CN108686634B - 用于蛋白质的混合式色谱纯化的固相 - Google Patents
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Abstract
通过一种混合式色谱系统纯化蛋白质,该系统由将具有阳离子交换和疏水官能团的配体与大孔支持物基质连接而形成,配体与支持物基质之间仅通过疏水基团和支持物基质之间链连接,所述链具有不超过3个原子的主链。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年10月19日提交的美国临时专利申请号61/549,146的优先权,通过引用将该申请的内容全文纳入本文。
发明背景
1.技术领域
提供了用于纯化或分离目的的从液体源提取免疫球蛋白或其他蛋白质的技术,特别的重点在于色谱分离技术和材料。
2.现有技术说明
从主要是哺乳动物体液或细胞培养收获物的液体源提取免疫球蛋白和其他蛋白质通常对于得到充分浓缩或纯化形式的用于诊断和治疗用途以及实验室研究的蛋白质而言是重要的。然而,蛋白质(尤其是免疫球蛋白)的纯化通常受到以下因素的影响:低产率、使用昂贵的分离介质、分离介质浸入产物中,和在提取过程中使用的外源性材料的安全控制的影响。本发明设法解决这些问题中的至少一些。
发明内容
已经发现可以通过使用混合式色谱系统来实现对免疫球蛋白和其他蛋白质的异常高效提取(即纯化),该混合式色谱系统结合阳离子交换和疏水官能团以及大孔支持基质。将阳离子交换和疏水性官能团被纳入配体中,使该配体结合至固体基质,所述固体基质具有0.5微米或更大的中值直径的孔(基本上没有直径小于0.1微米的孔),并且所述配体由该配体上的疏水基团通过1-3个原子的链的连接偶联至所述支持物基质。使用常规结合和洗脱条件,在低pH下实现蛋白质与基质支持的配体的结合,而在较高pH下实现对已结合蛋白质的洗脱。例如,利用液体源一次通过分离介质来获得高产率的高度纯化的免疫球蛋白。分离介质,即,基质支持的配体与使配体与基质连接的方法一样本身是创新的。
在一些实施方式中,提供了用于从源溶液纯化蛋白质的方法,所述方法如下:
(a)使源溶液接触混合式色谱介质,所述混合式色谱介质包含与固体支持物偶联的配体,该配体包含疏水基团以及羧基基团或磺基基团,其中疏水基团通过含肽连接与羧基基团或磺基基团接合,并且其中固体支持物具有中值直径为0.5微米或更大的孔并且基本没有直径为0.1微米或更小的孔,并且其中配体由疏水基团通过1-3个原子的链偶联至固体支持物,以通过配体来使源溶液中的蛋白质结合至固体支持物;以及
(b)从固体支持物洗脱结合的蛋白质。
在一些实施方式中,所述蛋白质是抗体。
在一些实施方式中,在4.0-约6.0的pH下实施接触步骤(步骤(a))并且在约6.1-约8.5的pH下实施洗脱步骤(步骤(b))。
本发明范围内的某些方法包括以下步骤:
(a)在pH 4.0-约6.0下,使含有抗体的源溶液接触混合式色谱介质,所述混合式色谱介质包含与固体支持物偶联的配体,配体包含疏水基团以及羧基基团或磺基基团,并且固体支持物具有中值直径为0.5微米或更大的孔而基本没有直径为0.1微米或更小的孔,配体由疏水基团通过1-3个原子的链与固体支持物偶联,以通过配体使源溶液中至少部分抗体与固体支持物结合;并且
(b)在约6.1-约8.5的pH下从固体支持物洗脱结合的抗体。
在一些实施方式中,所述疏水基团是苯基基团,并且在一些实施方式中,所述苯基基团通过含肽连接与酸部分接合。
一些实施方式中,所述配体是苯甲酰氨基乙酸(benzamidoacetic acid)。在一些实施方式中,所述连接是位于苯甲酰氨基乙酸的苯环对位的烷基氨基基团,从而所述配体和连接一起构成对-氨基苯甲酰氨基乙酸基团。
在一些实施方式中,所述固体支持物由中值粒径为约25微米-约150微米的颗粒组成。
在一些实施方式中,所述固体支持物是膜。在一些实施方式中,固体支持物是整料。
在一些实施方式中,提供了混合式色谱介质。在一些实施方式中,所述混合式介质包含与固体支持物偶联的配体,所述配体包含疏水基团以及羧基基团或磺基基团,所述固体支持物包含具有中值直径为0.5微米或更大的孔而基本没有直径为0.1微米或更小的孔的颗粒,并且所述配体由疏水基团通过1-3个原子的链与所述固体支持物偶联。
在一些介质中,所述颗粒具有约25微米-约150微米的中值粒径。在一些介质中,所述疏水基团是苯基基团,并且在一些情况下,所述苯基通过含肽连接与酸部分接合。一些介质中,所述配体是苯甲酰氨基乙酸。在这些介质的一些中,所述配体由疏水基团通过苯甲酰氨基乙酸的苯环上对位上的烷基氨基基团与所述固体支持物偶联,从而所述配体与烷基氨基基团一起构成4-氨基苯甲酰氨基乙酸基团。
本文还提供了制备混合式色谱介质的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)将二醇-官能化的固体颗粒上的二醇基团氧化为醛基,从而将二醇-官能化的固体颗粒转化为醛-官能化的固体颗粒,所述固体颗粒具有中值直径为0.5微米或更大的孔而基本没有直径为0.1微米或更小的孔并且具有约200-约300μmol/mL的二醇密度;并且
(b)将胺-官能化的配体与醛-官能化的颗粒偶联,所述胺-官能化的配体包含与羧基基团或磺基基团接合的胺-取代的疏水基团。
在本发明的一些实施方式中,所述疏水基团是苯基基团,并且在一些这样的实施方式中,所述苯基基团通过含肽连接与羧基基团接合。在一些实施方式中,所述配体是苯甲酰氨基乙酸。
本说明书的术语“磺基基团”表示具有下式的基团:
-SO3H
本发明的这些及其他目的、方面、特征和优点将通过下文的解释而更好地理解。
附图说明
图1是IgG1单克隆抗体在本发明的对氨基马尿酸-官能化树脂上纯化的吸收曲线。
图2是来自初始柱洗涤的流过部分和来自图1的洗脱的两个收集的部分的电泳图。
图3是对来自图1的洗脱的两个收集部分的HPLC-尺寸排阻色谱分析的吸收曲线。
发明详述和说明性实施方式
用作本文所述配体中的疏水性官能团的结构基团包含芳族基团和取代的芳族基团。苯基基团和联苯基基团,尤其是苯基基团,是芳族基团的常见示例并且用于本文的某些实施方式中。合适的取代基是保持芳族基团的疏水性特性的那些;示例包括某些烷基基团如己基。较不优选对免疫球蛋白产生位阻现象的取代基。可用作阳离子交换官能团的结构基团包括羧酸、羧酸酯和磺基基团,包括磺基基团本身和硫酸盐。可以通过链来接合阳离子交换和疏水部分,所述链优选包含除了氢原子和取代基以外的不超过5个原子的链。这样的链的示例是含肽的链,如—R1—C(O)—NH—R2—,其中R1和R2是烷基基团并且R1和R2之一或两者均可缺失。具体的示例是—C(O)—NH—CH2—。含有作为弱阳离子交换基团的羧基官能团和作为疏水基团的苯基官能团之间的后一种连接的配体是苯甲酰氨基乙酸。
接合所述配体与支持物基质(本文也称为固体支持物)的连接是一个末端与配体的疏水官能团直接偶联而另一个末端与基质直接偶联的链,作为基质偶联反应活化的结果,该链由此包含来自基质的任何侧基。不包含除了该连接以外的间隔子(spacer)。如上述,所述链是1-3个原子的含胺的链。这样的链的示例是具有式—R3—NH—R4—的那些链,其中R3和R4是甲基或乙基基团并且R3和R4之一或两者均可缺失。这样的基团的具体示例是—CH2—NH—。在配体是苯甲酰氨基乙酸或2-苯甲酰氨基乙磺酸的实施方式中,配体的苯环和基质之间的特别合适的连接是如下这种连接:其中在苯甲酰氨基乙酸的情况下,该连接的胺基团与苯环在相对于羰基氨基乙酸基团的对位连接,或者在2-苯甲酰氨基乙磺酸的情况下,该连接的胺基团与苯环在相对于羰基氨基乙磺酸基团的对位连接。
可以形成所述配体和至少部分所述连接的化合物的示例是4-氨基苯甲酰氨基乙酸,也被称为对-氨基马尿酸,其如下式所示:
并且可以形成所述配体和至少部分所述连接的化合物的另一个示例是2-(4-氨基苯甲酰氨基)乙磺酸,其如下式所示:
本文使用的术语“链”指代以线性排列方式互相接合的一系列原子,优选通过单键接合,诸如-A-B-C-…等,其中原子全部相同或含有一个或多个与其他原子不同的原子。该术语包含取代的或未取代的链,“取代的”是指除了氢原子以外的原子或基团,诸如–OH、-NH2和=O,但是在所有情况下,指示为构成所述链的原子数量,诸如在表述“1-3个原子的链”中,指线性排列的原子,排除了任何氢原子和任何取代基团。线性排列的原子也被称为所述链的主链。
上述的支持物基质是具有中值直径为0.5微米或更大的孔而基本没有直径小于0.1微米的孔的支持物基质。在本发明的某些实施方式中,中值孔径的范围为约0.5微米-约2.0微米。孔体积可不同,虽然在许多实施方式中,孔体积为约0.5-约2.0cc/g。所述基质可以是颗粒、膜或整料,并且“整料”表示单块、单颗或单片材料。当用作基质时,颗粒可以是具有平滑表面或者具有粗糙或织构化表面的球或珠。许多孔,并且在一些情况下所有孔均是通孔(through-pore),延伸穿过颗粒以用作足够大以允许流体动力学流过或快速扩散透过这些孔的通道。当以球或珠的形式时,在术语“直径”指代颗粒的最长外部尺寸的情况下,中值颗粒直径优选为约25微米-约150微米。公开的基质满足该段落中的描述并且制备它们的方法见述于Hjertén等,美国专利号5,645,717,Liao等,美国专利号5,647,979,Liao等,美国专利号5,935,429,以及Liao等,美国专利号6,423,666。可以被聚合化以获得有用基质的单体的示例是乙酸乙烯酯、乙烯基丙基胺、丙烯酸、甲基丙烯酸酯、丙烯酸丁酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙烯基吡咯烷酮(乙烯基吡咯烷酮),在一些情况下含有官能团。在许多实施方式中也使用交联剂,并且当存在时通常会与总单体构成约0.1-约0.7的摩尔比。交联剂的示例是二羟基亚乙基二丙烯酰胺、二烯丙基酒石二酰胺、三烯丙基柠檬三酰胺、二丙烯酸乙二酯、双(丙稀酰)胱胺(bisacrylylcystamine)、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺和哌嗪二丙烯酰胺。
出于形成与配体(尤其是含胺基的配体)连接的目的,纳入具有连位二醇的单体通常是有用的。一个示例是烯丙氧基丙二醇(3-烯丙氧基-1,2-丙二醇)。连位二醇单体可以与其他单体一起使用来制备共聚物。在从含二醇的单体产生的聚合物中,二醇基团的密度可有较大差异,诸如在约100-1000μmol/mL(即,每毫升填充珠中二醇的微摩尔数)的范围内,并且在许多情况下在约200-300μmol/mL的范围内。满足该描述并且市售可得的基质的示例是UNOsphereTM二醇(美国加利福尼亚州赫尔克里斯的伯乐实验室公司(Bio-RadLaboratories,Inc.))。为了用暴露的连位二醇将侧接的含胺配体与基质偶联,可将二醇氧化为醛基,然后可将该醛基与胺基团偶联以形成仲氨基连接,这均通过本领域熟知的常规化学技术进行。
可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行采用本发明树脂(即,分离介质)的蛋白质纯化。蛋白质的例子包括但不限于:抗体、酶、生长调节因子、凝血因子、转录因子和磷蛋白。在许多这样的常规方法中,树脂在使用前用具有将用于目标蛋白质(例如,抗体或非抗体蛋白质)结合的pH的缓冲液来平衡。平衡可关于会影响结合环境的全部特征来进行,合适时,包括离子强度和电导率。
在一些实施方式中,可以“结合-洗脱”的方式使用本文所述的树脂来从生物样品纯化目标蛋白质。在一些实施方式中,在目标蛋白质结合到树脂之后,可以利用pH的变化来洗脱目标蛋白质。
在一些实施方式中,一旦树脂被平衡,即加载液体源至树脂,同时用合适的缓冲液将液体源和可能使用的任何其它运载体液体维持在pH低于6.0,使得目标蛋白质与树脂结合。值得注意的是,已经发现本文所述的混合式树脂与盐浓度在细胞培养物的盐浓度范围内(例如,50-300mM或约100-150mM)的溶液有一定关系。因此,在一些实施方式中,在这样的盐浓度下将所述蛋白质加载至所述树脂。
在一些实施方式中,然后用任选地与加载步骤相同pH的洗涤液洗涤树脂,以去除任何可能在液体源中已经存在的未结合的生物物质。
随后可以洗脱结合的蛋白至(例如,根据需要,抗体或非抗体蛋白质)。在一些实施方式中,随后用pH超过6.0的洗脱液洗脱蛋白质。上文引用的说明性的pH范围是:对于结合和洗涤步骤而言,pH为4.0-6.0,而对于洗脱步骤而言,pH为6.1-8.5。在某些实施方式中,通过在样品和洗涤液中纳入盐来实施结合与洗涤步骤。可用于该目的的盐的示例是碱金属和碱土金属卤化物,特别是钠和钾的卤化物,并且具体的示例是氯化钠。所述盐的浓度可以不同;在大多数情况下,合适的浓度为约10mM-约1M的范围内的某个浓度。如在下文的工作实施例中可以看到,一些蛋白质的最优洗脱条件将包含盐浓度高于结合缓冲液的缓冲液,并且在其他情况下包含盐浓度低于结合缓冲液的缓冲液。在任何特定情况下,易于通过常规实验确定最优选择。
树脂可用于任何常规配置,包括填充柱和流化或膨胀床柱,并且通过任何常规方法,包括加载、洗涤和洗脱的分批模式,以及连续或流通(flow-through)模式。填充的流通柱的使用对于制备级提取和分析级提取而言都是特别合适的。因此柱直径范围可以是1cm-1m,并且高度范围是1cm-30cm或更高。
“抗体”是指免疫球蛋白、其复合(例如,融合)形式或其片段形式。该术语可以包括但不限于衍生自人或其它哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类的多克隆或单克隆抗体,包括天然或遗传修饰的形式,如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂交、突变、移植和体外产生的抗体。“抗体”也可以包括复合形式,其包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”也可以包括抗体片段,如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它组成,无论它们是否保留抗原结合功能。
在本发明中可以使用任何抗体制剂,其包含来自天然、合成或重组来源的未纯化或部分纯化的抗体。未纯化的抗体制剂可来自多种来源,包括但不限于血浆、血清、腹水、乳汁、植物提取物、细菌裂解液、酵母裂解液或限定条件的细胞培养基。部分纯化的制剂可来自已经由至少一种层析、沉淀、其它分级分离步骤或前述的任意组合处理的未纯化的制剂。在一些实施方式中,在纯化前,抗体还未经蛋白A亲和纯化。
如上述,据信树脂也可用于非抗体蛋白质的纯化。治疗性蛋白质的示例包括但不限于:因子VIII、血管假性血友病因子、酶、生长调节因子、凝血因子、转录因子和磷蛋白。
实施例1.对-氨基马尿酸-官能化的树脂的制备
采用球状珠形式的UNOsphereTM二醇(10mL),其为一种用N,N'-亚甲基双丙烯酰胺交联的3-烯丙氧基-1,2-丙二醇和乙烯基吡咯烷酮的共聚物,并且具有200-300μmol/mL的二醇密度。使这些珠在10mL的0.1M乙酸钠或水中悬浮。添加高碘酸钠至50-100mM范围内的浓度,并且在室温(大约70°F(21℃))下孵育所得的混合物3-24小时。反应导致二醇基团转化为醛基(150-250μmol/mL范围内)。将所得的醛-官能化树脂转移到20-mL柱,其中用100mL的水洗涤该树脂。
然后在10mL pH 7.0的0.05M磷酸钠缓冲液中悬浮洗涤的树脂并且与对-氨基马尿酸混合,并且在37℃下以200rpm在振荡器中孵育所得的混合物30分钟。然后向该混合物添加NaBH3CN(100mg),并且反应混合物中对-氨基马尿酸的浓度为25-100mM。3小时的反应时间之后,将所得的对-氨基马尿酸-官能化的树脂转移到20-mL柱,其中用3个柱体积的水以及之后的1-2个柱体积的0.1N NaOH水溶液洗涤所述树脂,然后再次用水洗涤直至洗脱物的pH低于10。所得产物中的对-氨基马尿酸配体的密度范围为25-100μmol/mL。
实施例2.免疫球蛋白与对-氨基马尿酸-官能化的树脂的结合
用实施例1中制备的对-氨基马尿酸-官能化的树脂填充测量为7mm内径和5.5cm长度的柱并且用pH 4.5的含有150mM NaCl的20mM乙酸钠缓冲液平衡该柱。然后以1mL/分钟的流速将该缓冲液中的1.0mg/mL的人免疫球蛋白G的溶液施加至柱。当280nm下的柱流出物吸光度的值达到等于对应于1.0mg/mL人IgG溶液的值的10%(从而指示10%临界点)时,用平衡缓冲液洗涤该柱。通过将达到10%临界点的保留时间乘以流速和免疫球蛋白浓度来确定结合能力。免疫球蛋白的动态结合能力为40mg/mL(即,每毫升柱填充40mg免疫球蛋白)。使用pH 7.0的100mM磷酸钠缓冲液洗脱结合的免疫球蛋白。
实施例3.在对-氨基马尿酸-官能化树脂上从哺乳动物培养物滤出液纯化免疫球蛋白G
用pH 5.0的50mM乙酸钠,125mM NaCl来平衡根据实施例1制备的对-氨基马尿酸-官能化树脂(60微摩尔对-氨基马尿酸/mL珠)的0.57cm×4cm柱。将含有12mg的mAb 1(一种IgG 1单克隆抗体)的10毫升的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物收获物以300cm/h的线性流速施加至柱。然后用平衡缓冲液洗涤柱直至280nm处的吸光度达到基线。在大约36分钟时,pH 6.2的含有50mM磷酸钠,50mM NaCl的洗脱缓冲液经过柱以洗脱结合的抗体,并且收集用该缓冲液得到的收集洗脱物并命名为收集池1。在大约44分钟时,用pH 7.5的20mM磷酸钠,1M NaCl进一步洗脱柱,并且收集用该缓冲液得到的洗脱物直至吸光度恢复到基线并命名为收集池2。然后通过用1M NaOH洗涤来清洁该柱。在260nm和280nm处测量光密度并且检测器输出示于图1,这是以吸光度单位与时间分钟表示的光密度的图并且显示了采用平衡缓冲液洗涤过程中的除了收集池1和2以外的流通部分(“流通”)的检测器信号。
流通部分以及收集池1和2(图1)的聚丙烯酰胺凝胶电泳产生的电泳图示于图2,其显示了在流通部分中不存在抗体而收集池1显示抗体高度富集。在收集池1中宿主细胞蛋白水平从CHO细胞收获物中的3.5×104ng/mg降低至391ng/mg,这使用购自美国北加利福尼亚绍斯波特的天鹅科技公司(Cygnus Technologies)的宿主细胞蛋白测定试剂盒CM015所确定。如由PicoGreen测定所确定,收集池1中的DNA水平从CHO细胞收获物中的>5.0×103ng/mg降低至458ng/mg。对收集池1和2实施采用Bio-Sil 250柱(美国加利福尼亚州赫尔克里斯的伯乐实验室公司)的尺寸排阻色谱,结果示于图3。结果显示收集池1含有单体抗体而收集池2含有小量的单体抗体和大量的聚集抗体。
实施例4.免疫球蛋白G与2-(4-氨基苯甲酰氨基)-乙磺酸-官能化的树脂的结合
用pH 4.5,20mM乙酸钠,150mM NaCl来平衡以与实施例1类似的方式制备的相同的固体支持物上的2-(4-氨基苯甲酰氨基)-乙磺酸-官能化的树脂的0.7cm×5.5cm柱。然后,将1.0mg/mL的该缓冲液中的人免疫球蛋白G的溶液以1mL/分钟的流速施加至该柱。当280nm处的柱流出物吸光度的值达到等于对应于1.0mg/mL人IgG溶液的值的10%(从而指示10%临界点)时,用平衡缓冲液洗涤柱。通过将达到10%临界点的保留时间乘以流速和免疫球蛋白浓度来确定结合能力。免疫球蛋白的动态结合能力为36mg/mL。使用pH 7.0的100mM磷酸钠缓冲液洗脱结合的免疫球蛋白。检测回收率为87%。
实施例5.在对-氨基马尿酸-官能化树脂上进行的各种蛋白质的结合与洗脱研究
用一系列蛋白质来重复实施例2以确定结合与洗脱的最优条件。结果见下表所示。
表:在对-氨基马尿酸-官能化树脂上进行蛋白质结合与洗脱的条件
表格显示牛血清白蛋白、牛碳酸酐酶和溶菌酶与树脂的结合主要以阳离子交换模式发生,如通过与最优结合缓冲液相比在最优洗脱缓冲液中盐浓度的大幅增高所示。相反,乳铁蛋白和mAbX的结合以混合式(阳离子交换和疏水相互作用)发生,如需要200-300mMNaCl来实现目标蛋白的充分结合且需要同时增加盐浓度和pH来实现完全洗脱所示。伴白蛋白的结合主要以阳离子交换模式发生,同时在pH 6下该蛋白质的最优洗脱缓冲液中NaCl的浓度在505mM处是适的。高于505mM的盐浓度产生伴白蛋白与柱的更强结合从而使得洗脱更加困难,这表明随着缓冲液导电率的增加向疏水互相作用模式的转化。
实施例6.在对-氨基马尿酸-官能化的树脂上纯化IgM BF
该实施例说明了在对-氨基马尿酸-官能化树脂上从主要污染物为牛血清白蛋白(pI=5)的样品中纯化IgM BF(pI=5.3-5.5)的条件。使用实施例1的树脂和实施例2的方法,向树脂施加30-mL样品,用20mL pH 6.5的含有20mM磷酸钠和125mM NaCl的结合缓冲液以200cm/h洗涤,并且用10mL pH 7.0的含有20mM磷酸钠和400mM NaCl的洗脱缓冲液以200cm/h洗脱,之后用19mL的1N NaOH进行柱再生。BSA不与柱结合,但是相反出现了柱部分收集物由14mL延伸至56mL的宽峰;IgM在80mL处以尖峰洗脱,而其他杂质在94mL处以尖峰洗脱。3个峰被完全分开没有重叠。
实施例7.在对-氨基马尿酸-官能化的树脂上进行mAb1的精加工
该实施例说明了在对-氨基马尿酸-官能化的树脂上的纯化mAb1的条件。使用实施例1的树脂和实施例2的方法用pH 5.0的含有50mM乙酸钠和125mM NaCl的结合缓冲液将样品施加至树脂35分钟,之后是第35-45分钟的梯度洗脱至100%洗脱缓冲液(15个柱体积),之后是第45-55分钟的100%洗脱缓冲液(5个柱体积),洗脱缓冲液pH 6.2,含有50mM磷酸钠和50mM NaCl。洗脱缓冲液之后是第55-65分钟的剥离缓冲液,剥离缓冲液pH 7.5,含有200mM磷酸钠和700mM NaCl,并且最后是第70分钟的1N NaOH剥离溶液。mAb1在48分钟时以尖峰洗脱,之后分别在剥离缓冲液和NaOH溶液开始时有较小但是仍然尖的峰。全部峰被完全分开没有重叠。该实施例显示洗脱可以在比结合缓冲液中存在的盐浓度更低的盐浓度下发生。
实施例8.使用对-氨基马尿酸-官能化的树脂从mAb2中去除mAb2聚集体
该实施例说明了在对-氨基马尿酸-官能化的树脂上从mAb2去除mAb2聚集体的条件。在0.56cm直径和4cm长度的柱中使用实施例1的树脂,并且以300cm/h的流速,用pH 4.5的含有20mM乙酸钠和300mM NaCl结合缓冲液(缓冲液A)向树脂加载mAb2样品持续33分钟,之后用pH 6.0的20mM MES和20mM NaCl(缓冲液B)洗涤,之后是第33-52分钟的缓冲液B至缓冲液C(pH 7.5的20mM磷酸钠和1M NaCl)的梯度洗脱(25个柱体积),然后在第52-57分钟保持100%缓冲液C,并且最后用1N NaOH进行再生。在第42分钟洗脱下第一个峰,并且在第60分钟洗脱第二个峰,两个峰完全分开。通过尺寸排阻色谱(HPLC)分析第一个峰,其表明与样品中11%聚集物相比,该峰所含单体有少于0.2%的聚集物。单体回收率超过80%。
在所附的权利要求书中,术语“一个”或“一种”是用来表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候,是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的,并且是非排它性的。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料以及任何现有技术之间存在矛盾之处的时候,以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或词组的定义与本说明书对相同的词或词组明确给出的定义之间的差异。
Claims (7)
1. 一种混合式色谱介质,所述混合式色谱介质包含与固体支持物偶联的配体,所述配体包含疏水基团和选自羧基基团或磺基基团的酸部分,其中所述疏水基团通过含肽连接与所述酸部分接合,所述疏水基团是苯基环,所述配体由所述苯基环通过1个原子的链偶联至所述固体支持物,其中:
所述配体是苯甲酰氨基乙酸,并且所述连接是位于所述苯甲酰氨基乙酸的苯环上的对位的烷基氨基,从而所述配体和链一起构成2-(4-氨基苯甲酰氨基)乙酸基团;或者
所述配体是2-苯甲酰氨基乙磺酸,并且所述连接是位于所述2-苯甲酰氨基-乙磺酸的苯环上的对位的烷基氨基,从而所述配体和链一起构成2-(4-氨基苯甲酰氨基)-乙磺酸基团;
所述固体支持物包含具有中值直径为0.5微米或更大的孔并且没有直径为0.1微米或更小的孔的颗粒。
2.如权利要求1所述的混合式色谱介质,其特征在于,所述颗粒具有25微米-150微米的中值粒径。
3.如权利要求1所述的混合式色谱介质,其特征在于,所述配体是苯甲酰氨基乙酸。
4.如权利要求1所述的混合式色谱介质,其特征在于,所述配体是2-苯甲酰氨基乙磺酸。
5.一种用于制备混合式色谱介质的方法,所述方法包含:
(a)将二醇-官能化的固体颗粒上的二醇基团氧化为醛基,所述固体颗粒具有中值直径为0.5微米或更大的孔并且没有直径为0.1微米或更小的孔并且具有200-300 μmol/mL的二醇密度,从而将所述二醇-官能化的固体颗粒转化为醛-官能化的固体颗粒;以及
(b)将胺-官能化的配体与所述醛-官能化的颗粒偶联,所述胺-官能化的配体包含与选自羧基基团或磺基基团的酸部分接合的胺-取代的疏水基团,所述疏水基团是苯基环,所述苯基环通过含肽连接与所述羧基基团或磺基基团接合,所述配体由所述苯基环通过1个原子的链偶联至所述固体支持物;
所述配体是苯甲酰氨基乙酸,并且所述连接是位于所述苯甲酰氨基乙酸的苯环上的对位的烷基氨基,从而所述配体和链一起构成2-(4-氨基苯甲酰氨基)乙酸基团;或者
所述配体是2-苯甲酰氨基乙磺酸,并且所述连接是位于所述2-苯甲酰氨基-乙磺酸的苯环上的对位的烷基氨基,从而所述配体和链一起构成2-(4-氨基苯甲酰氨基)-乙磺酸基团。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述配体是苯甲酰氨基乙酸。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述配体是2-苯甲酰氨基-乙磺酸。
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