CN102068833A - 一种多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱及其制备方法。所述开管柱经由毛细管内壁乙烯基化、环氧基团柱内接枝反应、支化亚胺开环接枝反应等步骤制得。所述毛细管开管柱固定相是甲基丙烯酸酯触须式聚合物。所述毛细管开管柱中的甲基丙烯酸酯触须式聚合物表面键合有多胺，所键合的多胺是支化聚乙烯亚胺。本发明所述多胺触须式聚合物修饰的毛细管开管柱键合相分布均匀，管壁键合修饰大量氨基基团，提供了明显且稳定的阳极电渗流和更多的静电作用位点，有效减少了对蛋白质等大分子样品的吸附作用，重现性好，适合用于复杂生物样品中多肽类及蛋白质类的毛细管电色谱微分离。
Description
技术领域：
本发明涉及一种多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱及其制备方法，属于毛细管电色谱技术领域。
背景技术：
毛细管电色谱(capillary electrochromatography)是近年发展起来的一种高效、快速的新型色谱微分离技术。毛细管分离柱是CEC的核心，毛细管开管柱作为毛细管柱主要类型之一，与填充柱相比无需制备塞子，与整体柱相比无需精确优化聚合物和致孔剂的混合比例，具有制备简单、容易操作、平衡时间短、冲洗方便和进样量小的特点，能够获得较高的柱效。
由于开管柱内能有效键合官能团的柱表面积较小，开管电色谱的相比较低，柱容量较小。为了克服低相比的难题，科学家相继将蚀刻管壁键合、多孔层修饰、高配基容量聚合和纳米材料修饰等技术应用于固定相的制备，以提高开管柱容量。触须式聚合物因为具备较高的配基容量而在液相色谱和膜技术领域具有广泛的应用，柱相比、配体容量和比表面积均有明显提高，分离效果明显改善。
支化聚乙烯亚胺是带有伯胺、仲胺和叔胺基团和部分支链的聚合物，易与环氧、酸、异氰酸酯化合物反应，可以进行多种化学改性。支化聚乙烯亚胺阳离子密度和活性高，热稳定性好，而且具有极性基团(氨基)和疏水基(烷基、乙烯基)结构，能与不同的物质相结合，是一种良好的毛细管功能修饰材料。本发明首次提出经由毛细管内壁乙烯基化、环氧基团柱内接枝反应，在毛细管内壁键合环氧基团，在此基础上接枝支化聚乙烯亚胺制备开管柱固定相，使得所制备的开管柱触须式聚合固定相有效作用位点大幅提升，提供了明显且稳定的阳极电渗流和更多的静电作用位点，可以有效减少对蛋白质等大分子样品的吸附作用，显著改善开管柱容量和分离效果。同时，在同向电渗流模式下，酸性化合物也可实现快速高效的分离，可适用的分离对象范围较广。
发明内容：
为了实现开管柱固定相有效作用位点大幅提升，提供稳定的阳极电渗流，本发明提供了一种多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱及其制备方法。采用毛细管内壁乙烯基化、环氧基团柱内接枝反应、支化聚乙烯亚胺开环反应等步骤，即首先通过甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷在管壁内表面引入可反应性的乙烯基，然后实施环氧基团柱内接枝反应，通过乙烯基与甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合反应形成表面带有环氧基、呈触须式分布的甲基丙烯酸酯聚合物；最后将应用支化聚乙烯亚胺与环氧基反应，将支化聚乙烯亚胺分子键合于毛细管表面，从而形成稳定的聚乙烯亚胺修饰层。所制得的聚合固定相键合大量胺基基团，且触须式结构使得有效作用位点大幅提升，从而能够提供了明显且稳定的阳极电渗流和更多的静电作用位点，稳定性高，可以有效减少碱性物质在管壁的吸附效应，应用于蛋白质、肽等生物样品分离，具有良好的效果。同时，在同向电渗流模式下，酸性化合物也可实现快速高效的分离，可适用的分离对象范围较广。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱，所述毛细管开管柱键合有甲基丙烯酸酯触须式聚合物，聚合物表面键合有多胺，所键合的多胺是支化聚乙烯亚胺。
所述多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱的制备方法包括以下步骤：
1、毛细管内壁乙烯基化：
将体积含量为30～50％的甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷和对应比例的N，N-二甲基甲酰胺以及1.0mg/mL阻聚剂二苯基苦基肼混合后，在低温下超声振荡15～20min，注入经HCl溶液和NaOH溶液预处理过的毛细管中。将毛细管两端封闭，于120℃下加热反应6～12h或者40～60℃下反应12～14h，优选为120℃下反应12h。待反应完成后，依次用N，N-二甲基甲酰胺和甲醇分别冲洗毛细管柱30min，于90℃氮气吹干。
2、环氧基团柱内接枝反应
将体积含量为10％的甲基丙烯酸缩水甘油酯和90％的无水甲苯以及0.25～1.25mg/mL引发剂偶氮二异丁腈，浓度优选为0.75mg/mL，混合后，在低温下超声振荡15～20min，吹氮气5～10min除去混合物中溶解的氧气，然后将混合物注入乙烯基化处理过的毛细管中。将毛细管两端封闭，浸于80℃水浴中反应2～20h，待反应完成后，依次用甲苯和甲醇分别冲洗毛细管柱30min，于90℃氮气吹干。
3、支化聚乙烯亚胺开环键合
将体积含量为5～35％的支化聚乙烯亚胺溶解于磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液的pH为6.0，浓度为20～50mmol/L，混匀后在室温下超声振荡15～20min后，将混合物注入已键合环氧基团的毛细管中。将毛细管两端封闭，浸于80℃水浴中反应12～24h或室温反应24～48h，待反应完成后，依次用去离子水、甲醇和流动相分别冲洗毛细管柱，除去柱内的残留试剂，得到聚乙烯亚胺修饰的触须式开管电色谱柱。
本发明的优点：
1、本发明的开管柱固定相采用毛细管内壁乙烯基化、环氧基团柱内接枝反应、支化聚乙烯亚胺开环反应等步骤，在触须式聚合物固定相的基础上再接枝支化聚合物制备而成，独特的触须式固定相结构实现了管壁空间内大量氨基的广泛分布，空间有效作用位点增加，比表面积增大，有利于改善开管柱容量和分离效果。
2、本发明的开管柱固定相采用化学键合的方法多步反应而成，由于是化学键与毛细管壁表面硅羟基结合，柱的稳定性和重现性较好，化学键合相分布比较均匀，不易出现脱落现象，柱寿命较长。
3、本发明的多胺修饰触须式聚合物固定相表面具有极性基团(氨基)和疏水基(链状烷基)结构，分离选择性提高，在较宽pH范围内能提供较强而稳定的阳极电渗流及更多的作用位点，可应用于开管毛细管电色谱，适宜于复杂生物样品中多肽类及蛋白质类的分离。在同向电渗流模式下也可以满足酸性化合物快速高效的分离要求，适用分离对象范围较广。
附图说明：
图1、多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱固定相结构式。
图2、多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱分离脑啡肽
1：Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，2：Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu，3：Gly-Gly-Phe-Met，4：Gly-Gly-Phe-Leu，5：Tyr-Gly-Gly，6：Gly-Phe-Met，7：Gly-Phe-Leu
图3、多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱分离蛋白质
1：肌红蛋白，2：α-乳白蛋白，3：牛血清白蛋白，4：溶菌酶。
图4、多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱分离核苷酸
1：5’-尿苷酸，2：5’-鸟苷酸，3：5’-腺苷酸，4：5’-胞苷酸。
具体实施方式：
实施例1：多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱的制备
1.毛细管内壁乙烯基化
在事先用0.1mol/L的HCl溶液和1.0mol/L的NaOH溶液预处理过的毛细管中加入体积含量为30％的甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷和70％的N，N-二甲基甲酰胺以及1.0mg/mL二苯基苦基肼的混合物，于120℃下反应12h。待反应完成后，依次用N，N-二甲基甲酰胺和甲醇分别冲洗毛细管柱30min，于90℃氮气吹干。
2、环氧基团柱内接枝反应
将体积含量为10％的甲基丙烯酸缩水甘油酯和90％的无水甲苯以及0.75mg/mL偶氮二异丁腈混合后，在低温下超声振荡15min，吹氮气5min除去混合物中溶解的氧气，然后将混合物注入乙烯基化处理过的毛细管中。将毛细管两端封闭，浸于80℃水浴中反应14h，待反应完成后，依次用甲苯和甲醇分别冲洗毛细管柱30min，于90℃氮气吹干。
3支化聚乙烯亚胺的开环修饰
将体积含量为30％的支化聚乙烯亚胺溶解于pH为6.0、50mmol/L磷酸盐缓冲液中，混匀后在室温下超声振荡15min，将混合物注入已键合环氧基团的毛细管中。将毛细管两端封闭，浸于80℃水浴中反应12h，待反应完成后，依次用去离子水、甲醇和流动相分别冲洗毛细管柱，除去柱内的残留试剂，得到聚乙烯亚胺修饰的触须式开管电色谱柱。该开管柱固定相的表面键合有大量的极性氨基和疏水链状烷基，其固定相结构如图1所示。
实施例2：多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱分离脑啡肽
在毛细管电色谱模式下，以pH 2.5，离子浓度30mmol/L、乙腈∶磷酸盐(25/75，v/v)的缓冲液为流动相，电动进样电压18kV，时间4s，外加分离电压18kV，波长214nm的条件下，对7种等电点相似的脑啡肽类物质在支化聚乙烯亚胺触须式聚合物修饰的开管柱上进行电色谱分离-紫外检测，如图2所示，洗脱峰依次为：1 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，2Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu，3 Gly-Gly-Phe-Met，4 Gly-Gly-Phe-Leu，5 Tyr-Gly-Gly，6 Gly-Phe-Met，7Gly-Phe-Leu，实现了基线分离，消除了肽在管壁上的吸附作用引起的拖尾现象。
实施例3：多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱分离蛋白质
在毛细管电色谱模式下，以pH 2.5，离子浓度20mmol/L、乙腈∶磷酸盐(20/80，v/v)的缓冲液为流动相，手动位差进样高度10cm，时间5s，外加分离电压18kV，波长214nm的条件下，四种蛋白质在该聚乙烯亚胺修饰的触须式聚合物开管柱上得到有效分离，如图2所示，洗脱峰依次为：1肌红蛋白，2α-乳白蛋白，3牛血清白蛋白，4溶菌酶，除了牛血清白蛋白峰宽较大外，其他蛋白质峰形较对称，没有产生拖尾，有效的避免了蛋白质类生物大分子在管壁的吸附现象。
实施例4：多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱分离核苷酸
在毛细管电色谱模式下，以pH 3.0，离子浓度20mmol/L、乙腈∶磷酸盐(25/75，v/v)的缓冲液为流动相，电动进样电压18kV，时间5s，外加分离电压18kV、波长254nm的条件下，四种酸性的单磷酸核苷酸类极性化合物在该聚乙烯亚胺修饰的触须式聚合物开管柱上同向电渗流模式下8min内达到高效分离。其谱图如图4所示。
Claims (2)
1.一种多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱，其特征是：所述毛细管开管柱固定相是甲基丙烯酸酯触须式聚合物。所述毛细管开管柱中的甲基丙烯酸酯触须式聚合物表面键合有多胺，所键合的多胺是支化聚乙烯亚胺。
2.如权利要求1所述多胺修饰的触须式聚合物毛细管电色谱开管柱的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)毛细管内壁乙烯基化：
将体积含量为30～50％的甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷和对应比例的N，N-二甲基甲酰胺以及1.0mg/mL阻聚剂二苯基苦基肼混合后，在低温下超声振荡15～20min，注入经HCl溶液和NaOH溶液预处理过的毛细管中。将毛细管两端封闭，于120℃下加热反应6～12h或者40～60℃下反应12～14h，优选为120℃下反应12h。待反应完成后，依次用N，N-二甲基甲酰胺和甲醇分别冲洗毛细管柱30min，于90℃氮气吹干。
(2)环氧基团柱内接枝反应
将体积含量为10％的甲基丙烯酸缩水甘油酯和90％的无水甲苯以及0.25～1.25mg/mL引发剂偶氮二异丁腈，浓度优选为0.75mg/mL，混合后，在低温下超声振荡15～20min，吹氮气5～10min除去混合物中溶解的氧气，然后将混合物注入乙烯基化处理过的毛细管中。将毛细管两端封闭，浸于80℃水浴中反应2～20h，待反应完成后，依次用甲苯和甲醇分别冲洗毛细管柱30min，于90℃氮气吹干。
(3)支化聚乙烯亚胺开环键合
将体积含量为5～35％的支化聚乙烯亚胺溶解于磷酸盐缓冲液中，磷酸盐缓冲液的pH为6.0，浓度为20～50mmol/L，混匀后在室温下超声振荡15～20min后，将混合物注入已键合环氧基团的毛细管中。将毛细管两端封闭，于80℃中反应12～24h或室温反应24～48h，待反应完成后，依次用去离子水、甲醇和流动相分别冲洗毛细管柱，除去柱内的残留试剂，得到聚乙烯亚胺修饰的触须式开管电色谱柱。
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