CN101043947B

CN101043947B - 一种纯化抗体的方法

Info

Publication number: CN101043947B
Application number: CN2005800360754A
Authority: CN
Inventors: C·恩格斯特兰德; A·福尔斯; G·格拉德; B·-L·约翰森; H·J·约翰森; J·-L·马洛伊塞尔
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Bioprocess R&D AB
Priority date: 2004-10-21
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2025-10-21
Also published as: SE0402558D0; CN101060931A; CN101060931B; CN101043947A

Abstract

本发明涉及一种将液体样品中的抗体与其他化合物分离的方法，其中将包含所述样品的流动相与多模式分离基质接触，从而吸附不需要的化合物而所述抗体在所述液体中仍保持游离，其中所述多模式分离基质包含能够与所述目标化合物的带负电荷的位点相互作用的第一基团以及能够与所述目标化合物进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团。本发明还涉及装填有以上所描述的多模式分离基质的色谱柱及具有吸附到其表面的这种多模式基团的滤料。

Description

一种纯化抗体的方法

技术领域

本发明涉及一种纯化抗体的方法。例如，可以基于粗原料使用所述方法，或者作为亲和色谱处理之后的步骤来除去残存杂质和从所述亲和树脂中泄漏的物质。本发明还包括一种用于纯化抗体的成套组件。

背景技术

免疫系统由许多相互依赖的细胞类型组成，这些细胞类型共同防止身体免于细菌、寄生虫、真菌及病毒感染以及防止肿瘤细胞的生长。免疫系统的守卫者为巨噬细胞，它们连续地随其宿主的血流漫游。当被感染或免疫机制激发时，巨噬细胞通过吞噬标记有被称为抗原的外来分子的侵入病菌来予以响应。由辅助性T细胞介导的该事件引起复杂的响应链条从而导致B细胞激化。接着，这些B细胞产生被称为抗体的蛋白质，其与所述外来入侵者结合。所述抗体与抗原之间的结合事件标记用于经由噬菌作用或补体系统的活化的破坏的所述外来入侵者。存在着许多不同种类的抗体，亦称为免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。它们的差异不仅在于它们的生理学作用而且在于它们的结构。基于结构视角，现有技术已经广泛研究了IgG抗体，这或许是因为它们在成年人的免疫响应中扮演着主导性角色。多克隆抗体是根据标准方法通过用适当的抗原引起动物免疫来制备的。在响应过程中，所述动物将产生多克隆的抗体。但是，出于诸多目的，人们希望拥有被称为单克隆抗体的某一抗体的单个克隆。单克隆抗体(Mabs)通过由仅产生单一抗体的正常B细胞与异常骨髓瘤肿瘤细胞间的融合组成的杂交或融合细胞来产生。近来，将所得到的被称为杂交瘤的杂交细胞用在标准方法中用于制备抗体。

现今，免疫球蛋白所具有的生物活性在人类及兽医诊断、保健及治疗部门中得到大范围的不同应用。事实上，近几年来，单克隆抗体及重组抗体的构建已经成为目前临床试验中所研究的并获得FDA批准作为治疗法及诊断法的最庞大的蛋白质种类。与表达系统及制备策略互补，需要高效纯化流程来以简单并且低成本的方式获得高纯度的抗体。

用于分离免疫球蛋白的传统方法是基于包含所述免疫球蛋白的蛋白质部分的选择性可逆沉淀而将其他类的蛋白质留在溶液中。典型的沉淀剂为乙醇、聚乙二醇、易溶盐例如硫酸铵及磷酸钾、以及辛酸。一般地，这些沉淀法得到非常不纯的产物而且同时耗时费工。此外，所述沉淀剂向原材料中的添加使得难以将上清液用于其他目的而产生排放问题，当论及免疫球蛋白的大规模纯化时，这一问题尤其需要加以关注。

一种用于免疫球蛋白分离的可选方法为色谱法，其包括一系列相近关联的分离方法。色谱法区别于大多数其他物理及化学分离方法的特征在于将两种相互不混溶的相相接触，其中一相为固定的而另一相为流动的。当引入流动相中的样品混合物被流动相载运通过系统时，与固定相及流动相进行一系列相互作用。相互作用利用所述样品中组分的物理或化学性质的差异。这些差异决定单个组分在流过包含固定相的色谱柱的流动相的影响下的迁移速度。所分离的组分按照与所述固定相的相互作用渐增的次序出来。最少阻滞的组分首先被洗脱，而最强保留的材料最后被洗脱。当一种组分被足够阻滞从而防止与作为从所述柱洗脱的样品组分的相邻溶质区带重叠时，则实现分离。现在不断地进行着努力来设计用于每个特定分离目的的最佳固定相。这种固定相通常由已经连接有包含官能团即结合基团的配体的载体或基础基质(base matrix)组成。通常基于其利用的相互作用的原则引用每种色谱法，例如离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法及亲和色谱法。

离子交换色谱法经常在用于分离免疫球蛋白的流程中被使用。在阴离子交换色谱法中，免疫球蛋白的带负电荷的氨基酸侧链将与色谱基质的带正电荷的配体相互作用。在另一方面，在阳离子交换色谱法中，免疫球蛋白的带正电荷的氨基酸侧链将与色谱基质的带负电荷的配体相互作用。

疏水性相互作用色谱法(HIC)是所描述的并在用于分离免疫球蛋白的流程中使用的另一种方法。如果目的是获得高纯度的免疫球蛋白产物，通常推荐将HIC与一个或多个进一步的步骤相结合。在HIC中，为了使所述免疫球蛋白有效地结合到HIC基质，需要将易溶盐添加到所述流动相中。随后通过降低易溶盐的浓度来将所结合的免疫球蛋白从所述基质释放。因此，该过程的缺点是需要将易溶盐添加到原材料中，由此可能带来问题并因之提高大规模使用者的成本。例如，对于原材料例如乳清、血浆及蛋黄，向所述原材料中加入易溶盐在许多情况下将在大规模应用中被禁止，因为所述盐可能妨碍所述免疫球蛋白已被耗尽的原材料的任何经济上可行的使用。以大规模方式应用的其他问题将是数千升废料的排放。

亲和色谱法基于目标生物分子与生物特异性配体之间以锁-匙识别原则的特定相互作用。因此，所述目标与配体将形成亲和对，例如抗原/抗体、酶/受体，等等。基于蛋白质的亲和配体为大家所熟知，例如蛋白A及蛋白G亲和色谱法，二者都是广泛使用的抗体分离及纯化方法。众所周知的是蛋白A色谱法提供显著的特异性，特别是对于单克隆抗体，并且因之可获得高纯度。将其与离子交换作用、疏水性相互作用、羟磷灰石和/或凝胶过滤步骤结合使用，基于蛋白A的方法已经成为许多生物制药公司选择的抗体纯化方法，参见，例如WO8400773及US 5,151,350。但是，由于所述蛋白质的肽键，蛋白A基质显示出一定程度的碱敏感性。另外，当将蛋白A基质用于从细胞培养基中纯化抗体时，来源于所述细胞的蛋白酶可引起蛋白A或其肽片段的泄漏。

在WO 03/041859(Boehringer Ingelheim Pharma KG)中已经介绍了减少来自亲和色谱法基质的配体泄漏的尝试，其中建议用至少一种表面活性剂预处理例如蛋白A基质从而减少配体泄漏。所述亲和基质可以被处理，例如用5-15倍柱床体积的表面活性剂。所述接触时间对于所述方法的效果是决定性的。例如，在室温下，需要至少16小时的接触时间用于减少泄漏。

US 4,983,722(Miles Inc.)中提供了一种解决来自亲和色谱法基质的配体泄漏问题的可选方法，其中蛋白A通过将其暴露于阴离子交换材料而从包含抗体及蛋白A的液体中被选择性分离。两种组分被吸附到所述阴离子交换材料上，然后在提高离子强度的条件下顺序洗脱所述抗体及蛋白A。示例性的阴离子交换剂为二乙基氨基乙基(DEAE)Trisacryl M或DEAE琼脂糖^TM。

WO 2004/076485(Lonza Biologies Plc.)涉及通过蛋白A及离子交换色谱法进行抗体纯化。所述离子交换作用步骤包括在允许蛋白A结合的条件下将所纯化的抗体加载在离子交换材料上的蛋白A上以及在流通液(flow-through)中收集所述抗体。所述阴离子交换剂为基于季铵的阴离子交换剂，最优选琼脂糖^TM Q(Amersham Biosciences，现在是GE Healthcare)。

US 5，429，746(SmithKline Beecham Corp.)涉及一种方法，其中所述抗体首先被吸附到蛋白A色谱载体上并洗脱；然后被吸附到阳离子交换色谱载体上并选择性地从该处洗脱；以及最后被吸附到HIC载体上并洗脱。施加于所述HIC柱且接着进行亲和和/或阳离子交换色谱处理的混合物可以包含免疫球蛋白聚集体、错误折叠的物种、宿主细胞蛋白及来自所述亲和色谱法步骤的残余材料。

US 6，498，236(Upfront Chromatography)涉及由基于蛋白质的亲和配体与目标免疫球蛋白之问分子量的小差异引起的具体问题。因此，公开了一种用于从溶液中分离或纯化免疫球蛋白的方法，所述溶液例如是杂交瘤细胞培养物上清液、动物血浆或血清(ser)，该方法被建议作为使用蛋白A、蛋白G、合成肽及其他相对高分子量的配体的一种代替。在所公开的方法中使用的固相基质由式M-SP1-X-A-SP2-ACID定义，其中M表示基质骨架，SP1表示间隔区(spacer)，X表示O、S或NH，A表示单或二环的任选地被取代的芳香族或杂芳香族部分，SP2表示任选的问隔区以及ACID表示酸性基团。所述具体的取代基被认为对于所述基质是否将有效地结合免疫球蛋白是决定性的。

US 5,945,520(Burton等)公开了混合模式的色谱树脂，其在结合的pH值下显示出疏水性特征并在解吸附的pH值下显示出亲水和/或静电特征。所述树脂被具体地设计来在低及高两种离子强度下都从水溶液中结合所述目标化合物。因此，所述吸附步骤使用HIC，而解吸附基于电荷排斥。

US 6,702,943(Johansson等)公开了一种通过将其吸附到带有多个包含阴离子交换基团及疏水性结构的配体的基质而从液体中移去目标物质的方法。更具体地说，所述配体在带正电荷的阴离子交换基团附近包含芳香环。一般认为包括其他能够提供电子给体-电子受体相互作用的基团可以提高所述物质与所述吸附剂之问的相互作用的强度。认为所希望的物质是细胞、细胞的部分及包含肽结构的物质。对于对照蛋白例如牛血清清蛋白及IgG’定义了所述基质的突破容量(break-through capacity)。所公开的配体由于它们在高浓度的盐例如0.25MNaCl下吸附目标物质的能力而被称为“高盐配体”。

进一步地，WO 01/38228(Belew等)公开了另一种通过将其结合到包含混合模式的阴离子交换配体的基质而从液体移去带负电荷的物质的方法。每个配体包含带正电荷的氮以及在距离所述带电荷的氮1-7个原子的位点处的硫醚键。类似于上述情形，所希望的物质，例如细胞、细胞的部分及包含肽结构的物质在0.25M NaCl左右的盐浓度下被吸附。

已经建议将陶瓷羟磷灰石用于免疫球蛋白的精加工。更具体地说，已经报道可以在CHT陶瓷羟磷灰石(Bio-Rad)上将IgG1从非分级介质中的IgG1-蛋白A复合物中分离出来(Chromatography，technote 2849；S.G.Franklin，Bio-Rad Laboratories，Inc.，2000AlfredNobel Drive，Hercules，CA 94547USA)。更具体地说，羟磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)为一种形式的磷酸钙，已经表明其具有独特的分离特性。但是，基于羟磷灰石的基质还已知包括某些缺点。例如，由于Ca-泄漏，它们在酸性pH值下是不稳定的，而且它们对螯合剂例如EDTA敏感。另外，已经表明使用基于羟磷灰石的基质难以发展且难以扩大规模为强有力且可重复的纯化方法，例如，因为难于装填羟磷灰石，以及难于在大型柱中保持其性能。最后，还存在由金属离子污染及钙离子交换所引起的树脂性质改变的风险，该改变与可控制的工作范围(regulatory authorities)密切相关。

Johansson等人(Journal of Chromatography A，1016(2003)21-33：“Preparation and characterization of prototypes for multi-modal separation media aimed for capture of negatively chargedbiomolecules at high salt conditions”)描述了用于从高电导性流动相收集带负电荷蛋白质的多模式配体原型的筛选。他们发现基于弱离子交换配体(伯及仲胺)的非芳香族多模式阴离子交换配体用于通过高盐条件下的吸附来收集蛋白质是最佳的。

发明简述

本发明的一个方面是提供一种将抗体与液体的其他组分分离的方法，其较现有技术方法需要更少的时间及工艺步骤。这可以通过其中将所述包含抗体的液体与多模式分离基质接触以及以非结合模式回收基本上纯的抗体的方法来获得。例如，如果将所述液体施加于包含所述基质的色谱柱，从所述流通液轻易地回收所述抗体。

本发明的另一个方面是提供一种将抗体与液体的其他组分分离的方法，其较现有技术方法取得了新的特性。

本发明的进一步方面是提供一种将抗体与液体的其他组分分离的方法，其中存在于粗原料例如宿主细胞蛋白中的杂质的清除得以改善。

以下详细说明将显示本发明进一步的方面和优点。

附图的简要说明

图1a)-d)显示可用在本发明方法中的多模式阴离子交换配体的例证性选择：N-苄基-N-甲基乙醇胺、N，N-二甲基苄胺、2-氨基苯并咪唑及2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(thiomicamine)。图2显示在多模式分离基质上分离单克隆抗体的色谱图，所述多模式分离基质包括固定在琼脂糖^TM 6FF上的N-苄基-N-甲基乙醇胺；固定在琼脂糖^TM 6FF上的N，N-二甲基苄胺；以及用于对照的强阴离子交换剂Q琼脂糖^TM FF，如下实施例1中所描述。

图3a)及b)显示加载到分离基质上的单克隆抗体的色谱图，所述分离基质包括以不同密度固定在琼脂糖^TM 6FF上的2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及2-氨基苯并咪唑，如以下实施例3所描述的。

图4a)-g)显示采用mAb1-r蛋白A的混合物在原型上进行色谱处理的结果。

图5a)-h)显示针对含有MAb 1、1％rPrA的样品和汇集的来自图4中的色谱操作的流通液及洗脱液馏分的分析型尺寸排阻色谱(SEC)的结果。

图6显示使用所述多模式基质Q苯基琼脂糖^TM Fast Flow的单克隆抗体分子的分离，如实施例5中所描述的。

定义

在本说明书中，术语“抗体”及“免疫球蛋白”可互换使用。

术语“分离基质”在本文中使用来表示由已经偶联有一种或多种包含官能团的配体的载体组成的材料。

术语“多模式”分离基质是指能够提供至少两个不同的但共同起作用的与将要被结合的所述化合物相互作用的位点的基质。例如，这些位点之一可以在所述配体与所关心的物质之间产生电荷-电荷相互作用的吸引类型。另一个位点可以产生电子受体-给体相互作用和/或疏水和/或亲水作用。电子给体-受体相互作用包括例如氢键键合、π-π、阳离子-π、电荷转移、偶极-偶极、诱导偶极等等的相互作用。“多模式”分离基质亦称“混合模式”分离基质。

在本文中术语“表面”是指所有外表面，并在多孔载体的情形下包括外表面以及孔隙表面。

短语“电子给体-受体相互作用”是指具有一对自由电子的作为给体并结合到缺电子原子的电负性的原子，该缺电子的原子作为所述给体的电子对的受体。(参见，例如，Karger等，An Introduction intoSeparation Science，John Wiley&Sons(1973)page 42。)

在本文中术语“阴离子交换基团”是指带正电荷或可带正电荷的基团。

术语“洗脱剂”按本领域中它的常规含义加以使用，即，用于从分离基质中释放一种或多种化合物的具有适宜pH值和/或离子强度的缓冲液。

在液相色谱的范围中术语“收集步骤”是指分离过程的起始步骤。最通常地，收集步骤包括澄清、浓缩、稳定及从可溶杂质中显著纯化。在收集步骤之后，可以接着进行中间体的纯化，这进一步降低杂质的残余量，所述杂质例如是宿主细胞蛋白质、DNA、病毒、内毒素、营养素、细胞培养介质的组分，例如消泡剂及抗生素以及与产物有关的杂质，例如聚集体、错误折叠物种及聚集体。

在液相色谱范围中术语“精加工步骤”是指最后的纯化步骤，其中痕量杂质被除去从而留下活性的、安全的产物。在所述精加工步骤期间除去的杂质常常是所述目标分子的构象异构体或可能是泄漏产物(leakage products)。

术语“Fc-结合蛋白”是指能够结合到抗体的可结晶部分(Fc)的蛋白并且包括例如蛋白A及蛋白G，或仍保持有所述结合性质的它们的任何片段或融合蛋白。

发明详述

在第一个方面，本发明涉及一种将抗体与液体样品的一种或多种其他化合物分离的方法，其中将包含所述液体样品的流动相与多模式分离基质接触，从而吸附一种或多种目标化合物而所述抗体在所述流动相中保持游离，其中所述多模式分离基质包含能够与所述目标化合物的带负电荷的位点相互作用的第一基团以及能够与所述目标化合物进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团。本发明还包括其中除了所述第一和第二基团外还加入第三或更进一步基团的方法。

在一个有利的实施方案中，本方法使用液相色谱的原理进行，即，通过将流动相流过包含所述多模式分离基质的色谱柱。所述载体可以是呈多孔或无孔颗粒，例如基本上球状颗粒、整块、滤料、膜、表面、毛细管的形式的，或者任何其他通常使用的形式。在一个可选实施方案中，本方法使用膨胀床色谱的原理进行，即，通过将所述流动相加入到分离基质的膨胀床中，所述分离基质呈颗粒，例如基本上球状颗粒的形式，包含高密度填料。在另一个可选实施方案中，本方法使用分批方式工艺进行，其中所述分离基质被加入到包含所述液体样品的容器中。

因此，在根据本发明的用于纯化抗体的方法中，一种或多种不希望的化合物被吸附到所述分离基质而所述希望的抗体保留在所述流动相中而未被吸附。在本方法的范围中，可理解的是，术语“目标”化合物是指被吸附到所述分离基质的化合物。显然，所吸附的化合物的性质及特性将取决于所述液体样品的来源。目标化合物的例子有细胞及细胞碎片；蛋白质及肽；核酸，例如DNA及RNA；内毒素，以及病毒。

在本发明的一个实施方案中，在色谱柱中提供所述多模式分离基质而所述流动相靠重力和/或泵送而穿过所述柱，所述抗体在所述柱的流通液中被回收。本方法的优点在于其不需要从所述柱洗脱所述抗体。从工艺角度看，避免具体的洗脱步骤是有益的，因为更少步骤将导致更为迅速的纯化流程并因此降低所述工艺成本。另外，抗体对某些可能损害它们的折叠模式；或者通过破坏它们的肽键而使它们降解的条件是敏感的。尽管用于阴离子交换剂的洗脱条件通常不涉及任何极端的化学试剂，但是盐及pH值的每一改变可能会影响到敏感的抗体，所述效果从种类到种类的改变取决于pI、电荷分布等等。因此，本方法的另一个优点在于其避免加入洗脱液并且避免对所述抗体施用洗脱条件。

如上所述，在根据本发明的方法中，从其中希望分离出所述抗体的所述目标化合物被吸附到所述多模式分离基质。为了获得最适于吸附目标化合物的条件，将所述液体样品与适当的缓冲液或其他液体混合从而提供流动相。本方法在阴离子交换色谱法的惯用条件下方便地运行，所述阴离子交换色谱法通常包括在相对低的盐浓度下进行吸附。因此，在本方法的一个实施方案中，所述流动相的电导率在0-25，例如10-15mS/cm的范围内。在一个实施方案中，所述流动相的pH值为大约5-6。本领域技术人员可以容易地改变所述条件以获得所述抗体的流通液，例如，通过调节pH值或电导率，这将取决于例如将要纯化的抗体的电荷及电荷分布。如果需要，可以在任何这样的过程(passage)之前或之间进行一个或多个洗涤步骤。如果希望随后释放所吸附的化合物，例如用于所述基质的再利用，可以在更高的盐浓度下进行洗脱，例如，通过利用渐增的盐梯度。还可以或可选地改变所述pH值，例如，是一种渐减的pH值梯度，从而洗脱所吸附的化合物。

如上所述，所述多模式分离基质包含能够与所述目标化合物的带负电荷的位点相互作用的第一基团以及能够与所述目标化合物进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团。在这方面，可理解的是所述分离基质的基团的相互作用的不同模式涉及相同的目标化合物，即，每个目标化合物理论上通过两种或更多种模式的相互作用被吸附。包含带正电荷或可带正电荷的阴离子-交换基团的多模式配体在本领域中是已知的，参见，例如，US 6,702,943(Johansson等)、WO 01/38228(Belew等)及WO 02/053252(Belew等)。

在一个实施方案中，所述第一基团即所述多模式分离基质的阴离子-交换基团为强阴离子交换剂。在这方面，术语“强”阴离子交换剂被理解为在宽的pH值范围内保持带电的基团。在一个有利的实施方案中，所述强阴离子交换基团为季胺，又名Q基团。在一个可选实施方案中，所述多模式分离基质的第一基团为弱离子交换基团。在这方面，术语“弱”阴离子交换剂被理解为是指在某些pH值下带电荷但可通过改变pH值而失电荷的基团。在一个具体实施方案中，所述第一基团包含阴离子-交换基团与其他官能团的混合体，例如阴离子交换剂与氢键键合基团的混合体。因此，在该实施方案中，所述第一基团可以为TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)。

在一个实施方案中，所述多模式分离基质的第二基团包含芳香族基团和/或氢键键合基团。在一个实施方案中，所述芳香族基团包含含有芳香族或杂芳香族结构的环系。在一个有利的实施方案中，第二基团包含苯基基团。可选地，第二基团可以包含芳香族与非芳香族疏水基团，例如烷基基团的混合体。因此，在一个具体实施方案中，所述第一基团包含烷基基团。根据本发明所使用的分离基质可以包含相同种类的两个或更多个官能团，例如两个或更多个不同种类的疏水基团；或包含两个或更多个不同种类的多模式阴离子交换剂。如本领域技术人员所理解的，在本方法中所使用的分离基质的官能团可以存在于相同的配体上，在这种情形下每一配体为多模式的，或在不同的配体上，在这种情形下所述分离基质的整体性质为多模式的。

因此，在一个实施方案中，所述分离基质包含偶联到相同配体的第一和第二基团。可以将任何一个以上所讨论的第一和第二基团用于本实施方案中，例如季胺基团及苯基基团。在一个实施方案中，所述配体已经通过它们的第一基团偶联到所述载体，例如通过胺得到季胺。在一个实施方案中，所述第一和第二基团彼此之间由包含1-6个，例如1-3个，优选1-2个碳原子的烃链隔开。在一个具体实施方案中，所述配体选自N-苄基-N-甲基乙醇胺、N，N-二甲基苄胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及Q苯基。

在一个可选实施方案中，所述分离基质包含偶联到不同配体的第一和第二基团。可以将任何一个以上所讨论的第一和第二基团用于该实施方案中，例如季胺基团及苯基基团。在本实施方案中，在颗粒状分离基质的情形下，这种不同的配体可以以基本上相等或不等的量被固定到不同或相同的颗粒上。可选地，或另外，颗粒状分离基质可以包含不同种类的被固定到不同颗粒上的第一基团；或不同种类的第二基团。

本领域技术人员可容易地制备在本方法中所使用的多模式色谱基质。简单地说，所述基质由偶联到载体的配体组成，所述载体在本领域中又被称为基础基质(base matrix)，直接或间接地经由常规的间隔区从而在载体表面与相互作用的基团之问提供适当的间隔。为了获得高吸附能力，所述载体优选是多孔的，然后将配体偶联到外表面以及孔隙表面。在本领域中将配体固定到多孔或无孔表面的方法为大家所熟知；参见，例如，Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia及Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992。在一个实施方案中，在所述载体表面上的配体密度在接近于通常用于常规离子交换基质的范围内。可以将所述配体直接偶联到所述载体，这简单地通过从所使用的化学作用引起的连接元素；或通过称为伸出物、触手或可弯曲臂的较长元件，参见，例如，US 6,428,707，其在此收入本文作为参考。简单地说，所述伸出物可以是以聚合物例如均聚物或共聚物的形式。亲水的聚合伸出物可以是合成来源的，即，具有合成骨架，或是生物来源的，即，具有天然存在的骨架的生物聚合物。典型的合成聚合物选自聚乙烯醇、聚丙烯酰胺及聚甲基丙烯酰胺以及聚乙烯基醚。典型的生物聚合物选自聚糖，例如淀粉、纤维素、右旋糖苷及琼脂糖。

所述载体可以由有机或无机材料制成。在一个实施方案中，所述载体从天然聚合物制备，所述天然聚合物例如是交联的碳水化合物材料，如琼脂糖、琼脂、纤维素、右旋糖苷、壳聚糖、魔芋胶(konjac)、卡拉胶、结冷胶(gellan)、藻酸盐等等。所述天然聚合物载体可根据标准方法容易地制备及任选地将其交联，例如，反向混悬液凝胶化(inverse suspension gelation)(S Hjerten：Biochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)。在一个特别有利的实施方案中，所述载体是一种相对刚性的但多孔的琼脂糖，其通过提高它的流动性质的方法制备，参见，例如，US 6,602,990(Berg)或SE 0402322-2(Berg等)。在一个可选实施方案中，所述载体从合成聚合物或共聚物制备，例如从交联的合成聚合物，例如，苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等等制备。这种合成聚合物可根据标准方法容易地制备及任选地将其交联，参见，例如，“Styrene based polymer supports developed by suspensionpolymerization”(R Arshady：Chimica eL′Industria 70(9)，70-75(1988))。天然或合成聚合物载体还可以从商业来源获得，例如GEHealthcare、Uppsala、Sweden，例如以多孔颗粒形式。在又一可选的实施方案中，所述载体从无机聚合物例如二氧化硅制备。无机多孔及无孔载体在本领域中为大家所熟知并且可根据标准方法容易地制备。

本分离基质的适当颗粒尺寸可以在5-500μm，例如10-100μm，如20-80μm的直径范围内。在基本上球状颗粒的情形下，所述平均颗粒尺寸可以在5-1000μm，例如10-500的范围内。在一个具体实施方案中，所述平均颗粒尺寸在10-200μm范围内。本领域技术人员可以根据所使用的工艺容易地选择适当的颗粒尺寸及孔隙率。例如，对于大规模过程，出于经济上的原因，可以优选更多孔的但刚性的载体来允许大批量的加工生产，特别是对于所述收集步骤。在色谱法中，工艺参数例如尺寸及柱的形状将会影响所述选择。在膨胀床工艺中，所述基质通常包含高密度填料，优选不锈钢填料。对于其他工艺，其他标准可影响所述基质的性质。

根据本发明所分离的抗体可以源自任何通常使用的来源，例如表面上所培养的细胞或者在发酵罐或容器中分批或连续的细胞培养物。因此，在一个实施方案中，所述液体为从细胞发酵过程得到的上清液。所吸附化合物的例子有蛋白质、DNA、病毒、内毒素、营养素、细胞培养物介质的组分，例如消泡剂及抗生素、以及与产物有关的杂质，例如错误折叠种类及聚集体。在所述流动相与所述多模式分离基质之间接触的步骤，即，所述吸附步骤之前可以进行机械过滤、离心分离和/或色谱处理步骤。例如，如果所述液体样品为发酵液，在所述多模式色谱处理之前用机械方法除去细胞碎片、完整细胞及其他相对大的组分是有利的。

在一个实施方案中，本方法构成纯化流程的收集步骤。在一个具体实施方案中，所述液体样品为粗原料，将其在与所述多模式色谱基质接触之前将其过滤。因此，该实施方案将仍构成收集步骤，尽管所述液体样品已经通过机械方法预纯化。众所周知，产生抗体的宿主细胞将还包含许多其他通常被称为宿主细胞蛋白(HCP)的蛋白质。这种HCP包括酶，例如蛋白酶，以及其他由所述宿主细胞产生的蛋白质。根据本发明，我们出乎意料地发现所述宿主细胞蛋白可以被吸附到所述多模式分离基质上而与此同时所述抗体在所述流动相中保持游离。因此，在一个实施方案中，所述液体样品的基本上所有宿主细胞蛋白均被吸附到所述多模式分离基质。

在可选的实施方案中，本方法用作提纯流程中的第二、第三乃至第四步骤，例如中间体纯化或精加工步骤。因此，在一个实施方案中，施加于所述多模式分离基质的流动相包含来自分离基质的包含抗体的洗脱液。在一个实施方案中，所述液体样品为来自在前的亲和色谱基质的洗脱液。在一个有利的实施方案中，从所述分离基质获得的洗脱液包含一种或多种结合Fc-的蛋白配体，例如蛋白A配体。在本文中，术语蛋白A配体包括天然及重组蛋白A或其官能片段。在这方面，术语“官能”片段是指仍保持所述蛋白的原始结合性质的片段。这种亲和性基质是市场上可买到的，例如来自GE Healthcare的MabSelect^TM。因此，在该实施方案中，所吸附的化合物可以是选自所释放的蛋白A；蛋白A与抗体形成的复合物，例如蛋白A-MAb复合物，该复合物每蛋白A分子可以包含若干抗体，例如一个蛋白A分子复合有2-4个抗体；以及所释放的蛋白A或抗体的聚集体的一种或多种复合物。正如本领域技术人员将理解的，取决于在前步骤，例如亲和色谱法中所使用的具体条件，所述洗脱液可需要通过适当的添加或调整来进行调节。因此，将所述洗脱液与适当的缓冲液或液体混合从而得到流动相。应注意到的是，尽管出于应用的原因这是优选的，如果将纯化来自蛋白A柱的洗脱液，本方法没有必要紧接着所述亲和色谱法进行，甚至在相同的设备中进行。

在一个具体实施方案中，本方法是一种多步工艺，其包括在亲和色谱基质例如蛋白A色谱基质上的收集步骤以及在如上所述的多模式分离基质上的精加工步骤。施加于所述亲和色谱基质的所述液体样品可以是细胞培养物液体或发酵液，其已任选地经预处理，例如过滤和/或通过调节pH值和/或电导率进行调节以提供流动相。在该工艺中，所述收集步骤将除去一种或多种宿主细胞蛋白以及宿主细胞残余物例如细胞碎片及蛋白质、DNA、内毒素等等。在随后的精加工步骤中，以来自所述收集步骤的残余物的形式的主要化合物，例如蛋白A-抗体聚集体，将被吸附。

本方法可用于回收任何单克隆抗体或多克隆抗体，例如源自哺乳动物宿主，如小鼠、啮齿类、灵长类及人类的抗体，或源自杂交瘤的抗体。在一个实施方案中，所回收的抗体为人类或人源化抗体(humanised antibodies)。在一个有利的实施方案中，所述抗体为单体抗体。所述抗体可以为任何类别，即，选自IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。在一个实施方案中，所述将被纯化的抗体为能够结合到蛋白A的抗体，或者含Fc的抗体片段或融合蛋白。在一个具体实施方案中，所回收的抗体为免疫球蛋白G(IgG)，例如IgG1。在一个实施方案中，本方法用于纯化具有6-9个范围内，例如7-8个范围内的pI的抗体。在一个具体实施方案中，所纯化抗体的pI为大约9。在本文中，应理解的是术语“抗体”还包括抗体片段以及任何包含抗体或抗体片段的融合蛋白。因此，本发明还包括纯化上述抗体以及包含这种抗体的融合蛋白的任何一种的片段。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

如以上描述所显示的，在本方法中，不希望的化合物被吸附到所述多模式分离基质，并回收未被吸附的抗体的基本上纯的部分。在本文中，术语“基本上纯的”被理解为是指基本上所有非抗体化合物已经被除去。最为有利的地，杂质总量的至少大约80％，例如至少大约95％，即，在95-100％之间，例如至少大约98％，即，在98-100％之间以及优选至少大约99％，即，在99-100％之间在所述多模式分离基质上被除去。但是，正如本领域技术人员将领会的，可能的纯度将取决于施加于所述分离基质的液体样品中抗体的浓度以及所使用的其他条件。因此，在一个实施方案中，根据本方法所分离的抗体是治疗级的抗体。因此，根据本发明所纯化的抗体可用于研究也可用于抗体药物例如MAb药物的制备。所纯化抗体的一个可选用途为诊断用途。进一步地，还可将所纯化的抗体用于食品例如人类食品添加剂。例如，根据本发明所纯化的牛抗体可用于食品。

在一个本方法的具体实施方案中，所述多模式分离基质作为一次性的色谱柱或滤料提供。在用于纯化治疗性化合物例如抗体的方法中使用一次性产品的优点在于：通过在使用之后丢弃所述分离基质而消除了两个不同工艺环节问交叉污染的风险。在许多这种方法中，需要保持无菌条件。因此，在本方法的一个实施方案中，所述多模式分离基质已经被灭菌，并且所述无菌多模式分离基质作为无菌填充色谱柱或滤料被提供。在一个实施方案中，本方法按分批工艺进行，其中一次性分离多模式基质被加入到容纳有从其中将回收所述抗体的液体的容器中。在一个有利的实施方案中，所述一次性分离基质由干燥的颗粒组成，所述干燥的颗粒例如干燥的琼脂糖颗粒，当接触含水液体时其容易溶胀。提供适当的时间用于将目标化合物吸附到所述基质，之后将包含所述抗体的液相从所述容器移开。然后可以将所使用的基质丢弃，在未释放所吸附化合物的情况下，出于安全的观点，这也可是有益的，因为化合物例如内毒素、朊病毒和/或某些宿主细胞蛋白不必进一步处理。

在第二个方面，本发明涉及一种用于从液体中的一种或多种其他组分纯化抗体的成套组件，该成套组件在分离隔室中包括装填有第一分离基质的第一色谱柱、装填有包含能够与所述目标化合物的带负电荷的位点相互作用的第一基团以及能够与所述目标化合物进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团的多模式分离基质的第二色谱柱、一种或多种缓冲液以及书面说明书。在一个有利的实施方案中，该说明书教导从多模式分离基质的流通液中纯化抗体。所述配体、载体及所述多模式分离基质的其他细节可以是如上所述的。本说明书有益地描述了如上所定义的方法。在所述成套组件的一个实施方案中，所述第一分离基质是亲和色谱基质并优选包含蛋白配体，例如蛋白A或G配体。在另一个实施方案中，所述第一和/或第二色谱柱是无菌的和/或一次性的柱。

最后，本发明还涉及一种用于纯化抗体的一次性色谱柱，该柱包含多模式分离基质，其含有能够与带负电荷的目标位点相互作用的第一基团以及能够进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团。所述配体、载体及所述多模式分离基质的其他细节可以是如上所述的。在一个实施方案中，所述分离基质能够从其中电导率在0-50，例如0-25，如0-15mS/cm的范围内的流动相吸附除抗体以外的蛋白质。此方面的一个可选实施方案为一种用于纯化抗体的一次性滤料，该滤料包含能够与带负电荷的目标位点相互作用的第一基团以及能够进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团，这些基团被偶联到所述滤料的表面。在一个具体实施方案中，本发明的滤料能够从其中电导率在0-50，例如0-25，如0-15mS/cm的范围内的流动相中吸附除抗体以外的蛋白质。

附图的详细说明

在图1中，a)显示了所述原型多模式配体2-氨基苯并咪唑；b)显示了所述原型多模式配体2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇；c)显示了固定到珠粒形式的载体上的原型多模式配体N-苄基-N-甲基乙醇胺；以及d)显示了所述原型多模式配体N，N-二甲基苄胺。在实验部分中，所述原型配体被偶联到6％琼脂糖基质琼脂糖^TM 6FF。

图2显示了包含50mg Mab1的样品施加于包含在25mM Bis-Tris、100mM NaCl(～12mS/cm)，pH值6.5中的固定在琼脂糖^TM6FF上的N-苄基-N-甲基乙醇胺(901035A)、固定在琼脂糖^TM 6FF上的N，N-二甲基苄胺(901035B)以及Q琼脂糖^TM FF的配体的多模式分离基质的色谱图。使用pH值6.5的25mM Bis-Tris、0.5M NaCl进行洗脱。

图3a)及b)显示了加载到原型及对照上的包含20mg MAb 2的样品的色谱图，如以下实施例3所述。用于平衡及加载的缓冲液是pH值为6.0的25mM Bis-Tris、100mM NaCl(～12mS/cm)。洗脱缓冲液是0.5M乙酸钠，pH值为4.0。3a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(1282004，绿色)，65μmol/mL、2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(1282002，蓝色)，128μmol/mL及Q琼脂糖^TM FF(黑色)。b)2-氨基苯并咪唑(1282045，蓝色)，65μmol/mL、2-氨基苯并咪唑(1282030，绿色)，146μmol/mL以及Q琼脂糖^TM FF(黑色)。

图4a)-g)显示用mAb1-r蛋白A在原型上进行色谱处理的结果。A-缓冲液是pH值为6.0的25mM Bis-Tris、50mM NaCl。所述电导率为大约7mS/cm。将B-缓冲液0.5M乙酸钠，pH值4.0，用于洗脱。流速为0.5mL/min(150cm/h)。样品为浓度为4mg/mL mAb1及1％rProtein A(w/w)的10mg mAb1及0.10mg rPrA。4a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，65μmol/mL(1282004)；b)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，128μmol/mL(1282002)；c)对照Q琼脂糖^TM FF；d)2-氨基苯并咪唑，65μmol/mL(1282045)；e)2-氨基苯并咪唑，146μmol/mL(1282032)；f)N-苄基-N-甲基乙醇胺，146μmol/mL(901035A)；以及g)N，N-二甲基苄胺，175μmol/mL(901035B)。

图5a)-h)显示了针对具有MAb 1、1％rPrA的样品汇集的来自图4中的色谱操作的流通液及洗脱液馏分的分析型空间排阻色谱(SEC)的结果。蓝色曲线为流通液(FT)馏分而红色为洗脱液。更具体地，图5a)显示了1％(w/w)的4mg/mL mAb1、0.04mg/mL rPrA的样品；5b)显示了来自图4a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，65μmol/mL(1282004)的FT及洗脱液；5c)显示了来自图4b)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，128μmol/mL(1282002)的FT及洗脱液；5d)显示了来自图4c)Q琼脂糖^TMFF的FT及洗脱液；5e)显示了来自图4d)2-氨基苯并咪唑，65μmol/mL(1282045)的FT及洗脱液；5f)显示了来自图4e)2-氨基苯并咪唑，146μmol/mL(1282032)的FT及洗脱液；5g)显示了来自图4f)N-苄基-N-甲基乙醇胺，146μmol/mL(901035A)的FT及洗脱液；以及5h)显示了来自图4g)N，N-二甲基苄胺，175μmol/mL(901035B)的FT及洗脱液。

图6显示了以下实施例5的结果。更具体地，显示了施加于Q苯基琼脂糖^TM 6Fast Flow的包含50mg Mab的样品所得到的色谱。用pH值为8.0的25mM Bis-Tris、0.5M NaC1进行洗脱。图6显示了单克隆抗体分子怎样没有被吸附到Q苯基琼脂糖^TM Fast Flow，因为在以梯度洗脱进行的色谱图中仅观察到非常小的峰。

实验部分

本实施例仅以举例说明的目的被提供，而不应被以任何方式解释为限制如所附权利要求书所定义的本发明的范围。本说明书中，以下及其他处所提供的所有参考文献在此引入本文作为参考。

分布

在未结合的情况下，将包含大约50mg mAb1的样品以大约5及12mS/cm下加载到原型901035A(N-苄基-N-甲基乙醇胺)及901035B(N，N--二甲基苄胺)上。在5、10及15倍柱体积(CV)时收集流通液馏分(FT)。合并来自所述洗脱峰的馏分。分析FT馏分的HCP及蛋白A含量。

对于多模式配体2-氨基苯并咪唑及2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇制备具有高及低配体密度的原型。在pH值6.5下，将包含20mgmAb1的样品在大约5及12mS/cm下加载到所述柱。首先用分析型SEC评价所述原型的性能。分析所选择的馏分的HCP及蛋白A含量。在用SEC筛选所述馏分之后，将所选择的馏分送至HCP及蛋白A分析。

为了证实所述色谱性能对于某一特定mAb不是独特的，使用包含mAb2的样品在pH值6.0及大约12mS/cm的条件下重复所述色谱操作。首先用分析型SEC评价所述原型的性能。分析所选择的馏分的HCP及蛋白A含量。在用SEC筛选所述馏分之后，将所选择的馏分送至HCP及蛋白A分析。

为了更容易地区分哪个原型得到最好的r蛋白A清除率，用1％(w/w)重组蛋白A(rPrA)掺杂mAb1。将对应于10mg mAb1、1％rProtein A的样品量在pH值6.0及大约7mS/cm的电导率下注入每个原型。将流通液及洗脱液馏分分别合并并用SEC分析。

材料/研究装置柱及凝胶得自GE Healthcare、Uppsala、SwedenHiPrep^TM 26/10Desalting 目录号17-5087-01 CV＝53.09mLTricorn^TM 5/50 目录号18-1163-09 CV＝1mLHR 5/5^TM 目录号18-0338-01 CV＝1mLSuperdex^TM 20010/300GL，目录号17-5175-01 CV＝23.56mL

仪器

色谱系统：

KTAExplorer^TM 10

分光光度计 Spectra MAX plus

化学试剂

所使用的所有化学试剂为分析纯。水为经MilliQ过滤了的。

色谱介质

所述对照基质为Q琼脂糖^TM Fast Flow(FF)(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)。所述多模式分离基质原型所携带的配体如下表1所述：

表1：多模式阴离子交换配体

原型参考	配体	C1^-载量(μmol/mL)
			901035A	N-苄基-N-甲基乙醇胺	146
901035B	N，N-二甲基苄胺	175
			1282002	2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇	128
1282004	2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇	65
			1282032	2-氨基苯并咪唑(ABI)	146
1282045	2-氨基苯并咪唑(ABI)	65

原型N-苄基-N-甲基乙醇胺琼脂糖^TM Fast Flow的制备

A.在所述基质上引入烯丙基基团

按以下方法用烯丙基缩水甘油醚活化琼脂糖^TM 6Fast Flow(GEHealthcare，Uppsala Sweden)：将100ml的琼脂糖^TM 6Fast Flow抽干，与0.3g NaBH₄、12g Na₂SO₄及35ml 50％的NaOH水溶液混合。将所述混合物在50℃下搅拌1小时。在加入100ml烯丙基缩水甘油醚之后，将所述混悬液在50℃下强烈搅拌另外16小时。在将所述混合物过滤之后，将所述凝胶依次用500ml蒸馏水、500ml乙醇、200ml蒸馏水、200ml 0.2M乙酸及500ml蒸馏水洗涤。滴定给出0.22mmol烯丙基/ml凝胶的取代度。

B.通过溴化活化烯丙基琼脂糖^TM6Fast Flow

将溴加入到已搅拌过的50ml经烯丙基活化的琼脂糖^TM6 FastFlow(0.22mmol烯丙基基团/ml排空凝胶)、1g乙酸钠及15ml蒸馏水的混悬液中，直到得到持久的黄色。然后加入甲酸钠直到所述混悬液被完全脱色。将所述反应混合物过滤而后用500ml蒸馏水洗涤所述凝胶。然后将经活化的凝胶直接转移至反应容器中并进一步与N-苄基-N-甲基乙醇胺反应。

C.在所述经活化的基质上引BMEA(N-苄基-N-甲基乙醇胺)基团

将所述胺基团直接通过所述胺基团的氮原子引入到所述基质上。在一个典型的过程中，对所述基质的偶联通过所述烯丙基的溴化及在碱性条件下的亲核取代来实现。将25ml经溴活化的凝胶(0.22mmol烯丙基基团/ml排出的凝胶)移入包含N-苄基-N-甲基乙醇胺(16.0ml)溶液的反应小瓶中。加入5ml水，然后用氢氧化钠溶液将所述反应溶液的pH值调节到12.0。将所述反应在50℃下搅拌16小时。在过滤所述反应混合物之后，依次用3×10ml蒸馏水、3×10ml 0.5HCl水溶液及最后用3×10ml蒸馏水洗涤所述凝胶。得到取代度为0.15mmol胺/ml凝胶的BMEA琼脂糖^TMFast Flow凝胶。

按照标准方法加以制备(参见US 6,702,943(Johansson等)，WO 01/38228(Belew等)及WO 02/053252(Belew等))具有高及低配体密度的2-氨基苯并咪唑及2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇原型。

样品

使用两种不同的人源化IgG抗体，亚类1，表示为MAb 1及MAb2，吸光系数分别为1.46及1.50。两种抗体均是在CHO培养物中被表达的而后在本实验之前采用常规蛋白A亲和色谱法加以纯化。

通过以Superloop^TM(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)注入适当体积(5-15mL)而在HiPrep^TM Desalting柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上进行缓冲液更换，将所述柱用所关心的缓冲液平衡。所述流速为5mL/min并收集5mL的馏分。将包含所述洗脱峰的馏分合并且一式两份在280nm处测定吸光度，用于根据方程式1计算所述浓度：

A₂₈₀＝ε·C·1 (方程式1)

其中 A₂₈₀为在280nm处的吸光度。

ε(mL^＊mg^-1＊cm^-1)为特定蛋白质的吸光系数。

C(mg/mL)为所述蛋白质的浓度。

l(cm)为光程长度。以0.5mL/min流速在

uperdex^TM 20010/300柱(GE Healthcare，Uppsala，

Sweden)上进行尺寸排阻色谱法(SEC)。所述缓冲液

为PBS(磷酸缓冲盐水)；10mM磷酸盐、0.137M NaCl、

2.7mM KCl，pH值为7.4且从片剂(Sigma，P-4417)

配制。

方法

平衡2/0.1CV；2CV，第一次使用；0.1CV，在两次操作之间样品注射50μl

等度洗脱1.5CV

用mAb在原型上进行色谱处理

A-缓冲液为25mM Bis-Tris，pH值为6.0或6.5。取决于所希望的电导率，大约5或12mS/cm，包含35或100mM NaC1。对于原型901035A及901035B，洗脱缓冲液(B-缓冲液)是25mM Bis-Tris，0.5M NaCl，pH值为6.5。对于以2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及ABI作为配体的原型，洗脱缓冲液(B-缓冲液)为0.5M乙酸钠，pH值为4.0。所述流速为0.5mL/min(150c m/h)。

方法：平衡 5CV A-缓冲液

样品注射 5-25mL 样品含有20或50mg mAb

洗涤 5CV A-缓冲液

梯度洗脱 10cV 0-100％B-缓冲液

洗脱 10CV 100％B-缓冲液

再生 5CV A-缓冲液

用MAb-rProtein A在原型上进行色谱处理

A-缓冲液为25mM Bis-Tris，pH值为6.0。通过添加50mM NaCl，所述电导率为大约7mS/cm，B-缓冲液为0.5M乙酸钠，pH值为4.0。流速为0.5mL/min(150c m/h)。样品浓度4mg/mL MAb 1-0.04mg/mLrPrA，得到1％(w/w)。

方法：平衡 5CV A-缓冲液

样品注射 2.5mL 10mg MAb，1％rPrA

洗涤 5CV A-缓冲液

梯度洗脱 10CV 0-100％B-缓冲液

洗脱 10CV 100％B-缓冲液

再生 5CV A-缓冲液

CIP(就地清洗)

在每个色谱操作之后，使所述原型及对照基质Q琼脂糖^TM FF经历以下CIP过程：

30％异丙醇 5CV(柱体积)

H₂O 5CV

1.0M NaOH 4CV(包括15min.暂停)

H₂O 5CV

A-缓冲液 5CV

H₂O 5CV

20％EtOH 5CV

蛋白A分析

按800μl SPA样品稀释剂+200μl样品的比例将所选择的馏分与SPA样品稀释剂混合。在混合后，在加热块上在99℃下将所述馏分加热10分钟，然后再次混合。然后分析所述样品的重组蛋白A。

宿主细胞蛋白(HCP)分析

分析所述样品(最小600μl)的HCP含量。检测下限为10ng/mL。

实施例1：

在原型配体N-苄基-N-甲基乙醇胺(901035A)及N，N-二甲基苄胺(901035B)上纯化的含有MAb1的样品

在实施例1中，将含有50mg MAb1的样品施加于在pH值为6.5的25mM Bis-Tris，100mM NaC1(～12mS/cm)中的固定在琼脂糖^TM6FF上的N-苄基-N-甲基乙醇胺(901035A)、固定在琼脂糖^TM6FF上的N，N-二甲基苄胺(901035B)以及所述对照基质Q琼脂糖^TMFF。采用pH值为6.5的25mM Bis-Tris，0.5M NaCl进行洗脱。

实施例1的色谱图示于图2，其显示所述两种原型N-苄基-N-甲基乙醇胺琼脂糖^TM6FF(901035A)及N，N-二甲基苄胺琼脂糖^TM6FF(901035B)与Q琼脂糖^TM FF的对比。用于分析而选择的流通液(FT)馏分用箭头指示。示于以下表2和3中的HCP及蛋白A的清除率结果显示所述原型在这方面优于Q琼脂糖^TMFF。

表2：HCP分析结果

柱	pH值	起始(ng/mL)	FT1(ng/mL)	FT2(ng/mL)	FT3(ng/mL)
						Q琼脂糖^TM FF(对照)	6.5	890	160	200	180
N-苄基-N-甲基乙醇胺，146μmol/mL(901035A)	6.5	890	10	20	35
						N，N-二甲基苄胺175μmol/mL(901035B)	6.5	890	27	39	45

表3：PrA分析结果

柱	pH值	起始(ng/mL)	FT1(ng/mL)	FT2(ng/mL)	FT3(ng/mL)
						Q琼脂糖^TM FF(对照)	6.5	0.40	0.69	0.46	0.31
N-苄基-N-甲基乙醇胺，146μmol/mL(901035A)	6.5	0.40	0	0	0
						N，N-二甲基苄胺175μmol/mL(901035B)	6.5	0.40	0.11	0.10	0.08

实施例2：

在原型配体2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及2-氨基苯并咪唑上纯化的含有MAb1的样品

在本实施例中，将含有20mg MAb1的样品加载到原型及对照分离基质上。用于平衡及加载的缓冲液是pH值为6.5的25mM Bis-Tris，35mM NaCl(5mS/cm)。洗脱缓冲液为0.5M乙酸钠，pH值为4.0。a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇，65μmol/mL(1282004)，b)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇128μmol/mL(1282002)，c)Q琼脂糖^TM FF，d)2-氨基苯并咪唑(ABI)，65μmol/mL(1282045)及e)2-氨基苯并咪唑(ABI)，146μmol/mL(1282032)。HCP及蛋白A分析的结果示于下表4及5。

表4：HCP分析结果

柱	pH值	起始(ng/mL)	FT1(ng/mL)	FT2(ng/mL)
					2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇65μmol/mL(1282004)	6.5	351	≤10	≤10
Q琼脂糖^TM FF	6.5	351	11	11
					2-氨基-苯并咪唑(ABI)65μmol/mL(1282045)	6.5	351	≤10	≤10

表5：PrA分析结果

柱	pH值	起始(ng/mL)	FT1(ng/mL)	FT2(ng/mL)
					2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇65μmol/mL(1282004)	6.5	0.39	0.00	0.00
Q琼脂糖^TM FF	6.5	0.39	0.09	0.21
					2-氨基苯并咪唑(ABI)65μmol/mL(1282045)	6.5	0.39	0.00	0.00

实施例3：

在原型配2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及2-氨基苯并咪唑上纯化的含有MAb2的样品

将含有20mg MAb2的样品施加于原型及对照。缓冲液为25mMBis-Tris，100mM NaCl(～12mS/cm)，pH值为6.0。用pH值为4.0的0.5M乙酸钠进行洗脱。所得到的色谱图示于图3。

3a)2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(1282004，绿色)，65μmol/mL，2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇(1282002，蓝色)，128μmol/mL及Q琼脂糖^TM FF(黑色)；b)2-氨基苯并咪唑(1282045，蓝色)，65μmol/mL，2-氨基苯并咪唑(1282030，绿色)，146μmol/mL及Q琼脂糖^TM FF(黑色)。使用分析型SEC来选择用于HCP及蛋白A分析的馏分，如下表6及7中所示。

表6：HCP分析结果

柱	pH值	起始(ng/mL)	FT1(ng/mL)	FT2(ng/mL)
					2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇65μmol/mL(1282004)	6.0	170	≤10	≤10
Q琼脂糖^TM FF	6.0	170	66	55

表7：PrA分析结果

柱	pH值	起始(ng/mL)	FT1(ng/mL)	FT2(ng/mL)
					2-氨基-1-(4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇65μmol/mL(1282004)	6.0	5.42	0.00	0.24
Q琼脂糖^TM FF	6.0	5.42	3.90	4.93

实施例4：

在原型配体N-苄基-N-甲基乙醇胺、N，N-二甲基苄胺、2-氨基-1- (4-甲硫基苯基)-1，3-丙二醇及2-氨基苯并咪唑上从包含MAb1及重组蛋白A(rPrA)的样品中纯化MAb1

在本实施例中，用含有mAb1-r蛋白A的样品在原型上进行色谱处理。A-缓冲液为25mM Bis-Tris，50mM NaCl，pH值为6.0。所述电导率为大约7mS/cm。B-缓冲液为0.5M乙酸钠，pH值为4.0。所述流速为0.5mL/min(150c m/h)。样品为浓度为4mg/mL mAb1及1％rProtein A(w/w)的10mg mAb1及0.10mg rPrA。结果示于图4。

最后，针对具有mAb1，1％rPrA的样品以及汇集的来自图4中的色谱操作的流通液和洗脱液馏分进行分析SEC。结果示于图5。在图5a中，阴影峰为mAb1-蛋白A的复合物。蓝色曲线为流通液(FT)馏分而红色曲线为洗脱液。

实施例5：在Q苯基琼脂糖6Fast Flow上的抗体纯化分布

在未结合条件下，将含有大约50mg mAb的样品加载到原型Q苯基琼脂糖^TM 6Fast Flow上。在5、10及15倍柱体积(CV)时收集流通液馏分(FT)。分析来自所述洗脱峰的馏分。

通过按照标准方法将Q-基团(-N(CH₃)₃)连接到苯基琼脂糖^TM6Fast Flow(45μmol苯基基团/ml凝胶)来制备Q苯基琼脂糖^TM 6FastFlow(参见下文)。Q苯基琼脂糖^TM 6Fast Flow的离子交换容量为108μmol/mL凝胶。在pH值7.0或8.0下，将含50mg mAb(MabSelect纯化的)的样品加载入所述柱中，然后通过分析所选择的流通液馏分的宿主细胞蛋白(HCP)及蛋白A含量来评价Q苯基琼脂糖^TM 6FastFlow的性能

原料/研究装置

柱及苯基琼脂糖^TM 6Fast Flow得自GE Healthcare，Uppsala，Sweden

HR 5/5^TM 目录号18-0338-01 CV＝1mL

仪器

色谱系统： KTAExplorer^TM 10

分光光度计 Spectra MAX plus

化学试剂

所使用的所有化学试剂为分析纯。水经MiIIiQ过滤。

Q苯基琼脂糖^TM 6Fast Flow的制备

一种从交联的琼脂糖凝胶(苯基琼脂糖^TM 6Fast Flow(highsub)，GE Healthcare，Uppsala，Sweden)开始的制备根据本发明的分离基质的方法被例示如下。

在苯基琼脂糖^TM6Fast Flow(high sub)上引入Q基团：

按以下方法通过与缩水甘油基三甲基氯化铵(G-MAC)反应而将Q-基团(-N(CH₃)₃引入到苯基琼脂糖^TM 6Fast Flow(high sub)上：将15g抽干了的苯基琼脂糖^TM 6Fast Flow(high sub)与5ml水、5ml 50％NaOH水溶液、0.02g NaBH₄及40ml G-MAC混合。在30℃下将所述混合物搅拌16小时。在过滤所述混合物之后，依次用100ml蒸馏水、100m1乙醇及100ml蒸馏水洗涤所述凝胶。滴定给出0.11mmol胺/ml凝胶的取代度。

样品

在CHO培养物中表达所使用的单克隆抗体，然后在本实验之前用常规蛋白A亲和色谱法对该抗体加以纯化。

mAb 浓度测定

用缓冲液将所述mAb样品稀释十倍。在A280处测量一式两份的所述样品溶液。使用平均值根据Lambert Beer定律计算所述浓度：

C＝A/(1×ε)

C＝IgG的浓度

A＝在280nm处的吸光度

l＝光程长度

ε＝mAb的摩尔吸光系数，mg^-1ml＝1.46

在Q苯基琼脂糖^TM 6Fast Flow上的色谱法

在未结合条件下试验来自宿主细胞蛋白的mAb与蛋白A的分离。施加于所述柱的样品为MabSelect纯化过的mAb。所述流速为0.5mL/min(150c m/h)。在所有操作期间测定在280nm处的吸光度。试验两种不同的缓冲液(参见下文)。在每次操作之前将缓冲液更换为A-缓冲液。取决于所述样品体积，使用HiPrep脱盐柱及HiTrap脱盐柱。

缓冲液：A-缓冲液：25mM Tris/HCl，pH值8.0

B-缓冲液：25mM Tris/HC1，0.5M NaCl，pH值8.0

A-缓冲液：25mM磷酸盐缓冲液，pH值7.0

B-缓冲液：25mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，pH值7.0

方法：将来自MabSelect的并且pH值调节过的洗脱液用作起始材料。

平衡 5CV A-缓冲液

样品注射 16CV(50mg mAb)

洗涤 5CV A-缓冲液

梯度 5CV 100％B-缓冲液

在梯度后清洗 5CV A-缓冲液

在样品注射、洗涤及洗脱期间收集1ml馏分。

在每次操作后用1M NaOH进行CIP(就地清洗)。所述保留时问为大约25分钟。

蛋白A分析

将所选择的馏分按800μl SPA样品稀释剂+200μl样品的比例与SPA样品稀释剂混合。混合后，在加热块上在99℃下将所述馏分加热10分钟，然后再次混合。然后分析所述样品的重组蛋白A。

宿主细胞蛋白(HCP)的分析

分析所述样品(最小600μl)的HCP含量。所述测量下限为10ng/mL。

结果

在未结合的条件下，在两种不同pH值(pH值7.0及8.0)下将大约50mg mAb加载到装填有Q苯基琼脂糖^TM Fast Flow的HR 5/5柱上。根据图1在5、10及15倍柱体积(CV)时收集流通液馏分(FT)。表8及9给出了所述流通液馏分的蛋白A及HCP分析结果。没有残余的蛋白A可在所述馏分中被检测到。此外，当所使用的样品pH值为8.0时，没有宿主细胞蛋白可在FT1及FT2中被检测到。当所使用的样品pH值为7.0时，观察到少量宿主细胞蛋白，但与所述样品中的HCP含量相比，HCP减少了大约50倍。图6还表明所述单克隆抗体分子没有被吸附到Q苯基琼脂糖^TM Fast Flow，因为在梯度洗脱的色谱图中仅观察到非常小的峰(图6)。

表8.蛋白A分析结果。

柱	pH值	起始(ng/mL)	FT1(ng/mL)	FT3(ng/mL)	洗脱液(ng/mL)
						Q琼脂糖^TM FF	8.0	6.98	0.00	0.00	48.25
Q琼脂糖^TM FF	7.0	5.03	0.00	0.00	36.15

所述样品体积为16ml而所述FT1-FT3为1ml馏分。所汇集的洗脱液体积为2ml。

表9.宿主细胞蛋白分析结果。

柱	pH值	起始(ng/mL)	FT1(ng/mL)	FT2(ng/mL)	FT3(ng/mL)	洗脱液(ng/mL)
							Q琼脂糖^TMFF	8.0	1100	<10	<10	12	4900
Q琼脂糖^TMFF	7.0	1200	16	23	26	5100

所述样品体积为16ml而FT1-FT3为1ml馏分。所汇集的洗脱液体积为2ml。

Claims

1.一种将液体样品中的一种或多种抗体与一种或多种其他化合物分离的方法，其中将包含所述液体样品的流动相与多模式分离基质接触，从而吸附一种或多种目标化合物而同时所述抗体在所述流动相中仍保持游离，其中所述多模式分离基质包含能够与所述目标化合物的带负电荷的位点相互作用的第一基团以及能够与所述目标化合物进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团。

2.根据权利要求1的方法，其中在色谱柱中提供所述多模式分离基质，所述流动相靠重力和/或泵送流过所述柱，并且在所述柱的流通液中回收所述抗体。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述液体样品包含从细胞发酵过程获得的上清液。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在与所述多模式分离基质的接触之前进行机械过滤和/或色谱的步骤。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述液体样品包括粗原料。

6.根据权利要求5的方法，其中所述目标化合物是宿主细胞蛋白质并且基本上所有的所述蛋白质被吸附到所述的多模式分离基质上。

7.根据权利要求4的方法，其中所述液体样品包含来自分离基质的洗脱液。

8.根据权利要求7的方法，其中从其中获得所述洗脱液的分离基质包含蛋白配体。

9.根据权利要求8的方法，其中蛋白配体为蛋白A或G配体。

10.根据权利要求9的方法，其中蛋白A和/或蛋白G配体被吸附到所述的多模式分离基质上。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述流动相的电导率在0-25mS/cm的范围内。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一基团是季铵。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二基团是氢键键合基团。

14.根据权利要求13的方法，其中所述第二基团是疏水性基团。

15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述分离基质包含偶联到相同配体的第一和第二基团。

16.根据权利要求15的方法，其中所述第一和第二基团彼此间被1-3个碳原子的烃链隔开。

17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体已经经由它们的第一基团被固定到载体上。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述分离基质包含偶联到不同配体的第一和第二基团。

19.根据权利要求18的方法，其中所述分离基质是颗粒状的并且包含第一颗粒与第二颗粒的混合物，包含所述第一基团的配体已经被固定到所述第一颗粒上，包含所述第二基团的配体已经被固定到所述第二颗粒上。

20.根据权利要求18的方法，其中所述分离基质是滤料，并且包含所述第一基团的第一配体与包含所述第二基团的第二配体的混合物已经被固定到所述滤料。

21.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述分离基质包含能够与目标化合物进行第三相互作用的第三基团。

22.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

23.根据权利要求22的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

24.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所分离的抗体是治疗级的单克隆抗体。

25.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在一次性色谱柱中提供所述的多模式分离基质。

26.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一次性柱在与所述流动相接触之前已经被灭菌。

27.一种用于从液体中的一种或多种其他组分中纯化抗体的成套组件，该成套组件在分离的隔室中包括：装填有第一分离基质的第一色谱柱、装填有包含能够与所述目标化合物的带负电荷的位点相互作用的第一基团以及能够与所述目标化合物进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团的多模式分离基质的第二色谱柱、一种或多种缓冲液以及教导从多模式分离基质的流通液中纯化抗体的书面说明书。

28.根据权利要求27的成套组件，其中在所述第一色谱柱中，所述分离基质包含蛋白配体。

29.根据权利要求28的成套组件，其中蛋白配体为蛋白A或G配体。

30.根据权利要求27或28的成套组件，其中所述分离基质包含偶联到相同配体的第一和第二基团。

31.根据权利要求27或28的成套组件，其中所述分离基质包含偶联到不同的配体的第一和第二基团。

32.根据权利要求27-31中任一项的成套组件，其中所述第一和/或第二色谱柱是一次性柱。

33.一种用于从液体中的一种或多种其他组分收集抗体的成套组件，该成套组件在分离的隔室中包括：装填有包含能够与所述目标化合物的带负电荷的位点相互作用的第一基团以及能够与所述目标化合物进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团的多模式分离基质的色谱柱、一种或多种缓冲液以及书面说明书。

34.根据权利要求27-33中任一项的成套组件，其中所述第一基团是季铵。

35.根据权利要求27-34中任一项的成套组件，其中所述第二基团是疏水性的和/或氢键键合基团。

36.根据权利要求27-35中任一项的成套组件，其中所述分离基质包含偶联到相同配体的第一和第二基团。

37.根据权利要求27-36中任一项的成套组件，其中所述分离基质包含偶联到不同配体的第一和第二基团。

38.一种色谱柱，其包含含有能够与目标化合物的带负电荷的位点相互作用的第一基团以及能够与目标化合物进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团的多模式分离基质。

39.一种用于纯化抗体的一次性色谱柱，该柱包含含有能够与带负电荷的目标位点相互作用的第一基团以及能够进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团的多模式分离基质，这些基团被偶联到多孔载体的表面上。

40.根据权利要求38或39的色谱柱，其中所述分离基质能够从流动相中吸附除抗体之外的蛋白质，其中所述流动相的电导率在0-25mS/cm的范围内。

41.一种用于纯化抗体的一次性滤料，该滤料包含能够与带负电荷的目标位点相互作用的第一基团以及能够进行除电荷-电荷相互作用以外的至少一种相互作用的第二基团，这些基团被偶联到所述滤料表面上。

42.根据权利要求41的滤料，其能够从流动相中吸附除抗体之外的蛋白质，其中所述流动相电导率在0-25mS/cm的范围内。