KR20200104279A - Herg1 및 herg/인테그린 베타 1에 결합하는 동종 및 이중특이적 항체 - Google Patents

Herg1 및 herg/인테그린 베타 1에 결합하는 동종 및 이중특이적 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2개의 항체, hERG1 mAb (hERG1의 세포외 도메인 S5-P를 결합시키는), 및 β1 인테그린의 세포외 도메인을 결합시키는 β1 인테그린 mAb TS2/16 혹은 BV7의 가변형 도메인 (VH 및 VL)으로 구성된 이중특이적 항체에 대해 개시한다. 본 발명은 VH 도메인의 위치 95에 Cys를 가진 신규한 항-hERG1 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양학 및 기타 의학 분야에서 진단 및 치료를 목적으로 한 이들의 응용에 대해서도 개시한다.

Description

HERG1 및 HERG/인테그린 베타 1에 결합하는 동종 및 이중특이적 항체
본 발명은 항체, 종양학 및 기타 의학 분야에서 진단 및 치료 목적을 위한 이의 응용에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 항 hERG1 분자, 및 hERG1과 β1 인테그린을 표적으로 하는 이중특이적 항체를 포함하는 상기 분자의 가공 유도체에 관한 것이다.
과거 20여년 동안 항체 생산 기술은 항체 가공을 통해 크게 개선되었다: 분자 가공 분야에 새로운 기술이 출현하면서 광범위한 유전공학적 항체류, 예를 들어 scFv 단일사슬의 Fab형이나 Fv형 절편, 이합체(diabody), 삼합체(triabody), 이중특이체, 소형체(minibody), 나노체, 파지항체 등을 생산하게 되었다. 실제로, Fc-매개 효과가 필요하지 않거나 심지어 불필요한 응용 분야들이 있는데 이는 상기 효과에 연루된 독성효과 및, Fc가 비인간 제공원으로부터 유래된 경우, 항체 효능을 중화시킬 수 있는 면역반응을 유발하는 상기 독성효과의 능력 탓이다.
가공된 항체 절편 중에서, 단일사슬 가변형 절편(scFv)이 가장 일반적이며 또한 이는 항원결합 활성 및 면역학적 응용시 쉽게 통제할 수 있는 특성을 가진 최소 재조합체 포맷 중 하나이다.
scFv는 플랙시블 펩티드 링커에 의해 서로 결합되어 있는 중사슬(VL) 및 경사슬(VL)의 가변형 영역들로 이루어지는 한편, VH-VL 페어링 및 항원결합 부위의 정확도를 떨어뜨리지 않는다. 링커의 선택은 scFv의 용해도, 발현 및 정확한 폴딩에 영향을 미칠 수 있다. 펩티드 링커의 길이는 10 내지 25 아미노산 범위이며 보통 글리신(G) 및 세린(S) 같은 친수성 아미노산으로 구성된다. 친수성 서열은 펩티드 폴딩 동안 가변형 도메인의 내부 혹은 도메인 간의 펩티드 삽입을 방해한다. 가장 일반적으로 사용되는 링커는 (Gly4Ser)3 모티프로서 이의 유연성, 중성 전하 및 용해도 때문에 선택된다. 진단 및 치료에 scFv를 사용하면 특히 고형 종양의 치료에 있어서 완전 항체보다 더 유리한 몇가지 장점이 있다: 실제로, 완전 분자에 대한 절편의 침투 속도가 가장 현저한 장점이다. 1988년 Ig 완전 분자는 고형종양에 1 mm 침투하는데 54시간이 소요되었으며 반면 Fab 절편은 동일한 거리를 16시간만에 도달했다. 더욱이, scFv 및 기타 다른 항체 절편 포맷은 다원자가 및 다종특이적 시약으로 성형되거나, 방사성 핵종, 독소 혹은 나노입자 등의 치료 툴에 쉽게 결합하여 가공됨으로써 이의 진단 치료 효능을 개선할 수 있다.
이들 가공된 분자는 박테리아 혹은 이스트 계통에서 쉽게 생산되며 더 효율적으로 분출하고 또한 전길이 Ig 보다 더 높은 조직침투력을 갖는다: 이들 분자의 유일한 한계점은 소형 크기에 따른 짧은 반감기이다. 약동학적 성질 예컨대 scFv의 다합체화 (링커 서열 단축)을 통해 삼합체 (약 90 kDa) 및 사합체 (약 120 kDa)를 형성하거나, 혹은 폴리에틸렌글리콜(PEG)(Natarajan et al. 2005)이나 인간 혈청 알부민(HSA) 같은 큰 분자에 대한 항체의 접합을 개선하는 다수의 방안이 개발되었다.
이중특이적 항체(bsAbs)는 다음과 같은 다수의 장점에 기반하여 잠재적 암치료제로서 최근에 큰 주목을 받고 있다;
- bsAbs는 특이적 면역세포를 종양세포로 재배향시켜 종양사멸을 향상시킬 수 있다:
- bsAbs는 2가지 상이한 타겟을 질병 측면에서 각각 특이하거나 서로 중복되는 기능을 수행하는 다양한 경로로 차단할 수 있다;
- bsAbs는 하나가 아닌 2가지의 상이한 세포-표면 항원과 상호작용하여 결합특이성을 증가시키는 능력이 있다.
이중특이적 항체(bsAbs)의 개발에는 많은 난점이 있었으며 이는 주로 제조공정상의 문제, 낮은 수율, 불안정성 및 면역원성 등에 기인한다 (Spiess C. et al, 2015).
bsAbs 생산의 방법적 측면을 고려하면, 이는 기본적으로 다음의 세가지 방법으로 제조한다. 즉:
- 2가지 상이한 하이브리도마 세포주의 체강 융해에 기초한 콰드로마(quadroma)기술;
- 화학적 교차 링커를 이용한 화학적 접합;
- 재조합 DNA 기술을 활용하는 유전적 접근.
이중특이적 항체는 대략 다음의 2가지 하위그룹으로 구분될 수 있다:
면역글로블린 G(IgG)-유사 분자 및 비-IgG-유사 분자, 또한 30종 이상의 bsAbs가 임상 개발 단계에 있으며 그 중 2가지인 카투막소맙과 블리나투모맙은 이미 시판 허가를 받았다.
비-IgG-유사 분자는 주로 scFv-계 bsAbs와 나노체를 포함한다. scFvs는 링커의 길이, 항체 서열 및 기타 요인에 따라 이량체, 삼량체 혹은 사량체로 될 수 있다 (Le Gall F.et al., 1999). 이러한 포맷이 바람직하며 이는 다수의 임상적 응용분야를 수반할 수 있다. scFv-계 bsAbs 포맷 중에는 다음과 같은 것이 있다:
- 직렬형 scFvs은 플랙시블 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 scFvs로 구성되며, 예컨대, 직렬 방향의 글리신-세린 반복 모티프를 들 수 있다. 널리 알려진 이중특이적 T 세포 엔게이저(BiTE) 기술은 상기의 포맷을 기초로 한다 (Chames P. et al., 2009).
- 이합체 포맷으로서, 이는 2가지 상이한 항체의 가변적 영역이 2개의 링커에 의해 연결되어 있다. 이들은 이합체의 안정성을 증가시키는 기능이 있다.
- 단일사슬 이합체(scDbs)로서, 별도의 연결 링커를 사슬 사이에 첨가하여 상기 이합체 포맷을 단일사슬 이합체로 변환할 수 있다.
- 직렬형 이합체(TandAbs)는 2개의 VL 및 VH 도메인쌍에 의해 형성되며, 단일 폴리펩티드 사슬 형태로 연결되어 4원자가 TandAb를 형성한다.
- 이중-친화성 재표적화 분자(DARTs)로서, DARTs는 VLA-VHB + VLB - VHA 구성에서 VL에 연결된 제1 가변형 영역의 VH을 제2 사슬에 결합시키고 또한 VL에 연결된 제2 가변형 영역의 VH를 제1 사슬에 결합시켜 생성한다. 크기가 작기 때문에 DARTs는 배제되기 쉽다 (Moore P.A. et al., 2011).
이합체와 scDbs 역시 이중특이적 항체 절편을 생성하는 매우 효과적인 방안으로서, 2개의 상이한 항원을 결합시킬 수 있으며 따라서 세포를 가교시키거나(예. 재표적화 면역계 이펙터 세포); 이펙터 분자를 보충하거나 (독소, 약물, 사이토킨, 방사성 동위원소 혹은 보체계통 등), 담체 계통을 재표적화하거나 (유전자 치료를 위한 바이러스 벡터 등) (Kontermann 2005), 혹은 종양 진행에 수반되는 거대분자형 복합체를 표적화 및 저해하는데 유용하다.
항체 가공은 또한 포식성 (예, 항체 절편의 복수분자화) 및 친화성 (예, 가변형 영역내 전장 Ig이나 항체 절편의 돌연변이)을 증대시키고; 이펙터 기능 (예, 불변 영역내 전장 Ig의 돌연변이, 혹은 항체 절편과 재조합 Fc, 독소, 약물, 사이토킨, 사멸 리간드, 방사성 동위원소, 나노입자 혹은 보체계통 분자 등의 접합)를 향상시키는 방법도 제공했다.
과거 30여년 동안 인간 에테르-a-go-go-관련 유전자 1 (hERG1) 칼륨 채널은 종양학 분야 및 기타 인간의 질병에서 타겟이었다. 그러나, 본래의 작용 혹은 부작용으로서 RG1 차단을 야기하는 대부분의 약물은 심장독성 (심전도 QT 간격의 연장 및 심실 부정맥 발병)을 일으킬 수 있다는 점 때문에 상기 채널을 치료목적으로 불법 이용하는 것은 금지되어 왔다. 심장에서 발현하는 hERG1을 암세포 및 기타 질병 특징의 세포에서 발현하는 hERG1과 구분하는 생체물리학 및 생물분자적 특성에 관한 연구에서, 다른 혈장막 단백질 특히 인테그린 수용체의 베타1 서브유닛을 가진 hERG1 복합체를 암세포의 혈장막에서 확인했다. 이러한 복합체는 심장 근육세포에서는 발생하지 않는다 (Becchetti A. et al., Sci.Signaling, 10(473). pii: eaaf3236. doi: 10.1126/scisignal.aaf3236. PMID: 28377405, 2017). 따라서, hERG1/베타1 인테그린 복합체는 형질전환 세포의 특징인 종양발생 유닛으로 구성되고, 이는 심장에서 발현하는 채널로부터 종양내 hERG1을 분화시킨다. 이러한 발견은 hERG1/베타1 인테그린 복합체를 표적화하는 임의의 분자 (소분자 약물이나 단백질)를 심장독성 없이 진단 및 치료 목적으로 사용할 수 있음을 시사한다. 이때 hERG1/베타1 인테그린 복합체를 표적화할 수 있는 분자는 현재 알려진 바가 없다.
이탈리아 특허 IT1367861에서는, hERG1의 S5-공극 세포외 부분에 대하여 특이적인 항-hERG1 단클론 항체(mAb)를 분비할 수 있는 하이브리도마 세포주 클론인 A7을 개시한다.
WO2016020483 (A1)은 완전 뮤린 단클론 항-hERG1 분자의 상세 구조 및 이에 상응하는 항-hERG1 scFv 항체를 mAb 항-hERG1 VH 및 VL의 분리후 수득하는 생산 방법에 대해 개시한다. 이러한 scFvw는 상응하는 완전 항체와 동일한 특이성이 있으며 따라서 종양 및 기타 질환에서 과도하게 발현한 동일한 항-hERG1 단백질을 인지할 수 있다. 각각 VH (SEQ ID NO:2) 및 VL (SEQ ID NO:4)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:3이, SEQ ID NO:6을 가진 scFV를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:5와 더불어 소개되었다.
연구 목적으로, 또다른 TS2/16 (Arroyo et al. J. Cell Biol. 1992, 117(3), 659-670) 및 BV7 (Martin-Padura et al. J. Biol. Chem. 1994, 269(8), 6124-6132) 중에서 예컨대 항-베타1 인테그린 mAb가 공지되어 있다. 본 발명은 hERG1과 베타1 인테그린 단백질을 동시에 타겟하는 이중특이적 항체를 제공하는 것을 목적으로 하며, 상기의 단백질은 암세포의 혈장막 상에 복합화된 것이다. 또한, 본 발명은 hERG1에 대하여 개선되거나 혹은 적어도 대안적인 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 대상은, hERG1의 세포외 도메인 S5-P를 결합시키는 항-hERG1 Ab의 중사슬 가변형(VH) 도메인과 경사슬 가변형(VL) 도메인, 및 β1 인테그린의 세포외 도메인을 결합시키는 항-β1 인테그린 Ab의 중사슬 가변형(VH) 도메인과 경사슬 가변형(VL) 도메인을 구비한 이중특이적 항체(bsAb)이다.
뜻밖에도, 본 발명에 따른 bsAb는 종양 세포에만 존재하는 hERG1+ β1-인테그린 복합체를 선택적으로 결합시킬 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 특히,본 발명에 따른 bsAb는 체외 세포성장 억제능 및 신생물질 세포주 패널에 대한 이동 전이 활성을 나타냈다.
일측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:8과 적어도 85% 동일성을 가진 중사슬 가변형(VH) 도메인으로서 여기서 위치 95 상의 잔기는 Cys인 도메인 및 SEQ ID NO:4와 적어도 85% 동일성을 가진 경사슬 가변형(VL) 도메인을 포함하는 항-hERG1 분자에 관한 것으로서, 상기의 분자는 hERG1 S5-공극 세포외 부분에 대한 특이성을 갖는 것이다.
뜻밖에도, 본 발명에 따른 것으로서 VH 도메인의 위치 95에 Cys를 가진 항-hERG1 분자 (항-hERG1-Cys)는 (SEQ ID No.:8), 종래 기술에서 공지된 바와 같이, VH 도메인의 위치 95에 Phe를 가진 분자 (SEQ ID No:2)와 비교시 부동화된 항원에 대해 더 우수한 친화성을 나타낸다는 것을 발견했다. 특히, 본 발명에 따른 scFv 분자는 신생물질 세포주 패널 상에서 세포외 세포성장 저해능을 나타냈다.
바람직하게, 본 발명의 bsAb는 항-hERG1 Ab의 중사슬 가변형(VH) 도메인이 SEQ ID No:8 혹은 SEQ ID No:2와 85% 동일성을 갖고 또한 항-hERG1 Ab의 경사슬 가변형(VL) 도메인이 SEQ ID No:4와 85% 동일성을 가지며; 또한 항-β1 인테그린 Ab의 중사슬 가변형(VH) 도메인과 경사슬 가변형(VL) 도메인은 TS2/16 (SEQ ID No:26 및 24) 혹은 BV7 (SEQ ID N:46 및 48)의 VH 및 VL과 적어도 85% 동일성을 갖는다.
바람직하게, 본 발명의 bsAb는 비-IgG-유사 bsAb, 바람직하게는 scFv계 bsAb이다. 본 발명에 따르면 scFv계 bsAb는 직렬 scFvs, 이합체 포맷, 단일사슬 이합체, 직렬 이합체(TandAbs) 및 이중-친화성 재표적화 분자 (DARTs)로 이루어진 군에서 선택된 포맷, 바람직하게는 scDb를 갖는다.
바람직하게, 항-β1 인테그린 Ab의 VH 도메인은 SEQ ID NO:26 혹은 SEQ ID NO:46, 더 바람직하게는 SEQ ID NO:26과 90%, 95%, 99% 혹은 100% 동일성을 갖는다.
바람직하게, 항-β1 인테그린 Ab의 VL 도메인은 SEQ ID NO:24 혹은 SEQ ID NO:48, 더 바람직하게는 SEQ ID NO:24와 90%, 95%, 99% 혹은 100% 동일성을 갖는다.
바람직하게, 여전히 위치 95에 아미노산 Cys가 유지되는 항-hERG1 Ab의 VH 도메인은 SEQ ID NO:8과 90%, 95%, 99% 혹은 100% 동일성을 갖는다.
바람직하게, 항-hERG1 Ab의 VH 도메인은 SEQ ID NO:2와 90%, 95%, 99% 혹은 100% 동일성을 갖는다.
바람직하게, 항-hERG1 Ab의 VL 도메인은 SEQ ID NO:4와 90%, 95%, 99% 혹은 100% 동일성을 갖는다.
본 발명에 따른 항-hERG1-Cys Ab의 VH 도메인은 바람직하게는 SEQ ID No:7과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 혹은 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 코딩되며, 여기서 잔기 283 내지 285의 트리플릿은 TGT 혹은 TGC일 수 있다.
본 발명에 따른 항-hERG1-Cys Ab의 VH 도메인은 바람직하게는 SEQ ID No:1과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 혹은 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 코딩된다.
본 발명에 따른 항-hERG1-Cys Ab의 VL 도메인은 바람직하게는 SEQ ID No:3과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 혹은 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 코딩된다.
본 발명에 따른 분자는 완전히 인간화된 재조합 Ab일 수 있다.
본 발명에 따른 분자는 scFv이거나, 또는 Fab, scFv의 단일사슬의 Fv 형태, 이합체, 삼합체, 이중특이체, 소항체, 파지 항체 등의 기타 다른 가공된 항체일 수 있으며; 바람직하게는 scFv 및 이합체 (scDb)이다.
바람직한 링커는 (Gly4Ser)3 모티프이다.
특히 바람직한 것은 항-hERG1-Cys scFv로서, 여기서 VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 연결되며; 더 바람직하게는 SEQ ID No: 10을 가진 항-hERG1-Cys scFv이다.
특히 바람직한 것은, 항-hERG1-Cys scFv 및 항-β1-인테그린 scFv으로 이루어진 단일사슬 이합체(scDb)인 bsAb로서, 이는 종양세포에만 존재하는 복합 hERG1+ β1-인테그린에 대해서 선택적으로 작용한다.
그러므로 바람직한 일 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO:8과 적어도 85% 동일성을 갖고 위치 95의 잔기가 Cys인 제1 중사슬 가변형(VH) 도메인, SEQ ID NO:4와 적어도 85% 동일성을 갖는 제1 VL 도메인, SEQ ID NO:26 혹은 SEQ ID N:46과 적어도 85% 동일성을 갖는 제2 VH 도메인, 및 SEQ ID NO:24 혹은 SEQ ID N:48과 적어도 85% 동일성을 갖는 제2 VL 도메인을 포함하는 bsAb 단일사슬 이합체(ScDb)에 관한 것으로서, 상기 이중특이적 Ab는 hERG1 S5-공극 세포외 부분 및 β1-인테그린에 대한 특이성을 갖는다.
본 발명에 따른 bsAb 혹은 항-hERG1 분자는 진단 또는 치료 기구로서 유용하다.
본 발명에 따른 진단 기구는 체외 hERG1 검출 (예, 수술 시료나 생검) 용도로서, 항-hERG1-Cys scFv 및/또는 본 발명에 따른 이중특이적 Ab (바람직하게는 scDb인)를 표지되지 않은 형태 혹은 형광단 바람직하게는 형광단 Alexa 488에 결합된 형태이다.
따라서, 본 발명의 대상은 동시 사용, 개별 사용 혹은 순차적 사용을 위한 구성요소들로 이루어진 체외 진단(IVD) 키트로서, 이 IVD 키트는:
상술한 바와 같은 항-hERG1-Cys scFv를 담은 용기; 및/또는
상술한 바와 같은 이중특이적 Ab를 담은 용기를 포함한다.
바람직하게, IVD 키트는 대조군으로서 WO2016020483에 개시된 완전 단클론 항체를 담은 용기를 더 포함한다.
IVD 키트는 면역조직화학법 (2 내지 3주내로 결과를 얻을 수 있는) 용도의 고정된 조직시료, 혹은 면역형광법에 이용되는 것으로서 1일 이내 결과를 얻을 수 있는 신선 생검 조직 (내시경이나 수술 등으로 수득한)에 대해 이용할 수 있다
형광단 (예를 들어 바람직하게는 Alex 750) 혹은 방사성 핵종 (예를 들어 바람직하게는 Tc99)으로 표지화된 상술한 바와 같은 항-hERG1-Cys scFv는, 항-hERG1-Cys scFv에 의해 나타나는 hERG1 양성 암종의 체내 (인간) 조기진단에 사용하는 분자이다. 본 발명에 따른 항-hERG1-Cys sc-FV 항체는 암조직에 대한 신속 침투, hERG1에 대한 신속 결합 및 신속 소거가 가능하고 또한, 방사성 핵종에 결합될 경우, hERG1 양성 암종의 체내 (인간) 조기진단이 가능한 이상적인 분자로 제공할 수 있는 특이적인 분자구조를 갖는다. 이는 1회 단일 투여에 이용되며, 8 mg/kg으로 정맥주사시 전신 독성 없이 3.5 시간의 빠른 반감기를 갖고 또한 ECG의 변화가 없으므로 (도 19 참조), 심장 세포와의 상호작용을 일으키지 않는다. 마지막으로, 췌장내 췌장암을 이종이식한 생쥐에 대해 1mg/kg으로 정맥주사시 매우 우수한 종양/조직비를 나타냈다.
치료기구: 본 발명에 따른 이중특이적 항체 분자는 치료 목적으로 암 hERG1/베타1 인테그린 분자 복합체를 저해하기 위해 특별히 고안된 것으로서, 베타1 인테그린에 의해 발현될 때, 심장과의 상호작용없이 암세포에 hERG1을 선택적으로 결합시킬 수 있는 단일사슬 이중특이적 항체 (단일사슬 이합체, scDb)이다. 본 발명에 따른 scDb는 hERG1 양성암이 있는 환자에게 반복적 (만성) 투여하기 위해 사용하는 이상적인 분자를 나타내며, 심장의 안전에 우려가 없고 초기암 및 진행/전이 단계 모두에서 치료 효능이 있으며, 단일 약제 및 화학요법, 방사선 요법, 표적치료법 및 면역-항암제 치료법에 추가되는 복합 치료제로서 양쪽 모두에 사용할 수있다. 복합 치료법에 적합한 것은, hERG1/베타1 인테그린 분자 복합체의 과발현에 의해 암세포에서 구조적으로 활성화된 경로가 현재 시판약물로 표적화한 경로와 상호보완적이거나 이에 통합되는 것이다. 또한, hERG1/베타1 인테그린 암 경로는 현재 사용되는 치료법에 있어서 종양 탈출 메카니즘을 나타낼 수 있다. 항-hERG1/베타1 인테그린 scDb는 대체로 12시간의 반감기를 갖고, 8 mg/kg의 정맥주사시 전신 독성이 없으며, 또한 ECG에 변화가 없는 것으로 나타났다 (도 20 참조). 마지막으로, 항-hERG1/베타1 인테그린 scDb는 췌장에 췌장암을 이종이식한 생쥐에서 총 6회에 걸쳐 1주 2회씩 1 mg/kg 주사시 매우 우수한 치료 효능을 나타냈다.
본 발명에 따른 bsAb나 분자를 이용하여 진단 혹은 치료할 수 있는 질병은 hERG1 단백질의 과발현 혹은 발현이상을 특징으로하는 모든 종류의 질병을 포함한다. 이러한 질병으로는 종양, 신경학적 질환, 내분비계 질환 및 신경내분비계 질환 등이 있다.
본 발명에 따른 bsAb나 분자, 특히, 항-hERG1-Cys scFV 혹은 scDb는 또한 약제학적 전달 벡터로 사용할 수 있으며; 예를 들어, 방사성 핵종, 효소, 약물이나 독소에 공유결합하거나 하지 않을 수 있다.
또한 본 발명의 대상은, 본 발명에 따른 bsAb나 분자 및 적어도 또다른 약제학적 수용가능한 성분을 포함하는 약제학적 조성물이다.
또한 본 발명의 대상은, 본 발명에 따른 이중특이적 Ab나 항-hERG1 분자를 코딩하는 뉴클레오티드의 서열이다. 본 발명에 따른 분자를 제공할 수 있는 상기의 코딩 서열과 적절한 수준의 상동성 (예, 적어도 85%)도 본 발명에 포함되는 것으로 한다.
본 발명에 따른 분자는 바람직하게는 각각 VH (SEQ ID NO:8) 및 VL (SEQ ID NO:4)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:2를 이용하여 조제할 수 있다.
특히 바람직하게, 본 발명은 본 발명에 따른 항-hERG1-Cys scFv의 제조방법을 제공하며, 이 방법은 SEQ ID NO:10을 가진 항-hERG1-Cys scFV을 코딩하기 위해 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:9를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 scDb-hERG1-β1은 바람직하게는, 항-hERG1-Cys VH (SEQ ID NO:8), 항-hERG1-Cys VL (SEQ ID NO:4), 항 β1-인테그린 VL (SEQ ID No:24 혹은 SEQ ID N:48) 및 항 β1-인테그린 VH (SEQ ID No:26 혹은 SEQ ID N:46)을 각각 코딩하는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:23 혹은 SEQ ID N:47 및 SEQ ID NO:25 혹은 SEQ ID N:45를 이용하여 제조한다. 바람직하게, 상기 도메인은 다음과 같은 순서로 배열된다: 항-hERG1-Cys VH (SEQ ID NO:8), 항 β1-인테그린 VL (SEQ ID No:24 혹은 SEQ ID N:48), 항 β1-인테그린 VH (SEQ ID No:26 or SEQ ID N:46) 및 항-hERG1-Cys VL (SEQ ID NO:4).
특히 바람직하게, 본 발명은 본 발명에 따른 scDb-hERG1-β1의 제조방법을 제공하며, 이 방법은 SEQ ID NO:30을 갖는 항-hERG1-Cys scFv를 코딩하기 위해 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:29를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 재조합 기술을 시사한다.
따라서 본 발명의 대상은, 본 발명에 따른 이중특이적 Ab나 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:2와 유전자변형된 미생물을 포함하는 발현 벡터나 플라스미드, 또는 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 세포이다. 상기 발현 벡터나 플라스미드는 또한 SEQ ID NO:23 혹은 47 및 SEQ ID NO:25 혹은 45를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 하기의 실험 단원을 참조하면 더욱 상세히 이해할 수 있다.
도 1은 scFv-hERG1 구조물에 실행된 돌연변이 유도후 4개의 집락에서 DNA 서열로부터 수득한 전기영동도로서, Phe에서 Cys로의 적절한 돌연변이를 나타낸다.
도 2은 (A): scFv-hERG1의 이스트 발현으로서, scFv-hERG1-G3 피치아 파스토리스(Pichi Pastoris) 클론을 유도하여 수득한 상청액의 24시간, 48시간 및 72시간 슬롯 블롯(slot blot)을 나타낸다. 클론 C7, C12, D9, E8, G3, G7 및 형질전환되지 않은 피치아 균주 GS115의 음성 대조군을 모두 분석했다. DB 색소유전자(핵유전자)를 이용하여 염색했다. G3이 가장 잘 발현하는 것으로 나타났다. (B): 6개의 클론의 정제된 시료에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. G3이 가장 높은 발현 레벨을 나타낸 반면, G7 클론에서는 거의 발현이 검출되지 않았다. (C): scFv-hERG1-D8Cys 피치아 파스토리스 클론을 유도하여 수득한 상청액의 24시간, 48시간 및 72시간 슬롯 블롯을 나타낸다. 클론 B11, C3, D8, D9, G4, G10 및 형질전환되지 않은 피치아 균주 GS115의 음성 대조군을 모두 분석했다. DAB 색소유전자를 이용하여 염색했다. D8이 가장 잘 발현하는 것으로 나타났다. (D): 6개의 클론의 정제된 시료에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다. D8이 가장 높은 발현 레벨을 나타낸 반면, C3 클론에서는 낮은 발현이 검출되었다.
도 3은 (A): 정제된 scFv-hERG1-G3 및 scFv-hERG1-D8Cys의 용리분획물의 SDS-PAGE; (B): 수퍼덱스(Superdex) 75 HR 10/30을 이용하여 나타낸 상기 양쪽의 정제된 항체의 겔여과 크로마토그래피; (C): scFv-hERG1-D8Cys 항체 안정성 시험을 각각 나타낸다. SDS-파지와 쿠마씨 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant blue) 염색처리 결과를 다양한 시점의 사진으로 기록한다 (단백질 정제후 0, 6, 12 및 18개월).
도 4는 (A): 고정처리된 및 생체 HEK293-Mock 및 HEK293-hERG1 세포에 대해, 표지화 되지 않은 (I. IF) 및 표지화된 scFv-hERG1-G3 항체 (D. IF)를 모두 사용하여 수행한 면역형광 분석의 결과이다. 20X 배율로 찍은 대표 영상에서, 핵 염색은 청색 형광으로 막 염색은 착색된 녹색으로 각각 나타낸다 (Alexa 488).
(B): 고정처리된 및 생체 HEK293-Mock 및 HEK293-hERG1 세포에 대해, 표지화되지 않은 (I. IF) 및 표지화된 scFv-hERG1-D8-Cys 항체 (D. IF)를 모두 사용하여 수행한 면역형광 분석의 결과이다. 20X 배율로 찍은 대표 영상에서, 핵 염색은 청색 형광으로 및 막 염색은 착색된 녹색으로 나타낸다 (Alexa 488).
(C): ImageJ 소프트웨어 (ImageJ 1.38, U.S. National Institutes of Health)를 이용하여 계산한 IF 강도(A.U.)를 나타내는 그래프이다. 각 영상에서, 청색 채널값 (핵 염색을 나타냄)을 제외한 3곳의 상이한 영역의 형광강도 평균치를 계산했다.
모든 실험 결과에서 HEK 293-hERG1에 대한 값은 HEK 293-Mock에 대해 얻은 값과 비교시 유의미하게 높았다. 통계학적 분석은 샤피로-윌크(Shapiro-Wilk) 검정을 통해 데이타 정규성 및 동분산성(homoscedasticity) 추정을 평가하여 수행했으며, 또한 변화도를 Anova를 통해 분석했다. 쌍별(pairwise) 유의미성은 t-검정 혹은 본페로니(Bonferroni) 검정으로 추산했다. (*p < 0.05)
도 5는 항-hERG1 단클론 항체 (100 μg/ml) 및 scFv-hERG1-D8Cys (10; 20μg/ml)을 이용하여 HCT-116, MDA MB-231, MIA PACA2, HEK 293 hERG1, HEK-MOCK, FLG 29.1, PANC-1, BxPC-3에서 각각 수행한 트립판 블루 생존율 분석을 나타낸다. 모든 실험은 3회 중복 실시했다.
도 6은 패널 A - HEK 293 hERG1 스페로이드 10, 20 및 40 μg/ml scFv-hERG1-D8Cys를 시험했다. 20 μg/ml 및 40 μg/ml scFv-hERG1-D8Cys로 치료한 스페로이드의 부피는 (각각 점선과 빗금선) 각 시점에서 대조군 (실선)보다 더 작다. 반면에, 패널 B는 대조군과 비교시, 시험된 3가지 농도의 scFv-hERG1-D8Cys에서 모두 치료대상 스페로이드간에 아무런 차이도 발견되지 않은 HEX-MOCK (hERG1을 발현하지 않는) 스페로이드의 성장 곡선을 나타낸다. 패널 A 및 B는 또한 72시간 배양 후 나타낸 것으로서 각각 대조군 HEK293-hERG1 및 HEK-MOCK 스페로이드의 대표적인 명시야(bright-field) 영상을 나타낸다. 패널 C - 췌장관 아데노칼시노마 스페로이드이다. 패널 C는 췌장관 아데노칼시노마 Mia Paca 2 세포에서 얻은 효과를 나타낸다. 20 μg/ml 및 40 μg/ml scFv-hERG1-D8Cys으로 치료한 세포에서 양쪽 모두 스페로이드 부피의 감소가 관찰되었으며, 대조군과 비교시, 각 시점에서 최고 시험 농도 (빗금선)일 때 더욱 결정적인 효과를 나타냈다. 또한 72시간후 찍은 사진을 패널 우측에 표시했으며, 대조군 (좌측 이미지 참조)과 비교시, 40 μg/ml scFv-hERG1-D8Cys 항체 (우측 이미지 참조)로 치료한 세포에서 스페로이드 부피가 크게 감소하는 것을 보여준다, 패널 D - 유방암 세포. MDA-MB 231 스페로이드: 대조군과 비교시, 3가지 농도의 시험 scFv-hERG1-D8Cys (10, 20, 40 μg/ml) 모두에서 부피 감소의 뚜렷한 효과를 관측했다. 부피 감소는 또한 도면 우측에 표시한 MDA-MB 231 스페로이드의 사진으로부터도 추정할 수 있다.
도 7은 72시간후 스페로이드에서 칼세인 AM 세포 생존율 분석을 수행한 결과이다. 녹색은 살아있는 세포를 나타내며 적색은 죽은 세포를 나타낸다. 좌측의 이미지 (패널 A)는 각 세포주에 관한 대조군의 사진이며 우측 (패널 B)은 40 μg/ml scFv-hERG1-D8Cys으로 치료한 스페로이드의 사진이다. 이미지로부터 상기 항체로 치료한 스페로이드, 특히 Mia Paca 2, MDA MB-231 및 PANC-1 스페로이드에서의 부피 감소를 확인할 수 있으며, 또한 특히 scFv-hERG1-D8Cys로 치료한 MDA MB-231 및 PANC-1 스페로이드에 있어서 죽은 세포의 갯수를 나타냈다.
도 8A는 자동 DNA 서열분석 서비스에 따라 제작한 항 b1-인테그린 (TS2/16) VL 및 VH 도메인 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID No: 23 및 25)을 나타낸다. 밑줄친 이 탤릭체 부분은 VL 서열 을, 이탤릭체 부분은 VH 서열을 각각 표시한다.
도 8B는 항 b1-인테그린 (BV7) VL 및 VH 도메인 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID No: 45 및 47)이다. 여기서 굵은 표시는 단일 도메인을 분리하는데 사용한 프라이머를 나타내는 한편, 회색 강조 표시는 공지되지 않았으나 정확한 프레임을 위해 필수적인 VH 서열 영역을 나타내는 것이다.
도 9는 상부 패널: 2개의 단일사슬 항체, 항-hERG1 및 항-TS2/16의 개략적인 구조를 나타낸다. 하부 패널: scDb-hERG1- β1의 개략적인 구조를 나타낸다.
도 10은 항 b1-인테그린 scFv 어셈블리를 VL-링커-VH의 순서로서 나타내는 SOE-PCR 법을 개략적으로 도시한다.
도 11은 패널 A - 항-hERG1-Phe-β1-scDb 구조물을 이용한 형질전환후 성장한 6개의 클론을 소규모로 유도하여 유발시킨 정제된 상청액의 쿠마씨 염색을 나타낸다. 1개의 밴드가 분자량 약 약 60 KDa인 클론 G5에 상응하는 것으로 검출되며 이는 예상한 것과 동일했다.
패널 B는 높은 수준의 G5 클론 발현에서 유래한 상청액의 정제후 생성된 크로마토그램을 나타내며: 여기서 1개의 단일 피크가 육안으로 확인되고, 청색 영역에 근거하여 용리물을 분석하여 쿠마씨 염색을 패널 C에 표시했다. 이는 시험된 모든 용리물에서 적정 분자량을 가진 밴드를 보여준다.
도 12는 패널 A에서, 상이한 양의 항-hERG1-Phe-β1-scDb 이중특이적 항체를 이용하여 HEK 293 HERG1 세포에서 수행한 세포-ELISA의 결과를 나타낸다.
도 13은 다양한 기질, BSA 및 피브로넥틴 (FB)에 시드한 세포에서 수행한 간접 IF를 나타낸다. IF는 BSA에 코팅된 세포에서 수득한 것과 비교시, FB에 코팅된 세포 HEK 293 HERG1에서의 신호가 더 강한 것을 보여준다.
도 14는 HEK 293 HERG1 세포에서 수행한 간접 IF를 나타낸다 (패널 A 및 B). 과량의 S5PORO 펩티드를 투여한 후 세포의 염색을 패널 D 및 E에 나타낸다. 패널C는 2차 항체로만 염색된 대조군 세포를 나타낸다.
도 15는 scDb-yhERG1-Cys-β1의 발현과 정제를 나타낸다. 패널 A - 피치아 파스토리스 상청액의 정제 결과로 얻은 크로마토그램이다. 패널 B - 크로마토그램의 청색 피크에 근거하여 scDb-hERG1-Cys-β1 정제로 나온 용리물의 분석 결과를 보여주는 쿠마씨 염색을 나타낸다.
도 16은 scDb-hERG1-Cys-β1-Alexa488을 이용한 직접 IF를 나타낸다. 구체적인 실험에서, 세포는 Alexa 499 형광단과 직접 접합된 scDb 항체를 이용하여 배양했다. DG25 WT 세포 (hERG1과 β1 인테그린 발현 양측에 대해 음성인)는 Alexa 488 형광단으로 직접 표지한 scDb-hERG1-Cys-β1 항체를 이용하여 배양했다. 어떤 신호도 표현되지 않는다. 패널 B - 피브로넥틴(FN)과 BSA 상에 시드하고 scDb-hERG1-Cys-β1-Alexa 488로 염색한 HEK 293 HERG1 세포를 나타낸다: 막대 그래프에서 보는 바와 같이, BSA 상에 시드된 세포 (
Figure pct00001
10 A.U.)와 비교시, FN에 시드된 세포에서 신호가 더 높다 (
Figure pct00002
17 A.U.). 패널 C - FN과 BA 상에 시드하고 scDb-hERG1-Cys-β1-Alexa 488로 배양한 HEK 293 WT 세포를 나타낸다: FN 상에 시드된 세포 (
Figure pct00003
12 A.U.)와 비교시, BSA에 시드된 세포에서 신호가 더 낮다 (
Figure pct00004
7 A.U.). 패널 B 및 C 로부터 추론할 수 있는 바와 같이, FN에 시드된 HEK 293 WT 세포 (
Figure pct00005
12 A.U.)와 비교하여, 형광값은 FN 상의 HEK 293 HERG1 세포에서 더 높다 (
Figure pct00006
17 A.U.).
도 17은 MDA-MB 231 및 PANC-1 세포에서 IC50 측정 결과를 나타낸다. 세포생존력에 대한 효과는 PANC-1 세포의 경우 24 μg/ml에서 및 MDA-MB 231 세포의 경우 42 μg/ml에서 입증되었다.
도 18은 HCT 116, MDA-MB 231 HERG1, MDA-MB 231 세포 및 PANC-1 세포에 대한 측면 운동성(횡동력) 실험의 결과이다. 대조군 세포와 비교하여, scDb-hERG1-Cys-β1로 치료한 세포에서 MI (운동지수)의 뚜렷한 감소가 나타난다. MDA-MB 231과 비교하여, MDA-MB 231 HERG1에서 더 결정적인 효과가 기록되었으며 이는 세포의 운동성에 대한 효과에 hERG1가 관련있음을 시사한다. 측면 운동성 실험은 PANC-1 세포에 대해 수행하였으며 대조군과 비교시 처리된 세포에서 MI가 더 낮은 것으로 나타났다.
도 19(A)는 iv 투약 (n = 2)에 의한 생쥐의 scFv-hERG1-D8Cys의 약동학을 나타낸다. 항체 농도는 scFv 주사뒤 5, 10 및 30분, 1, 2, 6, 24 및 48시간 후에 채혈한 생쥐 혈액시료의 혈장농도를 측정하는 ELISA 를 통해 측정 확인했다. t1/2 = 3.5시간이며, 2회 측정값의 평균 ± SD를 사용한다.
(B)는 ECG, 심전도 기록 그래프를 나타낸다. ECG 측정값은 생리용액(PBS)을 주사한 대조군 생쥐에 관한 좌측 패널 상에 기록되며, QT 간격 조정값은 86 ms이다. 우측 패널은 scFv-hERG1-D8Cys 투여후 수득한 ECG 그래프를 나타내며, 대조군과 비교시 유의할만한 변화는 보이지 않는다. QT 간격 조정값은 90 ms이다.
(C)는 생체내 분석 결과를 나타낸다. 각 패널은, PBS 용액으로 처리한 대조군 생쥐와 비교시, Alexa750이 접합된 scFv-hERG1-D8Cys 항체로 처리한 대표 생쥐에서의 형광 신호를 기록한 것이다. 검출된 최대 신호는 주사 10분후 나타나며 정맥 투여 24시간 후에는 어떤 형광신호도 검출되지 않았다.
(D)는 scFv-hERG1-D8Cys-Alexa750 흡수율 및 PDA의 MIAPaCa-2-nu/nu 생쥐 모델에서의 scFV-hERG1-D8Cys-Alexa750 보존율을 나타낸다. 6.5 μg의 scFv-hERG1-D8Cys-Alexa750 항체를 생쥐의 꼬리정맥 주사로 투여했다. 표지된 항체를 i.v. 주사한 생쥐의 대표 사진 (좌측)을 대조군 생쥐 (우측)와 비교했다. 종양에 근접한 부위인 복강 부분의 형광 강도를 분석했다. 형광 방출 스펙트럼은 광자 영상 촬영기 (Biospace Lab)로 측정했으며 예컨대, 주사 5분후 시작하여 60분 후까지 5분마다 상이한 시점에서 영상을 취득했다.
도 20(A)는 iv 투약 (n = 2)에 의한 생쥐의 scFv-hERG1-Cys-β의 약동학을 나타낸다. 항체 농도는 scFv 주사뒤 5, 10 및 30분, 1, 2, 6, 24 및 48시간 후에 채혈한 생쥐 혈액시료의 혈장농도를 측정하는 ELISA를 통해 측정 확인했다. t1/2
Figure pct00007
12시간이며, 2회 측정값의 평균 ± SD를 사용한다.
(B)는 ECG, 심전도 기록 그래프를 나타낸다. scFv-hERG1-Cys-β1 투여후 수득한 ECG 그래프는, 도 20(B)에 기록된 대조군 그래프와 비교시 유의할만한 변화는 보이지 않으며, QT 간격 조정값은 83 ms으로서 대조군에 필적하는 수준이다.
(C)는 scFv-hERG1-Cys-β1 항체로 처리 및 처리하지 않은 MIAPaCa-2-nu/nu 종량을 가진 생쥐의 췌장 부피(mm3)를 나타내는 표이다. 또한, 전이 확산율, 슬라이드 상의 괴사면적율(%) 및 혈관수를 표시한다.
(D)는 부검후 췌장의 영상으로서: 1, 무처리; 2, 3가지 용량의 scFv-hERG1-Cys-β1 항체로 처리; 3, 6가지 용량의 scFv-hERG1-Cys-β1 항체로 처리한 결과를 나타낸다.
실험 단원
1. scFv-hERG1 돌연변이 발생
WO2016020483 (A1)에 기술된 scFv hERG1 분자의 아미노산 서열은 VH 도메인의 위치 95에 아미노산 Phe가 존재한다. 뉴클레오티드 서열 SEQ ID No:1은 VH 도메인의 위치 283에 T (c283T)가 존재한다. 본 발명에 따르면, 상기 VH 도메인의 위치 283에 있는 T를 G로 대체함으로써 (c283T > G) 위치 95의 Phe (TTT)에서 Cys(TGT)로의 교환을 유도했다. 이러한 돌연변이의 결과로 프레임워크 3과 CDR3 사이의 위치에 1개의 아미노산 (Cys)이 도입되었으며 이는 면역글로불린 가변형 도메인 내의 이황화물 결합의 형성을 위한 기초가 되는 뜻밖의 결과를 가져왔다. Cys를 본래의 구조물에 도입하여 돌연변이 발생 프로토콜을 설정했다 (재료와 방법 단원 참조). 4개의 돌연변이 발생 scFv-hERG1 집락으로부터 얻은 cDNA를 서열화했으며, 그 서열목록 결과 (도 1)에서, 위치 283에서의 TTT에서 TGT로의 적절한 돌연변이(c283T > G)를 확인했다. 이는 Phe에서 Cys로의 원하는 돌연변이를 나타낸다.
2. 발현 및 단백질 정제
플라스미드, scFv-hERG1 및 돌연변이 유발된 scFv-hERG1 (scFv-hERG1-Cys 로 명명됨)를 각각 스페로플라스팅(spheroplasting) 기술을 이용하여 GS115 P. 파스토리스 숙주 균주로 형질전환시켰다, scFv-hERG1 형질전환체 중 6개의 클론 (C7, C12, D9, B8, G3, G7) 및 scFv-hERG1-Cys 로부터 나온 6개의 클론 (B11, C3, D9, D9, G4, G10)을 분석했다. 도 2는 소규모 발현의 결과를 보여주며, scFv-hERG1는 패널 A 및 B에, 또한 scFv-hERG1-Cys는 패널 C 및 D에 각각 나타낸다. 72시간 후에는 모든 클론이 단백질 발현을 나타냈으며 (상부 패널), 이는 또한 슬롯 블롯에서도 확인된다.
정제후 존재하는 단백질을 웨스턴 블롯으로 평가했다 (패널 B 및 D).
2개의 항체에 관하여 가장 우수한 2개의 발현 클론을 선택했다: scFv-hERG1의 G3 (이하 scFv-hERG1-G3) 및 scFv-hERG1-Cys의 D8 (이하 scFv-hERG1-D8-Cys).
대규모 발현 분석 결과는 도 3에서 보는 바와 같다. 단백질의 존재는 SDS-PAGE 및 쿠마씨 브릴리언트 염색법으로 평가했다. 분획물 11, 12, 13 (A, 좌측 패널)은 scFv-hERG1-G3에 상응하고; 분획물 12, 13, 14 (B, 우측 패널)은 scFv-hERG1-D8Cys에 상응한다. 두 항체의 분자 크기에 상응하는 밴드 (약 30 KDa)를 육안으로 확인할 수 있다. 두 단백질, scFv-hERG1-G3과 scFv-hERG1-D8Cys의 수율을 비교시 유의할 만한 수준의 차이를 확인했다: scFv-hERG1-G3 농도는 0,050 μg/μl; scFv-hERG1-D8Cys 농도는 0,444 μg/μl 이다.
Figure pct00008
a상기 수율은 피치아 파스토리스 이스트 배양액 1리터당 단백질의 mg 로 표준화했다.
3. scFv-hERG1-G3 and scFv-hERG1-D8Cys 간의 항원 친화성의 비교
도 3에 기록된 크로마토그램 (패널 B)은 겔 여과법으로 얻은 결과를 나타낸다. 크기배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하여 두 항체의 결합력에 영향을 미칠 수 있는 응집체의 존재 가능성을 조사했다. scFv-hERG1-G3에 관한 패널 B (좌측 패널)에 기록된 분석 결과로부터 몇개의 응집체가 검출되며; 반면에 scFv-hERG1-D8Cys (B, 우측 패널l)는 단량체 형태로 나타난다.
4. scFv-hERG1-D8Cys 항체 안정성 검증
scFv-hERG1-D8Cys 항체의 안정성은, 정제후 여러 시점에서 SDS-파지 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색법을 통해 단백질을 분석하여 (6, 12, 18 개월) 직접 평가했다. 도 3C의 데이타는 모든 시점에서 유일하고 뚜렷한 단일 밴드를 육안으로 확인할 수 있음을 보여주며, 이는 단백질이 분해 징후 없이 안정성을 유지하고 있음을 가리킨다.
5. scFv-hERG1-G3 및 scFv-hERG1-D8Cys의 면역반응성 평가
다음, 고정된 세포에 대해 scFv-hERG1-G3 및 scFv-hERG1-D8Cys을 사용하여 면역형광성을 분석하여 상기 두 항체의 면역반응성을 측정했다. 세포 모델로는 hERG1 cDNA (HEK-hERG1)가 트랜스펙트된 HEK293를 사용하고, hERG1 단백질을 발현하지 않은 HEK-MOCK를 대조군으로 이용했다. HEK-MOCK 세포는 상기 두 항체에 대해 약한 신호를 나타내거나 신호를 나타내지 않는 반면, HEK 293 hERG1은 scFv-hERG1-G3에 대해 우수한 라벨링(표지화)을 및 scFv-hERG1-D8Cys에 대해서는 더욱 우수한 라벨링을 나타냈다 (도. 4, A 및 B). ImageJ 소프트웨어를 이용하여 얻은 데이타 분석결과를 패널 C에 기록된 그래프 상에 표시한다. scFv-hERG1-D8Cys 염색으로 얻은 값은, HEK-MOCK 세포에서 얻은 대조군의 값과 비교시, hERG1을 과발현하는 세포에서 현저히 높다.
또한 형광분자 Alexa 488로 직접 라벨링한 후의 두 항체의 면역반응성을 검증했다. scFv-hERG1-G3-Alexa488 및 scFv-hERG1-D8Cys-Alexa488 항체를 고정된 세포 상의 IF에서 검사한 결과 (도 4, A 및 B), 형광단이 접합된 후라도 자연 배열내 항원을 인지하는 능력이 유지됨을 보여준다. IF 염색은 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 측정하고 그 결과는 패널 C에 기록된 그래프 상에 나타낸다. scFv-hERG1-G3-Alexa488 및 scFv-hERG1-D8Cys-Alexa488 양측에 있어서, HEK-MOCK 세포 대조군과 비교시, HEK 293 HERG1 세포에서 얻은 신호가 더 강하다.
분자 툴로서 scFv-hERG1-G3-Alexa488 및 scFv-hERG1-D8Cys-Alexa488의 생체내 사용 가능성을 평가 및 비교하기 위해, 생체 세포에 대한 IF에서 상기 두 항체를 사용했다 (도 4A 및 B).
실험을 통해 고정된 세포에 대한 염색으로 얻은 결과를 확인했다: HEK293 hERG1 세포는, 음성 대조군인 HEK293 MOCK 세포와 비교시, 더 강한 신호를 갖는 것으로 나타난다. HEK 293 hERG1 세포는 더 특이적인 스폿형 세포 라벨링을 갖는 반면, HEK-MOCK 세포는 비특이적 확산 배경을 갖는 것으로 나타난다. 이러한 이유로서 동일한 구역의 명시야 영상을 표시했다.
6. scFv-hERG1-D8Cys 항체 생존성 억제 및 스페로이드 시험
이 단계에서, 신생물 세포주 패널에서 scFv-hERG1-D8Cys의 세포성장 억제능을 분석했다. 도 5에 표시한 바와 같이, HCT-116, MDA-MB 231, Mia Paca-2, HEK293, HERG1, PANC-1 및 BxPc3에 있어서 세포 증식의 유의미한 용량의존적 억제효과를 관측했다. 항-hERG1 단클론 항체 (100 μg/ml) 및 scFv-hERG1-D8Cys (10; 20μg/ml)을 이용하여 세포를 처리했다. 예상과 같이, hERG1을 발현하지 않는 HEK-MOCK 세포에 있어서 세포 생존율의 유의미한 감소는 나타나지 않았다.
I3D 세포 모델에 있어서 scFv-hERG1-D8Cys의 효과를 조사하기 위하여, 스페로이드 상에서 3가지 상이한 농도의 scFv-hERG1-D8Cys (10; 20; 40μg/ml)를 검사했다.
도 6은 스페로이드 부피(mm3)를 Y축으로 하고 상이한 시점들을 X축으로 표시하는 (24h, 48h and 72h) 그래프를 도시한다.
도 6에서 패널 A는 HEK293-hERG1에서 생성된 스페로이드에 대하여 얻은 그래프를 표시한다. 20 μg/ml 및 40 μg/ml의 scFv-hERG1-D8Cys로 처리한 스페로이드의 부피는 각 시점에서 대조군과 비교시 더 작다. 반면에, 패널 B는 HEK-MOCK 스페로이드의 성장 곡선을 나타내며, 이에 따르면 검사한 scFv-hERG1-D8Cys의 상기 3가지 농도 모두에서, 대조군과 비교시, 처리한 스페로이드에서 아무런 차이점도 확인되지 않았다. 패널 A 및 B는 모두 각각 72시간 배양후에 나타낸 것으로서, 대조군 HEK293-hERG1 및 HEK-MOCK 스페로이드의 대표적인 명시야 영상을 보여준다.
패널 C는 췌장관 아데노칼시노마 Mia Paca 2 세포에서 얻은 효과를 보여준다. 20 μg/ml 및 40 μg/ml scFv-hERG1-D8Cys로 처리한 양측 세포에서 모두 스페로이드 부피 감소가 관측되었으며, 각 시점에서 대조군과 비교시, 최고 농도일때 가장 뚜렷한 효과가 나타났다. 도면의 우측부에 표시된 72시간후 얻은 영상에서 Mia Paca 2의 대조군 스페로이드의 4X 배율 사진을 나타내는 반면, 우측 영상은 40 μg/ml의 scFv-hERG1-D8Cys로 처리한 Mia Paca 2 스페로이드의 10X 배율 사진을 나타낸다. 실제로는 부피가 너무 커서 초점을 적절히 맞추기 어렵기 때문에 72시간 후 대조군 Mia Paca 2 스페로이드의 사진을 10X 배율로 수득하기는 불가능했다; 반면에 scFv-hERG1-D8Cys로 처리한 72시간 후의 Mia Paca 2 스페로이드는 대조군과 비교시 그 부피가 크게 감소했으므로 10X 배율로 가시화할 수 있다.
패널 D는 MDA-MB 231 스페로이드를 보여준다: 대조군과 비교시, 시험대상인 3가지 농도의 scFv-hERG1-D8Cys (10, 20, 40 μg/ml)에서 모두 현저한 부피 감소 효과가 관측된다. 또한 도면의 우측에 표시된 MDA-MB 231 스페로이드의 사진으로 부터도 부피 감소를 추정할 수 있다.
도 7은 72시간 후의 스페로이드에 대해 수행된 칼세인 AM 세포 생존율 분석에서 얻은 결과를 나타낸다. 녹색은 생체 세포를 나타내며 적색은 죽은 세포를 나타낸다. 좌측 (패널 A)의 영상은 각 세포주에서의 대조군의 사진이며, 우측 (패널 B)은 40 μg/ml scFv-hERG1-D8Cys로 처리한 스페로이드의 사진이다. 영상으로부터, 항체로 처리한 스페로이드 특히 Mia Paca 2, MDA MB-231 및 PANC-1 스페로이드에 대한 부피 감소 및, 특히 scFv-hERG1-D8Cys로 처리한 MDA MB-231 및 PANC-1 스페로이드에 있어서 죽은 세포의 수가 증가한 것이 주목된다..
7. scDb-hERG1-β1
β1-인테그린 (scFv-TS2/16) 및 scFv-hERG1-Cys 혹은 scFv-hERG1에 배향하는 단일사슬 항체를 포함하는 이중특이적 항체(bsAb)가 개발되었다 (상기 참조).
TS2/16의 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No:23 이며; TS2/16의 VH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No:25 이고 (도 8 참조); 또한 TS2/16의 VL 아미노산 서열은 SEQ ID No:24 이며 TS2/16의 VH 아미노산 서열은 SEQ ID No:26 이다.
이중특이적 항체의 포맷은 상기 단일사슬 이합체(scDb)로서, 이는 도 9에서 보는 바와 같이 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 항체의 가변형 도메인 (VH 및 VL)으로 구성된다. 도면의 상부 패널은 2개의 단일사슬 항체, 항-hERG1 scFv 및 항-β1-인테그린 TS2/16, scFv 항체 등을 표시한다.
하부 패널은 이중특이적 항체 항-hERG1-β1-인테그린의 최종 구조를 개략적으로 나타내며, 이 구조는 다음과 같은 순서로 2개의 항체의 가변형 도메인을 사용하여 배열한 것이다: VH scFv-hERG1 항체 (SEQ ID No:8 혹은 SEQ ID No:2), VL scFv-TS2/16 항체 (SEQ ID No:24), VH scFv-TS2/16 항체 (SEQ ID No:26), VL scFv-hERG1 항체 (SEQ ID No:4).
VL scFv-TS2/16 항체 (SEQ ID No:24) 및 VH scFv-TS2/16 항체 (SEQ ID No:26)는 펩티드 링커에 의해 연결된다.
VH scFv-hERG1 항체 (SEQ ID No:2 혹은 8) 및 VL scFv-TS2/16 항체 (SEQ ID No:24)는 펩티드 링커에 의해 연결된다.
VH scFv-TS2/16 항체 (SEQ ID No:26) 및 VL scFv-hERG1 항체 (SEQ ID No:4) 는 펩티드 링커에 의해 연결된다.
5' 및 3' 말단에는 FspI 및 AvrII 제한 부위가 삽입된다 (하기의 밑줄 부분으로 표시됨)
VLFspI:
AAAATGCGCAGACTACAAAGATATTGTGATGACACAGAC (SEQ ID No: 27)
VHAvrII:
GGGGCCTAGGATAGACAGATGGGGGTGTCGCGACACCCCCATCTGTCTAT (SEQ ID No: 28)
다음의 서열 (SEQ ID No:29)은 scDb-hERG1-1을 코딩하는 완전 뉴클레오티드 서열이고 (SEQ ID No:30): scFv-hERG1-Cys VH 서열은 회색으로 강조 표시한 것이며, scFv-TS2/16의 VL 서열 은 밑줄 및 이태리체로 표시하며, 굵은 글씨는 A, M, B링커 서열을 나타내고, 밑줄 및 굵은 이태리체는 scFv-TS2/16 항체의 VH 서열 을 나타내며, 또한 밑줄 및 회색 강조 표시는 scFv-hERG1-Cys의 VL 서열을 나타낸다.
Myc-태그 는 굵은 이태리체이며 His-태그 는 밑줄 및 굵은 글씨로 나타낸다. 제한 부위는 밑줄로 표시한다.
SEQ ID No 29:
Figure pct00009
상기 서열은 상기 표시된 제한 부위를 이용하여 상용의 벡터 pPICK에 클로닝 했다 (Life Technologies).
8. scDb-hERG1-Phe-β1: 발현 및 특징화
항-hERG1-Phe-β1-scDb 항체를 발현하는 구조물은 피치아 파스토리스 이스트 세포에서 발현하기에 적합한 벡터인 pIC9K 발현 벡터에 클로닝되었다.
GS115 피치아 파스토리스 균주는 스페로플래스팅 프로토콜에 따라 형질전환되었고, 96개의 클론은 선택용 G418을 함유하는 YPD-한천 플레이트에 스크리닝 했다. 다음, 6개의 클론을 소규모로 유도한 뒤 세파로스 Ni 비드 (GE Healthcare)를 이용하여 정제하며, pPIC9K 벡터와 함께 도입된 히스티딘 태그를 활용했다. 도 11의 패널 A은 쿠마씨 염색법을 나타내며, 여기에서 화살표로 강조한 1개의 밴드는 클론 G5에 상응하는 것으로서, 항-hERG1-Phe-β1-scDb 항체에 대해 예상되는 것과 동일한 분자량 (약 60 KDa)를 갖는다.
다음, 상기의 유도 프로토콜을 더 많은 양의 배양물에 대한 것으로 수정하여 G5 항-hERG1-Phe-β1-scDb 클론의 대규모 발현을 개시했다.
1L의 피치아 파스토리스 세포 배양물에서 얻은 상청액을 AKTA 정화제 (GE Healthcare)를 이용하여 정제했다. 그 결과를 도 11에 나타내며, 항체 정제처리의 결과인 크로마토그램 (패널 B), 및 청색 영역을 근거로 용리액을 분석한 쿠마씨 염색 결과 (패널 C)를 도시한다. 예상한 바와 동일하게, 정제된 항-hERG1-Phe-β1-scDb에 상응하는 단일 밴드를 각 용리액에서 검출했다.
항-hERG1-β1-scDb 분획물 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 18; 20을 모두 합하여 PBS 1X에 투석했다. 이에 항체의 세부적인 특징화를 시작했다.
중요한 단계 중 하나는 항-hERG1-Phe-β1-scDb 항체를 테스트하기에 적절한 모델을 선택하는 것이다. 하기의 표에서 특징화 실험을 위해 선택된 세포주의 hERG1 및 β1 인테그린에 관련된 발현 프로파일을 요약했다.
[표 4]
hERG1 및 β1 인테그린에 관련된 HEK 293 HERG1, HEK 293 WT 및 GD25 발현 프로파일
Figure pct00010
bsAb는 먼저 hERG1과 β1 항원을 모두 발현하는 HEK 293 hERG1 세포에서 분석했다. 세포-ELISA를 수행하고 그 결과를 도 12에 나타낸다. 여기서 세포-ELISA는 예상과 같이, hERG1과 β1 항원을 모두 발현하는 세포에 있어서 자연 항체와의 결합에 관하여 높은 OD450의 일정한 용량의존 비례성을 나타냈다.,
또한 항-hERG1-β1-scDb 이중특이적 항체는, 세포에 의해 내생적으로 발현하는 항원과 같이 자연 조건하에서 항원에 대한 결합능을 나타냈다. 항-hERG1-Phe-β1-scDb 이중특이적 항체의 결합특이성은 또한 동일한 양 (0,5μg)의 항-hERG1-Phe-β1-scDb 및, 상기 이중특이성 항체를 형성하는 2개의 단일사슬 항체 중 하나인, 항-scFv-hERG1-Phe 간의 비교를 통해 입증된다. 실제로, 항-hERG1-Phe-β1-scDb로 배양한 후에 얻은 신호는 항-scFv-hERG1-Phe을 사용하여 얻은 것보다 더 높다. 이러한 결과는 예상한 것과 같은 수준으로서, 이는 항-hERG1-Phe-β1-scDb에서 얻은 신호가 양측 항원 hERG1 및 β1에 대한 결합의 결과이며; 한편 scFv-hERG1을 이용하여 얻은 신호가 오로지 hERG1 항원에만 결합한 결과이기 때문이다.
또한 BSA에서 성장한 세포 (도 13, 패널 A 및 B) 및 피브로넥틴 (FN) 기질(도 13, 패널 C 및 D) 상에서 IF를 통한 항-hERG1-Phe-β1-scDb 항체의 면역반응성을 평가했다. 실제로, β1 복합체의 형성은 FN-의존적 인테그린 활성화에 의해 개선된다. 도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 복합체 형성으로 인해 패널 C 및 D에서는 피브로넥틴에 시드된 세포 HEK293-hERG1에서 강한 막 신호가 나타난다. 이 신호를 ImageJ 소프트웨어로 분석하고 그 결과를 그래프로 표시한다.
전술한 실험들로부터 얻은 검증 내용을 확인하기 위해, 항체 배양에 앞서 scFv-hERG1 항체의 배향 대상인 펩티드, 즉, 과량의 펩티드 S4PORO를 투여하여 HEK293-hERG1 세포에 대한 항-hERG1-Phe-β1-scDb의 결합을 평가했다. 도 14의 패널 A 및 B에서 추정할 수 있는 바와 같이, 항-hERG1-Phe-β1-scDb로 배양한 HEK293-hERG1 세포에 대한 신호를 확인할 수 있으며 이는 hERG1 및 β1 인테그린 양측에 대한 결합에 기인하는 것이다. 패널 C는 음성 대조군을, 패널 D와 E는 S5PORO 펩티드로 배양한 후에 얻은 결과를 각각 나타내며; 예상과 동일하게 신호감소가 있음을 육안으로 뚜렷이 확인할 수 있다. 실제로, 두 항원에 양성인 HEK293-hERG1 세포는 펩티드 배양후 hERG1 항원 결합 부위의 포화에 기인하는 염색강도의 감소를 보여주며; 따라서, 육안으로 확인되는 신호는 β1 항원에 대한 결합에서만 기원하는 것이다. 이러한 결과를 ImageJ 형광강도 정량분석으로 얻은 그래프 상에 요약했다.
9. scDb-hERG1-Cys-β1: 발현 및 특징화
피치아 파스토리스 이스트 세포의 발현에 적합한 벡터인 pPIC9K 발현 벡터,에 클로닝된 scDb-hERG1-Cys-β1 항체를 발현하는 구조물은 GS115 이스트 세포로 형질전환되었다.
scDb-hERG1-Cys-β1 형질전환에서 유래한 클론은 scDb-hERG1-Phe-β1 항체에 대하여 전술한 프로토콜에 따라 스크리닝했다.
1L의 피치아 파스토리스 세포 배양액에서 나온 상청액은 AKTA 정화제로 정제했다 (GE Healthcare). 이의 결과를 도 15에 나타내며, 여기서 항체 정제의 결과인 크로마토그램 (패널 A) 및 쿠마씨 염색 (패널 B)을 모두 보여준다. 청색 영역에 근거하여 용리액을 분석한 결과, 예상과 마찬가지로 대략 60 KDa의 분자량을 갖는 단일 밴드가 각 용리액에서 검출되었으며 이는 정제된 scDb-hERG1-Cys-β1에 상응한다.
성공적인 단백질 정제후, 항체를 Alexa488과 직접 접합 시킨 뒤 직접 면역형광 분석법(IF)으로 검사했다. 그 결과를 GD25 WT, HEK 293 WT 및 HEK 293-hERG1 세포에 대하여 도 16에 나타낸다. 도면의 영상에서 GD25 WT 세포, 패널 A (hERG1 및 β1 인테그린 발현에 대해 음성)는 scDb-hERG1-Cys-β1 항체로 배양후 유의미한 수준의 염색을 나타내지 않는 반면, 패널 B는 hERG1-β1 복합체 형성을 개선하는 작용을 하는 피브로넥틴(FN) 상에 시드된 HEK 293-hERG1 세포 (상기 두 항원을 모두 발현하는)에서 뚜렷한 막 염색성을 나타내며 또한 대조군으로 사용된 BSA에 시드된 세포와 비교시 (
Figure pct00011
10 A.U.) 더 높은 형광 신호값 (
Figure pct00012
17 A.U.)을 갖는 것을 보여준다. 패널 C는 HEK 293 WT 세포 (β1 인테그린만 발현하는) 상에서 얻은 형광염색성을 나타내며 이는, BSA에 시드된 세포와 비교시 (
Figure pct00013
7 A.U.), FN에 시드된 세포에서 더 높은 형광신호값 (
Figure pct00014
12 A.U.)을 보여준다, 도 17의 패널 A 및 B에서 보는 바와 같이 양측 세포주에 대한 IC50 를 측정했다. 세포 생존성에 대한 효과는 FANC-1 세포의 경우 24 μg/ml에서 및 MDA-MB 231 세포의 경우 42 μg/ml에서 확인 입증되었다. 이러한 발견은 hERG1 발현의 패턴과 동일하며 상기 발현은 MDA-MB 231 세포와 비교시 PANC-1 세포에서 우선한다.
따라서, 암세포 이동 거동에 대한 scDb-hERG1-Cys-β1의 효과를 측면 운동성분석을 통해 검증했다. 해당 실험은 MDA-MB 231, MDA-MB 231-hERG1, PANC-1 및 HCT116 세포에 대해 수행했다. 그 결과를 도 18에 나타낸다. 대조군과 비교시 처리된 세포에서 운동지수(MI)가 뚜렷하게 감소했다. 이러한 효과는 MDA-AB 231 세포와 비교시 MDA MB 231-hERG1에서 더욱 확실했으며 이는 세포 이동에 대한 항체의 hERG1-의존 효과를 시사한다.
PANC-1 및 HCT116 세포에서 바람직한 결과를 얻었으며, 대조군과 비교시 처리된 세포의 이동 거동이 감소한다.
재료와 방법
10. hERG1 항체의 중사슬 및 경사슬의 클로닝.
hERG1 (hERG1-mAb)에 대한 단클론 항체의 중사슬 및 경사슬을 하이브리도마 스크리닝 hERG1-mAb에서 정제된 mRNA로부터 수득한 cDNA에서 분리했다. VH 및 VL영역의 증폭에 있어서, 각 사슬의 가변형 도메인의 프레임워크 1 (FR1)에 어닐링하는 5' 프라이머 (전방향 프라이머) 및 각 사슬의 가변형 도메인에 인접한 고정 영역에 어닐링하는 프라이머 (역방향 프라이머)를 선택했다. VL에 관하여 카파 경사슬에 어닐링하는 퇴화 프라이머를 설계했으며 이는 상기 프라이머가 생쥐에서 더욱 잘 발현하는 면역글로불린의 표현형이기 때문이다 (Honjo and Alt, 1995). 항체의 중사슬(VH)은 다음과 같은 프라이머군을 이용하여 PCR를 통해 증폭했다: degVH 전방향, 5' GAGGTCCARCTGCAACARTC 3' (SEQ ID No: 11) 및 IgG2 역방향, 5' AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGG 3' (SEQ ID No: 12) (Wang, 2000). 다음과 같은 프라이머군은 항체의 경사슬(VL)을 PCR 증폭하는데 이용했다: degVL(K), 5' GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA 3' (SEQ ID No: 13) 및 K 역방향, 5' GGATACAGTTGGTGCAGCATC 3' (SEQ ID No: 14) (Wang, 2000). cDNA은 Phusion® High-Fidelity DNA 폴리머라제를 이용하여 증폭했다 (Finnzymes Reagents). 주기 순환 조건은 다음과 같았다: 94 ℃에서 2분간 초기 용융후 3단계 프로그램을 25 사이클로 수행했다 (94 ℃, 30초; 56℃ (VH); 48℃ (VL), 1분; 및 72℃, 1분). 이 반응들은 72℃에서 10분간 유지한 후 4℃로 냉각했다.
아가로스겔 전기영동으로 분리한 항체 절편 (VH 및 VL)을 QIAquick PCR 정제키트(QIAGEN)를 이용하여 정제한 다음 제조사의 지침에 따라 pCRTM-블런트 벡터에 삽입했다. 재조합 플라스미드는 자동 DNA 서열 분석 서비스를 통해 서열 분석했다(RIMM).
다음, VH 및 VL 절편은 2개의 상이한 클로닝 부위 사이에 링커 서열(Gly4Ser)3 을 함유하는 pHENIX 발현 벡터에 클로닝했다. 항체 절편을 pHenIV 벡터에 클로닝하기에 적절한 제한 부위를 가진 프라이머를 설계했다. VL 프라이머: 전방향 VL-ApaLI, 5' acgcgtgcactgGATATTGTGCTGACACAATCTCCA 3'(SEQ ID No: 15); 역방향 VL-NotI, 5' ataagaatgcggccgcGGATACAGTTGGTGCAGCATC 3' (SEQ ID No: 16). VH 프라이머: 전방향 VH-Salk, 5' acgcgtcgacGAGGTCCAACTGCAACAGTC 3'(SEQ ID No: 17); 역방향 VH-XhoI, 5' ccgctcgagccAGGGGCCAGTGGATAGACTGATGG 3'(SEQ ID No: 18). PCR 산물은 ApaLI 및 NotI (VH의 경우) 혹은 SalI 및 XhoI (VL의 경우) 제한효소 (New England BioLabs) 중 어느 것을 이용하여 소화시켜 호환가능한 클로닝 부위의 pHENIX 벡터에 결찰시켰다. 소화는 37℃에서 2시간 동안 수행되었다. 호환성 말단의 재결찰을 방지하기 위해, 다음과 같은 프로토콜에 따라 소의 장내 인산염 효소(CIP)를 사용하여 5' 인산염기를 상기 벡터의 5' 말단에서 제거했다: pHENIX 벡터 (50 ng/μl), 제3 완충액 (New England BioLabs) 1X 및 CIP (0,5 u/μg 벡터). 탈포스포릴화 반응액을 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 포스포릴화 벡터를 QIAquick PCR 정제 키트로 정제했다 (QIAGEN).
scFv-hERG1 절편과 pHENIX 사이의 결찰을 제2 완충액 (New England BioLabs)과 T4 리가제의 혼합물에서 수행했다. 벡터: scFv 상대비를 결찰 혼합물 내에서 1:3 및 1:10으로 설정했고 25℃에서 15분간 배양했다.
2 μl의 결찰 혼합물을 E. coli TOP10F'와 HB2151 세포 내로 전기영동했다(2500 mV 펄스). 전기영동된 세포를 450 μl의 SOC 배지 (1 mM MgSO4, 1 mM MgCl2를 보충한 SOB 배지)를 이용하여 회수한 다음 쉐이킹하면서 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 항생제를 담은 사전 온열된 LB-한천 플레이트에 박테리아를 도말하고 뚜껑을 덮어 37℃에서 하룻밤동안 배양했다.
11. pPIC9K 발현 벡터내 scFv-hERG1-G3의 클로닝
scFv-hERG1 발현 카세트를 6xHis 태그를 함유하는 형질전환된 pPIC9K 벡터 (Prof. Ermanno Gherardi로부터 제공받음, University of Pavia)에 클로닝했다, scFv 구조물을, FspI 및 AvrII 제한 부위를 각각 하기 서열의 3' 및 5' 말단에 부가할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 따라 pHENIX 벡터로부터 분리 및 증폭했다 (전방향 VH- FspI, AAAATGCGCAGAGGTCCAACTGCAACAGTC (SEQ ID No: 19); 역방향 VL- AvrII, GGGGCCTAGGGGATACAGTTGGTGCAGCATC (SEQ ID No: 20)). 상기 벡터 pPIC9는 AOX1 프로모터, 3' AOX1 전사 종결자(TT), 및 외래 유전자가 삽입될 다중-클로닝 부위로 구성된다.
발현 카세트는 FspI 및 AvrII으로 절단하여 Eco53KI 및 AvrII 제한효소를 이용하여 pPIC9K 절단편에 클로닝했다 (New England BioLabs).
12. scFv-hERG1 돌연변이 유발
QuikChange® XL 부위-배향 돌연변이 유발 키트를 이용하여 pPIC9K에 클로닝한 scFv-hERG1 발현 카세트에 대해 돌연변이를 유발시켰다 (Stratagene, Agilent Technologies). Cys 아미노산의 도입에 적절한 프라이머를 제조사의 지침에 따라 Primm Biotech에서 설계했다: 좌측 프라이머: GGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAACAGGTTGGGGACCTG (SEQ ID No: 21); 우측 프라이머: CAGGTCCCCAACCTGTTGCACAGTAATAGACTGCAGAATCC (SEQ ID No: 22)).
시료 반응물은 다음과 같이 준비했다: 5μl의 10X 반응 완충액; 1μl의 scFv-hERG1 dsDNA 탬플릿 (13ng/μl); 1,84μl (125 ng) 좌측 프라이머; 1,84μl (125 ng) 우측 프라이머; 1μl의 dNTP 혼합물; 3μl의 QuickSolution; 36, 32μl ddH2O. 다음, 1μl의 PfuTurbo DNA 폴리머라제 (2.5 U/μl)를 가했다. 주기 순환 조건은 적절히 조정했다: 초기 용융은 95℃ 에서 1분간 수행되고 이어서 3단계 프로그램이 18 사이클로 수행되었다 (95℃, 50 초; 60℃, 50 초 및 68℃, 4 분). 반응물을 68℃ 에서 7분간 유지한 다음 4℃ 로 냉각했다.
증폭 반응 후, 1 μl의 DnpI 제한 효소(10 U/μl)를 반응 혼합물에 직접 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 모체를 소화시킨 후 즉시 배양했다.
이때, 박테리아 DH5α 울트라 컴피턴트(초적격) 세포가 열충격으로 형질전환되었다. 세포를 얼음 위에서 천천히 해동시키고 2 μl의 DpI-처리된 DNA를 200 μl 초적격 세포의 또다른 분취물에 전달했다. 반응물을 얼음 위에서 30분간 배양했다. 배양관을 건식 반응기에서 42℃ 에서 45초 동안 히트펄스(heat-pulse) 처리했다. 배양관은 얼음 위에서 2분간 배양했다. 450 μl의 SOC 배지 (1 mM MgSO4, 1 mM MgCl2 를 보충한 SOB 배지)를 이용하여 세포를 회수한 뒤 쉐이킹하면서 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 암피실린 항생제 (50 μg/ml)를 담은 사전 온열된 LB-한천 플레이트에 박테리아를 도말한 다음 뚜껑을 덮고 37℃에서 하룻밤 동안 배양했다.
다음날, 수개의 집락이 성장했으며 이중 일부를 취해 DNA를 채취하고 서열분석하여 원하는 돌연변이의 존재 여부를 확인했다. 수득된 구조물에 scFv-hERG1-Cys로 라벨링 했다.
13. 피치아 파스토리스에서 scFv-hERG1-G3 및 scFv-hERG1-D8Cys의 발현
선형화된 scFv-hERG1 및 scFv-hERG1-Cys은 양쪽 모두 SalI 에 의해 소화되고 스페로플라스팅에 의해 피치아 파스토리스 균주 GS115로 형질전환됨으로써 Mut+ .형질전환체를 생성했다. 형질전환에 관련하여 피치아 발현 키트(Invitrogen) 지침을 참조했다.
형질전환 5일 후 단일 집락이 육안으로 확인되었고, 92개의 클론 및 4개의 음성 대조군을 취해 G418의 농도가 상이한, 즉, 각각 G418을 함유하지 않거나 5 mg/ml 및 15 mg/ml의 농도의 G418을 함유한 3개의 96-웰 플레이트에 전달했다. 피치아에 제네티신®에 대한 저항성을 부여할 박테리아 카나마이신 유전자가 pPIC9K에 병합되는 특징을 활용하여 G418을 선별하였다. 제네티신® 저항성 수준은 함유된 카나마이신 유전자의 개수에 대체로 의존한다. 피치아 게놈에 병합된 pPIC9K의 단일 복제는 ~0.25 mg/ml 수준의 제네티신® 저항성을 부여한다. pPIC9K의 다중 병합 복제물은 제네티신® 저항성 레벨을 0.5 mg/ml (1 내지 2개의 복제물)에서 최고 4 mg/ml (7 내지 12개의 복제물)로 증가시킬 수 있다. 카나마이신 유전자와 발현 카세트 (양쪽 모두 PAOX1 프로모터 하에 있음) 간의 유전자 결합 때문에, 제네티신® 저항성 클론이 대상 유전자의 다중 복제물을 함유하는 것으로 추정할 수 있다. 동일한 이유로서, 유전자 투여 효과 때문에 분비 단백질의 발현이 증가할 것이다. 따라서, pPIC9K의 존재는 대상 유전자, 즉, scFv-hERG1 및 scFv-hERG1-Cys의 다중 복제물이 잠복하는 pPIC9K 형질전환체를 노출시키는 툴로 사용했다.
30℃에서 성장 2일 후, 15mg/ml의 G418 플레이트에서 가장 크게 성장한 클론 6개를 취하고, 피치아 발현 키트 (Invitrogen)를 통해 소규모의 액상 배양물을 조제하여 대상 단백질을 발현시키는 이들의 능력을 평가했다.
각 클론 배양물로부터 얻은 시료를 다양한 시점에서 수거했다: 24h, 48h, 72h. 0,5% 최종농도의 100% 메탄올으로 유도처리하고, 3일 후 상청액을 수거하여 슬롯 블롯으로 검증했다.
14. 슬롯 블롯 분석
이스트 상청액을 수거하여 슬롯 블롯으로 단백질 발현에 대해 검증했다: 200 μl의 각 상청액을 3MM 왓맨 페이퍼의 2개의 스퀘어 사이에 놓인 슬롯 블롯 장치에 배치된 PVDF 막 (Amersham)에 도포했다. 시료를 15분간 배양 유지한 뒤 감압하여 시료를 건조했다. 막을 회수하여 T-PBS로 세척했다. T-PBS 5% BSA로 45분간 블로킹한 뒤 T-PBS로 10분간 세척했다. 항-6xHis-HRP 접합 항체 (Sigma)를 15 ml의 T-PBS 5% BSA에 1:2000 비율로 희석한 용액을 이용하여 상기의 막을 배양했다.
15. Ni 세파로스 정제
이스트 형질전환 후 클론을 스크리닝하여 수득한 상청액을 제조사의 지침에 따라 Ni 세파로스 6 고속유동으로 회전시키면서 O/N 하에 배양했다 (Ge Healthcare). 이후, 500μl의 세정 완충액 (20mM 인산나트륨, 500mM NaCl, pH 7.3)으로 세정 단계를 2회 수행하고 250μl의 용리 완충액 (20mM 인산나트륨, 500mM 이미다졸, pH 7.3)을 이용하여 용리 처리했다.
16. AKTA 정제
1리터의 scFv-hERG1-G3 및 scFv-hERG1-D8Cys 상청액은 각각, HisTrap HP 1 ml 컬럼이 탑재된
Figure pct00015
단백질 정제장치를 이용하여(Ge Healthcare Life Sciences) 친화성 크로마토그래피를 통해 정제했다. 세정 단계 및 평형화는 제조사의 지침에 따라 세정 완충액 (20mM 인산나트륨, 500mM NaCl, pH 7.3)을 이용하여 실시했고; 용리 처리는 선형구배의 용리 완충액 (20mM 인산나트륨, 500mM NaCl, 500mM 이미다졸, pH 7.3)을 사용하여 실행했다. UNICORN 7.0 소프트웨어로 분석을 수행했다.
17. 겔 여과
두 항체를 정제하여 얻은 시료들을 수퍼덱스 75 HR 10/30 (Ge Healthcare Life Sciences)로 겔 여과했다. 세정 완충액 조성물 (20mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.3)을 조정하여 최적의 프로토콜 조건으로 했다. 용리액은 SDS-Page로 분석했다.
18. 황산도데실 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)
각 시료는 15 μl의 동일한 부피로서 스택용 겔 (400 μl의 아크릴아미드 (40%)-비스아미크릴아미드 (0.8%), 1 ml의 0.5 M 트리스-HCl, pH 6.8, 40 μl의 10% SDS, 20 μl의 10% 과황산암모늄, 4 μl TEMED, 2,54 ml H2O)에 가했다. 스택용 겔을 분리용 겔 (2,6 ml의 아크릴아미드 (40%)-비스아크릴아미드 (0.8%), 1,75 ml의 1.5 M 트리스-HCl, pH 8.8, 70 μl의 10% SDS, 35 μl의 10% 과황산암모늄, 3,5 μl TEMED, 2,55 ml H2O)에 첨가했다. 전기영동 공정을 150 V에서 실행했다. 겔은 쿠마씨 브릴리언트 블루로 염색 또는 웨스턴 블롯 분석을 위해로 PVDF 막에 전달하여 단백질의 존재를 평가했다 (약 30 KDa).
19. 웨스턴 블롯 분석
SDS-PAGE 겔을 100V 에서 1시간 동안 전달 완충액 (14,4 g, 3,03 g 트리스 HCl, 200 ml 메탄올, 800 ml H2O)에 담긴 PVDF 막 (Amersham)에 전달했다. 막을 T-PBS (PBS 0.1% Tween)으로 세척한 다음 T-PBS 5% BSA으로 O/N 하에 블로킹했다. 상기 막을 T-PBS 5% BSA에 희석한 페록시다제-결합된 (Sigma) 1차 항체에 대해 실온에서 1시간 동안 노출시켰다. 막을 10분간 3회 세척한 뒤 ECL 시약(Amersham)으로 신호를 가시화했다.
다음의 항체를 이용하여 WB를 수행했다: 항myc (1:1000) 및 항-6xHis-HRP 접합 항체 (Sigma).
20. scFv-hERG1-G3 및 scFv-hERG1-D8Cys 정량분석, ELISA 분석 및 바이아 코어(이중공극) 분석
scFv-hERG1-G3과 scFv-hERG1-D8Cys를 함께 수거하여 슬라이드-A-LyzerTM 투석 카세트(Thermo Fisher)를 이용하여 PBS 1X에 대해 투석처리했다. 280 nm에서의 단백질 흡광도를 측정하고 램버트-비어(Lambert-Beer) 수식을 적용했다.
2개의 가공 항체, 즉, scFv-hERG1-G3 및 scFv-hERG1-D8Cys가 여전히 항원 결합력을 갖는지 평가하기 위해 또한 그후 상기 두 항체의 상이한 친화도를 조사하기 위해, 상기 항체가 배향하는 S5-공극 펩티드 (서열: EQPHMDSRIGWLHN)가 코팅된 플레이트를 이용하여 ELISA를 수행했다. 이 펩티드는 항-hERG1 A7 항체의 스크리닝에 사용한 것과 동일하다.
21. Alexa 488를 이용한 항체 라벨링
scFv-hERG1-G3 및 scFv-hERG1-D8Cys은 프로토콜 지침에 따라 Alexa Fluor® 488 마이크로 크기의 단백질 라벨링 키트에 의해 접합되었다 (Thermo Fisher Scientific).
22. 고정 세포에 대한 면역형광 처리
HEK 293 hERG1 (pcDNA3.1-hERG1 cDNA 구조물에 의해 안정하게 트랜스펙트된 HEK293) 및 HEK-MOCK (pcDNA 3.1 cDNA이 안정하게 트랜스펙트된 HEK 293)는 5% CO2가 함유된 37℃ 배양기 내에 10% FBS EU 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 세포는 유리 커버슬립 상에서 O/N 하에 시드한 뒤 PBS로 1회 세척하고 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 실온에서 2시간 동안 10% BSA로 블로킹을 수행했다. 항체 배양은 블로킹 용액에 1:20 비율로 희석 및 2시간30분 동안 배양한 scFv-hERG1-G3 및 scFv-hERG1-D8Cys을 이용하여 수행했으며, 이어서 블로킹 용액에서 항-His (1:250; Abcam) O/N 배양을 수행했다. 다음날, PBS로 3회 세포를 세척한 다음 항-마우스 Alexa488 항체(Invitrogen)로 1시간 동안 배양했다.
반면에, 블로킹 용액에 1:20 비율로 희석한 scFv-hERG1-G3-Alexa488 및 scFv-hERG1-D8Cys-Alexa488은 4℃에서 O/N 배양했다.
확인을 위하여 세포를 Hoechst (1:1000)로 30분간 배양한 다음 프로필 갈레이트로 마운팅했다. 공초점 현미경 (Nikon, C1)으로 세포를 육안 관찰했다.
면역형광 정량분석은 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 수행했다: 각 영상에 있어서, 3개의 상이한 면역을 측정하여 그 평균값을 계산했다.
23. 생체 세포에 대한 면역형광 처리
아가로스 겔(15g/L) 고리를 이용하여 60 mm 플레이트 (Saratedt) 상에서 세포를 성장시켜 세포를 분리하고 배양에 필요한 시약의 부피를 최소화했다. 이 세포는, 5% CO2가 함유된 37℃ 배양기 내의 완전 배양배지에 1:20으로 희석시킨 scFv-hERG1-G3-Alexa488 및d scFv-hERG1-D8Cys-Alexa488 를 이용하여 4시간 동안 배양했다. 상술한 바와 같이, 이 결과를 Hoechst를 이용하여 확인했다. 세포는 역광 현미경(Nikon, Eclipse TE300) 에서 육안으로 확인했다.
24. 세포 생존율
세포 생존율은 트리판 블루 분석법으로 평가했다; 간략히 설명하면, HCT-116, MDA-MB231, MIA PACA2, HEK293 hERG1, HEK-MOCK, FLG 29.1, PANC-1, BXPC3 세포를 5 x 103 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시드했다. 24시간 후, 상기의 배지를 상이한 농도의 scFv-hERG1-D8Cys 항체 (10 μg/ml 및 20 μg/ml)를 함유하는 100 μl의 신선한 배지로 교체했다. 완전한 면역글로불린, 항-hERG1 단클론 항체를 100 μg/ml의 농도로 시험했다. 세포는 37 ℃ 및 5% CO2 의 습식 배양기에서 24시간 배양했다.. 처리후 세포를 분리하고 생존 세포의 수를 세었다. 실험은 3회 중복 실시했다.
25. 스페로이드 3D 배양 및 스페로이드 상의 scFv-hERG1 검증
HEK-293 hERG1, HEK-MOCK, MDA-MB231, MIA PACA2 및 PANC-1을 96-웰 플레이트에서 각 웰 당 103 세포/웰의 밀도로 1.5% 아가로스 베이스층 상에 시드했다. 10 μL의 신선한 배지를 각 웰에 가하고 세포는 37℃ 및 5% CO2.의 배양기에서 유지하여 72시간 동안 성장시켰다. 72시간 후 스페로이드가 육안으로 확인되었으며 이 배지는 상이한 농도의 scFv-hERG1-D8Cys 항체 (10 μg/ml 및 40 μg/ml)를 함유하는 100 μl의 신선한 배지로 교체했다.
니콘 이클립스 TE300으로 칼세인 AM 세포 생존율 분석을 시행할 72시간까지 24시간마다 사진을 찍었다..
스페로이드 부피는 MATLAB 소프트웨어를 이용하여 24시간, 48시간 및 72시간에 찍은 사진을 분석하여 평가했다.
실험은 3회 중복 실시했다.
26. β1 인테그린 mAb: RNA 역상 전사
TS2/16 및 BV7 RNA는 총 부피 40 μl 에서 제조사의 지침에 따라 올리고(dT) 프라이머 (Invitrogen) 및 SuperScript® II 역상 전사효소 (Invitrogen)을 이용하여 cDNA로 역상 전사했다.
Figure pct00016
혼합물은 65℃에서 5분간 서모사이클러에서 배양하고 얼음으로 신속 냉각하고 다음의 성분들을 첨가했다.
Figure pct00017
혼합물을 42℃에서 2분간 가열한 다음 하기의 효소를 첨가했다.
Figure pct00018
혼합물 (40 μl)을 42℃에서 50분간 배양한 다음 반응물을 70℃에서 15분간 불활성시켰다.
27. β1 인테그린 mAb: 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)에 의한 가변형 도메인의 분리
항체 가변형 도메인 (VL 및 VH)을 분리하기 위해 변형체 (표 2)와 함께 Wang et al. (2000)에 개시된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행했다.
[표 2]
변형체를 이용하여 Wang et al. (2000)을 구성함에 있어서 VL 및 VH 가변형 도메인의 분리에 사용된 프라임
Figure pct00019
다음과 같은 2종의 경사슬이 있다: 카파 및 람다; 95%의 생쥐 항체가 카파 경사슬을 갖기 때문에 (Honjo and Alt, 1995) 람다형은 대체로 무시하고 카파 경사슬에 대해 특이적인 프라이머를 선택했다. 전방향 프라이머는 각각의 사슬 가변형 영역의 프라임워크1(FRW1)의 단백질 서열 배치를 이용하여 설계했다. 역방향 프라이머는 각 사슬 (카파 경사슬이나 IgG1 중사슬)의 가변형 도메인의 말단 다음의 불변 영역(CH1)에서 설계했다. 카파 경사슬에는 1개의 프라이머쌍만 이용되었으며 중사슬에는 IgGrev와 5개의 전방향 프라이머의 조합으로 구성된 5개의 프라이머쌍이 이용되었다.
TS2/16 및 BV7의 VH 분리를 위해, IgG1rev-degH4dir 프라이머쌍을 선택했다.
DNA 폴리머라제로 인한 돌연변이 방지를 위해, 증거판독능이 있는 고적합도의 DNA 폴리머라제; 및 다음의 프로토콜을 이용하는 KOD 핫스타트 DNA 폴리머라제(Novagen)를 사용했다:
Figure pct00020
혼합물을 서모사이클러에서 다음의 프로토코을 이용하여 배양했다.
Figure pct00021
단계 2 내지 4를 30회 반복했다.
28. β1 인테그린 mAb: 제한효소의 이용 없는 가변형 도메인의 클로닝
DNA 서열분석에 적합한 벡터에서 제한효소를 사용하지 않고 가변형 도메인을 클론화했다. 제조사의 지침에 따라 TA-클로닝 키트나 제로-블런트 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용했다.
DNA 전기영동 및 아가로스 겔로부터의 정제
DNA 전기영동은 아가로스겔 매트릭스를 통해 음전하 DNA을 양극 방향으로 이동시키는 전기장을 사용한다. PCR 산물 및 제한효소에 의해 소화되는 DNA을, 에티듐 브로마이드로 염색된 아가로스 겔 (TAE (트리스, 아세트산, EDTA) 완충액내 1.5% 아가로스) 상에 2 log DNA 사다리 (NEB)를 따라 작용시켜 다양한 크기의 절편을 분리했다. 전기영동을 100V로 실행했다. 깨끗한 메스로 겔에서 문제의 밴드를 절제하여 제조사의 지침에 따라 QIAquick PCR 정제 키트 (QIAGEN)로 정제처리했다. 정제된 DNA를 30 μl PCR용 H2O로 용리했다.
오버랩 연장 PCR (SOE-PCR)에 의한 스플라이싱(절단이음)
ScFv 구조물은 변형체 (표 3)와 함께 공지기술 (Wang et al. 2000)에 개시된 프라이머를 이용하여 VL-링커-VH 순서의 오버랩 연장 PCR(SOE- PCR)을 통해 스플라이싱 조립되었다. 가변형 도메인을 연결하는 폴리펩티드 링커는 4개의 GGGGS 반복단위로 설계되었다.
[표 3]
SOE-PCR (VLREVSOE 및 VHFORSOE)에 의해 VL-링커-VH 구조물을 조립하고 이 서열을 pHenIX 벡터 (VLFORSFI 및 VHREVNOT)로 혹은 scFv- hERG-pHenIX 벡터 (VLFORXHO 및 VHREVAPALI)로 클로닝하도록 설계된 프라이머.
이탤릭체는 탬플릿을 어닐링하는 프라이머의 부분이고, 회색 강조 표시는 pHenIX 혹은 scFv-hERG1-pHenIX 벡터내 발현 카세트를 이용하여 프레임에 구조물을 클로닝하기 위해 첨가한 서열이며, 밑줄 부분은 제한 부위이고, 회색 표시는 효소 소화를 촉진하기 위해 첨가한 서열이며, 굵은 글씨는 SOE-PCR에서 중복되는 서열을 각각 나타낸다
Figure pct00022
프로토콜은 도 10에 도시된 2개의 단계로 구성된다. 제1 단계는: VL의 3' 말단에는 링커의 처음 3개의 GGGGS 반복단위를 코딩할 서열이, 또한 HV의 5' 말단에는 상기 링커의 마지막 2개의 GGGGS 반복단위를 코딩할 서열이 부가되도록 것이다. 이 단계에서, VL의 5' 말단 및 VH의 3' 말단에는 각각 발현 벡터내 VL-링커-VH 구조물의 클로닝에 사용할 제한 부위들이 부착되어야 한다. 또한 제2 단계는 VL의 3' 말단 및 VH의 5' 말단에 있는 중복 서열(15 bp) 때문에 2개의 PCR 산물을 연결한다.
제1 단계에서는 2가지의 평행 PCR을 수행했다: 하나는 VLFORSFI-VLREVSOE 프라이머쌍과 pCRII-VL 탬플릿을 이용하는 것이고; 다른 하나는 VHFORSOE-VHREVNOT 프라이머쌍과 pCRII-VH 탬플릿을 이용하는 것이다. KOD DNA 폴리머라제를 사용하는 PCR 프로토콜은 상술한 바와 같이 수행했다,
제2 단계에서는 제1 단계에서 수행한 각 PCR 반응의 산물 1μl을 탬플릿으로 및 VLFORSFI-VHREVNOT 프라이머쌍을 사용하여 하기의 프로토콜에 따라 SOE-PCR을 종결했다:
Figure pct00023
혼합물 (50 μl)을 다음의 프로토콜에 따라 서모사이클러에서 배양했다:
Figure pct00024
단계 2 내지 4를 30회 반복했다.
29. 항-hERG1-β1 단일사슬 이합체 (scDb) - scDb-hERG1-β1 항체의 생산과 특징화
구조물 hERG1-β1-scDb을 상술한 스페로플라스팅 기술에 따라 GS115 피치아 파스토리스 균주로 형질전환시켰고, 단백질은 scFv-hERG1 및 scFv-hERG1-Cys 항체에 대해 상술한 바와 같은 발현 정제 프로토콜을 적용하여 발현 및 정제했다.
세포 ELISA
살아있는 세포에 대한 세포 ELISA를 Sette et al., (2013)에 따라 수행했다. HEK 293 WT (hERG1-/β1+) 및 HEK 293-hERG1 (hERG1+/β1+) 세포를 DMEM + 10 % 태아소 혈청(FBS) 내의 96-웰 플레이트의 반융합체에 시드하여 37℃ 및 5 % CO2.에서 하룻밤동안 배양했다. PBS로 3회 세척한 후, 항-hERG1-β1-scDb을 배양액에 상이한 농도로 희석시켜 실온에서 2일한 세포에 첨가했다. 후속 단계들은 상술한 바와 동일했다.
면역형광 분석 (IF)
상술한 프로토콜에 따라 IF를 수행했다. 커버슬립을 BSA와 피브로넥틴으로 2시간 동안 코팅했다. IF을 HEK 293 WT (hERG1-/β1+), HEK 293-hERG1 (hERG1+/β1+) 및 GD25 WT 세포 (hERG1-/β1-)에 대해 수행했다.
30. 항-hERG1-β1 단일사슬 이합체(scDb) - scDb-hERG1-Cys-β1-항체의 생산 및 초기 특징화
scDb-hERG1-β1 돌연변이 유발
pPIC9K에 클로닝된 scDb-hERG1-β1 발현 카세트에서 QuikChange® XL 부위-배향 돌연변이 유발 키트 (Stratagene, Agilent Technologies)를 이용하여 돌연변이 유발을 수행했다. Cys 아미노산의 도입에 적합한 프라이머를 제조사의 지침에 따라 Primm Biotech사에서 설계했다: 좌측 프라이머: GGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAACAGGTTGGGGACCTG (SEQ ID No: 21); 우측 프라이머: CAGGTCCCCAACCTGTTGCACAGTAATAGACTGCAGAATCC (SEQ ID No: 22)).
시료 반응물을 다음과 같이 준비했다: 51μl의 10X 반응 완충액; 1μl의 scFv-hERG1 dsDNA 탬플릿 (13 ng/μl); 1.84μl (125 ng)의 좌측 프라이머; 1,84μl (125 ng)의 우측 프라이머; 1μl의 dNTP 혼합물; 3μl의 QuickSolution; 36, 32 μl의 ddH2O. 다음, 1μl의 PfuTurbo DNA 폴리머라제(2.5 U/μl)를 여기에 첨가했다. 주기 순환 조건을 다음과 같이 조정했다: 95℃ 에서 1분간 1차 용융한 뒤 3단계 프로그램을 18 주기로 수행했다 ((95℃, 50초; 60℃, 50초 및 68℃, 4분). 다음, 68℃에서 7분간 반응을 유지한 후 4℃로 냉각했다.
증폭 반응 후, 1 μl의 DnpI 제한효소(10 U/μl)를 반응 혼합물에 직접 첨가한 후 즉시 37℃에서 1시간 동안 배양하여 모체를 소화시켰다. 이때, 박테리아 DH5α 초적격세포를 열충격으로 형질전환시켰다. 세포는 얼음 상에서 천천히 해동시키고 2 μl의 DpI-처리된 DNA를 200 μl의 초적격세포에서 분리된 분취물에 전달했다. 반응물은 얼음 상에서 30분간 배양했다. 배양관을 건식 반응기에서 45초동안 42℃에서 히트펄스 처리했다. 배양관을 얼음 상에서 2분간 배양했다. 450 μl의 SOC 배지 (1 mM MgSO4, 1 mM MgCl2 을 보충한 SOB 배지)로 세포를 회수하여 쉐이킹하면서 37℃에서 1시간 배양했다. 박테리아를 암피실린 항생제 (50 μg/ml)를 함유한 사전온열된 LB-한천 플레이트에 도말하여 뚜껑을 덮어 37℃에서 하룻밤동안 배양했다.
다음날, 수개의 집락이 성장했으며 이중 일부를 취해 DNA를 채취하고 서열분석하여 원하는 돌연변이의 존재 여부를 확인했다. 수득된 구조물을 scFv-hERG1-Cys-β1 로 라벨링했다.
scDb-hERG1-Cys-β1 항체의 발현 및 정제
scDb-hERG1-Cys-β1는 상술한 스페로플라스팅 기술에 따라 GS115 피치아 파스토리스 이스트 균주에서 형질전환시켰고, 단백질은 scFv-hERG1 및 scFv-hERG1-Cys 항체에 대해 상술한 바와 같은 발현 및 정제 프로토콜을 응용하고 AKTA 정화제(Ge Healthcare)를 사용하여 발현 정제했다. 유니콘 7.0 소프트웨어를 이용하여 크로마토그램을 분석했다.
면역형광 분석 (IF)
상술한 프로토콜을 이용하여 IF를 수행했다. 커버슬립을 BSA와 피브로넥틴으로 2시간동안 코팅했다. 상술한 프로토콜에 따라 GD25 WT 세포 (hERG1-/β1), HEK 293 WT (hERG1-/β1+), HEK 293-hERG1 (hERG1+/β1+)에서 IF를 수행했다. IF는 Alexa488 형광단과 접합된 scDb-hERG1-Cys-β1를 이용하여 수행했다.
생존율 분석
PANC-1 (췌장관 아데노칼시노마) 세포와 MDA-MB 231 (유방암) 세포를 96 웰-플레이트에서 5*105 로 시드하고 O/N 하에 성장시켰다. 다음날, 상이한 희석액 (0, 10, 20, 40, 100 μg/ml) 형태의 scDb-hERG1-Cys-β1 로 세포를 처리하고 항체와 함께 24시간 배양했다. 각각의 조건에서 3회 중복 실시했다.
배양후, 세포를 분리하여 그 수를 세었다. 이때 IC50 측정-기초 소프트웨어를 적용했다.
3D 스페로이드 배양
103 PANC-1 및 MDA-MB 231 세포를 96-웰 플레이트 내에서 아가로스 베이스층(1.5 g/l) 상에 시드하여 37℃ 및 5% CO2의 습식 배양기에서 72시간 동안 성장시켰다. 다음, scDb-hERG1-Cys-β1를 투여하고 (40 μg/ml) 배양액에 희석시키는 한편, 항체가 없는 신선한 배지를 음성 대조군으로서 처리된 세포가 함유된 웰에 첨가했다. 24시간후 사진을 찍어 니콘 이클립스 TE300 현미경으로 세포 성장을 관찰했다.
측면 운동성(횡동력) 분석
35 mm의 페트리 접시에 5*105의 초기밀도로 세포를 도말하여 24시간 동안 정치했다.
측면 운동성을 단층 권선 분석법 (Silletti et al., 1995; Peck and Isacke, 1996)으로 평가했다. 권선폭(감긴 폭)은 처리 즉시 (0시간) 45개의 고정점에서 감긴 폭을 측정하여 결정했다.
세포 운동성은 다음과 같이 정의된 "운동지수" (MI)로서 정량화했다:
MI=1-(Wt/Wo)
MI = 0 는 세포의 이동이 전혀 없음을 가리키고, 반면에 MI=1의 값은 완전히 권선된 상태를 나타낸다.
scFv-hERG1-D8Cys 및 scDb-hERG1-Cys-β1 항체의 체내 분포도
160 μg의 각 항체를 2마리의 Balb/c 생쥐에 정맥 주사했다. 혈액 시료를 정맥 주사후 상이한 시점에 각 생쥐로부터 수득했다: 주사후 5, 10, 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 24시간. 혈액 시료를 가공 및 혈장 분리했다. 혈장 시료에 대한 ELISA 검정을 본 단원의 상술한 프로토콜에 따라 수행했다. 정밀 PK 약동학 소프트웨어를 적용하여 t1/2(반감기)를 계산했다.
ECG 측정
항체 투여전 및 항체를 15분간 정맥주사한 뒤 지속적으로 ECG를 측정했다.
체내 실험
체내 분석
Alexa 750를 이용한 scFv-hERG1-D8Cys 라벨링 처리: PBS 용액 및 0.1 M 중탄산나트륨 완충액(pH 8.3)에 용해된 2 mg/ml 농도의 scFv-hERG1-D8Cys를 150 μg의 양으로서 12 μl의 Alexa Fluor®750 NHS 에스테르 (Succinimidyl Ester) (Thermo Fisher Scientific)와 함께 교반하면서 22℃에서 1시간 동안 배양하고, 10 mg/ml의 DMSO에 재현탁했다. 반응을 얼음 상에서 5분간 차단시키고 라벨화된 단백질을 PBS로 평형화한 세파덱스 G25 (Sigma) 컬럼 상에서 크기배제 크로마토그래피로 정제했다.
체내 영상 촬영을 위해, 3마리의 6주령 암컷 면역결핍 무흉선-Foxn1 누드 생쥐에 50 μl (1 nm 염료/생쥐)의 형광단 Alexa 750 라벨처리된 scFv-hERG1-D8Cys를 정맥주사하고, 항체 주사 5분, 10분, 60분 및 24시간 후에 형광도를 측정했다. 1마리의 대조군 생쥐는 멸균 PBS 용액으로 처리했다. 광자 영상촬영기 (Biospace Lap)을 사용하여 형광방출 스펙트럼을 모두 측정했다. 촬영기에는 형광 여기 (λ=679 nm) 용도의 레이저원, 형광 검출을 위한 방사필터 (λ=702 nm) 및 데이타 분석을 위한 컴퓨터가 탑재되어 있다.
생쥐 모델: Lastraioli et al. 2015 에서 개시된 바와 같이 종양세포 이식을 위해 MIAPaCa-2 세포주를 사용했다. L-글루타민 (4 mM), 10% 태아 소 혈청 및 제네티신 (G418) (2.4 mg/ml) (Gibco)를 보충한 DMEM에서 세포를 37℃ 및 5% CO2의 습식 분위기하에 배양했다. 누드 생쥐의 췌장에 MIAPaCa-2-luc 세포를 주사하고 해당 동물을 관측했다 ([17] 단원에 기술된 바와 같음). 또한 세포 접종 45일 후, 생쥐에 scFv-hERG1-D8Cys-Alexa750 항체를 투여했다.
SEQUENCE LISTING <110> DI.V.A.L. TOSCANA SRL UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI FIRENZE <120> NOVEL ANTIBODIES <130> P019342WO <150> IT102017000083637 <151> 2017-07-21 <160> 48 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 381 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> 1..381 <223> /note="hERG1 VH domain" /transl_table=1 <300> <310> WO2016020483 <312> 2016-02-11 <313> (1)..(381) <400> 1 gag gtc caa ctg caa cag tct gga cct gaa ctg gtg aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tct gtg aag ata tcc tgc aag act tca gga tac aca ttc act gaa tac 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 acc gtt cac tgg gtg aaa cag agc cat gga aag agc ctt gaa tgg att 144 Thr Val His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga ggc att aat cct aat ggt ggt act acc tat aat cag aag ttc aag 192 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 ggc aag gcc aca ttg act att gac aag tcc tcc agc tca gcc ttc atg 240 Gly Lys Ala Thr Leu Thr 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Ala 85 90 95 Thr Gly Trp Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125 <210> 3 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> 1..363 <223> /note="hERG1 VL domain" /transl_table=1 <300> <310> WO2016020483 <312> 2016-02-11 <313> (1)..(363) <400> 3 gat att gtg ctg aca caa tct cca ctc act ttg tcg gtt aac att ggt 48 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Asn Ile Gly 1 5 10 15 caa cca gcc tct atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc tta tat act 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 aat gga aaa acc tat ttt aat tgg tta tta cag agg cca ggc cag tct 144 Asn Gly Lys Thr Tyr Phe Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc act ggc agt gga tca gga aca gat ttt aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gaa gat ttg gga gtt tat tac tgc gcg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly 85 90 95 aca cat ttt ccg tgg acg ttc ggt gga ggg acc aag ctg gaa atc aaa 336 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 cgg gct gat gct gca cca act gta tcc 363 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 115 120 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> [CDS]:1..363 from SEQ ID NO 3 <400> 4 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Asn Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Phe Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly 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aag ttc aag 192 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 ggc aag gcc aca ttg act att gac aag tcc tcc agc tca gcc ttc atg 240 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Phe Met 65 70 75 80 gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gat tct gca gtc tat tac tgy gca 288 Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aca ggt tgg gga cct gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc 336 Thr Gly Trp Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 tcc tca gcc aaa aca aca ccc cca tca gtc tat cca ctg gcc cct 381 Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125 <210> 8 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct [CDS]:1..381 from SEQ ID NO 7 <400> 8 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Val His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Phe Met 65 70 75 80 Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Gly Trp Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125 <210> 9 <211> 879 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-hERG1-Cys scFv <220> <221> CDS <222> 28..879 <223> /note="anti-hERG1-Cys scFv" /transl_table=1 <400> 9 atggcccagg tgcagctgca ggtcgac gag gtc caa ctg caa cag tct gga cct 54 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 1 5 gaa ctg gtg aag cct ggg gct tct gtg aag ata tcc tgc aag act tca 102 Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser 10 15 20 25 gga tac aca ttc act gaa tac acc gtt cac tgg gtg aaa cag agc cat 150 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Val His Trp Val Lys Gln Ser His 30 35 40 gga aag agc ctt gaa tgg att gga ggc att aat cct aat ggt ggt act 198 Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr 45 50 55 acc tat aat cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act att gac aag 246 Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys 60 65 70 tcc tcc agc tca gcc ttc atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gat 294 Ser Ser Ser Ser Ala Phe Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp 75 80 85 tct gca gtc tat tac tgy gca aca ggt tgg gga cct gac tac tgg ggc 342 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Trp Gly Pro Asp Tyr Trp Gly 90 95 100 105 caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa aca aca ccc cca tca 390 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 110 115 120 gtc tat cca ctg gcc cct ggc tcg agt ggt gga ggc ggt tca ggc gga 438 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 125 130 135 ggt ggc tct ggc ggt agt gca ctg gat att gtg ctg aca caa tct cca 486 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 140 145 150 ctc act ttg tcg gtt aac att ggt caa cca gcc tct atc tct tgc aag 534 Leu Thr Leu Ser Val Asn Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys 155 160 165 tca agt cag agc ctc tta tat act aat gga aaa acc tat ttt aat tgg 582 Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Asn Gly Lys Thr Tyr Phe Asn Trp 170 175 180 185 tta tta cag agg cca ggc cag tct cca aag cgc cta atc tat ctg gtg 630 Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val 190 195 200 tct aaa ctg gac tct gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt gga tca 678 Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 205 210 215 gga aca gat ttt aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gaa gat ttg 726 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu 220 225 230 gga gtt tat tac tgc gcg caa ggt aca cat ttt ccg tgg acg ttc ggt 774 Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly 235 240 245 gga ggg acc aag ctg gaa atc aaa cgg gct gat gct gca cca act gta 822 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 250 255 260 265 tcc gcg gcc gca gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat ggg 870 Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly 270 275 280 gcc gca tag 879 Ala Ala <210> 10 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct [CDS]:28..879 from SEQ ID NO 9 <400> 10 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Val His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Phe Met 65 70 75 80 Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Gly Trp Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly 115 120 125 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala 130 135 140 Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Asn Ile 145 150 155 160 Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr 165 170 175 Thr Asn Gly Lys Thr Tyr Phe Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln 180 185 190 Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val 195 200 205 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 210 215 220 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln 225 230 235 240 Gly Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 245 250 255 Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys 260 265 270 Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 275 280 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 1..20 <223> /note="primer degVH forward" <400> 11 gaggtccarc tgcaacartc 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> 1..24 <223> /note="primer IgG2 reverse" <400> 12 aggggccagt ggatagactg atgg 24 <210> 13 <211> 24 <212> 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Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asp Ile Pro 85 90 95 ctc acg ttc ggt gat ggg acc aag ctg gac ctg aaa cgg gct gat gct 336 Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys Arg Ala Asp Ala 100 105 110 gca cca act gta tcc 351 Ala Pro Thr Val Ser 115 <210> 24 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct [CDS]:1..351 from SEQ ID NO 23 <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ile Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Ser Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Asp Ile Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys Arg Ala Asp Ala 100 105 110 Ala Pro Thr Val Ser 115 <210> 25 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct 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Arg Ile Gly Tyr Asp Glu Asp Tyr Ala Met Asp His Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc tca gtc acc gtc tcc tca gcc aaa acg aca ccc cca tct gtc 384 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 tat 387 Tyr <210> 26 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct [CDS]:1..387 from SEQ ID NO 25 <400> 26 Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Gly Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ile Gly Tyr Asp Glu Asp Tyr Ala Met Asp His Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 Tyr <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial 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ctt gaa tgg att gga ggc att aat cct aat ggt ggt act acc 192 Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Thr 50 55 60 tat aat cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act att gac aag tcc 240 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser 65 70 75 80 tcc agc tca gcc ttc atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gat tct 288 Ser Ser Ser Ala Phe Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 85 90 95 gca gtc tat tac tgt gca aca ggt tgg gga cct gac tac tgg ggc caa 336 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Trp Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa aca aca ccc cca tca gtc 384 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 tat cca ctg gcc cct ggc tcg agt gat att gtg atg aca cag act cca 432 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro 130 135 140 acc acc atg gct gca tct ccc ggg gac aag atc act atc acc tgc agt 480 Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly Asp Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser 145 150 155 160 gtc agt tca att ata agt tcc aat tac ctg cat tgg tat agt cag aag 528 Val Ser Ser Ile Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Ser Gln Lys 165 170 175 cca gga ttc tcc cct aaa ctc ttg att tat agg aca tcc aat ctg gct 576 Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala 180 185 190 tct gga gtc cca cct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc tct tac 624 Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr 195 200 205 tct ctc aca att ggc acc atg gag gct gaa gat gtt gcc act tac tac 672 Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 tgc cag cag ggt tct gat att cca ctc acg ttc ggt gat ggg acc aag 720 Cys Gln Gln Gly Ser Asp Ile Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys 225 230 235 240 ctg gac ctg aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc ggt ggt ggt 768 Leu Asp Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Gly Gly Gly 245 250 255 ggt tct ggt ggt ggt ggt tct ggc ggc ggc ggc tcc ggt ggt ggt gga 816 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 260 265 270 tcc gag gtg aag gtg gtg gaa tct ggg gga ggc tta gtg aag cct gga 864 Ser Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 275 280 285 ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt agc 912 Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 290 295 300 tat acc atg tct tgg gtt cgc cag act ccg gag aag agg ctg gag tgg 960 Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp 305 310 315 320 gtc gca acc ata agt agt ggt ggt tct tac acc tac tat cca gac agt 1008 Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 325 330 335 gtg aag ggc cga ttc acc att tcc aga gac aaa gcc aag aac acc ctg 1056 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu 340 345 350 tat ttg caa atg ggc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat tac 1104 Tyr Leu Gln Met Gly Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 355 360 365 tgt aca aga ata ggt tac gac gaa gat tat gct atg gac cac tgg ggt 1152 Cys Thr Arg Ile Gly Tyr Asp Glu Asp Tyr Ala Met Asp His Trp Gly 370 375 380 caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca gcc aaa acg aca ccc cca tct 1200 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 385 390 395 400 gtc tat agt gca ctg gat att gtg ctg aca caa tct cca ctc act ttg 1248 Val Tyr Ser Ala Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu 405 410 415 tcg gtt aac att ggt caa cca gcc tct atc tct tgc aag tca agt cag 1296 Ser Val Asn Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 420 425 430 agc ctc tta tat act aat gga aaa acc tat ttt aat tgg tta tta cag 1344 Ser Leu Leu Tyr Thr Asn Gly Lys Thr Tyr Phe Asn Trp Leu Leu Gln 435 440 445 agg cca ggc cag tct cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg 1392 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu 450 455 460 gac tct gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt gga tca gga aca gat 1440 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 465 470 475 480 ttt aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gaa gat ttg gga gtt tat 1488 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 485 490 495 tac tgc gcg caa ggt aca cat ttt ccg tgg acg ttc ggt gga ggg acc 1536 Tyr Cys Ala Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr 500 505 510 aag ctg gaa atc aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc gcg gcc 1584 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ala Ala 515 520 525 gca gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat ggg gcc cct agg 1632 Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Arg 530 535 540 cat cat cac cat cac cat cat cac taa tag 1662 His His His His His His His His 545 550 <210> 30 <211> 552 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct [CDS]:1..1662 from SEQ ID NO 29 <400> 30 Glu Ala Glu Cys Ala Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu 1 5 10 15 Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Val His Trp Val Lys Gln Ser His Gly 35 40 45 Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Thr 50 55 60 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser 65 70 75 80 Ser Ser Ser Ala Phe Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Trp Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro 130 135 140 Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly Asp Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser 145 150 155 160 Val Ser Ser Ile Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Ser Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Gly Ser Asp Ile Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Asp Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 260 265 270 Ser Glu Val Lys Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 275 280 285 Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 290 295 300 Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp 305 310 315 320 Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 325 330 335 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu 340 345 350 Tyr Leu Gln Met Gly Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 355 360 365 Cys Thr Arg Ile Gly Tyr Asp Glu Asp Tyr Ala Met Asp His Trp Gly 370 375 380 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 385 390 395 400 Val Tyr Ser Ala Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu 405 410 415 Ser Val Asn Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 420 425 430 Ser Leu Leu Tyr Thr Asn Gly Lys Thr Tyr Phe Asn Trp Leu Leu Gln 435 440 445 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu 450 455 460 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 465 470 475 480 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 485 490 495 Tyr Cys Ala Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr 500 505 510 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ala Ala 515 520 525 Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Arg 530 535 540 His His His His His His His His 545 550 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..24 <223> /note="forward primer degKappadir" <400> 31 gayattgtgm tsacmcarwc tmca 24 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..21 <223> /note="reverse primer Kapparev" <400> 32 ggatacagtt ggtgcagcat c 21 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..22 <223> /note="forward primer degH1dir" <400> 33 caggttactc tgaaagwgts tg 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..20 <223> /note="forward primer degH2dir" <400> 34 gaggtccarc tgcaacartc 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..21 <223> /note="forward primer degH3dir" <400> 35 caggtccaaa ctucagcarc c 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..20 <223> /note="forward primer degH4dir" <400> 36 gaggtgaass tggtggaatc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..20 <223> /note="forward primer degH5dir" <400> 37 gatgtgaact tggaagtgtc 20 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..36 <223> /note="reverse primer IgG1rev" <400> 38 ggaagatcta tagacagatg ggggtgtcgt tttggc 36 <210> 39 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..48 <223> /note="VLFORSFI" <400> 39 cacgcggccc agccggccat ggccgatatt gtgatgacac agactcca 48 <210> 40 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..66 <223> /note="VLREVSOE" <400> 40 ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc agaaccacca ccaccggata cagttggtgc 60 agcatc 66 <210> 41 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..50 <223> /note="VHFORSOE" <400> 41 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc gaggtgaagg tggtggaatc 50 <210> 42 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..43 <223> /note="VHREVNOT" <400> 42 ataagaatgc ggccgcatag acagatgggg gtgtcgtttt ggc 43 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..36 <223> /note="VLFORXHO" <400> 43 cacgcctcga gtgatattgt gatgacacag actcca 36 <210> 44 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> prim_transcript <222> 1..38 <223> /note="VHREVAPALI" <400> 44 acgcgtgcac tatagacaga tgggggtgtc gttttggc 38 <210> 45 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> primer_bind <222> 1..20 <223> /note="primer used to isolate the single domain" <220> <221> CDS <222> 1..390 <223> /transl_table=1 <220> <221> misc_feature <222> 294..294 <223> /note="n is a, c, g, or t" <220> <221> primer_bind <222> 363..390 <223> /note="primer used to isolate the single domain" <400> 45 gag gtg aag ctg gtg gaa tct ggg gga ggc tta gtg cag cct gga gag 48 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gaa tcc aat gaa tac gaa ttc cct tcc cat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 20 25 30 gat ttg tct tgg gtc cgc aag act ccg gag aag agg ctg gag ttg gtc 144 Asp Leu Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 gca gcc att aat agt gat ggt ggt agc acc tac tat cca gac acc atg 192 Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 gag aga cga ttc atc atc tcc aga gac aat acc aag aag acc ctg tac 240 Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg agc agt ctg agg tct gag gac aca gcc ttg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca agn cgt cta ttc tay gta cga cgg ttc tac ttt gac ttc tgg ggc 336 Ala Xaa Arg Leu Phe Tyr Val Arg Arg Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gcc aaa acg aca ccc cca tct 384 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125 gtc tat 390 Val Tyr 130 <210> 46 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct [CDS]:1..390 from SEQ ID NO 45 <220> <221> DOMAIN <222> 98..98 <223> ARG or SER <400> 46 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 20 25 30 Asp Leu Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Xaa Arg Leu Phe Tyr Val Arg Arg Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 115 120 125 Val Tyr 130 <210> 47 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> primer_bind <222> 1..20 <220> <221> CDS <222> 1..348 <223> /transl_table=1 <220> <221> primer_bind <222> 328..348 <400> 47 gat att gtg atc acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga 48 Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att agg aat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc ctc atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att acc aac ctg gag caa 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 gaa gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt aat act ctt cca tgg 288 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gga atc aag cgg gct gat gct gca 336 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 cca act gta tcc 348 Pro Thr Val Ser 115 <210> 48 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct [CDS]:1..348 from SEQ ID NO 47 <400> 48 Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser 115

Claims (17)

  1. 이중특이적 항체(Ab)로서,
    hERG1의 세포외 도메인 S5-P를 결합시키는 항-hERG1 Ab의 중사슬 가변형(VH) 도메인과 경사슬 가변형(VL) 도메인; 및 β1 인테그린의 세포외 도메인을 결합시키는 항-β1 인테그린 Ab의 중사슬 가변형(VH) 도메인과 경사슬 가변형(VL) 도메인을 포함하며,
    상기 항-hERG1 Ab의 중사슬 가변형(VH) 도메인은 SEQ ID No:8 혹은 SEQ ID No:2와 85% 동일성을 갖고; 상기 항-hERG1 Ab의 경사슬 가변형(VL) 도메인은 SEQ ID No:4와 85% 동일성을 갖고; 상기 항-β1 인테그린 Ab의 중사슬 가변형(VH) 도메인은 SEQ ID N:26 혹은 SEQ ID N:46과 85% 동일성을 갖고; 또한 상기 항-β1 인테그린 Ab의 경사슬 가변형(VL) 도메인은 SEQ ID N:24 혹은 SEQ ID N:48과 85% 동일성을 갖는 것인 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 직렬 scFvs, 이합체 포맷, 단일사슬 이합체, 직렬 이합체(TandAbs) 및 이중-친화성 재표적화 분자(DARTs)로 이루어진 군에서 선택된 포맷을 갖는 것인 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    SEQ ID NO:8과 적어도 85% 동일성을 갖고 위치 95의 잔기가 Cys인 제1 중사슬 가변형(VH) 도메인, SEQ ID NO:4와 적어도 85% 동일성을 갖는 제1 VL 도메인, SEQ ID NO:26 혹은 SEQ ID N:46과 적어도 85% 동일성을 갖는 제2 VH 도메인, 및 SEQ ID NO:24 혹은 SEQ ID N:48과 적어도 85% 동일성을 갖는 제2 VL 도메인을 포함하는 것인 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 도메인들은 다음과 같은 순서, 즉: 항-hERG1-Cys VH 도메인이 제1 링커에 의해 항 β1-인테그린 VL 도메인에 연결되고, 이는 제2 링커에 의해 항 β1-인테그린 VH 도메인에 연결되며, 이는 다시 제3 링커에 의해 항-hERG1-Cys VL 도메인에 연결되는 형태로 배열되는 것인 항체.
  5. 항-hERG1 분자로서,
    SEQ ID NO:8과 적어도 85% 동일성을 가진 중사슬 가변형(VH) 도메인으로서 여기서 위치 95 상의 잔기는 Cys인 도메인, 및 SEQ ID NO:4와 적어도 85% 동일성을 가진 경사슬 가변형(VL) 도메인을 포함하고, 상기의 분자는 hERG1 S5-공극 세포외 부분에 대한 특이성을 갖는 것인 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    완전 인간화된 재조합 Ab, scFv 단일사슬의 Fab형이나 Fv형 절편, 이합체(diabody), 삼합체(triabody), 이중특이체, 소형체(minibody), 나노체 또는 파지항체인 것인 분자.
  7. 제6항에 있어서,
    VH 및 VL은 펩티드 링커에 의해 연결된 것인 분자.
  8. 제4항에 있어서 또는 제7항에 있어서,
    링커는 (Gly4Ser)3 모티프인 것인 이중특이적 Ab 또는 항-hERG1 분자.
  9. 제5항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID No:10을 갖는 것인 분자.
  10. 제5항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    형광단 혹은 방사성 핵종에 의해 라벨화되는 것인 분자.
  11. 제1항 내지 4항 및 8항 중 어느 한 항 또는 제5항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약품 혹은 진단 툴로 사용하기 위한 이중특이적 Ab 또는 항-hERG1 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    hERG1 단백질의 과발현 혹은 발현이상(mis-expression)을 특징으로 하는 모든 질병, 바람직하게는, 신경학적 질환, 내분비계 질환 및 신경내분비계 질환의 치료 혹은 진단에 사용하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 Ab 또는 분자.
  13. 제1항 내지 4항 및 8항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 Ab 또는 제5항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 항-hERG1 분자 및 적어도 또다른 약제학적 수용가능한 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 4항 및 8항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 Ab 또는 제5항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 분자를 코딩하는 뉴클레오티드의 서열.
  15. 제14항에 따른 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 발현 벡터 혹은 플라스미드.
  16. 제15항에 따른 발현 벡터 혹은 플라스미드를 포함하는 유전자 변형된 미생물 또는 세포.
  17. 동시적, 개별적 혹은 순차적 사용을 위한 부품들을 포함하는 체외(시험관내) 진단 키트로서, 상기 키트는:
    제5항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 항-hERG1-Cys scFv를 함유하는 용기; 및/또는
    제1항 내지 4항 및 8항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 Ab를 함유하는 용기를 포함하고, 또한
    선택적으로 비교 대조군으로서 완전 단클론 항-hERG1 Ab를 함유하는 용기를 더 포함하는 것인 키트.
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