilmentämällä TNF-R-DNA:t bakteereis sa kuten Eh_ colissa saadaan ei-glykosyloituja molekyylejä. Nisäkäs-TNF-R:n funktionaalisia mutanttianalogeja, joissa on inaktivoituja N-glykosylaatiokeskuksia, voidaan tuottaa oligonukleotidisynteesillä ja ligatoimalla tai käyttäen 20 paikkaohjatun mutatoinnin tekniikoita. Näitä analogipro-teiineja voidaan tuottaa homogeenisessa, pelkistetty hiilihydraatti -muodossa saannon ollessa hyvä hiivailmennys-.!· : systeemejä käyttäen. Eukaryoottisten proteiinien N- j'·'. glykosylaatiokeskuksille on karakteristista aminohappo- ·.*. 25 tripletti Asn-Ai-Z, jossa Ai on mikä tahansa aminohappo • · · t···, paitsi Pro, ja Z on Ser tai Thr. Tässä sekvenssissä aspa- « · ragiinista saadaan sivuketjuaminoryhmä hiilihydraatin ko- » * • * \\\ valenttiseksi kiinnittämiseksi. Tällainen keskus voidaan eliminoida substituoimalla toinen aminohappo Asn:n tai 30 tähteen Z tilalle, deletoimalla Asn tai Z tai insertoi- ’·"· maila ei-Z-aminohappo Ai:n ja Z:n väliin, tai muu amino- happo kuin Asn Asn:n ja Ai:n väliin.The present invention also encompasses TNF-R, which comprises or does not comprise glycosylation of the associated native pattern. TNF-R expressed in yeast or mammalian expression systems, eg, COS-7 cells, may have the same or slightly different molecular weight and Gly cosylation pattern than native molecules, depending on the expression system. Expression of TNF-R DNA in bacteria such as Ehc-coli yields non-glycosylated molecules. Functional mutant analogs of mammalian TNF-R having inactivated N-glycosylation centers can be produced by oligonucleotide synthesis and ligation or using 20 site-directed mutation techniques. These analogue proteins can be produced in a homogeneous reduced carbohydrate form with good yield of yeast expression systems. N-j '·' of eukaryotic proteins. glycosylation centers are characterized by amino acid ·. *. A triplet Asn-Ai-Z, where Ai is any amino acid except Pro, and Z is Ser or Thr. In this sequence, aspartic acid provides a side chain amino group for carbohydrate co-attachment. Such a center can be eliminated by substituting another amino acid for Asn or 30 residues Z, deleting Asn or Z or inserting a bat between a non-Z amino acid Ai and Z, or an amino acid other than Asn Asn and Ai.
TNF-R-johdannaisia voidaan saada samoin mutatoi-. maila TNF-R:ää tai sen alayksiköitä. TNF-R-mutantti tässä , 35 tarkoitetussa mielessä on TNF-R:ään nähden homologinen po- > i » t * i t I * 108645 15 lypeptidi, joka aminohapposekvenssiltään kuitenkin poikkeaa natiivista TNF-R:stä deleetion, insertion tai substituution vuoksi.TNF-R derivatives may also be obtained by mutation. racket TNF-R or its subunits. In this sense, the TNF-R mutant is a polypeptide homologous to TNF-R, but differs in amino acid sequence from native TNF-R due to deletion, insertion or substitution.
TNF-R-proteiinien bioekvivalenttisia analogeja 5 voidaan rakentaa esimerkiksi tekemällä erilaisia tähteiden tai sekvenssien substituutioita tai deletoimalla päässä sijaitsevia tai sisäisiä tähteitä tai sekvenssejä, jotka eivät ole biologiselle aktiivisuudelle välttämättömiä. Esimerkiksi kysteiinitähteet voidaan deletoida (esim.Bioequivalent analogs of TNF-R proteins can be constructed, for example, by making various substitutions of residues or sequences, or by deleting end-to-end or internal residues or sequences that are not essential for biological activity. For example, cysteine residues may be deleted (e.g.
10 Cys178) tai korvata muilla aminohapoilla tarpeettomien tai virhellisten molekyylinsisäisten disulfidisiltojen muodostuksen estämiseksi renaturoinnissa. Muihin lähestymistapoihin mutatoinnin suorittamiseksi kuuluu viereisten kak-siemäksisten aminohappotähteiden modifiointi ilmennyksen 15 tehostamiseksi hiivasysteemeissä, joissa esiintyy KEX2-proteaasiaktiivisuutta. Yleisesti substituutiot tulisi tehdä konservatiivisesti; eli edullisimpia korvaavia aminohappoja ovat ne, jotka fysikokemiallisilta ominaisuuksiltaan muistuttavat korvattavan tähteen vastaavia. Samoin 20 käytettäessä deleetio- tai insertiostrategiaa deleetion tai insertion mahdollinen vaikutus biologiseen aktiivisuuteen tulisi ottaa huomioon. Oleellisesti samanlaiset poly-peptidisekvenssit edellä määritellyn mukaisesti käsittävät10 Cys178) or substituted with other amino acids to prevent the formation of unnecessary or defective intramolecular disulfide bridges during renaturation. Other approaches for performing the mutation include modifying adjacent double-stranded amino acid residues to enhance expression in yeast systems that exhibit KEX2 protease activity. In general, substitutions should be made conservatively; i.e., the most preferred replacement amino acids are those which have physicochemical properties similar to those of the residue to be replaced. Similarly, when using a deletion or insertion strategy, the potential effect of the deletion or insertion on biological activity should be considered. Substantially similar polypeptide sequences as defined above comprise
* I* I
I’.*. yleensä saman lukumäärän aminohapposekvenssejä, vaikka « · *.·, 25 C-päätypistelmät liukoisten TNF-R:ien rakentamista silmäl- ..•t lä pitäen sisältävät harvempia aminohapposekvenssejä.I '. *. usually the same number of amino acid sequences, although · · *. ·, 25 C-terminal points for the construction of soluble TNF-Rs contain fewer amino acid sequences.
ΙΓ. TNF-R:ien biologisen aktiivisuuden säilyttämiseksi delee- tioiden ja substituutioiden tuloksena saadaan edullisesti homologisia tai konservatiivisesti substituoituja sekvens-30 sejä, mikä tarkoittaa, että tietty tähde on korvattu bio-logisesti samanlaisella tähteellä. Esimerkkejä konserva-’ii(! tiivisista substituutioista ovat yhden alifaattisen täh- teen sijoittaminen toisen tilalle, kuten Ile, Vai, Leu tai sΙΓ. Preferably, deletions and substitutions result in homologous or conservatively substituted sequences to maintain the biological activity of TNF-Rs, which means that a particular residue is replaced by a biologically similar residue. Examples of conservative substitutions include the placement of one aliphatic residue in place of another, such as Ile, Val, Leu or s.
Ala toistensa tilalle, tai substituutiot, joissa yksi po-35 laarinen tähde sijoitetaan toisen tilalle, kuten keskenään >Substitute for each other, or substitutions where one polar residue is replaced by another, such as with each other>
S i i IS i i I
! 108645 16! 108645 16
Lys ja Arg; Glu ja Asp; tai Gin ja Asn. Muitakin tällaisia konservatiivisia substituutioita, esimerkiksi hydrofobi-suusominaisuuksiltaan samanlaisten kokonaisten alueiden substituutiot, tunnetaan hyvin. Lisäksi nimenomaiset ami-5 nohappoerot ihmisen, hiiren ja muun nisäkkään TNF-R:ien välillä viittaa toisiin konservatiivisiin substituutioihin, joita voidaan tehdä muuttamatta TNF-R:n oleellisia biologisia ominaisuuksia.Lys and Arg; Glu and Asp; or Gin and Asn. Other such conservative substitutions, for example substitutions of whole regions with similar hydrophobic properties, are well known. In addition, explicit amino acid differences between human, mouse, and other mammalian TNF-Rs suggest other conservative substitutions that can be made without altering the essential biological properties of TNF-R.
TNF-R-alayksiköitä voidaan rakentaa deletoimalla 10 päässä sijaitsevia tai sisäisiä tähteitä tai sekvenssejä. Erityisen edullisia sekvenssejä ovat ne, joissa TNF-R:n transmembraanialue ja solunsisäinen alue on deletoitu tai substituoitu hydrofiilisillä tähteillä reseptorin erityksen solukasvualustaan helpottamiseksi. Saatua proteiinia 15 kutsutaan liukoiseksi TNF-R-molekyyliksi, jolla on tallella kykynsä sitoa TNF:ää. Erityisen edullinen liukoinen TNF-R-rakenne on TNF-R-delta-235 (aminohappojen 1 - 235 sekvenssi kuviossa 2), joka käsittää TNF-R:n solunulkoisen alueen kokonaisuudessaan päättyen Asp235:een välittömästi 20 transmembraanialueen vieressä. Lisää aminohappoja voidaan deletoida transmembraanialueelta säilyttäen TNF:ää sitova aktiivisuus. Esimerkiksi hu-TNF-R-delta-183:11a, joka kä-sittää aminohappojen 1 - 183 sekvenssin kuviossa 2, ja TNF-R-delta-163:11a, joka käsittää aminohappojen 1 - 163 t · · • 25 sekvenssin kuviossa 2, on tallella kyky sitoa TNF-ligandi, '·*.* mikä määritetään käyttäen alla esimerkissä 1 kuvattuja si- • · * ·...* toutumismäärityksiä. TNF-R-delta-142:11a ei kuitenkaan ole tallella kykyä sitoa TNF-ligandia. Tämä viittaa siihen, : että jompikumpi tai kumpikin tähde Cys157 ja Cys163 on vält- 30 tämätön molekyylinsisäisen disulfidisillan muodostamiseksi TNF-R: n laskostamiseksi oikein. Cys , joka deletoitiin .···, ilman mitään ilmeistä kielteistä vaikutusta liukoisen TNF- ’·' R:n kykyyn sitoa TNF:ää, ei vaikuta välttämättömältä TNF- * ' R:n laskostamiseksi oikein. Täten minkä tahansa deleetion, 35 joka on C-pään puolella Cys163:een nähden, voitaisiin olet- • · · 108645 17 taa johtavan biologisesti aktiiviseen liukoiseen TNF-R:ään. Esillä oleva keksintö koskee tällaisia liukoisia TNF-R-rakenteita, jotka vastaavat kokonaisuudessaan tai osittain TNF-R:n solunulkoista aluetta päättyen mihin 5 tahansa aminohappoon Cys163:n jälkeen. Muita C- päädeleetioita, kuten TNF-R-delta-157, voidaan tehdä kätevästi leikkaamalla TNF-R-cDNA:ta tarkoituksenmukaisilla restriktioentsyymeillä ja tarvittaessa rakentamalla uudestaan spesifisiä sekvenssejä käyttäen synteettisiä oligo-10 nukleotidiliittäjia. Saadut liukoiset TNF-R-rakenteet in- sertoidaan sitten ja ilmennetään tarkoituksenmukaisissa ilmennysvektoreissa ja määritetään niiden kyky sitoa TNF:ää, kuten kuvataan esimerkissä 1. Biologisesti aktiiviset liukoiset TNF-R:t, jotka saadaan tällaisista raken-15 teista, katsotaan myös esillä olevan keksinnön piiriin kuuluviksi.TNF-R subunits can be constructed by deleting residues or sequences located at 10 ends or internal. Particularly preferred sequences are those in which the transmembrane region and the intracellular region of TNF-R are deleted or substituted by hydrophilic residues to facilitate receptor secretion into the cell culture medium. The resulting protein 15 is called a soluble TNF-R molecule that retains its ability to bind TNF. A particularly preferred soluble TNF-R construct is TNF-R-delta-235 (amino acid sequence 1-23 in Figure 2), which comprises the entire extracellular region of TNF-R terminating in Asp235 immediately adjacent to the 20 transmembrane regions. Additional amino acids can be deleted from the transmembrane region while maintaining TNF binding activity. For example, hu-TNF-R-delta-183 comprising the sequence of amino acids 1-183 in Figure 2 and TNF-R-delta-163 comprising the sequence of amino acids 1-163 of Figure 2 , has the ability to bind TNF ligand, '· *. * as determined using the binding assays described in Example 1 below. However, TNF-R-delta-142 does not retain the ability to bind TNF ligand. This suggests that either or both Cys157 and Cys163 residues are essential for the formation of an intramolecular disulfide bridge for the proper folding of TNF-R. Cys, which was deleted. ···, without any apparent negative effect on the ability of soluble TNF-′ R to bind TNF, does not appear to be necessary for the correct folding of TNF-′ R. Thus, any deletion 35 at the C-terminus relative to Cys163 could be expected to result in biologically active soluble TNF-R. The present invention relates to such soluble TNF-R constructs which correspond wholly or partially to the extracellular domain of TNF-R terminating at any of 5 amino acids after Cys163. Other C major deletions, such as TNF-R-delta-157, can be conveniently made by digesting TNF-R cDNA with appropriate restriction enzymes and, if necessary, rebuilding specific sequences using synthetic oligo-10 nucleotide linkers. The resulting soluble TNF-R constructs are then inserted and expressed in appropriate expression vectors and assayed for their ability to bind TNF as described in Example 1. Biologically active soluble TNF-Rs derived from such constructs are also contemplated herein. within the scope of the invention.
Mutaatioiden nukleotidisekvensseissä, jotka on rakennettu analogi-TNF-R:n ilmentämiseksi, on luonnollisesti säilytettävä koodisekvenssien lukualuevaihe ja edullisesti 20 ne eivät muodosta komplementaarisia alueita, jotka voisivat hybridisoitua tuottaen sekundaarisia mRNA-rakenteita, kuten silmukoita tai hiussilmiä, joilla olisi kielteinen . . vaikutus reseptori-mRNA:n luentaan. Vaikka mutaatiokohta ; voidaan määrittää ennalta, ei ole tarpeen, että mutaation • ·’ 25 luonne sinänsä määritetään ennalta. Esimerkiksi optimiomi- a ·.*.* naisuuksien valitsemiseksi mutanteille tietyssä kohdassa • aa voidaan suorittaa kohdekodonin satunnaismutatointi ja seu- a a a loa ilmennetyt TNF-R-mutantit halutun aktiivisuuden suh-teen.Naturally, the mutation nucleotide sequences constructed to express analog TNF-R must retain the reading sequence step of the code sequences, and preferably do not form complementary regions that could hybridize to produce secondary mRNA structures, such as loops or hair eyes. . effect on receptor mRNA reading. Although the mutation site; can be predetermined, it is not necessary that the nature of the mutation itself is predetermined. For example, the optimization of?. *. * Mutants at a particular site? Aa can be subjected to random mutation of the target codon and followed by the expression of the TNF-R mutants for the desired activity.
30 Kaikki mutaatiot TNF-R:ää koodittavassa nukleoti- disekvenssissä eivät ilmenny lopputuotteessa, esimerkiksi ,···, nukleotidisubstituutioita voidaan tehdä ilmennyksen tehos- "* tamiseksi, ensisijaisesti sekundaaristen rakennesilmukoi- ’**’ den välttämiseksi kopioidussa mRNArssa (katso EP-A- *”” 35 75 444A, joka sisällytetään tähän viitteeksi), tai kodo- i a a 18 108645 nien saamiseksi, jotka valittu isäntä helpommin lukee, esim. hyvin tunnetut Eh_ coli ensisijaisuuskodonit ilmennykseen Jh, colissa.Not all mutations in the nucleotide sequence encoding TNF-R are expressed in the final product, for example, ···, nucleotide substitutions may be made to enhance expression, primarily to avoid secondary structural loops in the copied mRNA (see EP-A- * "" 35 75 444A, which is incorporated herein by reference), or codon 18 108645 to obtain those which are easier to read by the selected host, e.g.
Mutaatioita voidaan tehdä nimenomaisiin kohtiin 5 syntetisoimalla oligonukleotideja, jotka sisältävät mu- tanttisekvenssin, jota sivuavat restriktiokeskukset, jotka mahdollistavat fragmenttien ligatoinnin natiiviin sekvenssiin. Ligatoinnin jälkeen saatu uudelleenrakennettu sekvenssi koodittaa analogia, jossa on haluttu aminohappoin-* 10 sertio, -substituutio tai -deleetio.Mutations can be made at specific sites 5 by synthesizing oligonucleotides containing a mutant sequence flanked by restriction sites which allow the fragments to be ligated to the native sequence. The rebuilt sequence obtained after ligation encodes an analog with the desired amino acid * 10 series, substitution, or deletion.
Vaihtoehtoisesti oligonukleotidiohjattuja paikka-spesifisiä mutatointimenettelyjä voidaan käyttää muutetun geenin saamiseksi, jossa tiettyjä kodoneja on muutettu tarvittavan substituution, deleetion tai insertion mukai-15 sesti. Esimerkkimenetelmiä edellä esitettyjen muutosten tekemiseksi julkistavat Walder et ai. (Gene 42 (1986) 133); Bauer et ai. (Gene 37 (1985) 73); Craik (BioTechn- iques 1985:tammikuu 12 - 19); Smith et ai. ("Genetic Eng- ineering: Principles and Methods", Plenum Press, 1981); ja 20 US-patenttijulkaisuissa 4 518 584 ja 4 737 462 jul kistetaan sopivia tekniikoita, ja nämä sisällytetään tähän viitteiksi.Alternatively, oligonucleotide-directed site-specific mutation procedures may be used to obtain a modified gene in which certain codons have been altered according to the required substitution, deletion or insertion. Exemplary methods for making the above modifications are disclosed by Walder et al. (Gene 42: 133 (1986)); Bauer et al. (Gene 37: 73 (1985)); Craik (BioTechnologies 1985: January 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); and U.S. Patent Nos. 4,518,584 and 4,737,462 disclose suitable techniques and are incorporated herein by reference.
, . TNF-R:n sekä yksivalenssiset muodot että moniva- *' lenssiset muodot ovat käyttökelpoisia tämän keksinnön mu- : ·’ 25 kaisissa koostumuksissa ja menetelmissä. Monivalenssisissa • · muodoissa on useita TNF-R-sitoutumiskohtia TNF-ligandille.,. Both monovalent forms and polyvalent forms of TNF-R are useful in the compositions and methods of this invention. Multivalent forms of · · have multiple TNF-R binding sites for TNF ligand.
•.>t: Esimerkiksi kaksivalenssinen liukoinen TNF-R voi : koostua kahdesta peräkkäisestä toistosta aminohappoja 1 - 235 kuviossa 2, joita erottaa liittosekvenssialue. Vaih-30 toehtoisia monivalenssisia muotoja voidaan niinikään ra-kentaa esimerkiksi kemiallisesti liittämällä TNF-R mihin • · #...i tahansa kliinisesti hyväksyttävään kantomolekyyliin, poly- meeriin, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Ficoll, polyetyleeniglykoli tai dekstraani, käyttäen tavanomaisia ’F" 35 kytkemistekniikoita. Vaihtoehtoisesti TNF-R voidaan ke- I > » i 19 108645 miallisesti kytkeä biotiiniin, minkä jälkeen biotiini-TNF-R-konjugaatin annetaan sitoutua avidiiniin, jolloin saadaan nelivalenssisia avidiini/biotiini/TNF-R-molekyylejä.For example: bivalent soluble TNF-R may: consist of two consecutive repeats of amino acids 1 through 235 in Figure 2 separated by a fusion sequence region. Alternative polyvalent forms of step-30 can also be constructed, for example, by chemical attachment of TNF-R to any clinically acceptable carrier molecule, a polymer selected from the group consisting of Ficoll, polyethylene glycol or dextran, using conventional 'F Alternatively, TNF-R may be chemically coupled to biotin, after which the biotin-TNF-R conjugate is allowed to bind to avidin to give quaternary avidin / biotin / TNF-R molecules.
TNF-R voidaan myös liittää kovalenttisesti dinitrofenoliin 5 (DNP) tai trinitrofenoliin (TNP) ja saatu konjugaatti sa-ostaa anti-DNP:llä tai anti-TNP-IgM:llä dekameeristen kon-jugaattien muodostamiseksi, joiden valenssi TNF-R-si-toutumiskeskusten suhteen on 10.TNF-R may also be covalently linked to dinitrophenol 5 (DNP) or trinitrophenol (TNP) and the resulting conjugate purchased with anti-DNP or anti-TNP-IgM to form decameric conjugates having a TNF-R there are 10 in the case of healing centers.
Voidaan samoin muostaa kimeerinen yhdistelmä-DNA-10 vasta-ainemolekyyli, jossa on TNF-R-sekvensseillä substi-tuoitu vaihtuvia alueita immunoglobuliinimolekyylin joko raskaassa tai kevyessä ketjussa tai molemmissa ja jossa on ei-modifioituja pysyvä alue -alueita. Esimerkiksi kimeerinen TNF-R/IgGi voidaan tuottaa kahdesta kimeerisestä 15 geenistä: TNF-R/humaani-kappa-kevyt ketju-kimeeristä (TNF-R/ C kappa) ja TNF-R/humaani-gammai-raskas ket ju-kimeeristä (TNF-R/Cgamma-i) · Kahden kimeerisen geenin kopioinnin ja luennan jälkeen geenituotteet kokoontuvat yhdeksi kimeeri-seksi vasta-ainemolekyyliksi, jossa TNF-R esiintyy kaksi-20 valenssisesti. Tällaisilla monivalenssisilla TNF-R-muo-doilla voi olla tehostunut sitoutumisaffiniteetti TNF-li-gandille. Lisää yksityiskohtia koskien tällaisten ki-. . meeristen vasta-ainemolekyylien rakentamista julkistetaan ;t ; patenttijulkaisuissa WO 89/09622 ja EP-315 062.Similarly, a recombinant chimeric antibody-10 antibody molecule having variable regions substituted by TNF-R sequences in either the heavy or light chain of the immunoglobulin molecule, or both, and having non-modified constant regions may be formed. For example, chimeric TNF-R / IgGi can be produced from two chimeric 15 genes: TNF-R / human-kappa-light chain-chimera (TNF-R / C kappa) and TNF-R / human-gamma-heavy chain ju-chimeric (TNF). -R / Cgamma-i) · After duplication and reading of two chimeric genes, the gene products assemble into a single chimeric antibody molecule in which TNF-R is present at a valence of two to 20. Such multivalent forms of TNF-R may have enhanced binding affinity for TNF-ligand. For more details regarding such ki-. . construction of meric antibody molecules disclosed; WO 89/09622 and EP 315 062.
·’ 25 Yhdistelmä-DNA-TNF-R: n ilmennys • · TNF-R:ää koodittavan DNA:n vahvistamiseksi tai il- • « ♦ mentämiseksi voidaan käyttää yhdistelmä-DNA-ilmennys-vektoreita. Yhdistelmä-DNA-ilmennysvektorit ovat replikoi-tuvia DNA-rakenteita, joissa on synteettisiä tai cDNA-30 peräisiä DNA-fragmentteja, jotka koodittavat nisäkäs-TNF-R:ää tai bioekvivalenttisia analogeja ja jotka on opera- » » t···, tiivisesti kytketty sopiviin kopiointia tai luentaa sääte- leviin yksiköihin, jotka ovat peräisin nisäkäs-, mikrobi-, ’*"· virus- tai hyönteisgeeneistä. Kopiointiyksikkö käsittää 35 yleensä yhdistelmän, jossa on (1) yksi tai useampi geneet- » · · » I t » 108645 20 tinen yksikkö, jolla on säätelevä osa geeni-ilmennyksessä, esimerkiksi kopiointipromoottorit tai -tehostimet, (2) rakenne- tai koodisekvenssi, joka kopioidaan mRNArksi ja luetaan proteiiniksi, ja (3) tarkoituksenmukaisia kopioin-5 nin ja luennan käynnistäviä ja päättäviä sekvenssejä, ku ten kuvataan yksityiskohtaisesti alla. Tällaiset säätöyk-siköt voivat käsittää operaattorisekvenssin kopioinnin kontrolloimiseksi, joka sekvenssi koodittaa sopivia mRNA-ribosomisitoutumiskeskuksia. Kyky replikoitua isännässä, 10 tavallisesti replikaatioalkukohdan mukanaan tuomana, ja valikointigeeni transformanttien tunnistuksen helpottamiseksi voi niinikään sisältyä mukaan. DNA-alueet ovat operatiivisesti kytketyt, kun ne funktionaalisesti liittyvät toisiinsa. Esimerkiksi signaalipeptidin DNA (eritysjoh-15 tosekvenssi) on operatiivisesti kytketty polypeptidin DNAihan, jos se ilmentyy prekursorina, joka osallistuu polypeptidin eritykseen; promoottori on operatiivisesti kytketty koodisekvenssiin, jos se kontrolloi sekvenssin kopiointia; tai ribosomisitoutumiskeskus on operatiivisesti 20 kytketty koodisekvenssiin, jos se on sijoitettu siten, et tä luenta on mahdollista. Yleensä operatiivisesti kytketty merkitsee jatkuvaa, ja eritysjohtosekvenssien kohdalla . . jatkuvaa ja lukualueella olevaa. Hiivailmennyssysteemeissä '' ‘ käytettäviksi tarkoitettuihin rakenneyksiköihin kuuluu • · · • ·' 25 edullisesti johtosekvenssi, jonka ansiosta isäntäsolu voi • · V." erittää ulkopuolelleen luetun proteiinin. Vaihtoehtoisesti • · · ilmennettäessä yhdistelmä-DNA-proteiini ilman johto- tai kuljetussekvenssiä se voi käsittää N-päämetioniinitähteen.Recombinant TNF-R Expression Recombinant expression vectors can be used to amplify or express the DNA encoding TNF-R. Recombinant DNA expression vectors are replicable DNA constructs containing synthetic or cDNA-30-derived DNA fragments encoding mammalian TNF-R or bioequivalent analogues that are operatively linked. linked to appropriate transcriptional or translational regulatory units derived from mammalian, microbial, '* "· viral or insect genes. The transcriptional unit typically comprises a combination of (1) one or more genetic» · · »I t »108645 20 unit having a regulatory role in gene expression, for example, copy promoters or enhancers, (2) a structural or coding sequence that is copied to mRNA and read as a protein, and (3) appropriate copy-initiation and termination sequences as described in more detail below, such control units may comprise an operator sequence for controlling duplication which encodes suitable sequences mRNA ribosome binding centers The ability to replicate in a host, usually provided with the origin of replication, and a selection gene to facilitate the identification of transformants may also be included. DNA regions are operatively linked when functionally linked to one another. For example, the signal peptide DNA (secretion leader sequence) is operably linked to the polypeptide DNA if it is expressed as a precursor that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter is operably linked to a coding sequence if it controls the copy of the sequence; or the ribosome binding center is operably linked to a code sequence if it is positioned so that it is readable. Usually operatively linked means continuous, and for secretory lead sequences. . continuous and within the reading range. The structural units for use in yeast expression systems' '' preferably include a leader sequence that allows the host cell to secrete a read protein. Alternatively, when expressed, the recombinant protein without the leader or transport sequence may comprise: n-päämetioniinitähteen.
Tämä tähde voidaan mahdollisesti sittemmin lohkaista il- • * · 30 mennetystä yhdistelmä-DNA-proteiinista lopputuotteen saa-miseksi.This residue may subsequently be cleaved from the lost * * 30 recombinant protein to yield the final product.
• · ... DNA-sekvenssit, jotka koodittavat nisäkäs-TNF-re- septoreita, jotka on määrä ilmentää mikro-organismissa, eivät edullisesti sisällä introneja, jotka saattaisivat 35 ennenaikaisesti päättää DNA:n kopioinnin mRNA:ksi; kuiten-· · ... DNA sequences encoding mammalian TNF receptors to be expressed in a microorganism preferably do not contain introns that could prematurely terminate DNA copy to mRNA; However,
I · I » II · I »I
108645 21 kin kopioinnin ennenaikainen päättyminen voi olla toivottavaa esimerkiksi silloin, kun se johtaisi mutantteihin, joissa on edullisia C-päätypistyksiä, esimerkiksi trans-membraanialueen deleetio liukoisen reseptorin saamiseksi, 5 joka ei ole sitoutunut solumembraaniin. Koodin degeneraat-tiluonteen johdosta saattaa ilmetä huomattavaa vaihtelua nukleotidisekvensseissä, jotka koodittavat samaa aminohapposekvenssiä. Muita suoritusmuotoja ovat sekvenssit, jotka kykenevät hybridisoitumaan annetun cDNA:n sekvensseihin ‘ 10 kohtuullisen ankarissa olosuhteissa (50 °C, 2x SSC), ja muita sekvenssejä, jotka hybridisoituvat biologisesti aktiivisia TNF-reseptoripolypeptidejä koodittaviin tai ovat degeneroituneita mainittuihin nähden.108645 21 premature termination of transcription may also be desirable, for example, when it would lead to mutants with advantageous C-terminal inserts, such as deletion of the trans membrane region to obtain a soluble receptor that is not bound to the cell membrane. Due to the degenerate character of the code, considerable variation in nucleotide sequences encoding the same amino acid sequence may occur. Other embodiments include sequences that are capable of hybridizing to sequences of a given cDNA under moderately stringent conditions (50 ° C, 2x SSC), and other sequences that hybridize to or are degenerate with biologically active TNF receptor polypeptides.
Yhdistelmä-DNA-TNF-R-DNA ilmennetään tai vahviste-15 taan yhdistelmä-DNA-ilmennyssysteemissä, joka käsittää oleellisesti homogeenisen sopivan isäntämikro-organismin puhdasviljelmän, esimerkiksi bakteerista kuten |h_ colista tai hiivasta kuten S^_ cerevisiaestä, jotka ovat stabiilista integroineet (transformoinnin tai transfektoinnin 20 tuloksena) yhdistelmä-DNA-kopiointiyksikön kromosomi-DNA:han tai jotka käsittävät yhdistelmä-DNA-kopiointiyk-sikön läsnä olevan plasmidin rakenneosana. Yleensä sys-. . teemin muodostavat solut ovat yhden kantatransformantin ;* ; jälkeläisiä. Tässä määritellyt yhdistelmä-DNA-ilmennyssys- • · · • ·* 25 teemit ilmentävät heterologisen proteiinin, kun ilmennet- • · tävään DNA-sekvenssiin tai synteettiseen geeniin kytketyt säätöyksiköt indusoidaan.The recombinant TNF-R DNA is expressed or amplified in a recombinant DNA expression system comprising a substantially homogeneous culture of a suitable host microorganism, for example, from a bacterium such as H1 -Col or a yeast such as S-Cerevisiae which has been stably integrated ( as a result of transformation or transfection) into the chromosomal DNA of the recombinant copy unit or comprising the plasmid as an integral part of the plasmid present. Usually sys-. . the cells forming the theme are one strain transformant; *; offspring. The recombinant DNA expression themes defined herein express a heterologous protein when inducing regulatory units linked to the expressed DNA sequence or synthetic gene.
: *. Transformoidut isäntäsolut ovat soluja, jotka on ·/“: transformoitu tai transfektoitu TNF-R-vektoreilla, jotka 30 on rakennettu käyttäen yhdistelmä-DNA-tekniikoita. Trans-formoidut isäntäsolut ilmentävät tavallisesti TNF-R:n, • » S··' mutta isäntäsolujen, jotka on transformoitu TNF-R-DNA:n kloonaus- tai monistustarkoituksessa, ei tarvitse ilmentää '·' · TNF-R:ää. Ilmennetty TNF-R varastoituu solumembraaniin tai 35 tulee eritetyksi viljelmäsupernatanttiin riippuen väli- * > » I » · i i i • · 22: *. Transformed host cells are cells that have been transformed or transfected with TNF-R vectors constructed using recombinant DNA techniques. Transformed host cells normally express TNF-R, • S ·· ', but host cells transformed for TNF-R DNA cloning or amplification purposes do not need to express' ·' · TNF-R. The expressed TNF-R is either stored in the cell membrane or secreted into the culture supernatant, depending on the medium.
1 ö 8 6 4 S1 8 8 6 4 S
I tusta TNF-R-DNA:sta. Sopivia isäntäsoluja nisäkäs-TNF-R:n ilmentämiseksi ovat prokaryootit, hiiva- tai korkeammat eukaryoottiset solut tarkoituksenmukaisten promoottorien kontrollissa. Prokaryootteihin lukeutuu gram-negatiivisia 5 tai gram-positiivisia organismeja, esimerkiksi EL_ coli tai basillit. Korkeampia eukaryoottisia soluja ovat nisä-käsalkuperää olevat vakiintuneet solulinjat kuten alla kuvataan. Soluja sisältämättömiä luentasysteemejä voitaisiin niinikään käyttää nisäkäs-TNF-R:n tuottamiseksi käyttäen 10 RNA-sekvenssejä, jotka on saatu edellä kuvatuista DNA-rakenteista. Tarkoituksenmukaisia kloonaus- ja ilmennys-vektoreita käytettäviksi bakteeri-, sieni-, hiiva- ja ni-säkässoluisäntien kanssa kuvaavat Pouwels et ai. ("Cloning Vectors: A Laboratory Manual", Elsevier, New York, 1985), 15 jonka oleellinen julkistus sisällytetään tähän viitteeksi.TNF-R DNA. Suitable host cells for expression of mammalian TNF-R are prokaryotes, yeast or higher eukaryotic cells under the control of appropriate promoters. Prokaryotes include gram-negative 5 or gram-positive organisms, for example EL_coli or bacilli. Higher eukaryotic cells include established cell lines of mammalian origin as described below. Cell-free reading systems could also be used to produce mammalian TNF-R using 10 RNA sequences derived from the DNA constructs described above. Appropriate cloning and expression vectors for use with bacterial, fungal, yeast and mammalian cell hosts are described by Pouwels et al. ("Cloning Vectors: A Laboratory Manual", Elsevier, New York, 1985), 15 the relevant disclosure of which is incorporated herein by reference.
Prokaryoottisia ilmennysisäntiä voidaan käyttää TNF-R:n ilmentämiseksi, joka ei tarvitse laajamittaista proteolyysi- ja disulfidiprosessointia. Prokaryoottiset ilmennysvektorit käsittävät yleensä yhden tai useamman fe- 20 notyyppivalikointimerkin, esimerkiksi geenin, joka koo- dittaa proteiineja, jotka tuovat antibioottiresistenssin, tai täyttävät autotrofiavaatimuksen, sekä isännän tunnis- . . tämän replikaatioalkukohdan vahvistuksen isännässä varmis- • · • · · ; tamiseksi. Sopivia prokaryoottisia isäntiä transformoin- • · t : ·' 25 tiin ovat E. coli, Bacillus subtilis. Salmonella tvphimu- • * ·.*.* rium ja eri lajit suvuista Pseudomonas, Streptomyces ja • < · **,,,· Staphylococcus, vaikka valinnan mukaan voidaan käyttää • · · : *. muitakin.Prokaryotic expression hosts can be used to express TNF-R, which does not require extensive proteolysis and disulfide processing. Prokaryotic expression vectors generally comprise one or more phenotype selection markers, for example, a gene encoding proteins that confer antibiotic resistance or fulfill an autotrophic requirement, as well as a host identifier. . the confirmation of this replication origin in the host • · • · ·; tamiseksi. Suitable prokaryotic hosts for transformation include: E. coli, Bacillus subtilis. Salmonella tvphimu- • * ·. *. * Rium and various species of the genus Pseudomonas, Streptomyces and • <· ** ,,, · Staphylococcus, although optional may be used. other.
• t I• t I
Bakteerikäyttöön käyttökelpoiset ilmennysvektorit 30 voivat käsittää valikointimerkin ja bakteeriperäisen rep-likaatioalkukohdan, joka on saatu kaupallisesti saatavina .··, olevista plasmideista ja joka käsittää geeniyksiköitä hy- T vin tunnetusta kloonausvektorista pBR322 (ATCC 37017).Useful expression vectors for bacterial use 30 may comprise a selection marker and a bacterial origin of replication obtained from commercially available ··· plasmids comprising gene units from the well known cloning vector pBR322 (ATCC 37017).
• · Tällaisia kaupallisia vektoreita ovat esimerkiksi pKK223-3 'F*: 35 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) ja pGEMl (Pro- » * »Such commercial vectors include, for example, pKK223-3 'F *: 35 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and pGEM1 (Pro- *).
» I»I
108645 23 mega Biotec, Madison, WI, USA). Nämä pBR322-"runko"-osat yhdistetään tarkoituksenmukaiseen promoottoriin ja ilmennettävään rakennesekvenssiin. JL_ coli transformoidaan tyypillisesti käyttäen pBR322-johdannaisia, joka plasmidi 5 saadaan EL_ coli -lajista (Bolivar et ai ♦, Gene 2 (1977) 95). pBR322 sisältää geenit ampisilliini- ja tetrasyklii-niresistenssille ja antaa siten yksinkertaisen keinon transformoitujen solujen tunnistamiseksi.108645 23 mega Biotec, Madison, WI, USA). These pBR322 "backbone" portions are linked to the appropriate promoter and the expressed structural sequence. JL-coli is typically transformed using pBR322 derivatives obtained from plasmid 5 from EL-coli (Bolivar et al., Gene 2 (1977) 95). pBR322 contains genes for ampicillin and tetracycline resistance and thus provides a simple means for identifying transformed cells.
Yhdistelmä-DNA-mikrobi-ilmennysvektoreissa tavan-10 omaisesti käytettyjä promoottoreita ovat β-laktamaasi-(penisillinaasi-) ja laktoosipromoottorisysteemi (Chang et ai., Nature 275 (1978) 615; ja Goeddel et ai., Nature 281 (1979) 544), tryptofaani- (trp-) promoottorisysteemi (Goeddel et ai,, Nucl.Acids Res. 8^ (1980) 4057; ja EP-A-15 36 776) sekä tac-promoottori (Maniatis, "Molecular Clon ing: A Laboraroty Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 412). Erityisen käyttökelpoisessa bakteeri-ilmen-nyssysteemissä käytetään lambdafagi-PL-promoottoria ja lä-mpölabiilia cl857ts-repressoria. Talletuslaitoksesta the 20 American Type Culture Collection saatavana olevia plasmidi vektoreita, jotka sisältävät lambda-PL-promoottorijohdannaisia, ovat plasmidi pHUB2, joka on läsnä EL_ coli . . -kannassa JMB9 (ATCC 37092) , ja pPLc28, joka on läsnä f EL coli RRl: ssä (ATCC 53082) .Conventional promoters used in recombinant microbial expression vectors include the β-lactamase (penicillinase) and lactose promoter system (Chang et al., Nature 275 (1978) 615; and Goeddel et al., 1979, Nature 281: 544). , the tryptophan (trp) promoter system (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057 (1980); and EP-A-15 36 776); and the tac promoter (Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboraroty Manual ", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 412). A particularly useful bacterial expression system utilizes the lambda-phage PL promoter and the heat lab cl857ts repressor. Plasmid vectors available from the 20 American Type Culture Collection containing lambda-PL promoter derivatives are plasmid pHUB2 present in EL_coli. . strain JMB9 (ATCC 37092), and pPLc28 present in f EL coli RR1 (ATCC 53082).
♦ » · : ·’ 25 Yhdistelmä-DNA-TNF-R-proteiineja voidaan niinikään « · ·.*.* ilmentää hiivaisännissä, edullisesti Saccharomyces-lajis- i i · :,t,: ta, kuten S_^ cerevisiaessä. Voidaan käyttää muidenkin su- : _*· kujen hiivoja, kuten Pichia tai Kluyveromyces. Hiivavek- torit sisältävät yleensä replikaatioalkukohdan 2p-hiiva-30 plasmidista tai autonomisesti replikoituvan sekvenssin (ARS), promoottorin, TNF-R:ää koodittavan DNA:n, sekvens-sit polyadenylaatiolle sekä kopioinnin lopettamiseksi, ja valikointigeenin. Edullisesti hiivavektoreissa on repli-· kaatioalkukohta ja valikointimerkki, jotka mahdollistavat 35 transformoinnin sekä hiivaan että EL_ coliin, esim. ampi- i t % t * l t ft I )The recombinant TNF-R proteins can also be expressed in yeast hosts, preferably Saccharomyces, such as S. cerevisiae. Other yeasts such as Pichia or Kluyveromyces may also be used. Yeast vectors generally contain an origin of replication from the 2β yeast plasmid or an autonomously replicating sequence (ARS), a promoter, DNA encoding TNF-R, sequences for polyadenylation and termination of transcription, and a select gene. Preferably, the yeast vectors have a replication origin and a selection mark that allow transformation into both yeast and EL_coli, e.g., amp% t * l t ft I)
I t II t I
a t*a t *
I II I
24 108645 silliiniresistenssigeenin Eh_ colista ja cerevisiaestä TRP1- tai URA3-geenin, josta saadaan valikointimerkki hiivan mutanttikannalle, jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofäänillä, sekä promoottorin, joka on peräisin voimakkaasti 5 ilmentyvästä hiivageenistä, alavirran rakennesekvenssin kopioinnin indusoimiseksi. TRP1- tai URA3-puutoksen esiintymisestä hiivaisäntäsolugenomissa saadaan sitten tehokas ympäristö transformoinnin toteamiseksi kasvusta tryptofaa-nin tai urasiilin puuttuessa.24 of the E86 colin of the silicin resistance gene and the cerevisiae TRP1 or URA3 gene, which provides a selectable marker for a downstream structural sequence copy of a yeast mutant strain lacking the ability to grow with tryptophan and a highly expressed yeast gene. The presence of TRP1 or URA3 deficiency in the yeast host cell genome then provides an effective environment for detecting transformation from growth in the absence of tryptophan or uracil.
10 Sopivia promoottorisekvenssejä hiivavektoreihin ovat promoottorit metallotioneiinille, 3-fosfoglyseraat-tikinaasille (Hitzeman et ai., J.Biol.Chem. 255 (1980) 2073) tai muille glykolyyttisille entsyymeille (Hess et ai. , J. Adv. Enzyme Reg. Ί_ (1968) 149; ja Holland et ai., 15 Biochem. 17 (1978) 4900), kuten enolaasi, glyseraldehydi- 3-fosfaattidehydrogenaasi, heksokinaasi, pyruvaattidekar-boksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi-6-fosfaatti-iso-meraasi, 3-fosfoglyseraattimutaasi, pyruvaattikinaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja 20 glukokinaasi. Sopivia vektoreita ja promoottoreita käytettäviksi hiiva-ilmennyksessä kuvataan edelleen julkaisussa R. Hitzeman et ai. EP-A-73 657.Suitable promoter sequences for yeast vectors include promoters for metallothionein, 3-phosphoglycerate kinase (Hitzeman et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 2073) or other glycolytic enzymes (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 1968, 149; and Holland et al., 15 Biochem., 17, 4900 (1978)) such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphate , pyruvate kinase, triose phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are further described in R. Hitzeman et al. EP-A-73,657.
, . Edullisia hiivavektoreita voidaan koota käyttäen j’ i* DNA-sekvenssejä pUC18:sta valikointiin ja replikaatioon : ·* 25 Eh_ colissa (Ampr-geeni ja replikaatioalkukohta) ja hiiva- DNA-sekvenssejä, joihin kuuluu glukoosirepressoituva ADH2-promoottori ja α-tekijäeritysjohtosekvenssi. ADH2-promoot-; ; toria ovat kuvanneet Russell et ai. (J. Bio!.Chem. 258 (1982) 2674) ja Beier et ai. (Nature 300 1982 724) . Hiiva-30 α-tekijäjohtosekvenssi, joka ohjaa heterologisten pro-teiinien eritystä, voidaan insertoida promoottorin ja il-.mennettävän rakennegeenin väliin. Katso esim. Kurjan et ‘I* ai., Cell 30 (1982) 933; ja Bitter et ai., Proc.Natl. -,. Preferred yeast vectors can be assembled using j1 * DNA sequences from pUC18 for selection and replication: · * 25 in E1 coli (Ampr gene and origin of replication) and yeast DNA sequences including the glucose-repressing ADH2 promoter and α-factor secretion. ADH2 promoter; ; the market has been described by Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674 (1982)) and Beier et al. (Nature 300 1982 724). The yeast 30 α-factor leader sequence that directs secretion of heterologous proteins can be inserted between the promoter and the structural gene to be expressed. See, e.g., Kurjan et al., Cell 30 (1982) 933; and Bitter et al., Proc.Natl. -
Acad.Sci. USA 81 (1984) 5330) . Johtosekvenssiä voidaan mo-*:*': 35 difioida sisältämään lähellä 3’-päätään yhden tai useamman I * » 108645 25 käyttökelpoisen restriktiokeskuksen johtosekvenssin fuusion vierasgeeneihin helpottamiseksi.Acad. USA 81: 5330 (1984)). The leader sequence may be mo-*: * ': 35 diffused to include, near its 3'-end, one or more useful restriction sites to facilitate fusion of the leader sequence to the foreign genes.
Sopivia hiivatransformointiprotokollia on alan ammattilaisten tiedossa; esimerkkitekniikkaa kuvaavat Hinnen 5 et ai. , Proc.Natl.Aca.Sei. USA 75 (1978) 1929, jonka mu kaan Trp+-transformantit valitaan selektiivisessä kasvualustassa, joka sisältää 0,67 % hiivatyppiemästä, 0,5 % kasaminohappoja, 2 % glukoosia, 10 pg/ml adeniinia ja 20 pg/ml urasiilia, tai URA+-transformantit kasvualustas-10 sa, joka sisältää 0,67 % YNB:tä, käyttäen aminohappoja ja emäksiä kuten ovat kuvanneet Sherman et ai., "Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986.Suitable yeast transformation protocols are known to those skilled in the art; exemplary techniques are described in Price 5 et al. , Proc.Natl.Aca.Sei. USA 75, 1929 (1978), according to which Trp + transformants are selected in selective medium containing 0.67% yeast nitrogen base, 0.5% casino acids, 2% glucose, 10 pg / ml adenine and 20 pg / ml uracil, or URA + - transformants in growth medium 10 containing 0.67% YNB using amino acids and bases as described by Sherman et al., "Cold Spring Harbor Laboratory, Manual of Methods in Yeast Genetics," Cold Spring Harbor, New York , 1986.
Isäntäkantoja, jotka on transformoitu ADH2-15 promoottorin käsittävillä vektoreilla, voidaan kasvattaa ilmennettäviksi rikkaassa kasvualustassa, joka sisältää 1 %:n hiivauutetta, 2 % peptonia, ja 1 %:n tai 4 % glukoosia ja jota on täydennetty 80 pg:lla/ml adeniinia ja 80 pg:lla/ml urasiilia. ADH2-promoottorin derepressio tapah-20 tuu kasvualustaglukoosin loppuessa. Epäpuhtaat hiivasu- pernatantit otetaan talteen suodattamalla ja niitä pidetään 4 °C:ssa ennen jatkopuhdistusta.Host strains transformed with vectors comprising the ADH2-15 promoter can be grown for expression in rich medium containing 1% yeast extract, 2% peptone, and 1% or 4% glucose supplemented with 80 pg / ml adenine and 80 pg / ml uracil. Derepression of the ADH2 promoter occurs at the end of substrate glucose. The crude yeast supernatants are recovered by filtration and stored at 4 ° C before further purification.
, , Erilaisia nisäkäs- tai hyönteissoluviljelysystee- I ·’ mejä käytetään niinikään edullisesti yhdistelmä-DNA-pro- • · · • ·' 25 teiinin ilmentämiseksi. Yhdistelmä-DNA-proteiinien ilmen- • » *.*’.· täminen nisäkässoluissa on erityisen edullista, koska täl- • laiset proteiinit ovat yleensä oikein laskostuneita, tar-koituksenmukaisesti modifioituja ja täysin funktionaali-siä. Esimerkkejä sopivista nisäkäsisäntäsolulinjoista ovat » * · 30 apinan munuaissolujen COS-7-solulinjat, joita kuvaa Gluz-,,,,: man (Cell 23 (1981) 175) , sekä muut solulinjat, jotka ky- ... kenevät ilmentämään tarkoituksenmukaisen vektorin, mukaan i lukien esimerkiksi L-solut, C127-, 3T3-, kiinalaisen hams-terin munasarja- (CHO-) , HeLa- ja BHK-solulinjät. Nisäkäs-35 ilmennysvektorit voivat käsittää ei-kopioituja yksiköitä I » » I i ) i i I < t I * • I · I » 108645 26 kuten replikaatioalkukohta, sopiva promoottori ja tehostin kytkettyinä ilmennettävään geeniin, ja muita sivuavia ei-kopioituja 5'- tai 3'-sekvenssejä, ja ei-luettuja 5'- tai 3'-sekvenssejä, kuten välttämättömät ribosomisitoutumis-5 keskukset, polyadenylaatiokeskus, silmukan luovuttaja- ja vastaanottajakeskukset, ja kopioinninpäätössekvenssit. Katsauksen bakulovirussysteemeistä heterologisten proteiinien tuottamiseksi hyönteissoluissa esittävät Luckow ja Summers, Bio/Technology 6 (1988) 47.Various mammalian or insect cell culture systems are also preferably used to express recombinant protein. Expression of recombinant proteins in mammalian cells is particularly advantageous because such proteins are generally properly folded, appropriately modified, and fully functional. Examples of suitable mammalian host cell lines are the COS-7 cell lines of > 30 monkey kidney cells described by Gluz, ,,,,, man (Cell 23 (1981) 175) and other cell lines capable of expressing the appropriate vector, including, for example, L cells, C127, 3T3, Chinese Hams terrier ovary (CHO), HeLa and BHK cell lines. Mammalian-35 expression vectors may comprise untranslated units I »» I i) I I kuten kuten kuten8686868686 kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten86 kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten kuten8686868686 kuten 3'-sequences, and unread 5'- or 3'-sequences such as essential ribosome binding-5 centers, polyadenylation center, loop donor and recipient centers, and copy decision sequences. A review of baculovirus systems for production of heterologous proteins in insect cells is provided by Luckow and Summers, Bio / Technology 6 (1988) 47.
' ! 10 Kopioinnin ja luennan kontrollisekvenssit ilmen- nysvektoreissa, joita on määrä käyttää selkärankaissolujen transformoimiseksi, voidaan saada viruslähteistä. Esimerkiksi tavanomaisesti käytettyjä promoottoreita ja tehostumia saadaan polyoomasta, adenovirus-2:sta, apinavirus-15 40:stä (SV40) ja ihmisen sytomegaloviruksesta. SV40-virus-genomista saatuja DNA-sekvenssejä, esimerkiksi SV40-alku-kohtaa, varhais- ja myöhäispromoottoria, tehostinta, sil-mukoimis- ja polyadenylaatiokeskuksia voidaan käyttää muiden geneettisten yksiköiden saamiseksi, joita tarvitaan 20 heterologisen DNA-sekvenssin ilmentämiseksi. Varhais- ja myöhäispromoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska molemmat saadaan helposti viruksesta fragmenttina, joka sisältää myös SV40-virusreplikaatioalkukohdan (Fiers et ·.·. ai. , Nature 273 (1978) 113). Pienempiä tai suurempia SV40- *.. *. 25 fragmentteja voidaan niinikään käyttää edellyttäen, että • · ) mukaan sisältyy noin 250 ep:n sekvenssi, joka ulottuu • ·'! Control and copy control sequences in expression vectors to be used to transform vertebrate cells can be obtained from viral sources. For example, commonly used promoters and enhancers are obtained from polyoma, adenovirus-2, monkey-1540 (SV40) and human cytomegalovirus. DNA sequences derived from the SV40 viral genome, for example, the SV40 start site, early and late promoter, enhancer, splice and polyadenylation centers, can be used to obtain other genetic units required for expression of 20 heterologous DNA sequences. Early and late promoters are particularly useful because both are readily obtained from the virus as a fragment which also contains the SV40 viral replication origin (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)). Smaller or larger SV40- * .. *. 25 fragments may also be used provided that a · 250) sequence is included which extends • ·
Hind3-keskuksesta Bqll-keskukseen, joka sijaitsee viruksen '··' replikaatioalkukohdassa. Edelleen nisäkkään genomi-TNF-R- ·...’ promoottori-, kontrolli- ja/tai signaalisekvenssejä voi- I I · • >t,· 30 daan käyttää edellyttäen, että tällaiset kontrollisekvens sit sopivat yhteen valitun isäntäsolun kanssa. Lisää yksi- ;·*· tyiskohtia koskien nisäkäskorkeailmennysvektorin käyttöä .’··. yhdistelmä-DNA-nisäkäs-TNF-reseptorin tuottamiseksi esi- • t tetään esimerkeissä 2 ja 7 alla. Esimerkkivektoreita voi- 35 daan rakentaa kuten ovat kuvanneet Okayama ja Berg 11*1· • ♦ • » · • · · • · 108645 27 .From Hind3 to Bqll, located at the replication origin of the virus '··'. Further, the promoter, control and / or signal sequences of the mammalian genomic TNF-R- ... 'may be used, provided that such control sequences are compatible with the selected host cell. For more details on using a mammalian high expression vector. '··. the production of recombinant mammalian TNF receptor is shown in Examples 2 and 7 below. Exemplary vectors can be constructed as described by Okayama and Berg 108645 27.
(Mol.Cell.Biol. 3 (1983) 280).(Mol.Cell.Biol. 3 (280) (1983)).
Käyttökelpoinen systeemi nisäkäsreseptori-cDNA-sekvenssien stabiiliksi ilmentämiseksi korkeina tasoina C127-hiiririntarauhasepiteelisoluissa voidaan rakentaa 5 oleellisesti kuten ovat kuvanneet Cosman et ai. (Mol. Immunol. 23 (1986) 935).A useful system for the stable expression of mammalian receptor cDNA sequences at high levels in C127 mouse mammary epithelial cells can be constructed essentially as described by Cosman et al. (Mol. Immunol. 23, 935 (1986)).
Edullisesti TNF-R-cDNA-sekvenssejä käsittävät yh-distelmä-DNA-ilmennysvektorit on stabiilisti integroitu isäntäsolun DNA:hän. Kohonneita määriä ilmennystuotetta 10 saadaan valikoimalla solulinjoja, joissa on monistettua vektori-DNA:ta. Solulinjat, joissa on monistettua vektori-DNA:ta, valitaan esimerkiksi transformoimalla isäntäsolu vektorilla, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa entsyymiä, jonka inhiboi tunnettu lääke. Vektori voi niin-15 ikään käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa halutun proteiinin. Vaihtoehtoisesti isäntäsolu voidaan yh-teistransformoida toisella vektorilla, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa halutun proteiinin. Transformoituja tai yhteistransformoituja isäntäsoluja viljellään 20 sitten tunnetun lääkkeen kasvavissa pitoisuuksissa, jol loin valikoidaan lääkkeelle resistenttien solujen suhteen. Tällaiset lääkeresistentit solut jäävät henkiin myrkyllisen lääkkeen pitoisuuksien kasvaessa tuottamalla run-*.·. säästi entsyymiä, jonka lääke inhiboi, usein seurauksena 25 entsyymiä koodittavan geenin vahvistumisesta. Silloin kun ! lääkeresistenssin on aiheuttanut kasvu inhiboitavaa ent- syymiä koodittavan vektori-DNA:n kopioluvussa, on samalla ’ ”* tapahtunut haluttua proteiinia (TNF-R:ää) koodittavan vek- tori-DNA:n yhteisvahvistuminen isäntäsolun DNA:ssa.Preferably, recombinant DNA expression vectors comprising the TNF-R cDNA sequences are stably integrated into the host cell DNA. Increased amounts of expression product 10 are obtained by selection of cell lines containing amplified vector DNA. Cell lines containing amplified vector DNA are selected, for example, by transforming the host cell with a vector comprising a DNA sequence encoding an enzyme which is inhibited by a known drug. The vector may also comprise a DNA sequence encoding the desired protein. Alternatively, the host cell may be co-transformed with another vector comprising a DNA sequence encoding the desired protein. Transformed or co-transformed host cells are then cultured at increasing concentrations of the known drug, which is selected for drug resistant cells. Such drug - resistant cells survive as concentrations of the toxic drug increase by producing run - *. saved the enzyme the drug inhibited, often as a result of the amplification of the gene encoding the enzyme. When ! drug resistance has been caused by growth in the copy number of the vector DNA encoding the enzyme which is inhibiting, while co-amplification of the vector DNA encoding the desired protein (TNF-R) in the DNA of the host cell.
I s t 30 Edullisessa systeemissä tällaiseksi yhteisvahvis- tamiseksi käytetään dihydrofolaattireduktaasi- (DHFR-) ·;···. geeniä, joka voidaan inhiboida lääkkeellä metotreksaatti (MTX) . Yhteisvahvistukseen pääsemiseksi isäntäsolu, josta • # puuttuu aktiivinen DHFR:ää koodittava geeni, joko trans- 35 formoidaan vektorilla, joka käsittää DHFR:ää ja haluttua » » » » » » » 108645 28 proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin, tai se yhteistrans-formoidaan vektorilla, joka käsittää DHFR:ää koodittavan DNA-sekvenssin, ja vektorilla, joka käsittää haluttua proteiinia koodittavam DNA-sekvenssin. Transformoituja tai 5 yhteistransformoituja isäntäsoluja viljellään kasvualustassa, joka sisältää kasvavia MTX-tasoja ja eloonjäävät solulinjat valitaan.In a preferred system, dihydrofolate reductase (DHFR) ·; ··· is used for such co-amplification. a gene that can be inhibited by the drug methotrexate (MTX). To achieve co-amplification, a host cell which lacks an active DHFR-encoding gene is either transformed with a vector comprising the DHFR and the desired DNA sequence encoding the desired protein 108645 28 or co-transformed with the vector. comprising a DNA sequence encoding DHFR and a vector comprising a DNA sequence encoding a desired protein. Transformed or co-transformed host cells are cultured in medium containing increasing levels of MTX and surviving cell lines are selected.
Erityisen edullisessa yhteismonistussysteemissä käytetään glutamiinisyntetaasi-(GS-)geeniä, joka on vas-' 10 tuussa glutamaatin ja ammoniakin synteesistä käyttäen ATP:n hydrolyysiä ADP:ksi ja fosfaatiksi reaktion ylläpitämiseksi. GS:ää inhiboivat monet erilaiset inhibiittorit, esimerkiksi metioniinisulfoksimiini (MSX). Täten TNF-R voidaan ilmentää korkeina pitoisuuksina yhteisvahvistamal-15 la soluja, jotka on transformoitu vektorilla, joka käsittää DNA-sekvenssin GS:lle ja halutulle proteiinille, tai yhteistransformoitu vektorilla, joka käsittää GS:ää koodittavan DNA-sekvenssin, ja vektorilla, joka käsittää haluttua proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin, minkä jäl-20 keen isäntäsoluja viljellään kasvualustassa, joka sisältää kasvavia MSX-tasoja, ja valikoidaan eloonjääneiden solujen suhteen. GS-yhteismonistussysteemiä, tarkoituksenmukaisia yhdistelmä-DNA-ilmennysvektoreita ja solulinjoja kuvataan ·.·. seuraavissa PCT-patenttihakemusjulkaisuissa: WO 87/04 462, 25 W0 89/01 036, WO 89/10 404 ja WO 86/05 807.A particularly preferred co-amplification system utilizes the glutamine synthetase (GS) gene responsible for the synthesis of glutamate and ammonia using hydrolysis of ATP to ADP and phosphate to maintain the reaction. GS is inhibited by many different inhibitors, for example methionine sulfoximine (MSX). Thus, TNF-R can be expressed at high concentrations by co-amplifying cells transformed with a vector comprising a DNA sequence for GS and the desired protein or a co-transformed vector comprising a DNA sequence encoding GS and a vector comprising a DNA sequence encoding the desired protein, followed by culturing the host cells in a medium containing increasing levels of MSX and selecting for surviving cells. The GS co-amplification system, appropriate recombinant expression vectors, and cell lines are described. in the following PCT patent applications: WO 87/04462, 25 WO 89/0136, WO 89/10404 and WO 86/05807.
\ ! Yhdistelmä-DNA-proteiinit ilmennetään edullisesti ; ; yhteisvahvistamalla DHFR tai GS nisäkäsisäntäsolussa, ku- '··** ten kiinalaisen hamsterin munasarja- (CHO-) soluissa, tai ...’ vaihtoehtoisesti hiiren myeloomasolulinjassa, kuten * * · 30 SP2/0Agl4 tai NSO tai rotan myeloomasolulinjassa, kuten YB2/3.0-Ag20, jotka julkistetaan PCT-patenttihakemusjul-·;··; kaisuissa WO 89/10 404 ja WO 86/05 807.\! The recombinant proteins are preferably expressed; ; by co-amplifying DHFR or GS in a mammalian host cell, such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, or ... ', alternatively in a mouse myeloma cell line such as * * · 30 SP2 / 0Agl4 or a NSO or a rat myeloma cell line such as YB2 / 3.0-Ag20, which are disclosed in PCT Patent Application Publication No. · · ·; WO 89/10404 and WO 86/05807.
Edullinen eukaryoottinen vektori TNF-R-DNA:n il- • , mentämiseksi julkistetaan alla esimerkissä 2. Tämä vekto- 35 ri, jota kutsutaan pCAV/NOT:ksi, saatiin nisäkäskorkeail- • · • I ·A preferred eukaryotic vector for expression of TNF-R DNA is disclosed in Example 2 below. This vector, called pCAV / NOT, was obtained in mammalian high.
• I I• I I
I · 108645 29 ' mennysvektorista pDC201 ja se sisältää säätösekvenssejä SV40:stä, adenovirus-2:sta ja ihmisen sytomegalovirukses-ta.I · 108645 29 'from pDC201 and contains regulatory sequences from SV40, adenovirus-2, and human cytomegalovirus.
Yhdistelmä-DNA-TNF-R:n puhdistaminen 5 Puhdistettuja nisäkäs-TNF-reseptoreita tai analo geja valmistetaan viljelemällä sopivia isäntä/vektorisys-teemejä yhdistelmä-DNA-luentatuotteiden ilmentämiseksi edellä kuvatuista DNA-sekvensseistä ja puhdistamalla ne sitten viljelykasvualustasta tai solu-uutteista.Purification of recombinant TNF-R Purified mammalian TNF receptors or analogs are prepared by culturing appropriate host / vector systems for expression of recombinant DNA reading products from the DNA sequences described above and then purifying them from the culture medium or cell extract.
10 Esimerkiksi supernatantteja systeemeistä, jotka erittävät yhdistelmä-DNA-proteiinin kasvualustaan, voidaan ensin konsentroida käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa proteiinikonsentrointisuodatinta, esimerkiksi Amiconin tai Milliporen ultrasuodatusyksikköä. Konsentrointivaiheen 15 jälkeen konsentraatti voidaan panostaa sopivaan puhdistus-matriisiin. Esimerkiksi sopiva affiniteettimatriisi voi käsittää TNF- tai lektiini- tai vasta-ainemolekyylin sidottuna sopivaan tukeen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää anioninvaihtohartsia, esimerkiksi matriisia tai substraat-20 tia, jossa on riippuvia dietyyliaminoetyyli- (DEAE-) ryhmiä. Matriisit voivat olla akryyliamidia, agaroosia, deks-traania, selluloosaa tai muita tyyppejä, joita tavanomaisesti käytetään proteiinien puhdistuksessa. Vaihtoehtoi-V. sesti voidaan käyttää kationinvaihtovaihetta. Sopivia ka- 25 tioninvaihtajia ovat erilaiset ei-liukoiset matriisit, • · * jotka käsittävät sulfopropyyli- tai karboksimetyyliryhmiä. Sulfopropyyliryhmät ovat edullisia.For example, supernatants from systems that secrete recombinant protein into culture media may first be concentrated using a commercially available protein concentration filter, such as an Amicon or Millipore ultrafiltration unit. After the concentration step 15, the concentrate can be charged into a suitable purification matrix. For example, a suitable affinity matrix may comprise a TNF or lectin or antibody molecule bound to a suitable support. Alternatively, an anion exchange resin such as a matrix or substrate having dependent diethylaminoethyl (DEAE) groups may be used. The matrices may be acrylamide, agarose, dextran, cellulose or other types conventionally used in protein purification. An alternative-V. a cation exchange step may be used. Suitable cation exchangers include various non-soluble matrices, which contain sulfopropyl or carboxymethyl groups. Sulfopropyl groups are preferred.
• · *···1 Lopuksi TNF-R-koostumuksen puhdistamiseksi edel- < 1 · ·...1 leen voidaan käyttää yhtä tai useampaa käänteisfaasikor- • · · 30 keapainenestekromatografia- (RP-HPLC-) vaihetta käyttäen hydrofobista RP-HPLC-alustaa, esim. silikageeliä, jossa on ·;··· riippuvia metyyliryhmiä tai muita alifaattisia ryhmiä.Finally, one or more reverse phase liquid chromatography (RP-HPLC) steps can be used to purify the TNF-R composition to <1 · · ... 1 using hydrophobic RP-HPLC. substrate, e.g., silica gel with ·; ··· dependent methyl groups or other aliphatic groups.
.··. Joitakin tai kaikkia edeltäviä puhdistusvaiheita erilai- • t sinä yhdistelminä voidaan samoin käyttää homogeenisen yh- 35 distelmä-DNA-proteiinin saamiseksi.. ··. Some or all of the preceding purification steps in various combinations may also be used to obtain a homogeneous recombinant protein.
(MM(MM
· · • » » ψ 1 108645 30· · • »» ψ 1 108645 30
Bakteeriviljelmässä tuotettu yhdistelmä-DNA-pro-teiini eristetään tavallisesti ensin uuttamalla solupel-lettejä, minkä jälkeen suoritetaan yksi tai useampi kon-sentrointi-, ulossuolaus-, vesi-ioninvaihto- tai kokoeks-5 kluusiokromatografiavaihe. Lopuksi korkeapainenestekroma- tografiaa (HPLC) voidaan käyttää viimeisissä puhdistus-vaiheissa. Yhdistelmä-DNA-nisäkäs-TNF-R:n ilmentämiseksi käytetyt mikrobisolut voidaan rikkoa millä tahansa kätevällä menetelmällä, mukaan lukien jäädytys/sulatuskierrä-10 tys, ultraäänikäsittely, mekaaninen rikkominen tai solujen lyysin aikaansaavien aineiden käyttö.The recombinant protein produced in the bacterial culture is usually first isolated by extraction of the cell pellets, followed by one or more steps of concentration, desalting, water ion exchange or size-exclusion chromatography. Finally, high pressure liquid chromatography (HPLC) can be used in the final purification steps. The microbial cells used to express recombinant mammalian TNF-R can be disrupted by any convenient method, including freeze / thaw recycling, sonication, mechanical disruption, or the use of cell lysis agents.
Nisäkäs-TNF-R:n eritettynä proteiinina ilmentävän hiivan fermentointi yksinkertaistaa suuresti puhdistusta. Fermentaatiosta suuressa mittakaavassa saatua eritettyä 15 yhdistelmä-DNA-proteiinia voidaan puhdistaa menetelmillä, jotka ovat analogisia menetelmiin nähden, joita ovat julkistaneet Urdal et ai. (J.Chromatoq. 296 (1984) 171). Tässä julkaisussa kuvataan kahta peräkkäistä käänteisfaasi-HPLC-vaihetta yhdistelmä-DNA-ihmis-GM-CSF:n puhdistamisek-20 si preparatiivisessa HPLC-kolonnissa.Fermentation of yeast expressing mammalian TNF-R as a secreted protein greatly simplifies purification. Large-scale secreted 15 recombinant DNA from fermentation can be purified by methods analogous to those disclosed by Urdal et al. (J.Chromatoq. 296: 171 (1984)). This publication describes two sequential reverse phase HPLC steps for purification of recombinant human GM-CSF on a preparative HPLC column.
Yhdistelmä-DNA-viljelmässä syntetisoidulle humaa-ni-TNF-R:lle on karakteristista ei-ihmissolurakenneosien, mukaan lukien proteiinien, läsnäolo määrinä ja tyyppinä, ·.·. jotka riippuvat humaani-TNF-R:n talteenottamiseksi viljel- 25 mästä käytetyistä puhdistusmenetelmistä. Nämä rakenneosat ! ovat tavallisesti alkuperältään hiivaprokaryooteista tai *;// korkeammista ei-humaanieukaryooteista, ja niitä on edul- *··' lisesti läsnä harmittomina kontaminoivina määrinä suuruus- ,,,* luokiltaan alle noin 1 paino-%. Edelleen yhdistelmä-DNA- 30 soluviljelmällä on mahdollista tuottaa TNF-R:ää, joka ei sisällä proteiineja, joita voi normaalisti liittyä TNF-·;·· R:ään sellaisena kuin se esiintyy luonnossa alkuperälajis- saan, esim. soluissa, solu-ulosvirtausnesteissä tai ruu-’ , miin nesteissä.Human TNF-R synthesized in recombinant culture is characterized by the presence of non-human cellular components, including proteins, in amounts and types, ·. ·. which depend on the purification methods used to recover human TNF-R. These components! are usually derived from yeast prokaryotes or *; // higher non-human eukaryotes, and are preferably present in harmless contaminating amounts of less than about 1% by weight. Furthermore, recombinant cell culture makes it possible to produce TNF-R which does not contain proteins normally associated with TNF ·; ·· R as it occurs naturally in its native species, eg, in cells, in cellular effluents. or food, what in liquids.
35 Seuraavat esimerkit esitetään havainnollistavassa 10864b 31 eikä rajaavassa tarkoituksessa.The following examples are provided for illustrative purposes only and not for purposes of limitation.
Esimerkkejä Esimerkki 1 Sitoutumismäärityksiä 5 A. TNF-a:n ja TNF-B:n radioleimaus. Yhdistelmä- DNA-humaani-TNF-a ilmennettiin fuusioproteiinin muodossa, joka sisältää hydrofiilisen oktapeptidin N-päässä, hiivassa erittyvänä proteiinina ja se puhdistettiin affini-teettikromatografisesti (Hopp et ai., Bio/Technoloqy 6 10 (1988) 1204) . Puhdistettu yhdistelmä-DNA-humaani-TNF-β hankittiin valmistajalta R&D Systems (Minneapolis, MN) . Molemmat proteiinit radioleimattiin käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa kiinteäfaasiainetta, Iodo-Gen (Pierce). Tässä menettelyssä 5 pg Iodo-Gen-tuotetta maljättiin 10 x 15 75 mm:n lasiputken pohjalle ja inkuboitiin 20 minuutin ajan 4 °C:ssa 75 piillä 0,1 M natriumfosfaattiliuosta, pH 7,4, ja 20 pl:lla (2 mCi) Na125I:tä. Tämä liuos siirrettiin sitten toiseen lasiputkeen, joka sisälsi 5 pg TNF-a:aa (tai TNF-5:aa) 45 piissä PBS:ää, 20 minuutiksi 20 4 °C:ssa. Reaktioseos fraktioitiin geelisuodattamalla 2 ml:n petitilavuuden Sephadex G-25 -tuotetta (Sigma) läpi, jota oli tasapainotettu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -kasvualustassa, joka sisälsi 2,5 % (w/v) nautaseerumialbumiinia (BSA), 0,2 % (w/v) natriumatsidia b 25 ja pitoisuuden 20 mM Hepes, pH 7,4 (sitoutumiskas- ; vualusta) . Lopullinen 125I-TNF-pooli laimennettiin sitoutu- miskasvualustaan työvarastoliuokseksi, jonka pitoisuus oli 1 x 10"7 M, ja jota varastoitiin aina kuukauden ajan 4 °C:ssa ilman todettavaa reseptorisitoutumisaktiivisuuden 30 menetystä. Spesifinen aktiivisuus on tavanomaisesti 1 x 106 tuiketta/min/mmol TNF:ää.EXAMPLES Example 1 Binding Assays 5 A. Radiolabeling of TNF-α and TNF-B. Recombinant human TNF-α was expressed in the form of a fusion protein containing the hydrophilic octapeptide at the N-terminus as a yeast secreted protein and purified by affinity chromatography (Hopp et al., Bio / Technoloqy 6 10 (1988) 1204). Purified recombinant human TNF-β was purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN). Both proteins were radiolabeled using a commercially available solid phase material, Iodo-Gen (Pierce). In this procedure, 5 µg of Iodo-Gen product was plated on the bottom of a 10 x 15 75 mm glass tube and incubated for 20 minutes at 4 ° C with 75 µl of 0.1 M sodium phosphate, pH 7.4, and 20 µl (2 m ) Na125I. This solution was then transferred to another glass tube containing 5 µg of TNF-α (or TNF-5) in 45 PBS for 20 minutes at 4 ° C. The reaction mixture was fractionated by gel filtration through a 2 mL bed volume of Sephadex G-25 (Sigma) equilibrated in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium containing 2.5% (w / v) bovine serum albumin (BSA). , 2% (w / v) sodium azide b 25 and 20 mM Hepes, pH 7.4 (binding medium). The final pool of 125I-TNF was diluted in binding medium to a working stock solution of 1 x 10 7 M and stored for one month at 4 ° C without any detectable loss of receptor binding activity. The specific activity is usually 1 x 10 6 scintillation per minute. mmol of TNF.
• ;··; B. Sitoutuminen ehyisiin soluihin. Sitoutumismää- ritykset ehyillä soluilla suoritettiin kahdella menetel-• . mällä. Ensimmäisessä menetelmässä soluja kasvatettiin en- 35 sin joko lietteenä (esim. U937) tai kiinnittämällä kudos- 108645 32 viljelymaljoihin (esim. WI26-VA4-, COS-solut, jotka ilmentävät yhdistelmä-DNA-TNF-reseptorin). Kiinnittyneet solut poistettiin sitten käsittelemällä 5 mM EDTA-liuoksella 10 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sitoutumismääritykset suoritet-5 tiin sitten ftalaattiöljyerotusmenetelmällä (Dower et ai., J.Immunol. 132 (1984) 751) oleellisesti kuten ovat kuvanneet Park et al^_ (J.Biol.Chem. 261 (19 8 6 ) 4 1 77). 125I-TNF:n ei-spesifinen sitoutuminen mitattiin 200-kertaisen tai suuremman mooliylimäärän ei-leimattua TNF:ää läsnä olles-: 10 sa. Natriumatsidia (0,2 %) sisällytettiin sitoutumis- määritykseen I-TNF:n siirtymisen solujen sisään estämiseksi. Toisessa menetelmässä testattiin COS-solujen, jotka oli transfektoitu TNF-R:n sisältävällä plasmidilla ja jotka ilmensivät pinnallaan TNF-reseptoreita, kykyä sitoa 15 125I-TNF:ää maljasitoutumismäärityksellä, jota ovat kuvan- neet Sims et ai. (Science 241 (1988) 585).•; ··; B. Commitment to intact cells. Binding assays on intact cells were performed by two methods. by. In the first method, cells were first grown either by slurry (e.g. U937) or by attachment to tissue culture plates (eg WI26-VA4, COS cells expressing recombinant TNF receptor). The adherent cells were then removed by treatment with 5 mM EDTA for 10 minutes at 37 ° C. Binding assays were then performed by the phthalate oil separation method (Dower et al., J. Immunol. 132: 751 (1984)), essentially as described by Park et al. (J. Biol. Chem. 261 (198-6) 4-177). Non-specific binding of 125 I-TNF was measured in the presence of 200-fold or greater molar excess of unlabeled TNF. Sodium azide (0.2%) was included in the binding assay to prevent intracellular migration of I-TNF. The second method tested the ability of COS cells transfected with a TNF-R-containing plasmid that expressed TNF receptors on its surface to bind 125 I-TNF by the plate binding assay described by Sims et al. (Science 241: 585 (1988)).
C. Sitoutumismääritykset kiinteässä faasissa. Keino TNF-R:n toteamiseksi saatiin TNF-R:n kyvystä adsorboitua stabiilisti nitroselluloosaan ihmissolujen detergent-20 tiuutteista siten, että TNF-sitoutumisaktiivisuus kuitenkin säilyy. Solu-uutteet valmistettiin sekoittamalla so-lupelletti 2x tilavuuteen PBSrää, joka sisälsi 1 %:n Triton X-100 -valmistetta ja sekoituksen proteaasi-·.*. inhibiittoreita (2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, 10 25 μΜ pepstatiini, 10 μΜ leupeptiini, 2 mM o-fenantroliini ja 1 2 mM EGTA), kiivaasti vortex-sekoittamalla. Seosta inku- boitiin jäissä 30 minuutin ajan, minkä jälkeen sitä sent-*·*·’ rifugoitiin 12 000 x g:ssä 15 minuutin ajan 8 °C:ssa tumi- I « i :...· en ja muun jätteen poistamiseksi. Kahden mikrolitran erät » » · :,,,· 30 solu-uutteita sijoitettiin kuiville BA85/21- nitroselluloosamembraaneille (Schleicher & Schuell, Keene, ·;··; NH) ja annettiin kuivaa. Membraaneja inkuboitiin kudosvil- jelymaljoissa 30 minuutin ajan Tris- (0,05 M) puskuroidus- * , sa suolaliuoksessa (0,15 M), pH 7,5, joka sisälsi 3 % 35 (w/v) BSA:ta, ei-spesifisten sitoutumiskeskusten salpaa- 4 I » I » • · • I * • t » » · · » »C. Binding Assays in Solid Phase. The means for detecting TNF-R was obtained by the ability of TNF-R to adsorb stably to nitrocellulose from detergent-20 extracts of human cells, while retaining TNF-binding activity. Cell extracts were prepared by mixing the cell pellet with 2x volume PBS containing 1% Triton X-100 and mixing with protease. inhibitors (2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 25 μΜ pepstatin, 10 μΜ leupeptin, 2 mM o-phenanthroline and 1 2 mM EGTA), vigorously vortexing. The mixture was incubated on ice for 30 minutes then centrifuged at 12,000 x g for 15 minutes at 8 ° C to remove dark matter and other debris. Two microliters aliquots of cell extracts were placed on dry BA85 / 21 nitrocellulose membranes (Schleicher & Schuell, Keene, ·; ···; NH) and allowed to dry. Membranes were incubated in tissue culture plates for 30 minutes in Tris (0.05 M) buffered saline (0.15 M) pH 7.5 containing 3% 35 (w / v) BSA, non- latches for specific binding centers- 4 I »I» • I * • t »» · · »»
I » II »I
• » » t · 108645 33 naiseksi. Membraani peitettiin sitten seoksella, jossa oli 5 x 10"11 M 125I TNF:ää PBSrssä, jossa oli 3 % BSA:ta, ja inkuboitiin 2 tunnin ajan 4 °C:ssa ravistellen. Tämän ajan kuluttua membraanit pestiin 3 kertaa PBS:llä, kuivattiin 5 ja sijoitettiin Kodak X-Omat AR -filmille 18 tunniksi -70 °C: seen.• »» t · 108645 33 women. The membrane was then covered with a mixture of 5 x 10 11 M 125 I TNF in PBS containing 3% BSA and incubated for 2 hours at 4 ° C. After this time, the membranes were washed 3 times with PBS, dried and placed on Kodak X-Omat AR film for 18 hours at -70 ° C.
Esimerkki 2Example 2
Humaani-TNF-R-cDNA:n eristäminen ilmentämällä aktiivinen proteiini suoraan COS-7-soluissa 10 Erilaisia ihmissolulinjoja seulottiin TNF-R-ilmen- nyksen suhteen niiden kyvyn nojalla sitoa I-leimattua TNFrää. Ihmisen sidekudosmuodostussolulinjan WI-26 VA4 todettiin ilmentävän kohtuullisen lukumäärän reseptoreita solua kohden. Tasapainositoutumistutkimukset osoittivat, 15 että solulinja osoitti kaksifaasista I-TNF:n sitomista käsittäen noin 4 000 korkea-affiniteettikeskusta (Ka = 1 x 1010 M-1) ja 15 000 matala-af f initeettikeskusta (Ka = 1 x 108 M”1) solua kohden.Isolation of human TNF-R cDNA by direct expression of active protein in COS-7 cells Different human cell lines were screened for TNF-R expression by their ability to bind I-labeled TNF. The human connective tissue-forming cell line WI-26 VA4 was found to express a reasonable number of receptors per cell. Equilibrium binding studies showed that the cell line showed biphasic I-TNF binding, comprising approximately 4,000 high affinity centers (Ka = 1 x 10 10 M -1) and 15,000 low affinity centers (Ka = 1 x 10 8 M 1) cells. for.
Koon mukaan jaottelematon cDNA-kirjasto rakennet-20 tiin suorittamalla käänteiskopiointi polyadenyloidulle mRNA:lle, joka oli eristetty kokonais-RNA:sta, joka oli uutettu ihmisen sidekudosmuodostus-WI-26 VA4 -soluista, joita oli kasvatettu Phytolacca americana (engl. pokeweed) ·.·. -mitogeenin läsnä ollessa, käyttäen vakiotekniikoita (Gub- t · ♦ 25 ler et ai., Gene 25 (1983) 263; Ausubel et ai., toim., 1 "Current Protocols in Molecular Biology", osa 1, 1987).The size-disaggregated cDNA library was constructed by reverse transcription of polyadenylated mRNA isolated from total RNA extracted from human connective tissue WI-26 VA4 cells grown in Phytolacca Americana (pokeweed) · . ·. in the presence of a mitogen using standard techniques (Gubt ♦ 25 ler et al., Gene 25 (1983) 263; Ausubel et al., Ed. 1, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1987).
• t ·• t ·
Solut otettiin talteen aikaansaamalla soluissa lyysi gua-'·*·* nidiinihydrokloridiliuoksessa ja kokonais-RNA eristettiin kuten aiemmin on kuvattu (March et ai., Nature 315 (1985) 30 641) .Cells were harvested by lysis of the cells in guan * * * * nidine hydrochloride solution and total RNA was isolated as previously described (March et al., Nature 315: 30641 (1985)).
Poly A+ -RNA eristettiin oligo-dT-selluloosakroma-*; : tografisesti ja kaksisäikeinen cDNA valmistettiin mene- telmällä, joka oli samanlainen kuin Gublerin ja Hoffmanin , (Gene 25 (1983) 263) . Lyhyesti, poly A+ -RNA muutettiin ’ 35 RNA-cDNA-hybridiksi käyttäen käänteiskopioijaentsyymiä ja , t I · t · I » I * * 34 108645 oligo-dT:tä alukkeena. RNA-cDNA-hybridi muutettiin sitten kaksisäikeiseksi cDNArksi käyttäen RN-aasi-H:ta yhdessä DNA-polymeraasi-I:n kanssa. Saadun kaksisäikeisen cDNA:n päistä tehtiin tasaiset käyttäen T4-DNA-polymeraasia.Poly A + RNA was isolated from oligo-dT-cellulose chroma *; : topographically and double stranded cDNA was prepared by a method similar to that of Gubler and Hoffman (Gene 25: 263 (1983)). Briefly, poly A + RNA was converted to a '35 RNA cDNA hybrid using the reverse transcriptase enzyme and t I · t · I * * 34 108645 oligo-dT as a primer. The RNA-cDNA hybrid was then converted to double-stranded cDNA using RNase-H together with DNA polymerase-I. The ends of the resulting double-stranded cDNA were made flat using T4 DNA polymerase.
5 cDNA:han, jonka päät olivat tasaiset, lisätään EcoRI-liittosekvenssejä (joissa on sisäisiä Not1-keskuksia), jotka oli fosforyloitu vain toisesta päästä (Invitrogen). Liittosekvensseillä varustettua cDNA:ta käsiteltiin T4-po-lynukleotidikinaasilla liittosekvenssin 5'-ylijäämäalueen 10 fosforyloimiseksi ja ligatoitumatta jääneet liittosekvens-sit poistettiin ajamalla cDNA Sepharose CL4B -kolonnissa. Liittosekvensseillä varustettu cDNA ligatoitiin ekvimolaa-riseen pitoisuuteen bakteriofagi lambda-gtlO:n EcoRI;llä leikattuja ja defosforyloituja varsia (Huynh et ai., "DNA 15 Cloning: A Practical Approach"; Glover, toim., IRL Press, ] ss. 49 - 78). Ligatoitu DNA pakattiin fagipartikkeleihin käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa pakkausta yhdis-telmä-DNA-tuotekirjaston saamiseksi (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Yhdistelmä-DNA-tuotteita 20 vahvistettiin edelleen maljaamalla fagi JL_ coli -kanta c600(hfl”) bakteerimatolle.EcoRI fusion sequences (which have internal Not1 centers) that have been phosphorylated at one end only (Invitrogen) are added to 5 flat-ended cDNAs. The cDNA with the fusion sequences was treated with T4 polynucleotide kinase to phosphorylate the 5 'excess region of the fusion sequence and the non-ligated fusion sequences were removed by running the cDNA on a Sepharose CL4B column. The cDNA with the fusion sequences was ligated to an equimolar concentration of EcoRI cut and dephosphorylated stems of bacteriophage lambda-gt10 (Huynh et al., "DNA Cloning: A Practical Approach"; Glover, ed., IRL Press,] pp. 49- 78). The ligated DNA was packaged into phage particles using a commercially available kit to obtain a recombinant DNA product library (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). The recombinant DNA products were further amplified by plating the phage JL_ coli strain c600 (hfl ') on a bacterial mat.
Fagi-DNA puhdistettiin saadusta lambda-gtlO-cDNA-kirjastosta ja cDNA-insertit leikattiin pilkkomalla res-*.·, triktioentsyymillä Notl. Suoritettiin pilkkomistuotteiden !. ! 25 elektroforeesi agaroosigeelissä, minkä jälkeen eristettiin ( 2 000 ep:tä suuremmat cDNA-fragmentit.The phage DNA was purified from the resulting lambda-gt10 cDNA library and the cDNA inserts were cleaved by digestion with res - *. Done cleavage! ! After electrophoresis on an agarose gel, cDNA fragments larger than 2,000 bp were isolated.
Saadut cDNA-f ragmentit ligatoitiin eukaryoottiseen '<··* ilmennysvektoriin pCAV/NOT, joka oli suunniteltu ilmentä- ·...* mään sen monikloonauskeskukseen insertoidut cDNA-sekvens- >,"· 30 sit nisäkässoluihin transfektoituna. pCAV/NOT koottiin pDC201:stä (pMLSV-johdannainen, jota ovat aiemmin kuvan-·;·· neet Cosman et ai., Nature 312 (1984) 768), SV40:stä ja sytomegalovirus-DNA: sta ja käsittää järjestyksessä ko- • , pioinnin suunnassa replikaatioalkukohdasta lukien: (1) 35 SV40-sekvenssit koordinaatit 5171-270 mukaan lukien rep- »The resulting cDNA fragments were ligated into the eukaryotic '<·· * expression vector, pCAV / NOT, designed to express the cDNA sequence inserted into its multicloning center, transfected into mammalian cells. PCAV / NOT was assembled in pDC201: (pMLSV derivative of Cosman et al., 1984, Nature 312 (768) 768), SV40 and cytomegalovirus DNA, and comprises, in sequence, from the origin of replication: (1) 35 SV40 sequences with coordinates 5171-270 including rep- »
• I• I
I » * 1086^5 35 likaatioalkukohta, tehostinsekvenssit ja varhais- ja myö-häispromoottorit; (2) sytomegalovirussekvenssit mukaan lu kien promoottori- ja tehostinalueet (nukleotidit 671 - +63 sekvenssistä, jonka ovat julkistaneet Boechart et ai.I * 1086 ^ 5 35 lysation primers, enhancer sequences, and early and late night promoters; (2) cytomegalovirus sequences including promoter and enhancer regions (nucleotides 671 to +63 of the sequence disclosed by Boechart et al.
5 (Cell 41 (1985) 521); (3) adenovirus-2-sekvenssit, jotka sisältävät ensimmäisen eksonin ja osan intronista kolmiosaisen johtosekvenssin ensimmäisen ja toisen eksonin välissä, toisen eksonin ja osan kolmiosaisen johtosekvenssin kolmannesta eksonista sekä monikloonauskeksuksen 10 (MCS), joka sisältää keskukset Xhol:lie, Kpnl:lie,5 (Cell 41: 521 (1985)); (3) adenovirus-2 sequences containing a first exon and part of an intron between a first and second exon of a three-part leader, a second exon and a third of a three-part leader sequence and a multicloning invention 10 (MCS) containing XhoI, KpnI,
Smal:lie, Notl:lie ja Bgll:lie; (4) SV40-sekvenssit koordinaatit 4127-4100 ja 2770-2533, joihin sisältyy polyade-nylaatio- ja päätössignaalit varhaiskopioinnille; (5) pBR322:sta peräisin olevia sekvenssejä ja virusliitteiset 15 sekvenssit VAI ja VAII pDC201:stä, jolloin adenovirussek-i venssit 10532-11156 sisältävät VAI- ja VAII-geenit, joita seuraavat pBR322-sekvenssit 4363-2486:sta ja 1094-375:stä, jotka sisältävät ampisilliiniresistenssigeenin ja repli-kaatioalkukohdan.Smal: lie, Notl: lie and Bgll: lie; (4) SV40 sequences coordinates 4127-4100 and 2770-2533, including polyadenylation and termination signals for early copying; (5) pBR322 derived sequences and VAI and VAII sequences from pDC201, wherein adenovirus sequences 10532-11156 include VAI and VAII genes followed by pBR322 sequences from 4363-2486 and 1094-375 which contain the ampicillin resistance gene and the origin of replication.
20 Saadulla WI-26 VA4 -cDNA-kirjastolla pCAV/NOT:ssä transformoitiin L coli -kanta DH5-a, minkä jälkeen yh-distelmä-DNA-tuotteet maljaamalla saatiin noin 800 pesäkettä maljaa kohden, jolloin maljoja käytettiin riittä- • t1t västi, jotta saatiin kaikkiaan noin 50 000 pesäkettä seu- »· » ! !. 25 lontaa kohden. Pesäkkeet raaputettiin kustakin maljasta, ; yhdistettiin pooleiksi ja kustakin poolista valmistettiin • · *·’·' plasmidi-DNA. Pooli-DNA: 11a transfektoitiin sitten ei vie- • · lä yhteenkasvanut kerros apinan COS-7-soluja käyttäen DEAE-dekstraania, ja sitten klorokiinikäsittelyä kuten ί,,,ί 30 ovat kuvanneet Luthman et ai. (Nucl.Acids Res. 11 (1983) 1295) ja McCutchan et ai. (J.Natl.Cancer Inst. 41 (1986) • ;..j 351) . Soluja kasvatettiin sitten viljelmässä 3 päivän ajan .·1·. insertoitujen sekvenssien tilapäisen ilmennyksen saami- • t seksi. Kolmen päivän kuluttua soluviljelmäsupernatantit 35 heitettiin pois ja kustakin maljasta määritettiin so- 1 1 • I » » » 108645 36 ' luyksikerroksien TNF-sitoutuminen seuraavasti. Kolme ml sitoutumiskasvualustaa, joka sisälsi pitoisuuden 1,2 x 10’11 M 125I-leimattua FlagR-TNF:ää, lisättiin kuhunkin maljaan ja maljoja inkuboitiin 4 °C:ssa 120 minuutin ajan.The resulting WI-26 VA4 cDNA library in pCAV / NOT transformed the L coli strain DH5, and then plated the recombinant DNA products to about 800 colonies per plate, allowing sufficient use of the plates, in order to obtain a total of about 50,000 colonies »» »! !. 25 per litter. Colonies were scraped from each plate; were pooled and plasmid DNA was prepared from each pool. The pooled DNA was then transfected with an untranslated layer of monkey COS-7 cells using DEAE-dextran and then chloroquine treatment as described in Luthman et al. (Nucl. Acids Res. 11 (1295) (1983)) and McCutchan et al. (J.Natl.Cancer Inst. 41 (1986) •; .. j 351). Cells were then grown in culture for 3 days. obtaining a transient expression of the inserted sequences. After three days, the cell culture supernatants were discarded and the TNF binding of the cell layers was determined from each plate as follows. Three ml of binding medium containing 1.2 x 10'11 M 125 I-labeled FlagR-TNF was added to each plate and the plates were incubated at 4 ° C for 120 minutes.
5 Sitten tämä kasvualusta heitettiin pois ja kukin malja pestiin kerran kylmällä sitoutumiskasvualustalla (joka ei sisältänyt leimattua TNF:ää) ja kahdesti kylmällä PBS:llä. Sitten kunkin maljan reunat rikottiin, jolloin saatiin tasainen levy, joka saatettiin kosketuksiin rönt-10 gensädefilmin kanssa 72 tunniksi -70 °C:ssa monistussuo-dinta käyttäen. TNF-sitoutumisaktiivisuus näkyi valotetuilla filmeillä tummana kohtana suhteellisen tasaista taustaa vasten.This medium was then discarded and each plate was washed once with cold binding medium (which did not contain labeled TNF) and twice with cold PBS. The edges of each dish were then broken to obtain a flat plate that was contacted with X-ray gene film for 72 hours at -70 ° C using an amplification filter. TNF-binding activity was visible on exposed films as a dark spot against a relatively even background.
Kun noin 240 000 yhdistelmä-DNA-tuotetta kirjas-15 tosta oli seulottu tällä tavalla, yhden transfektanttipoo-lin havaittiin tarjoavan TNF-sitoutumiskohtia, jotka näkyivät selvästi taustan valotusta vasten.After screening about 240,000 recombinant DNA products from booklet 15 in this manner, one transfectant pool was found to provide TNF binding sites which were clearly visible against the background exposure.
Jäädytettyä varastokantaa positiivisen poolin bakteereista käyttäen valmistettiin sitten noin 150 pesäkettä 20 käsittäviä maljoja. Näistä maljoista valmistettiin kopiot nitroselluloosasuodattimille, minkä jälkeen maljat raaputettiin ja valmistettiin plasmidi-DNA, joka transfektoi-tiin kuten edellä kuvattiin positiivisen maljan tunnista-V. miseksi. Bakteereja yksittäisistä pesäkkeistä tämän maljan I » · !. 1 25 nitroselluloosakopiosta kasvatettiin 0,2 ml:n viljelminä, *. ! joita käytettiin plasmidi-DNA:n saamiseksi, joka transfek- » · ';// toitiin COS-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tällä ta- *···* valla eristettiin yksi klooni, klooni-1, joka kykeni indu- soimaan humaani-TNF-R:n ilmennyksen COS-soluilla. Ilmen- t » ·Plates of about 150 colonies were then prepared using a frozen stock of positive pool bacteria. Copies of these plates were made on nitrocellulose filters, then the plates were scraped and plasmid DNA transfected as described above for positive plate recognition V. order. Bacteria from single colonies of this dish I »·!. 1 25 copies of nitrocellulose were grown in 0.2 ml cultures, *. ! which were used to obtain plasmid DNA which was transfected into COS-7 cells as described above. In this manner, one clone, clone-1, capable of inducing the expression of human TNF-R on COS cells, was isolated. Illustrations »·
30 nysvektori pCAV/NOT, joka sisältää TNF-R-DNA-klooni-1: n, on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture ·;··· Collction, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USAThe 30 nection vector pCAV / NOT containing TNF-R DNA clone-1 has been deposited with the American Type Culture, ··· Collction, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA
(hakunumero 68088) nimellä pCAV/NOT-TNF-R.(ref. 68088) as pCAV / NOT-TNF-R.
* * ♦ 35 > i » I I * I » > » t I I I · * • · » 108645 37* * ♦ 35> i »I I * I»> »t I I I · * • ·» 108645 37
Esimerkki 3Example 3
Liukoista hu-TNF-R-delta-235:tä koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminenConstruction of cDNA sequences encoding soluble hu-TNF-R-delta-235
Liukoista hu-TNF-R-delta-235: tä koodittava cDNA 5 (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 235 kuviossa 2) raken nettiin leikkaamalla 840 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja Pvu2. Notl leikkaa pCAV/NOT-TNF-R:n monikloonauskeskuksesta ja Pvu2 leikkaa TNF-R-koodialueelta 20 nukleotidia 5' transmembraa- 10 nialueesta. TNF-R-sekvenssien 3'-pään uudelleenrakentami seksi syntetisoitiin kaksi oligonukleotidia, jotka juotettiin seuraavan oligonukleotidiliittosekvenssin saamiseksi : 15 Pvu 2 BamHl Bgl2 CTGÄAGGGAGCACTGGCGACTAAGGATCCA GACTTCCCTCGTGACCGCTGATTCCTAGGTCTAG AlaGluGlySerThrGlyAspLoppu 20 Tässä oligonukleotidiliittosekvenssissä on päässä sijaitsevat Pvu2- ja Bgl2-restriktiokeskukset, se luo uudelleen 20 nukleotidia TNF-R:ää, joita seuraa päätöskodoni (alleviivattu) ja BamHI-restriktiokeskus (kätevyyden vuok-·,·. si eristettäessä liukoinen TNF-R kokonaisuudessaan I I · 25 Notl/BamHI-pilkkomisella. Tämä oligonukleotidi liqatoitiin ·, \ sitten 840 ep:n Notl/Pvu2-TNF-R-insertin kanssa Bgl2/~ ''’l* Notl: llä leikattuun pCAV/NOT:hen, jolloin saatiin psolhu- '...* TNF-R-delta-235/CAVNOT, joka transfektoitiin COS-7-solui- hin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori indusoi » * * !ii(! 30 liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennyksen, joka kykeni sito maan TNFrää.The cDNA 5 encoding soluble hu-TNF-R-delta-235 (having the sequence amino acids 1 to 235 in Figure 2) was constructed by cleaving the 840 bp fragment of pCAV / NOT-TNF-R with the restriction enzymes Not1 and Pvu2. Not1 cuts pCAV / NOT-TNF-R from the multicloning site and Pvu2 cuts 20 nucleotides 5 'of the transmembrane region of the TNF-R coding region. TNF-R sequences of the 3'-terminal was synthesized uudelleenrakentami into two oligonucleotides which are soldered in order to obtain the next oligonukleotidiliittosekvenssin: 15 Bam HI Pvu two Bgl2 CTGÄAGGGAGCACTGGCGACTAAGGATCCA GACTTCCCTCGTGACCGCTGATTCCTAGGTCTAG AlaGluGlySerThrGlyAspLoppu this oligonukleotidiliittosekvenssissä 20 is located away from the Pvu2- and Bgl2 restriction sites, it re-creates the 20 nucleotides of the TNF-R followed by the decision codon (underlined) and the BamHI restriction site (for convenience, for isolation of soluble TNF-R as a whole by II · 25 NotI / BamHI digestion), this oligonucleotide was then lysed ·, then 840 bp NotI / With pvu2-TNF-R insert into Bgl2 / ~ '' 'l * Notl-cut pCAV / NOT to give psolho-... * TNF-R-delta-235 / CAVNOT transfected with COS-7 cells as described above. This expression vector induced the expression of? 30 * soluble human TNF-R capable of binding TNF.
* t I « i # I » I I t t · t* t I «i # I» I I t t · t
Iitti » l I * * | | · » * • · » » » I I $ » 108645 38Iitti »l I * * | | · »* • ·» »» I I $ »108645 38
Esimerkki 4Example 4
Liukoista hu-TNF-R-delta-185:tä koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminenConstruction of cDNA sequences encoding soluble hu-TNF-R-delta-185
Liukoista hu-TNF-R-delta-185:tä koodittava cDNA 5 (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 185 kuviossa 2) rakennettiin leikkaamalla 640 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja Bgl2. Notl leikkaa pCAV/NOT-TNF-R:n monikloonauskeskuksesta ja Bgl2 leikkaa TNF-R-koodialueelta nukleotidin 637 kohdalta, joka on 237 10 nukleotidia 5' transmembraanialueesta. Syntetisoitiin seu-raavat oligonukleotidiliittosekvenssit:The cDNA 5 encoding soluble hu-TNF-R delta-185 (having the sequence amino acids 1 to 185 in Figure 2) was constructed by cleaving a 640 bp fragment of pCAV / NOT-TNF-R with the restriction enzymes NotI and Bgl2. Not1 cuts pCAV / NOT-TNF-R from the multicloning site and Bgl2 cuts the TNF-R coding region at nucleotide 637, which is 237 10 nucleotides 5 'from the transmembrane region. The following oligonucleotide fusion sequences were synthesized:
Bgl2 5'-GATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGÄATGCAAGCATGGÄTGC-3'Bgl2 5'-GATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGÄATGCAAGCATGGÄTGC-3 '
15 ACATTGCACCACCGGTAGGGACCCTTACGTTCG15 ACATTGCACCACCGGTAGGGACCCTTACGTTCG
IleCysAsnValValAlalleProGlyAsnAlaSerMetAspAlaIleCysAsnValValAlalleProGlyAsnAlaSerMetAspAla
Notl 5'- AGTCTGCACGTCCACGTCCCCCACCCGGTGAGC -3'Notl 5'- AGTCTGCACGTCCACGTCCCCCACCCGGTGAGC -3 '
2 0 TACCTACGTCAGACGTGCAGGTGCAGGGGGTGGGCCACTCGCCGG2 0 TACCTACGTCAGACGTGCAGGTGCAGGGGGTGGGCCACTCGCCGG
ValCysThrSerThrSerProThrArgLoppu ·* Edeltävät oligonukleotidiliittosekvenssit rakenta- I ’.· vat uudelleen reseptorimolekyylin 3'-pään nukleotidiin ••S 25 708, jota seuraa päätöskodoni (alleviivattu). Nämä oligo- nukleotidit ligatoitiin sitten 640 ep:n Notl-TNF-R-inser-tin kanssa Notl:llä leikattuun pCAV/NOT:hen, jolloin saa- • · · .·*. tiin ilmennysvektori psol-TNF-R-delta-185/CAVNOT, joka • · · transfektoitiin C0S-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tä- . 30 mä ilmennysvektori indusoi liukoisen humaani-TNF-R:n il- ... mennyksen, joka kykeni sitomaan TNF:ää.ValCysThrSerThrSerProThrArg End · * The above oligonucleotide fusion sequences construct I '. · Re-construct the 3' end of the receptor molecule to nucleotide • 25708, followed by the decision codon (underlined). These oligonucleotides were then ligated with the 640 bp Notl-TNF-R insert into Notl-cut pCAV / NOT to obtain • · ·. · *. an expression vector psol-TNF-R-delta-185 / CAVNOT was transfected into C0S-7 cells as described above. Here- 30 expression vector induced the expression of soluble human TNF-R capable of binding TNF.
• * ·;·’ Esimerkki 5• * ·; · 'Example 5
Liukoista hu-TNF-R-delta-163:ea koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminenConstruction of cDNA sequences encoding soluble hu-TNF-R-delta-163
35 Liukoista hu-TNF-R-delta-163: ea koodittava cDNA35 cDNA encoding soluble hu-TNF-R-delta-163
; \ (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 163 kuviossa 2) raken- 108645 39 nettiin leikkaamalla 640 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja Bgl2 kuten kuvattiin esimerkissä 4. Syntetisoitiin seuraava oligonukleotidi-liittosekvenssi: 5; 108645 39 was constructed by cutting the 640 bp fragment of pCAV / NOT-TNF-R with the restriction enzymes Not1 and Bgl2 as described in Example 4. The following oligonucleotide fusion sequence was synthesized: 5
Bgl2 Notl 5’GATCTGTTGAGC -3'Bgl2 Notl 5'GATCTGTTGAGC -3 '
ACAACTCGCCGGACAACTCGCCGG
IleCysLoppu 10 Tämä edeltävä oligonukleotidiliittosekvenssi rakentavaa uudelleen reseptorimolekyylin 3'-pään nukleotidiin 642 (aminohappo 163), jota seuraa päätöskodoni (alleviivattu) . Tämä oligonukleotidi ligatoitiin sitten 640 15 ep:n Not1-TNF-R-insertin kanssa Notl:llä leikattuun pCAV/-NOT-:hen, jolloin saatiin ilmennysvektori psol-TNF-R-del-ta-163/CAVNOT, joka transfektoitiin COS-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori indusoi liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennyksen, joka kykeni sitomaan TNF:ää 20 esimerkissä 1 kuvatussa sitoutumismäärityksessä.IleCys End 10 This preceding oligonucleotide fusion sequence rebuilds the 3 'end of the receptor molecule to nucleotide 642 (amino acid 163), followed by a decision codon (underlined). This oligonucleotide was then ligated with the 640 15 bp Not1-TNF-R insert into Not1-cut pCAV / -NOT- to give the expression vector psol-TNF-R-del-163 / CAVNOT transfected with COS- 7 cells as described above. This expression vector induced the expression of soluble human TNF-R capable of binding TNF in the binding assay described in Example 1.
Esimerkki 6Example 6
Liukoista hu-TNF-R-delta-142:ta koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminenConstruction of cDNA sequences encoding soluble hu-TNF-R-delta-142
• Liukoista hu-TNF-R-delta-142: ta koodittava cDNA• cDNA encoding soluble hu-TNF-R-delta-142
.Y: 25 (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 142 kuviossa 2) raken- nettiin leikkaamalla 550 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:sta restriktioentsyymeillä Notl ja AlwNl. AlwNl leikkaa ,*··, TNF-R-koodialueelta nukleotidin 549 kohdalta. Syntetisoi tiin seuraava oligonukleotidiliittosekvenssi: 40 108645.Y: 25 (having the sequence of amino acids 1-142 in Figure 2) was constructed by cleaving the 550 bp fragment of pCAV / NOT-TNF-R with the restriction enzymes NotI and AlwN1. AlwN1 cleaves, * ··, the TNF-R coding region at nucleotide 549. The following oligonucleotide fusion sequence was synthesized: 40 108645
Bgl2 Not1Bgl2 Not1
5'-CTGAAACATCAGACGTGGTGTGCAAGCCCTGTTAAA-3' CTTGACTTTGTAGTCTGCACCACACGTTCGGGACAATTTCTAGA5'-CTGAAACATCAGACGTGGTGTGCAAGCCCTGTTAAA-3 'CTTGACTTTGTAGTCTGCACCACACGTTCGGGACAATTTCTAGA
Loppu 5 Tämä edeltävä oligonukleotidiliittosekvenssi rakentavaa uudelleen reseptorimolekyylin 3'-pään nukleotidiin 579 (aminohappo 142), jota seuraa päätöskodoni (alleviivattu) . Tämä oligonukleotidi ligatoitiin sitten 10 550 ep:n Notl/AlwNl-TNF-R-insertin kanssa Notl/Bgl2:11a leikattuun pCAV/NOT:hen, jolloin saatiin ilmennysvektori psol-TNF-R-delta-142/CAVNOT, joka transfektoitiin COS-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori ei indusoinut liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennystä, joka ky-15 kenisi sitomaan TNF:ää. Arvellaan, että tämä nimenomainen rakenne ei kyennyt ilmentämään biologisesti aktiivista TNF-R:ää, koska yksi tai useampi molekyylinsisäiselle sitoutumiselle (TNF-R-molekyylin oikeanlaisen tertiaarira-kenteen muodostamiseksi) välttämätön oleellinen kysteii-20 nitähde (esim. Cys157 tai Cys163) oli eliminoitu.End 5 This previous oligonucleotide fusion sequence rebuilds the 3 'end of the receptor molecule to nucleotide 579 (amino acid 142), followed by a decision codon (underlined). This oligonucleotide was then ligated with the 10,550 bp Notl / AlwN1-TNF-R insert into Notl / Bgl2-cut pCAV / NOT to obtain the expression vector psol-TNF-R-delta-142 / CAVNOT, which was transfected with COS- 7 cells as described above. This expression vector did not induce the expression of soluble human TNF-R, which would be capable of binding TNF. It is believed that this particular structure was unable to express biologically active TNF-R because one or more of the essential cysteine residues (e.g., Cys157 or Cys163) necessary for intracellular binding (to form the correct tertiary structure of TNF-R) were eliminated. .
Esimerkki 7Example 7
Liukoisten TNF-reseptorien ilmennys CHO-soluissa • · :**.· Liukoinen TNF-reseptori ilmennettiin kiinalaisen ; V hamsterin munasarja-(CHO-)soluissa käyttäen glutamiinisyn- 25 tetaasi- (GS-) geenimonistussysteemiä, oleellisesti kuten kuvataan PCT-patenttihakemusjulkaisuissa nrot WO 87/04 462 ja WO 89/01 036. Lyhyesti, CHO-solut transfektoidaan il- .··*. mennysvektorilla, joka sisältää geenit sekä TNF-R:lle että « · GS:lle. CHO-solut valikoidaan GS-geeni-ilmennyksen suhteen . 30 transfektoidun DNA:n kyvyn nojalla tuottaa resistenssi al haisille metioniinisulfoksimiini- (MSX-) tasoille. GS- » * ···* sekvenssimonistustapahtumat tällaisissa soluissa valikoi- ·:·; daan käyttäen korkeampia MSX-pitoisuuksia. Tällä tavalla .;·· jatkuvat TNF-R-sekvenssit vahvistuvat myös ja päästään te- 35 hostuneeseen TNF-R-ilmennykseen.Expression of soluble TNF receptors in CHO cells • ·: ** Soluble TNF receptor was expressed in Chinese; V hamster ovary (CHO) cells using the glutamine synthetase (GS) gene amplification system, essentially as described in PCT Patent Application Nos. WO 87/04462 and WO 89/01036. Briefly, CHO cells are transfected with II. · *. gene vector containing genes for both TNF-R and «· GS. CHO cells are selected for GS gene expression. The ability of 30 transfected DNA to confer resistance to low levels of methionine sulfoximine (MSX). GS- »* ··· * sequence amplification events in such cells selectively: ·; using higher concentrations of MSX. In this way; ·· continuous TNF-R sequences are also amplified and enhanced TNF-R expression is achieved.
• · 108645 41 GS-ilmennyssysteemissä käytetty vektori oli psol-TNF-R/P6/PSVLGS, joka rakennettiin seuraavasti. Ensin vektori pSVLGS.l (jota kuvataan PCT-patenttihakemusjulkaisuissa nrot WO 87/04462 ja WO 89/01036 ja jota on saa-5 tavana valmistajalta Celltech, Ltd., Berkshire, UK) leikattiin BamHI-restriktioentsyymillä ja defosforyloitiin vasikansuolen alkalisella fosfataasilla (CIAP) vektorin sisäisen uudelleenligatoitumisen estämiseksi. BamHI:llä leikattu pSVLGS.1-fragmentti ligatoitiin sitten 2,4 ke:n 10 BamHI-Bgl2-fragmenttiin pEE6hCMV:stä (jota kuvataan PCT- patenttihakemus julkaisussa nro WO 89/01036, ja jota niinikään on saatavana valmistajalta Celltech), jota leikattiin Bgl2:11a, BamHI:llä ja Fspl:llä kahden saman kokoisen fragmentin muodostumisen välttämiseksi, jolloin saatiin 15 11,2 ke:n vektori, joka nimettiin p6/PSVLGS.1:ksi.The vector used in the GS expression system was psol-TNF-R / P6 / PSVLGS, constructed as follows. First pSVLGS.l vector (described in PCT Patent Application Publication Nos WO 87/04462 and WO 89/01036, and which is the receiver-5 tavana from Celltech, Ltd., Berkshire, UK) was cut with the restriction enzyme BamHI and dephosphorylated with calf intestinal alkaline phosphatase (CIAP) to prevent internal re-ligation of the vector. The BamHI-cleaved pSVLGS.1 fragment was then ligated to the 2.4 kb BamHI-Bgl2 fragment of pEE6hCMV (described in PCT Patent Application Publication No. WO 89/01036 and also available from Celltech), which was cleaved Bgl2, BamHI and Fsp1 to avoid the formation of two fragments of the same size, resulting in a 15 11.2 kb vector, designated p6 / PSVLGS.1.
pSVLGS.l sisältää glutamiinisyntetaasivalikointimerkki-geenin SV40-myöhäispromoottorin kontrollissa. BamHI-Bql2-fragmentti pEE6hCMV:stä sisältää ihmisen sytomegaloviruk-sen pääasiallisen välittömän varhaispromoottorin (hCMV), 20 polyliittäjän ja SV40-varhaispolyadenylaatiosignaalin.pSVLGS.l contains the glutamine synthetase selection marker gene under the control of the SV40 late promoter. The BamHI-Bq12 fragment from pEE6hCMV contains the major human cytomegalovirus immediate early promoter (hCMV), a poly-linker, and the SV40 early polyadenylation signal.
Liukoisen TNF-R:n koodisekvenssit lisättiin p6/-PSVLGS.l:een leikkaamalla Notl-BamHI-fragmentti ilmennys- :·'.· vektorista psol-TNF-R/CAVNOT (joka valmistettiin edeltävän · # ; esimerkin 3 mukaan) tasaamalla päät Klenow-entsyymilla ja 25 ligatoimalla Smal:llä leikattuun defosforyloituun p6/PS- VLGS.l:een, jolloin sol-TNF-R-koodisekvenssit sijoitettiin » » * .*·. hCMV-promoottorin kontrolliin. Tästä saatiin yksittäinen ,*··. plasmidivektori, jossa SV40/GS- ja hCMB/sol-TNF-R-kopioin- tiyksiköt kopioidaan vastakkaisiin suuntiin. Tämä vektori 30 nimettiin psol-TNF-R/P6/PSVLGS:ksi.Soluble TNF-R coding sequences were inserted into p6 / -PSVLGS.l by cleaving the NotI-BamHI fragment from expression vector: psol-TNF-R / CAVNOT (prepared according to the above · #; Example 3), aligning the ends. Klenow and ligation with SmaI-dephosphorylated p6 / PS-VLGS.1, whereby the sol-TNF-R code sequences were inserted »» *. * ·. hCMV promoter control. This resulted in a single, * ··. a plasmid vector in which the SV40 / GS and hCMB / sol-TNF-R copy units are copied in opposite directions. This vector was designated psol-TNF-R / P6 / PSVLGS.
psol-TNF-R/P6/PSVLGS:llä transfektoitiin CHO-K1->··* soluja (saatavana ATCC-talletuslaitoksesta, Rockville, MD, ·:··· jossa hakunumero on CCL 61) seuraavasti. CHO-Kl-soluyksi- kerros kasvatettiin lähes yhteenkasvavaksi minimivaatimus-,·. 35 kasvualustassa (MEM), 10X (Gibco: 330-1581AJ), joka ei si- 108645 42 sältänyt glutamiinia ja jota oli täydennetty 10 %:lla dia-lysoitua nautasikiöseerumia (Gibco: 220-6300AJ), pitoi suudella 1 mM natriumpyruvaatti (Sigma), MEM-ei-välttämät-tömillä aminohapoilla (Gibco: 320-1140AG), pitoisuudella 5 500 μΜ asparagiini ja glutamaatti (Sigma) ja nukleosideil- la (30 μΜ adenosiini, guanosiini, sytidiini ja uridiini ja 10 μΜ tymidiini) (Sigma).CHO-K1-> ·· * cells (available from ATCC Depository, Rockville, MD, ·: ··· with accession number CCL 61) were transfected with psol-TNF-R / P6 / PSVLGS. The CHO-K1 cell monolayer was grown to almost coexist with minimum requirement, ·. In 35 media (MEM), 10X (Gibco: 330-1581AJ), which did not contain 108645 42 glutamine free and supplemented with 10% dialyzed bovine serum (Gibco: 220-6300AJ), 1 mM sodium pyruvate (Sigma) ), MEM non-essential amino acids (Gibco: 320-1140AG), 5,500 μΜ asparagine and glutamate (Sigma) and nucleosides (30 μΜ adenosine, guanosine, cytidine and uridine and 10 μΜ thymidine) (Sigma) .
Noin 1 x 106 solua 10 cm:n petrimaljassa transfek-toitiin 10 pg:lla psol-TNF-R/P6/PSVLGS:ää käyttäen kal-10 siumfosfaattivakiosaostusta oleellisesti kuten ovat kuvanneet Graham ja van der Eb, Virology 52 (1983) 456. Soluihin kohdistettiin glyserolishokki (15 % glyserolia seerumia ei sisältävässä kasvualustassa noin 1,5 minuutin ajan) noin 4 tunnin kuluttua transfektoinnista oleelli-15 sesti kuten ovat kuvanneet Frost ja Williams, Virology 91 , (1978) 39, minkä jälkeen ne pestiin seerumia ei sisältä vällä kasvualustalla. Päivää myöhemmin transfektoiduille soluille annettiin tuoretta selektiivistä kasvualustaa, joka sisälsi MSXtää loppupitoisuuden 25 μΜ. 3-4 viikon 20 kuluttua voitiin nähdä MSX-resistenttien eloonjääneiden solujen muodostamia pesäkkeitä. Eloonjääneet pesäkkeet siirrettiin 24-kuoppaisille levyille, ja niiden annettiin ' .* kasvaa yhteen selektiivisessä kasvualustassa. Käsitellystä ; kasvualustasta yhteenkasvaneita soluja käsittävistä kuo- . 25 pistä määritettiin sitten liukoisen TNF-R:n aktiivisuus käyttäen edellä esimerkissä 1 kuvattua sitoutumismääritys-tä. Määritykset osoittivat, että pesäkkeet ilmensivät bio-logisesti aktiivista liukoista TNF-R:ää.Approximately 1 x 10 6 cells in a 10 cm petri dish were transfected with 10 µg psol-TNF-R / P6 / PSVLGS using calcium 10 phosphate constant precipitation essentially as described by Graham and van der Eb, Virology 52 (45) (1983). Cells were subjected to glycerol shock (15% glycerol in serum-free medium for about 1.5 minutes) approximately 4 hours after transfection as described essentially by Frost and Williams, Virology 91, (1978) 39, followed by serum-free washing. growth platform. One day later, transfected cells were given fresh selective medium containing MSX at a final concentration of 25 μΜ. After 3-4 weeks, colonies of MSX-resistant surviving cells could be seen. The surviving colonies were transferred to 24-well plates and allowed to grow together in a selective medium. Processed; medium containing monolayer cells. From 25 points, soluble TNF-R activity was then determined using the binding assay described in Example 1 above. Assays showed that the colonies expressed soluble TNF-R biologically active.
< » GS-geenivahvistuksen suhteen valikoimiseksi useita , 30 MSX-resistenttejä solulinjoja transfektoidaan psol-TNF- R/P6/PSVLGS:llä ja kasvatetaan eri MSX-pitoisuuksissa.To select for GS gene amplification, several MSX-resistant cell lines are transfected with psol-TNF-R / P6 / PSVLGS and grown at various concentrations of MSX.
···* Kustakin solulinjasta noin 1 x 106 solua maljoitetaan vä- ;··: hittäin kasvaviin pitoisuuksiin 100 μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ ja 1 mM MSX ja inkuboidaan 10 - 14 päivän ajan. 12 päivän ku-35 luttua korkeammille MSX-tasoille resistenttejä pesäkkeitä 108645 43 tulee näkyviin. Eloonjääneistä pesäkkeistä määritetään TNF-R-aktiivisuus käyttäen edellä esimerkissä 1 kuvattua sitoutumismääritystä. Kukin näistä hyvin resistentistä so-lulinjasta sisältää soluja, jotka syntyvät monista riippu-5 mattomista monistustapahtumista. Näistä solulinjoista eristetään yksi tai useampi kaikkein resistenteimmistä so-lulinjoista. Vahvistettuja soluja, joiden tuotantotehot ovat korkeita, kloonataan sitten rajaavan laimentamisen kloonauksella. Transfektanttien massasoluviljelmät erittä-10 vät aktiivista liukoista TNF-R:ää.··· * Approximately 1 x 106 cells from each cell line are plated at high concentrations of 100 μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ and 1 mM MSX and incubated for 10-14 days. After 12 days at-35, colonies resistant to higher levels of MSX 108645 43 appear. Surviving colonies are assayed for TNF-R activity using the binding assay described in Example 1 above. Each of these highly resistant cell lines contains cells generated by a number of independent replication events. One or more of the most resistant cell lines are isolated from these cell lines. Fortified cells with high production efficiencies are then cloned by limiting dilution dilution. Cell cultures of transfectants secrete active soluble TNF-R.
Esimerkki 8Example 8
Liukoisen humaani-TNF-R:n ilmentäminen hiivassaExpression of soluble human TNF-R in yeast
Liukoinen humaani-TNF-R ilmennettiin hiivassa käyttäen ilmennysvektoria pIXY432, joka saatiin hiivail-15 mennysvektorista pIXY120 ja plasmidista pYEP352. pIXY120 on identtinen pYaHuGMrään (ATCC 53157) nähden lukuunottamatta, että se ei sisällä cDNA-inserttiä ja sisältää po-lyliittäjä/monikloonauskeskuksen, jossa on Ncol-restrik-tiokeskus.Soluble human TNF-R was expressed in yeast using the expression vector pIXY432 obtained from the yeast expression vector pIXY120 and plasmid pYEP352. pIXY120 is identical to pYaHuGM (ATCC 53157) except that it does not contain a cDNA insert and contains a poly-linker / multi-cloning center with an Nco I restriction site.
20 DNA-fragmentti, joka koodittaa TNF-reseptoria ja sopii kloonattavaksi hiivailmennysvektoriin pIXY120, muodostettiin ensin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) vahvis-·.1 .1 tamalla solunulkoista osaa täysimittaisesta reseptorista pCAV/NOT-TNF-R: stä (ATCC 68088). Tässä PCR-monistuksessa . 25 käytettiin seuraavia alukkeita: • » · » · • 1 • · ♦ » M • · > · I i i 141·· • · * I · » » t · · » » · 108645 44 5'-pääaluke: 5'-TTCCGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGAC Asp718->ProLeuAspLysArgAspTyrLysAsp 5 GACGATGACAAGTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTACA-3'The 20 DNA fragment encoding the TNF receptor and suitable for cloning into the yeast expression vector pIXY120 was first generated by a polymerase chain reaction (PCR) amplification of the .1.11 extracellular portion of the full length receptor pCAV / NOT-TNF-R (ATCC 680). In this PCR amplification. The following primers were used: • »·» · • 1 • · ♦ »M • ·> · I ii 141 ·· • · * I ·» »t · ·» »· 108645 44 5'-main primer: 5'-TTCCGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGAC Asp718-> ProLeuAspLysArgAspTyrLysAsp 5 GACGATGACAAGTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTACA-3 '
AspAspAspLys<--------TNF-R---------> 3'-pääaluke (ei-tietosekvenssi): 10 5'-CCCGGGATCCTTAGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGCTGGG-3'AspAspAspLys <--------TNF-R---------> 3 'Master Primer (Non-Data Sequence): 10 5'-CCCGGGATCCTTAGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGCTGGG-3'
BamHl>Loppu<-----------TNF-R------>Bam> End <----------- TNF-R ------>
Monistuksessa käytetty 5'-pääoligonukleotidialuke sisälsi 5'-päässään Asp718-restriktiokeskuksen, ja sen 15 jälkeen nukleotidit, jotka koodittavat hiivan a-tekijäjoh-tosekvenssin 3'-päätä (Pro-Leu-Asp-Lys-Arg), sekä nukleotidit, jotka koodittavat 8 aminohappoa FlagR-peptidistä (AspTyrLysAspAspAspAspLys) fuusioituna sekvenssiin, joka koodittaa kypsän reseptorin 5'-päätä. FlagR-peptidi (Hopp 20 et ai., Bio/Technoloqy 6 (1988) 1204) on hyvin antigeeninen sekvenssi, joka sitoo reversiibelisti monoklonaalisen vasta-aineen Ml (ATCC HB 9259). Oligonukleotidi, jota käy-tettiin PCR-peräisen fragmentin 3'-pään muodostamiseksi, • on ei-tietosäie DNA-koodisekvensseistä, jotka päättävät 25 reseptorin avoimen lukualueen kypsän koodialueen nukleoti- din 704 jälkeen (Asp-tähteen jälkeen, joka edeltää trans-membraanialuetta) tuomalla TAA-lopetuskodonin (alleviivat-.··, tu) . Lopetuskodonia seuraa sitten BamHI-restriktiokeskus.The 5 'major oligonucleotide primer used for amplification contained an Asp718 restriction site at its 5' end followed by nucleotides encoding the 3 'end of the yeast α-factor leader sequence (Pro-Leu-Asp-Lys-Arg) and nucleotides encoding 8 amino acids from the FlagR peptide (AspTyrLysAspAspAspAspLys) fused to the sequence encoding the 5 'end of the mature receptor. The FlagR peptide (Hopp 20 et al., Bio / Technoloqy 6: 1204 (1988)) is a highly antigenic sequence that reversibly binds monoclonal antibody M1 (ATCC HB 9259). The oligonucleotide used to generate the 3 'end of the PCR-derived fragment is a non-coding strand of DNA code sequences that terminate the open reading region of the 25 receptor after nucleotide 704 (after the Asp residue preceding the trans membrane region). by importing the TAA termination codon (underlined. ··, tu). The stop codon is then followed by the BamHI restriction center.
TNF-R:ää koodittavat DNA-sekvenssit vahvistetaan sitten . 30 PCR:llä, oleellisesti kuten ovat kuvanneet Innis et ai., toim., "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applica- ·;·* tions", Academic Press, 1990.The DNA sequences encoding TNF-R are then amplified. 30 PCR, essentially as described by Innis et al., Ed., "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicants," Academic Press, 1990.
·:**: Liukoista humaani-TNF-R:ää koodittava PCR:llä saa- ·;···, tu DNA-fragment ti alakloonattiin hiivailmennysvektoriin 35 pIXY120 pilkkomalla PCR:llä saatu DNA-fragmentti BamHI- ja 108645 45·: **: The DNA fragment ti obtained by PCR encoding soluble human TNF-R was subcloned into the yeast expression vector 35 pIXY120 by digestion with BamHI and 108645 by PCR.
Asp718-restriktioentsyvmeillä, pilkkomalla pIXYl20 Bam-HI:llä ja Asp718:11a ja ligatoimalla PCR-fragmentti leikattuun vektoriin in vitro T4-DNA-ligaasia käyttäen. Saatu rakenne (pIXY424) fuusioi FlagR-liukoisen TNF-reseptorin 5 avoimen lukualueen lukualueella täydelliseen a-teki- jäjohtosekvenssiin ja sijoitti ilmennyksen hiivassa säädellyn hiiva-alkoholidehydrogenaasi-(ADH2-)promoottorin säätelyyn. pIXY424:ään sisältyvän liukoisen TNF-reseptorin nukleotidisekvenssin identtisyys cDNA-klooni-1:n sisältä-10 miin nähden varmistettiin DNA-sekventoinnilla käyttäen di- deoksinukleotidiketjupäämenetelmää. pIXY424 transformoitiin sitten JL_ coli -kantaan RR1.Asp718 restriction enzymes, digestion of pIXY120 with Bam-HI and Asp718 and ligation of the PCR fragment into the cut vector in vitro using T4 DNA ligase. The resulting construct (pIXY424) fused the open reading region of the FlagR-soluble TNF receptor 5 to the complete α-factor leader sequence and inserted the expression into the yeast regulated yeast alcohol dehydrogenase (ADH2) promoter. The nucleotide sequence of the soluble TNF receptor contained in pIXY424 with respect to the content of cDNA clone-1 was confirmed by DNA sequencing using the dideoxynucleotide chain method. pIXY424 was then transformed into JL_ coli strain RR1.
Liukoinen humaani-TNF-reseptori ilmennettiin myös ja eritettiin hiivassa toisessa vektorissa. Tämä toinen 15 vektori muodostettiin ottamalla pIXY424-plasmidi talteen E. colista ja pilkkomalla EcoRI- ja BamHI-restriktioent-syymeillä fragmentin eristämiseksi, joka käsittää ADH2-promoottoria koodittavam alueen, a-tekijäjohtosekvenssin, FlagR-liukoisen TNF-reseptorin ja lopetuskodonin. Tämä 20 fragmentti ligatoitiin in vitro EcoRI:llä ja BamHI:llä leikattuun plasmidiin pYEP352 (Hill et ai., Yeast 2 (19869 163), jolloin saatiin ilmennysplasmidi pIXY432, joka transformoitiin Eh_ coli -kantaan RR1.Soluble human TNF receptor was also expressed and secreted in yeast in another vector. This second vector was constructed by recovering plasmid pIXY424 from E. coli and digestion with EcoRI and BamHI to isolate a fragment comprising the ADH2 promoter coding region, the? -Factor leader sequence, the FlagR-soluble TNF receptor and the stop codon. This fragment was ligated in vitro with EcoRI and BamHI cut plasmid pYEP352 (Hill et al., Yeast 2 (19869 163)) to give expression plasmid pIXY432, which was transformed into Eh1 coli strain RR1.
• Liukoisen humaani-TNF-reseptorin erityksen hiivas- . : : 25 ta määrittämiseksi pIXY424 puhdistettiin ja vietiin dip- loidiseen S_;_ cerevisiae -hiivakantaan (XV2181) elektropo-raatiolla ja valikoimalla plasmidin käsittämän hiiva- * * · ,*·, TRPl+-geenin siirtymisen suhteen kasvualustalla, josta puuttui tryptofaani. pIXY432:n ohjaaman reseptorierityksen . 30 määrittämiseksi plasmidi vietiin hiivakantaan PB149-6b elektroporaatiolla, minkä jälkeen valikoitiin plasmidin ···* käsittämän URA3+-geenin suhteen kasvattamalla kasvualus- :··: talla, josta puuttui urasiili. Yön yli kasvaneita viljel- ·;·· miä kasvatettiin 30 °C:ssa tarkoituksenmukaisessa selek- 35 tiivisessä kasvualustassa. PB149-6b/pIXY434-transformantit 108645 46 1 laimennettiin YEP-1 % glukoosi-kasvualustaan ja kasvatet tiin lämpötilassa 30 °C 38 - 40 tunnin ajan. Supernatantit valmistettiin poistamalla solut sentrifugoimalla ja suodattamalla supernatantit 0,45 μ:η suodattimien läpi.Soluble human TNF receptor secretion in yeast. For determination, pIXY424 was purified and introduced into the diploid S. cerevisiae yeast strain (XV2181) by electroporation and selection for plasmid-containing yeast * * ·, * ·, TRP1 + gene in medium lacking tryptophan. pIXY432-driven receptor secretion. To determine 30, the plasmid was introduced into the yeast strain PB149-6b by electroporation, followed by selection for the ··· * URA3 + gene containing plasmid by growth medium lacking uracil. Overnight cultures were grown at 30 ° C in an appropriate selective medium. PB149-6b / pIXY434 Transformants 108645 46 L were diluted in YEP-1% glucose medium and grown at 30 ° C for 38-40 hours. Supernatants were prepared by removing the cells by centrifugation and filtering the supernatants through 0.45 μ η filters.
5 Eritetyn reseptorin taso supernatanteissa määri tettiin immuuni-piste blot -määrityksellä. Lyhyesti, 1 μΐ supernatantteja ja supernatanttien laimennoksia tiputettiin nitroselluloosasuodattimille ja annettiin kuivaa. Ei-spesifinen proteiinisitoutuminen salvattiin 3-%:isella 10 BSA-liuoksella, minkä jälkeen suodattimia inkuboitiin lai mennetulla Ml-anti-FlagR-vasta-aineella ja ylimääräinen vasta-aine poistettiin pesemällä, minkä jälkeen edelleen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitujen anti-hiiri-IgG-vas-ta-aineiden laimennoksia inkuboitiin suodattimien kanssa.The level of secreted receptor in the supernatants was determined by immuno-dot blot. Briefly, 1 μΐ of supernatants and dilutions of supernatants were dropped on nitrocellulose filters and allowed to dry. Non-specific protein binding was blocked with 3% BSA, followed by incubation of the filters with diluted M1 anti-FlagR antibody and removal of excess antibody by washing followed by further horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody. dilutions were incubated with filters.
15 Ylimääräiset sekundaarivasta-aineet poistettiin, minkä jälkeen peroksidaasisubstraatit lisättiin ja värinkehityk-sen annettiin kestää noin 10 minuuttia ennen kuin sub-straattiliuos poistettiin.Excess secondary antibodies were removed, after which the peroxidase substrates were added and the color development allowed for approximately 10 minutes before the substrate solution was removed.
Supernatanteista tavattu anti-FlagR-reaktiivinen 20 materiaali osoitti, että merkittäviä reseptoritasoja erit tyi kummassakin ilmennyssysteemissä. Vertailut osoittivat, että pIXY432-systeemi eritti noin 8-16 kertaa enemmän V liukoista humaani-TNF-reseptoria kuin pIXY424-systeemi.The anti-FlagR reactive material found in the supernatants showed that significant levels of receptors were secreted in both expression systems. Comparisons showed that the pIXY432 system secreted about 8-16 times more V soluble human TNF receptor than the pIXY424 system.
Supernatanteista määritettiin liukoisen TNF-R:n aktiivi-, : 25 suus kuten kuvattiin esimerkissä 1 niiden kyvyn nojalla sitoa 125I-TNF-a:aa ja salava TNF-a-sitoutumista. pIXY432-The supernatants were assayed for solubility of soluble TNF-R as described in Example 1 by their ability to bind 125 I-TNF-α and to block TNF-α binding. pIXY432-
• I I• I I
supernatanttien todettiin sisältävän merkittäviä tasoja • * · .···. aktiivista liukoista TNF-R:ää.supernatants were found to contain significant levels • * ·. ···. active soluble TNF-R.
Esimerkki 9 . 30 Hiiri-TNF-R-cDNA-sekvenssien eristäminen fin· I ·Example 9. 30 Isolation of murine TNF-R cDNA sequences fin · I ·
Hiiri-TNF-R-cDNA-sekvenssejä eristettiin cDNA-kir-;*’ jastosta, joka oli valmistettu hiiren 7B9-solulinjasta, ·;··: joka on antigeeniriippuvainen avustaja-T-solulinja, joka .;··· saadaan C57BL/6-hiiristä, ristilajihydridisaatiolla humaa- 35 ni-TNF-R-koettimeen. cDNA-kir jasto rakennettiin lambda- * i • * · 108645 47 ZAP:iin (Stratagene, San Diego), oleellisesti kuten kuvattiin edellä esimerkissä 2, eristäen polyadenyloitu RNA 7B9-soluista.Mouse TNF-R cDNA sequences were isolated from a cDNA library constructed from the mouse 7B9 cell line, ·; ··: an antigen-dependent helper T cell line; 6 mice by cross-species hydration to a human TNF-R probe. The cDNA library was constructed with lambda * * 108645 47 ZAP (Stratagene, San Diego), essentially as described above in Example 2, isolating polyadenylated RNA from 7B9 cells.
Kaksisäikeinen humaani-TNF-R-cDNA-koetin valmis-5 tettiin leikkaamalla noin 3,5 ke:n NotI-fragmentti humaa-ni-TNF-R-klooni-1:stä ja 32P-leimaamalla cDNA käyttäen sa-tunnaisalukkeita (Boehringer-Mannheim).The double-stranded human TNF-R cDNA probe was prepared by cutting a NotI fragment of about 3.5 kb from human TNF-R clone-1 and 32 P-labeled cDNA using random primers (Boehringer- Mannheim).
Hiiri-cDNA-kirjasto vahvistettiin kerran ja kaikkiaan 900 000 plakkia seulottiin, oleellisesti kuten ku-10 vattiin esimerkissä 2, humaani-TNF-R-cDNA-koettimellä.The mouse cDNA library was amplified once and a total of 900,000 plaques were screened, essentially as described in Example 2, with a human TNF-R cDNA probe.
Noin 21 positiivista plakkia puhdistettiin ja sinikopio-plasmidit, jotka sisälsivät EcoRI-liitteisiä inserttejä, leikattiin (Stratagene, San Diego). Osan hiiri-TNF-R-klooni-ll:tä nukleiinihapposekventointi osoitti, että hii-15 ri-TNF-R:n koodisekvenssi oli noin 88-%:isesti homologinen vastaavaan humaani-TNF-R-nukleotidisekvenssiin nähden. Hiiri-TNF-R-cDNA-klooni-11:n osanukleotidisekvenssi esitetään kuvioissa 4-5.About 21 positive plaques were purified and Sini copy containing plasmids containing Eco RI inserts were cut (Stratagene, San Diego). Nucleic acid sequencing of a portion of murine TNF-R clone-II showed that the coding sequence for hii-15 ri-TNF-R was approximately 88% homologous to the corresponding human TNF-R nucleotide sequence. The partial nucleotide sequence of murine TNF-R cDNA clone-11 is shown in Figures 4-5.
Esimerkki 10 20 TNF-R-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusExample 10 Preparation of Monoclonal Antibodies Against TNF-R
Valmisteita puhdistetusta yhdistelmä-DNA-TNF- * » R:stä, esimerkiksi humaani-TNF-R:stä, tai transfektoituja ; V COS-soluja, jotka ilmentävät korkeita TNF-R-tasoja, käy- • # .#!t! 25 tetään TNF-R-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden muodostamiseksi tavanomaisia tekniikoita käyttäen, esimer-kiksi US-patenttijulkaisussa 4 411 993 kuvattuja. Täl-laiset vasta-aineet ovat todennäköisesti käyttökelpoisia osina TNF:n tai liukoisen TNF-reseptorin diagnoosi- tai , 30 tutkimusmäärityksiä.Preparations from purified recombinant TNF-R, e.g. human TNF-R, or transfected; V COS cells expressing high levels of TNF-R visit • #. #! T! 25 to form monoclonal antibodies against TNF-R using conventional techniques, for example those described in U.S. Patent No. 4,411,993. Such antibodies are likely to be useful as part of diagnostic assays for TNF or soluble TNF receptor.
Hiirten immunoimiseksi TNF-R-immunogeeni emulgoi-daan täydelliseen Freundin tehosteeseen ja ' määrä 10 -100 pg ruiskutetaan ihonalaisesti Balb/c-hiiriin. 10 - 12 ·;· päivän kuluttua immunoiduille eläimille annetaan tehostee- ,35 na lisää immunogeenia emulgoituna epätäydelliseen Freundin I < 108645 48 tehosteeseen, minkä jälkeen annetaan ajoittainen tehoste 1-2 viikon immunointiohjelman mukaisesti. Silloin tällöin otetaan seeruminäytteitä laskemalla verta silmäkuopan takaa tai leikkaamalla hännänpäätä analyysiä varten blot-5 pistemäärityksellä (vasta-aine-sandwich) tai ELISA:11a (entsyymiliitteinen immuunisorbenttimääritys). Muutkin määritysmenettelyt ovat sopivia. Kun tarkoituksenmukainen vasta-ainetiitteri on todettu, positiivisille eläimille annetaan laskimonsisäinenä ruiskeena antigeeniä suolaliu-10 oksessa. 3-4 päivän kuluttua eläimet uhrataan, pernasolut otetaan talteen ja fuusioidaan hiiren myeloo-masolulinjaan NS1. Tällä menettelyllä muodostettuja hyb-ridoomasolulinjoja maljataan useille mikrotiitterilevyille selektiiviseen HAT-kasvualustaan (hypoksantiini, aminopte-15 riini ja tymidiini) ei-fuusioitujen solujen, mye-loomahybridien ja pernasoluhybridien lisääntymisen estämiseksi .To immunize mice, TNF-R immunogen is emulsified in complete Freund's booster and injected subcutaneously in an amount of 10-100 pg into Balb / c mice. After 10 to 12 days, immunized animals are boosted with 35 additional immunogens emulsified in incomplete Freund's I <108645 48 followed by intermittent boost according to a 1-2 week immunization program. Occasionally, serum samples are taken by counting blood from behind the eye or by cutting the tail end for analysis by blot-5 spot (antibody-sandwich) or ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Other assay procedures are appropriate. Once an appropriate antibody titer has been determined, positive animals are given an intravenous injection of antigen in saline. After 3-4 days, the animals are sacrificed, the spleen cells are harvested and fused to the murine myeloma cell line NS1. The hybridoma cell lines generated by this procedure are plated on multiple microtiter plates in selective HAT medium (hypoxanthine, aminopterin and thymidine) to prevent proliferation of non-fused cells, myeloma hybrids and spleen cell hybrids.
Näin muodostetut hybridoomakloonit voidaan seuloa ELISA:11a reaktiivisuuden suhteen TNF:lle, esimerkiksi 20 käyttäen muunnoksia tekniikoista, joita ovat julkistaneet Engvall et ai., Immunochem. 8 (1971) 871; ja joita julkistetaan US-patenttijulkaisussa 4 703 004. Positiivisia klooneja ruiskutetaan sitten syngeenisten Balb/c-hiirten ‘ 1f! vatsaonteloon vatsaontelonesteen tuottamiseksi, joka si- ,Y: 25 sältää korkeita pitoisuuksia (> 1 mg/ml) anti-TNF-R-mono- klonaalista vasta-ainetta. Saatu monoklonaalinen vasta-aine voidaan sitten puhdistaa ammoniumsulfaatilla saosta- ,···, maila ja suorittamalla sitten geeliekskluusiokromatografia 1 · ja/tai affiniteettikromatografia nojautuen vasta-aineen . 30 sitoutumiseen proteiini-A:hän Staphylococcus aureuksesta.The hybridoma clones thus formed can be screened by ELISA for reactivity to TNF, for example, using modifications of the techniques disclosed by Engvall et al., Immunochem. 8, 871 (1971); and disclosed in U.S. Patent No. 4,703,004. Positive clones are then injected into the '1f !, syngeneic Balb / c mice. intraperitoneal to produce an intraperitoneal fluid containing high concentrations (> 1 mg / ml) of an anti-TNF-R monoclonal antibody. The resulting monoclonal antibody can then be purified with ammonium sulfate by precipitation, ···, racket and then subjected to gel exclusion chromatography 1 and / or affinity chromatography on the antibody. 30 binding to protein A: from Staphylococcus aureus.
UM i « I < 1 t · * » 1 1 » ·UM i «I <1 t · *» 1 1 »·
Claims (7)
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US40324189A | 1989-09-05 | 1989-09-05 | |
US40324189 | 1989-09-05 | ||
US40537089A | 1989-09-11 | 1989-09-11 | |
US40537089 | 1989-09-11 | ||
US42141789A | 1989-10-13 | 1989-10-13 | |
US42141789 | 1989-10-13 | ||
US9004001 | 1990-07-17 | ||
PCT/US1990/004001 WO1991003553A1 (en) | 1989-09-05 | 1990-07-17 | TUMOR NECROSIS FACTOR-α AND -β RECEPTORS |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI20000833A FI20000833A (en) | 2000-04-07 |
FI108645B true FI108645B (en) | 2002-02-28 |
Family
ID=27410535
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI920946A FI105099B (en) | 1989-09-05 | 1992-03-03 | Method for Preparation of a Biologically Active Tumor Necrosis Factor Receptor Protein of Mammalian Origin and DNA Encoding This |
FI20000833A FI108645B (en) | 1989-09-05 | 2000-04-07 | Tumor necrosis factor alpha and beta receptors |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI920946A FI105099B (en) | 1989-09-05 | 1992-03-03 | Method for Preparation of a Biologically Active Tumor Necrosis Factor Receptor Protein of Mammalian Origin and DNA Encoding This |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
FI (2) | FI105099B (en) |
NO (2) | NO312769B1 (en) |
-
1992
- 1992-03-03 FI FI920946A patent/FI105099B/en active Protection Beyond IP Right Term
- 1992-03-04 NO NO19920862A patent/NO312769B1/en not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-04-07 FI FI20000833A patent/FI108645B/en active
-
2002
- 2002-12-30 NO NO2002015C patent/NO2002015I1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO920862D0 (en) | 1992-03-04 |
FI20000833A (en) | 2000-04-07 |
FI105099B (en) | 2000-06-15 |
FI920946A0 (en) | 1992-03-03 |
NO2002015I1 (en) | 2003-02-03 |
NO920862L (en) | 1992-05-04 |
NO312769B1 (en) | 2002-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2960039B2 (en) | Tumor necrosis factor-α and -β receptors | |
US5395760A (en) | DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors | |
CA2065346C (en) | Tumor necrosis factor-.alpha. and-.beta. receptors | |
US5945397A (en) | Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides | |
JP4392058B2 (en) | Oncostatin M receptor | |
EP0604418B1 (en) | Isolated viral protein cytokine antagonists | |
AU647566B2 (en) | Leukemia inhibitory factor receptors | |
US5464938A (en) | Isolated viral protein TNF antagonists | |
IE66494B1 (en) | Granulocyte-colony stimulating factor receptors | |
IE66249B1 (en) | Interleukin-7 receptors | |
WO1991005046A1 (en) | Granulocyte-colony stimulating factor receptors | |
FI108645B (en) | Tumor necrosis factor alpha and beta receptors | |
IE911108A1 (en) | Isolated Viral Protein Cytokine Antagonists | |
DD297664A5 (en) | TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA AND BETA RECEPTORS |