EA045298B1 - Моно и биспецифичные антитела, связывающиеся с hergi и hergi/интегрином бета 1 - Google Patents
Моно и биспецифичные антитела, связывающиеся с hergi и hergi/интегрином бета 1 Download PDFInfo
- Publication number
- EA045298B1 EA045298B1 EA202090344 EA045298B1 EA 045298 B1 EA045298 B1 EA 045298B1 EA 202090344 EA202090344 EA 202090344 EA 045298 B1 EA045298 B1 EA 045298B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- herg1
- antibody
- scfv
- seq
- cells
- Prior art date
Links
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 title claims description 27
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 title claims description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 146
- 101001047090 Homo sapiens Potassium voltage-gated channel subfamily H member 2 Proteins 0.000 claims description 63
- 102100022807 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 2 Human genes 0.000 claims description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 claims description 18
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 claims description 18
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 claims description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 8
- 230000004899 motility Effects 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- -1 succinimidyl ester Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 4
- 102220080600 rs797046116 Human genes 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 claims description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 claims description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 2
- 208000015706 neuroendocrine disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000013643 reference control Substances 0.000 claims description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 claims 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 claims 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 39
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 22
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 20
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 15
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 9
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 201000008129 pancreatic ductal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101100172879 Caenorhabditis elegans sec-5 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- 101150077427 Slc17a6 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- ZVEUWSJUXREOBK-DKWTVANSSA-N 2-aminoacetic acid;(2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid Chemical group NCC(O)=O.OC[C@H](N)C(O)=O ZVEUWSJUXREOBK-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 229940123776 Immuno-oncology therapy Drugs 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011869 Shapiro-Wilk test Methods 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 206010047281 Ventricular arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960003008 blinatumomab Drugs 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960000419 catumaxomab Drugs 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000000375 direct analysis in real time Methods 0.000 description 1
- 238000012063 dual-affinity re-targeting Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 238000009432 framing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000012308 immunohistochemistry method Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 230000001480 pro-metastatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001273 protein sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000205 reproductive and developmental toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVWQQPYHYQKEIZ-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-dodecylbenzenesulfonate;3-dodecylbenzenesulfonate;4-dodecylbenzenesulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].CCCCCCCCCCCCC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1.CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O AVWQQPYHYQKEIZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 231100000164 trypan blue assay Toxicity 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области антител и их применению для диагностических и терапевтических целей в онкологии и других областях медицинских наук. В частности, оно относится к молекулам против hERG1 и их сконструированным производным, включающим биспецифичные антитела, нацеленные как на hERG1, так и на в1-интегрин.
Предшествующий уровень техники
За последние два десятилетия технология получения антител была значительно улучшена благодаря конструированию антител; Появление новых технологий в области молекулярной инженерии привело к получению широкого спектра генно-инженерных антител, таких как фрагменты типа Fab, Fv-формы простой цепи scFv, диател, триател, биспецифических молекул, минител, нанотел, фаговых антител. На самом деле существует ряд применений, в которых Fc-опосредованные эффекты не требуются и даже нежелательны из-за связанных с ними токсических эффектов и их способности вызывать иммунный ответ, способный нейтрализовать эффективность антитела, когда его Fc получен из нечеловеческого источника.
Среди сконструированных фрагментов антител одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) является наиболее популярным и одним из наименьших рекомбинантных форматов с функцией антигенсвязывающей активности и обладает свойством легкого управления для иммунологического применения.
ScFv состоит из вариабельных областей тяжелых (VH) и легких (VL) цепей, которые соединены друг с другом гибким пептидным линкером, не нарушая точность сайтов спаривания VH-VL и антигенсвязывающих сайтов. Выбор линкера может повлиять на растворимость, экспрессию и правильное сворачивание scFv. Пептидные линкеры могут иметь длину от 10 до 25 аминокислот и обычно состоят из гидрофильных аминокислот, таких как глицин (G) и серин (S). Гидрофильные последовательности предотвращают интеркаляцию пептида внутри или между вариабельными доменами на всем протяжении укладки белка. Наиболее распространенным используемым линкером является мотив (Gly4Ser)3, благодаря его гибкости, нейтральному заряду и растворимости. Применение scFv в диагностике и терапии дает ряд преимуществ по сравнению с цельными антителами, особенно в терапии солидных опухолей; на самом деле, скорость проникновения фрагмента по сравнению с интактной молекулой является наиболее заметным преимуществом. В 1988 году было установлено, что интактной молекуле IgG потребовалось пятьдесят четыре часа, чтобы проникнуть на 1 мм в солидную опухоль, в то время как фрагмент Fab прошел такое же расстояние за шестнадцать часов. Кроме того, scFv, как и все другие форматы фрагментов антител, может быть превращен в многовалентные и полиспецифические реагенты или легко связан с терапевтическими средствами, такими как радионуклиды, токсины или наночастицы, и разработан для улучшения их диагностической и терапевтической эффективности.
Эти сконструированные молекулы легко продуцируются в бактериальных или дрожжевых системах, кроме того, они более эффективно подвергаются экстравазации и имеют более высокую способность проникновения в ткани, чем Ig полной длины; единственное ограничение этих молекул - короткий период полувыведения из-за их небольшого размера. Было разработано много стратегий для улучшения фармакокинетики, таких как мультимеризация scFv (укорочение их линкерной последовательности) с образованием триател (около 90 кДа) и тетрател (около 120 кДа), или конъюгация антител к большим молекулам, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Natarajan et al. 2005) или сывороточный альбумин человека (HSA).
Биспецифичные антитела (bsAb) в последнее время привлекли большое внимание в качестве потенциальных противоопухолевых терапевтических агентов, поскольку они предлагают несколько преимуществ:
bsAb могут перенаправлять специфические иммунные клетки на опухолевые клетки, тем самым усиливая уничтожение опухоли;
bsAb могут одновременно блокировать две разные мишени в разных путях, которые выполняют уникальные или перекрывающиеся функции в патогенезе;
bsAb может потенциально увеличить специфичность связывания, взаимодействуя с двумя различными антигенами клеточной поверхности вместо одного.
Разработка биспецифичных антител (bsAb) столкнулась с множеством трудностей, главным образом из-за производственных проблем, плохого выхода, нестабильности и иммуногенности (Spiess С. et al, 2015).
Что касается методологии производства bsAb, они в основном производятся тремя способами, которые включают:
технологию квадром, основанную на соматическом слиянии двух разных линий гибридомных клеток; химическая конъюгация с использованием химических перекрестно-сшивающих агентов; генетические подходы с использованием технологии рекомбинантных ДНК.
Биспецифичные антитела можно условно разделить на две основные подгруппы: молекулы, подобные иммуноглобулину G (IgG), и молекулы, не похожие на IgG, и до настоящего времени в клинической разработке находится более 30 bsAb, причем два препарата - Катумаксомаб и Блинатумомаб - уже одобрены для продажи.
He-IgG-подобные включают в основном bsAb на основе scFv и нанотела. Известно, что scFv могут становиться димерами, тримерами или тетрамерами в зависимости от длины линкера, последовательно
- 1 045298 сти антитела и других факторов (Le Gall F. et al, 1999). Такой формат является предпочтительным и имеет много возможных клинических применений.
Среди форматов bsAb на основе scFv существуют.
Тандемные scFv, которые состоят из двух scFv, связанных гибким пептидным линкером, таким как глицин-сериновые повторяющиеся мотивы в тандемной ориентации. Знаменитая технология привлекающего Т-клетки биспецифического активатора (BiTE) основана на этом формате (Chames P. et al., 2009).
Формат диатела, в котором вариабельные домены двух разных антител связаны двумя линкерами. Они имеют функцию увеличения стабильности диатела.
Одноцепочечные диатела (scDb), формат диатела может быть преобразован в одноцепочечный диатело путем добавления дополнительного линкерного соединения между цепями
Тандемные диатела (TandAb) образованы двумя парами доменов VL и VH, соединенных в одну полипептидную цепь, образуя четырехвалентный TandAb.
Переориентирующиеся молекулы с двойной аффинностью (DART) DART создаются путем ассоциации VH первой вариабельной области, связанной с VL на второй цепи, и VH второй вариабельной области, связанной с VL на первой цепи в VLA - VHB + VLB - конфигурация VHA. Из-за их небольшого размера DART склонны к уничтожению (Moore P.A. et al., 2011).
Диатела и scDb также являются наиболее эффективным способом получения фрагментов биспецифичных антител, способных связывать два разных антигена и, следовательно, полезных для сшивания клеток (например, перенацеливания эффекторных клеток иммунной системы); привлечения эффекторных молекул (таких как токсины, лекарственные средства, цитокины, радиоизотопы или системы комплемента) для перенацеливания системы-носителя (например, вирусных векторов для генной терапии) (Kontermann, 2005); нацеливания и ингибирования макромолекулярных комплексов, участвующих в прогрессировании опухоли.
Антительная инженерия также обеспечила способы увеличения авидности (например, мультимеризацией фрагментов антител); аффинности (например, мутацией в вариабельных областях целых Ig или фрагментов антител); и усилила эффекторные функции (например, мутацией в константных областях цельного Ig или конъюгаций фрагментов антител с рекомбинантным Fc, токсином, лекарственными средствами, цитокинами, лигандами смерти, радиоизотопами, наночастицами или молекулами системы комплемента).
За последние три десятилетия ген специфических калиевых каналов сердца человека 1 (hERG1) стал мишенью в онкологии и при других заболеваниях человека. Однако его применение в терапевтических целях было затруднено тем фактом, что большинство лекарственных средств, которые вызывают блокаду hERG1 в качестве основного или побочного эффекта, могут вызывать кардиотоксичность (удлинение интервала электрокардиографического QT и возникновение желудочковых аритмий). В поисках биофизических и биомолекулярных признаков, которые отличают hERG1, экспрессируемый в сердце, от hERG1, экспрессируемого в раковых клетках и других клетках, характерных для заболеваний, было обнаружено, что hERG1 образует комплексы с другими белками плазматической мембраны, в частности с субъединицей бета1 рецепторов интегрина, на плазматической мембране раковых клеток. Такой комплекс не встречается в миоцитах сердца (Becchetti A. et al, Sci.Signaling, 10 (473). pii: eaaf3236. doi: 10.1126/scisignal.aaf3236. PMID: 28377405, 2017). Следовательно, комплекс hERG1/бета1 интегрин конфигурируется как онкогенная единица, свойственная трансформированным клеткам, факт, который дифференцирует hERG1 в опухоли от канала, экспрессируемого в сердце. Это открытие означает, что любая молекула (низкомолекулярное лекарственное средство или в ином случае белок), нацеленная на комплекс hERG1/бета1 интегрин, может использоваться в диагностических и терапевтических целях, будучи лишенной кардиотоксичности. В настоящее время молекулы, способные нацеливаться на комплекс hERG1/бета1 интегрин, не известны.
В итальянском патенте IT1367861 описан клон гибридомной клеточной линии, названный А7, способный секретировать моноклональное антитело против hERG1 (mAb), специфичное в отношении внеклеточной части S5-поры hERG1.
В WO 2016020483 (A1) описывается подробная структура интактной мышиной моноклональной молекулы против hERG1 и соответствующее получение анти-hERG1 scFv, полученного после выделения VH и VL анти-hERG1 mAb. Такой scFv обладает той же специфичностью, что и соответствующее целое антитело, и, таким образом, способен распознавать тот же анти-hERG1 белок, который аберрантно экспрессируется в опухолях и других заболеваниях. Нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3, кодирующие соответственно VH (SEQ ID NO: 2) и VL (SEQ ID NO: 4), были раскрыты вместе с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5, кодирующей scFV, имеющую SEQ ID NO: 6.
В данной области техники в исследовательских целях известны анти-бета1 интегрин mAb, например, среди прочего известны TS2/16 (Arroyo et al. J. Cell Biol. 1992, 117 (3), 659-670) и BV7 (MartinPadura et al. J. Biol. Chem. 1994, 269(8), 6124-6132).
Целью настоящего изобретения является создание биспецифического антитела, которое одновременно направлено на белки hERG1 и бета1 интегрин, и которое образует комплекс на плазматической
- 2 045298 мембране раковых клеток. Еще одной целью настоящего изобретения является создание улучшенного или, по меньшей мере, альтернативного антитела против hERG1.
Сущность изобретения
Объектом настоящего изобретения является биспецифическое антитело (bsAb), содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) анти-hERG1 Ab, которое связывает внеклеточный домен S5-P hERG1 и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) анти-Р1-интегрин Ab, которое связывает внеклеточный домен в1-интегрина.
Неожиданно было обнаружено, что bsAb по изобретению способно избирательно связывать комплекс hERG1 + β1 -интегрин, который присутствует только в опухолевых клетках. В частности, bsAb по изобретению продемонстрировал способность in vitro ингибировать рост клеток и миграционную, прометастатическую активность на панели неопластических клеточных линий.
В аспекте настоящее изобретение относится также к молекуле анти-hERG1, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий, по меньшей мере, 85% идентичности с SEQ ID NO: 8, где остаток в положении 95 представляет собой Cys, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий, по меньшей мере, 85% идентичности с SEQ ID NO: 4, причем указанная молекула обладает специфичностью в отношении внеклеточной части S5-поры hERG1.
Неожиданно было обнаружено, что молекула анти-hERG1 (анти-hERG1-Cys) по изобретению, имеющая Cys в положении 95 домена VH (SEQ ID NO: 8), показала лучшее сродство к иммобилизованному антигену по сравнению с молекулой, известной в данной области техники, имеющей Phe в положении 95 домена VH (SEQ ID NO: 2). В частности, молекула scFv по изобретению показала способность in vitro ингибировать рост клеток на панели линий опухолевых клеток.
Подробное описание изобретения
Предпочтительно bsAb по изобретению представляют собой такие, у которых вариабельный домен (VH) тяжелой цепи анти-hERG1 Ab имеет 85% идентичности с SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 2; и вариабельный домен (VL) легкой цепи анти-hERG1 Ab имеет 85% идентичности с SEQ ID NO: 4; и вариабельный домен (VH) тяжелой цепи и вариабельный домен (VL) легкой цепи анти-в1-интегрин Ab имеют, по меньшей мере, 85% идентичности с VH и VL TS2/16 (SEQ ID NO: 26 и 24) или BV7 (SEQ ID NO: 46 и 48).
Предпочтительно bsAb по изобретению представляет собой не IgG-подобное bsAb, предпочтительно bsAb на основе scFv. Согласно изобретению bsAb на основе scFV имеет формат, выбранный в группе, состоящей из тандемных scFv, формата диатела, одноцепочечных диател, тандемных тел (TandAb) и переориентирующихся молекул с двойной аффинностью (DART), предпочтительно scDb.
Предпочтительно домен VH анти-в1-интегрин Ab имеет 90%, 95%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 46, более предпочтительно SEQ ID NO: 26.
Предпочтительно домен VL анти-в1-интегрин Ab имеет 90%, 95%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 48, более предпочтительно SEQ ID NO: 24.
Предпочтительно VH-домен Ab против hERG1 Ab, все еще сохраняющий аминокислоту Cys в положении 95, имеет 90%, 95%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 8.
Предпочтительно домен VH Ab против hERG1 имеет 90%, 95%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 2.
Предпочтительно домен VL Ab против hERG1 имеет 90%, 95%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 4.
Домен VH анти-hERG1-Cys Ab согласно настоящему изобретению предпочтительно кодируется последовательностью нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% гомологии с SEQ ID NO: 7 где триплет из остатков с 283 по 285 может быть TGT или TGC.
Домен VH анти-hERG1 Ab согласно настоящему изобретению предпочтительно кодируется последовательностью нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% гомологии с SEQ ID NO: 1.
Домен VL анти-hERG1 Ab согласно настоящему изобретению предпочтительно кодируется последовательностью нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или 100% гомологии с SEQ ID NO: 3.
Молекула согласно изобретению может представлять собой полностью гуманизированное рекомбинантное антитело.
Молекула согласно изобретению может представлять собой scFv или любое другое сконструированное антитело, такое как Fab, Fv-форма простой цепи scFv, диатела, триатела, биспецифические молекулы, минитела, фаговые антитела; предпочтительными являются scFv и диатела (scDb).
Предпочтительными линкерами являются мотивы (Gly4Ser)3.
Особенно предпочтительным является анти-hERG1-Cys scFv, где VH и VL связаны пептидным линкером; более предпочтительным является анти-hERG1-Cys scFv, имеющий SEQ ID NO: 10.
Особенно предпочтительным является bsAb, который представляет собой одноцепочечное диатело (scDb), содержащее анти-hERG1-Cys scFv и анти-в1-интегрин scFv, таким образом, селективно воздействуя на комплекс hERG1 + в1-интегрин, который присутствует только в опухолевых клетках.
- 3 045298
Следовательно, для предпочтительного аспекта настоящее изобретение относится к одноцепочечному диателу bsAb (scDb), содержащему первый вариабельный домен (VH) тяжелой цепи, имеющий, по меньшей мере, 85% идентичности с SEQ ID NO: 8, где остаток в положении 95 представляет собой Cys, и первый домен VL, имеющий, по меньшей мере, 85% идентичности с SEQ ID NO: 4, и второй домен VH, имеющий, по меньшей мере, 85% идентичности с SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 46, и второй домен VL, имеющий, по меньшей мере, 85% идентичности с SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 48, причем указанное биспецифичное Ab обладает специфичностью в отношении внеклеточной части S5-поры hERG1 и в отношении в1-интегрина.
Молекула bsAb или анти-hERG1 по изобретению полезна в качестве диагностического или терапевтического средства.
Диагностический инструмент согласно изобретению предназначен для обнаружения in vitro hERG1 (например, в хирургических образцах или биопсиях), содержит анти-hERG1-Cys scFv и/или биспецифичное Ab (предпочтительно в виде scDb) согласно изобретению, либо немеченое, либо связанное с флуорофором, предпочтительно флуорофором Alexa 488.
Таким образом, объект настоящего изобретения также представляет собой набор для диагностики in vitro (IVD), содержащий части для одновременного, раздельного или последовательного применения, причем указанный набор IVD включает:
контейнер, содержащий анти-hERG1-Cys scFv, как описано выше; и/или контейнер, содержащий биспецифичное Ab, как описано выше
Предпочтительно набор IVD дополнительно включает контейнер, содержащий интактное моноклональное антитело, как описано в WO 2016020483, в качестве референсного контроля.
Набор IVD может использоваться либо на образцах фиксированных тканей для методов иммуногистохимии (с результатами, которые будут доступны через 2-3 недели), либо на свежих биопсийных тканях (получаемых, например, с помощью эндоскопии или хирургии), для применения с методами иммунофлюоресценции, причем результаты доступны через 1 день.
Как описано выше, анти-hERG1-Cys scFv, меченное флуорофором (например, предпочтительно, Alex 750) или радионуклидом (например, предпочтительно, Тс99), представляет собой молекулу для применения при ранней диагностике hERG1-положительных видов онкологических заболеваний in vivo (у людей) и представлено анти-hERG1-Cys scFv. Анти-hERG1-Cys sc-FV антитело согласно изобретению имеет специфическую молекулярную структуру, обеспечивающую быстрое проникновение в раковую ткань, быстрое связывание с биомаркером hERG1 и быструю элиминацию, что делает его, при связывании с радионуклидом, идеальной молекулой для получение раннего in vivo (у людей) диагноза hERG1положительного рака. Применение за одно введение и быстрый период полувыведения, 3,5 часа молекулы без системной токсичности при внутривенном введении в дозе 8 мг/кг и отсутствие изменений на ЭКГ (см. фиг. 19) позволяют не взаимодействовать с клетками сердца. Наконец, оказалось, что анти-hERG1-Cys scFv имеет очень хорошее соотношение опухоль/ткань при внутривенном введении в дозе 1 мг/кг у мышей, несущих ксенотрансплантированный рак поджелудочной железы в поджелудочной железе.
Терапевтические средства.
Молекула биспецифического антитела в соответствии с изобретением, специально разработанная для ингибирования злокачественного молекулярного комплекса hERG1/бета1 интегрин в терапевтических целях, представляет собой одноцепочечное биспецифическое антитело (одноцепочечное диатело, scDb), которое способно селективно связываться с hERG1 при экспрессии с бета1 интегрином на раковых клетках, без взаимодействия с сердцем. ScDb согласно изобретению представляет собой идеальную молекулу, которую следует использовать для повторного (постоянного) введения пациентам с hERG1положительным раком, не вызывающих опасений по поводу безопасности сердца, с терапевтическим потенциалом как на ранней, так и на поздней/метастатической стадии, как в качестве отдельного агента, так и в качестве агента комбинированной терапии, для добавления к химиотерапии, облучению, таргетной терапии и иммуноонкологической терапии. Обоснование комбинированной терапии заключается в том, что пути, конституционально активируемые в раковых клетках за счет избыточной экспрессии молекулярного комплекса hERG1/бета1 интегрин, являются комплементарными и интегративными для путей, на которые в настоящее время нацелены доступные лекарственные средства. Кроме того, канцерогенный путь с участием hERG1/бета1 интегрин может представлять собой механизм ускользания опухоли от надзора в сравнении с доступными в настоящее время методами лечения. Оказалось, что антиhERG1/бета1 интегрин scDb имеет период полувыведения примерно 12 часов, без системной токсичности при внутривенном введении в дозе 8 мг/кг и без изменений на ЭКГ (см. фиг. 20). Наконец, оказалось, что анти-hERG1/бета1 интегрин scDb обладает очень хорошей терапевтической эффективностью при введении в дозе 1 мг/кг два раза в неделю шесть раз у мышей с ксенотрансплантированным раком поджелудочной железы в поджелудочной железе.
Патологии, которые можно диагностировать или лечить с использованием bsAb или молекулы согласно изобретению, представляют собой все патологии, характеризующиеся сверхэкспрессией или неправильной экспрессией белка hERG1. Среди указанных патологий можно назвать опухоли, неврологические заболевания, эндокринные заболевания и нейроэндокринные заболевания.
- 4 045298
BsAb или молекула в соответствии с изобретением, в частности анти-hERGl-Cys scFV или scDb, также могут быть использованы в качестве фармацевтического вектора доставки: так, например, она может быть ковалентно или нековалентно связана с радионуклидом, ферментом, лекарственными средствами или токсином.
Таким образом, дополнительным объектом настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция, содержащая bsAb или молекулу в соответствии с изобретением и, по меньшей мере, другой фармацевтически приемлемый ингредиент.
Еще одним объектом настоящего изобретения является также последовательность нуклеотидов, кодирующих биспецифичное Ab или молекулу анти-hERG1 по изобретению. Подходящие степени гомологии (например, по меньшей мере, 85%) с кодирующими последовательностями, которые позволяют получать молекулу согласно изобретению, предназначены для включения.
Молекула согласно изобретению может быть предпочтительно получена с использованием нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 2, кодирующих соответственно VH (SEQ ID NO: 8) и VL (SEQ ID NO: 4).
Особенно предпочтительным согласно изобретению является способ получения анти-hERG1-Cys scFv согласно изобретению, причем указанный способ включает применение нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9, кодирующей анти-hERG1-Cys scFV, имеющей SEQ ID NO: 10.
ScDb-hERG1-e1 по изобретению предпочтительно получают с применением нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 45, кодирующих соответственно анти-hERG1-Cys VH (SEQ ID NO: 8), анти-hERG1-Cys VL (SEQ ID NO: 4), анти-в1-интегрин VL (SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 48) и анти-в1-интегрин VH (SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 46). Предпочтительно домены собраны в следующем порядке: анти-hERG1Cys VH (SEQ ID NO: 8), анти-в1-интегрин VL (SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 48), анти-в1-интегрин VH (SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 46) и анти-hERG1-Cys VL (SEQ ID NO: 4).
Особенно предпочтительным в соответствии с изобретением является способ получения scDbhERG1-e1 в соответствии с изобретением, причем указанный способ включает использование нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 29, кодирующей scFV против hERG1-Cys, имеющего SEQ ID NO: 30.
Способ согласно изобретению подразумевает рекомбинантные методики.
Следовательно, объектом настоящего изобретения являются также экспрессирующий вектор или плазмида, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующих биспецифичное Ab или молекулу согласно изобретению, предпочтительно содержащую SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 2, а также генетически модифицированные микроорганизмы или клетка, содержащие экспрессирующий вектор по изобретению. Вышеуказанный экспрессирующий вектор или плазмида также могут содержать SEQ ID NO: 23 или 47 и SEQ ID NO: 25 или 45.
Настоящее изобретение может быть лучше понято в свете экспериментального раздела ниже.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - электрофореграммы, полученные для секвенирования ДНК четырех колоний после мутагенеза, выполненного на конструкции scFv-hERG1, показывающие правильную мутацию с Phe на Cys.
Фиг. 2. (А): дрожжевая экспрессия scFv-hERG1. Слот-блот на надосадочных жидкостях, собранных путем индукции клонов scFv-hERG1-G3 Pichia Pastoris через 24 ч, 48 ч и 72 ч.
Были проанализированы клоны С7, С12, D9, Е8, G3, G7 и отрицательный контроль нетрансформированного штамма Pichia GS115. Окрашивание проводили с использованием хромогена DAB. G3 показан как лучший экспрессирующий клон. (В): Вестерн-блоттинг, проведенный на очищенных образцах шести клонов. G3 показал самый высокий уровень экспрессии, в то время как у клона G7 экспрессия почти не была обнаружена. (С): Слот-блот на надосадочных жидкостях, собранных путем индукции клонов scFvhERG1-D8Cys Pichia Pastoris через 24 ч, 48 ч и 72 ч. Были проанализированы клоны В11, С3, D8, D9, G4, G10 и отрицательный контроль нетрансформированного штамма Pichia GS115. Окрашивание проводили с использованием хромогена DAB. D8 показан как лучший экспрессирующий клон. (D): Вестерн-блоттинг, проведенный на очищенных образцах шести клонов. D8 был клоном, который показал самый высокий уровень экспрессии, в то время как более низкая экспрессия была обнаружена для клона С3.
Фиг. 3. (A) SDS-PAGE очищенных фракций элюции scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys; (В) гельфильтрационная хроматография обоих очищенных антител с использованием Superdex 75 FIR 10/30. (С) тест стабильности антитела scFv-hERG1-D8Cys. SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси бриллиантовым голубым представлены на снимке в разные моменты времени (через 0, 6, 12 и 18 месяцев после очистки белка).
Фиг. 4. (А) Иммунофлуоресценция, проведенная на фиксированных и живых клетках НЕК293Моск и HEK293-hERG1, с использованием как немеченого (I. IF), так и меченого антитела scFv-hERG1-G3 (D.IF). Репрезентативные изображения, полученные при 20-кратном увеличении, окрашенные ядра представлены синей флуоресценцией, окрашенные мембраны представлено зеленым окрашиванием (Alexa 488).
(B) Иммунофлуоресценцию проводили на фиксированных и живых клетках НЕК293-Моск и HEK293
- 5 045298 hERGl, с использованием как немеченого (I. IF), так и меченого антитела scFv-hERG1-D8-Cys (D.IF). Репрезентативные изображения, полученные при 20-кратном увеличении, окрашенные ядра представлены синей флуоресценцией, окрашенные мембраны представлено зеленым окрашиванием (Alexa 488).
(C) Графики, показывающие интенсивность IF (A.U.), рассчитанную с использованием программного обеспечения Image J (ImageJ 1.38, U.S. Национальные институты здоровья). Для каждого изображения среднее значение интенсивности флуоресценции трех разных областей рассчитывали после вычитания значений синих каналов (что относится к окрашиванию ядер).
Во всех экспериментах результаты на HEK 293-hERG1 были значительно выше по сравнению с результатами, полученными на HEK 293-Моск. Статистический анализ проводился для оценки допущений о нормальности и гомоскедастичности данных с использованием теста Шапиро-Уилка, а дисперсия анализировали с помощью ANOVA. Значимость парных волн оценивали с использованием t-критерия Стьюдента или критерия Бонферрони (*р<0,05).
Фиг. 5. Анализ жизнеспособности с трипановым синим, выполненный на НСТ-116, MDA MB-231, MIA PACA2, HEK 293 HERG1, HEK-МОСК, FLG 29.1, PANC-1, ВхРС-3, с использованием моноклонального антитела против hERG1 (100 мкг/мл) и scFv-hERG1-D8Cys (10; 20 мкг/мл). Все эксперименты были выполнены в трех повторах.
Фиг. 6. Панель А: тестировали сфероиды HEK 293 HERG1 10, 20 и 40 мкг/мл scFv-hERG1-D8Cys. Объем сфероидов, обработанных 20 мкг/мл и 40 мкг/мл scFv-hERG1-D8Cys, меньше (см. пунктирные и штрих-пунктирные линии, соответственно) по сравнению с контролем (сплошная линия) в каждый момент времени. Вместо этого на панели В показана кривая роста сфероидов HEK-МОСК (не экспрессирующих hERG1), в которой не было обнаружено различий для обработанных сфероидов при всех трех протестированных концентрациях scFv-hERG1-D8Cys по сравнению с контролем. Панели А и В также показывают репрезентативное изображение в светлом поле контрольных сфероидов HEK293-hERG1 и HEK-MOCK соответственно, по мере их появления после 72 ч культивирования. Панель С. Сфероиды протоковой аденокарциномы поджелудочной железы. На панели С показано влияние, оказываемое на клетки протоковой аденокарциномы поджелудочной железы Mia Раса 2. Уменьшение объема сфероидов наблюдалось как для клеток, обработанных 20 мкг/мл, так и для 40 мкг/мл scFv-hERG1-D8Cys, с более выраженным эффектом, полученным при самой высокой протестированной концентрации (штрихпунктирная линия) по сравнению с контролями в каждый момент времени. Также снимки, сделанные через 72 ч, показанные на правой стороне панели, показывают значительное уменьшение объема сфероида для клеток, обработанных антителом scFv-hERG1-D8Cys 40 мкг/мл (см. правое изображение), по сравнению с контролем (см. левое изображение). Панель D - клетки рака молочной железы, сфероиды MDA-MB 231: заметный эффект уменьшения объема наблюдается для всех трех концентраций scFvhERG1-D8Cys (10, 20, 40 мкг/мл) по сравнению с контролем. Сделать вывод об уменьшении объема также можно сделать из изображений сфероидов MDA-MB 231, приведенных на правой стороне фигуры.
Фиг. 7. Анализ жизнеспособности клеток Calcein AM, выполненный на сфероидах через 72 ч. Зеленое окрашивание представляет живые клетки, в то время как красное окрашивание представляет мертвые клетки. Изображение слева (панель А) представляет собой изображения контроля для каждой клеточной линии, в то время как справа (панель В) есть изображения сфероидов, обработанных 40 мкг/мл scFvhERG1-D8Cys. Из изображения можно отметить уменьшение объема для сфероидов, обработанных антителом, особенно для сфероидов Mia Раса 2, MDA MB-231 и PANC-1 и, кроме того, увеличенное количество мертвых клеток, особенно для MDA МВ-231 и сфероидов PANC-1, обработанных scFv-hERG1D8Cys.
Фиг. 8А - нуклеотидная последовательность анти-b1-интегрин доменов VL и VH (TS2/16) (SEQ ID NO: 23 и 25) получена службой автоматического секвенирования ДНК (PRIMM). Подчеркнутым курсивом показана последовательность VL, курсивом VH последовательность.
Фиг. 8В - нуклеотидная последовательность доменов VL и VH анти-b1-интегрин (BV7) (SEQ ID NO: 45 и 47). Жирным шрифтом выделены праймеры, используемые для выделения одиночных доменов, тогда как серым цветом выделена область VH-последовательности, которая неизвестна, но в результате необходима для правильной рамки.
Фиг. 9. Верхние панели: схематическая структура двух одноцепочечных антител, анти-hERG1 и анtu-TS2/16. Нижние панели: схематическая структура scDb-hERG1-e1.
Фиг. 10. Схема, представляющая метод SOE-PCR для сборки анти-b1-интегрин scFv в порядке VLлинкер-VH.
Фиг. 11. Панель А показывает окрашивание Кумасси очищенных надосадочных жидкостей, полученных в результате индукции шести клонов в малом масштабе, выращенных после трансформации анти-hERG1-Phe-β1-scDb конструкцией. Обнаружена одна полоса, соответствующая клону G5 с молекулярной массой около 60 кДа, что соответствует ожидаемой.
На панели В показана хроматограмма, полученная после очистки надосадочной жидкости, полученной в результате крупномасштабной экспрессии клона G5: виден один единственный пик, и элюции, лежащие под синей областью, были проанализированы, а окрашивание Кумасси, представленное на па
- 6 045298 нели С, демонстрирует полосы с надлежащей молекулярной массой во всех проверенных элюциях.
Фиг. 12. Панель А. Результаты клеточного ELISA, проведенного на клетках HEK 293 HERG1 с использованием различных количеств биспецифического анти-hERG1-Phe-β1-scDb антитела.
Фиг. 13 - непрямой IF, выполняемый на клетках, высеянных на разные субстраты, BSA и фибронектин (FB). IF показывает более сильный сигнал для клеток HEK 293 HERG1, покрытых FB, по сравнению с сигналом, полученным для клеток, покрытых BSA.
Фиг. 14 - непрямой IF, выполняемый на клетках HEK 293 HEKG (панели А и В). Окрашивание клеток после введения избытка пептида S5PORO показано на панелях D и Е. На панели С представлены контрольные клетки, окрашенные только вторичными антителами.
Фиг. 15. Экспрессия и очистка scDb-hERG1-Cys-e1. Панель А. Хроматограмма, полученная в результате очистки надосадочных жидкостей Pichia Pastoris. Панель В. Окрашивание Кумасси, показывающее анализ элюции при очистке scDb-hERG1-Cys-e1, в пределах синего пика хроматограммы.
Фиг. 16 - прямой IF с scDb-hERG1-Cys-e1-Alexa488. В этих конкретных экспериментах клетки инкубировали с антителом scDb, непосредственно конъюгированным с флуорофором Alexa 488. Клетки GD25 WT (отрицательные по экспрессии hERG1 и в1-интегрина) инкубировали с антителом scDbhERG1-Cys-e1, непосредственно меченным флуорофором А1еха488. Сигнал отсутствует. Панель В. Клетки HEK 293 HERG1, высеянные на фибронектин (FN) и BSA и окрашенные scDb-hERG1-Cys-e1Alexa488: как показано на гистограмме, сигнал выше (~17 A.U.) в клетках, посеянных на FN, по сравнению с клетками, посеянными на BSA (~10 A.U.). Панель С. Клетки HEK 293 WT, высеянные на FN и BSA и инкубированные с scDb-hERG1-Cys-β1-А1еха488: сигнал ниже для клеток, высеянных на BSA (А 7 A.U.), по сравнению с клетками, посеянными на FN (~12 A.U.). Как можно понять из панелей В и С, значения флуоресценции ниже для клеток HEK 293 HERG1 на FN (~17 A.U.) по сравнению с клетками HEK 293 WT, посеянными на FN (~ 12 A.U.).
Фиг. 17 - определение IC50 на клетках MDA-MB 231 и PANC-1. Влияние на жизнеспособность клеток было очевидно при 24 мкг/мл для клеток PANC-1 и 42 мкг/мл для клеток MDA-MB 231.
Фиг. 18. Эксперименты с латеральной подвижностью на клетках НСТ 116, MDA-MB 231 hERG1, MDA-MB 231 и PANC-1. Четкое снижение MI (индекса подвижности) показано в клетках, обработанных scDb-hERG1-Cys-e1, по сравнению с контрольными клетками. Более выраженный эффект сообщается для MDA-MB 231 hERG1 по сравнению с клетками MDA-MB 231, что свидетельствует о влиянии hERG1 на подвижность клеток. Эксперименты по латеральной подвижности, выполненные на клетках PANC-1, показали более низкий MI на обработанных клетках по сравнению с контролем. Эксперименты по латеральной подвижности, выполненные на клетках НСТ116, показали более низкий MI на обработанных клетках по сравнению с контролем.
Фиг. 19. (А) Фармакокинетика scFv-hERG1-D8Cys у мышей путем внутривенного введения (n=2). Концентрацию антител определяли с помощью ELISA, дозируя концентрации в образцах плазмы крови мышей, взятых через 5, 15, 30 мин и 1, 2, 6, 24 и 48 ч после инъекции scFv. t1/2 = 3,5 ч. Значения представляют собой средние значения двух измерений ±SD.
(В) ЭКГ, регистрация электрокардиограммы. Измерения ЭКГ приведены на левой панели для контрольной мыши, которой вводили физиологический раствор PBS, скорректированное значение интервала QT составляет 86 мс. На правой панели показан график ЭКГ, полученный после введения scFv-hERG1D8Cys, без значительных изменений по сравнению с контролем с установленным значением интервала QT 90 мс.
(C) Анализ in vivo. Каждая панель сообщает о флуоресцентном сигнале репрезентативной мыши, обработанной антителом scFv-hERG1-D8Cys, конъюгированным с Alexa750, по сравнению с контрольной мышью, обработанной раствором PBS. Максимальный обнаруженный сигнал был через 10 мин после инъекции; и не было обнаружено флуоресцентного сигнала через 24 ч после внутривенного введения.
(D) Поглощение scFv-hERG1-D8Cys-Alexa750 и удержание scFv-hERG1-D8Cys-Alexa750 в мышиной модели PDA MIAPaCa-2-nu/nu. Мышам вводили путем инъекции в хвостовую вену 6,5 мкг антитела scFvhERG1-D8Cys-Alexa750. Репрезентативные фотографии мышей в.в. инъецированных мечеными антителами (слева) сравнивали с контрольными мышами (справа). Была проанализирована интенсивность флуоресценции в брюшной области, участок, ближайший к опухоли. Спектры флуоресцентного излучения измеряли с использованием фотонного сканера (Biospace Lab), изображения получали в разные моменты времени, каждые 5 мин, начиная с 5 мин после инъекции и до 60 мин после инъекции.
Фиг. 20. (А) Фармакокинетика scDb-hERG1-Cys-e у мышей путем внутривенного введения (n=2). Концентрацию антител определяли с помощью ELISA, дозируя концентрации в плазме крови мышей, взятых через 5, 15, 30 мин и 1, 2, 6, 24 и 48 ч после инъекции scDb. t1/2 — 12 ч Значения представляют собой средства двух измерений ±SD.
(B) ЭКГ, регистрация электрокардиограммы. График ЭКГ, полученный после введения антитела scDb-hERG1-Cys-e1, не показывает значительных изменений по сравнению с контрольным графиком, представленным на фиг. 20В, со скорректированным значением интервала QT 83 мс, сравнимым с контролем.
- 7 045298 (C) Таблица, показывающая объем поджелудочной железы (мм3) у мышей с опухолями MIAPaCa2-nu/nu, получавших и не получавших антитело scDb-hERG1-Cys-e1. Также представлены данные о метастатической диффузии, % некротической площади на предметном стекле и числе сосудов.
(D) Изображения поджелудочной железы после некроскопии: 1, без обработки; 2, обработанной тремя дозами антитела scDb-hERG1-Cys-e1; 3, обработанной шестью дозами антитела scDb-hERG1-Cys-p1.
Экспериментальная часть
1. Мутагенез scFv-hERG1.
Аминокислотная последовательность молекулы scFv hERG1, как описано в WO 2016020483 (А1), содержит аминокислоту Phe в положении 95 домена VH. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 обнаружила присутствие Т в положении 283 (с283Т) домена VH. Согласно настоящему изобретению замена G была введена вместо Т в положении 283 (с283Т> G) домена VH, что привело к переключению Phe (ТТТ) в положении 95 на Cys (TGT). Эта мутация привела к введению одной аминокислоты (Cys) в положение между каркасом 3 и CDR3, что неожиданно привело к фундаментальному образованию дисульфидной связи в вариабельном домене иммуноглобулина. Cys был введен в оригинальную конструкцию, что является ориентиром для протокола мутагенеза (см. Материалы и методы). кДНК, полученную из четырех мутагенизированных колоний scFv-hERG1, секвенировали, и результаты секвенирования (фиг. 1) продемонстрировали правильную мутацию с ТТТ на TGT в положении c283T>G, что указывает на желаемую мутацию с Phe на Cys.
2. Экспрессия и очистка белка.
Плазмиды, scFv-hERG1 и мутагенизированный scFv-hERG1 (далее называемый scFv-hERG1-Cys), трансформировали в штамм-хозяин GS115 P. pastoris, используя технику сферопластирования. Было проанализировано шесть клонов (С7, С12, D9, Е8, G3, G7) среди трансформантов scFv-hERG1 и шесть (В11, С3, D8, D9, G4, G10) из scFv-hERG1-Cys. Результаты экспрессии в малом масштабе показаны на фиг. 2 панели А и В для scFv-hERG1 и панели С и D для scFv-hERG1-Cys, соответственно. Все клоны продемонстрировали экспрессию белка после 72-часовой индукции (верхние панели), что также показано слотблотингом.
После очистки присутствие белка оценивали с помощью вестерн-блоттинга (панели В и D).
Два наиболее экспрессирующих клона были выбраны для двух антител: G3 для scFv-hERG1 (далее называемый scFv-hERG1-G3) и D8 для scFv-hERG1-Cys (называемый scFv-hERG1-D8-Cys).
Анализы экспрессии в большом масштабе показаны на фиг. 3. Присутствие белка оценивали с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым. Фракции 11, 12, 13 (А, левая панель) соответствуют scFv-hERG1-G3; фракции 12, 13, 14 (В, правая панель) соответствуют scFv-hERG1D8Cys. Видны полосы, соответствующие молекулярному размеру обоих антител (около 30 кДа). При сравнении выходов двух белков, scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys, были обнаружены существенные различия: концентрация scFv-hERG1-G3 составляла 0,050 мкг/мкл; Концентрация scFv-hERG1-D8Cys составляла 0,444 мкг/мкл.
| БЕЛОК | Выход (мг/л) |
| ScFv-hERGl-G3 | 0200 |
| ScFv-hERGl-D8Cys | 1 |
аВыходы были нормализованы до мг белка на литр дрожжевой культуры Pichia Pastoris
3. Сравнение аффинности антигена между scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys.
Хроматограммы, представленные на Фиг. 3 (панели В), показывают результаты, полученные при гель-фильтрации. Эксклюзионная хроматография (SEC) была выполнена для того, чтобы исследовать возможное присутствие агрегатов, которые могут повлиять на связывающую способность двух антител. Несколько агрегатов обнаруживаются в анализе, представленном в В (левая панель), который относится к scFv-hERG1-G3; при этом scFv-hERG1-D8Cys (В, правая панель) представлен в мономерной форме.
4. Тест стабильности антитела scFv-hERG1-D8Cys.
Стабильность антитела scFv-hERG1-D8Cys оценивали непосредственно, анализируя белок посредством окрашивания SDS-PAGE Кумасси бриллиантовым голубым в разные моменты времени (6, 12, 18 месяцев) после очистки. Данные на Фиг. 3С показывают, что во все моменты времени видна только одна аккуратная одиночная полоса, что указывает на то, что белок сохраняет свою стабильность, не показывая признаков деградации.
5. Оценка иммунореактивности scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys Затем проводили иммунофлуоресцентный анализ с использованием scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys на фиксированных клетках, чтобы определить иммунореактивность двух антител. В качестве клеточной модели использовали HEK 293, трансфицированные кДНК hERG1 (HEK-hERG1) и, в качестве контроля HEK-MOCK, которые не экспрессируют белок hERG1. Клетки HEK-MOCK показали отсутствие или слабый сигнал с обоими антителами, в то время как hEK 293 hERG1 показали хорошее мечение scFv-hERG1-G3, а еще лучше с scFv-hERG1-D8Cys (Фиг. 4, А и В). Анализ данных, полученных с использованием программного обеспечения ImageJ, представлен на графиках, приведенных на панели С. Значения, полученные при окраши
- 8 045298 вании scFv-hERG1-D8Cys, значительно выше в клетках, сверхэкспрессирующих hERGl, по сравнению со значениями контроля, полученного в клетках HEK-MOCK.
Также была протестирована иммунореактивность двух антител после прямого мечения флуоресцентной молекулой Alexa 488. Антитела scFv-hERG1-G3-Alexa488 и scFv-hERG1-D8Cys-Alexa488 тестировали в IF на фиксированных клетках (Фиг. 4, А и В), демонстрируя сохранение способности распознавать антиген в нативной конформации даже после сопряжение с флуорофором. Окрашивание IF измеряли с использованием программного обеспечения ImageJ, и результаты показаны на графиках, представленных на панели С. Сигнал, полученный на клетках HEK 293 HEK 293, сильнее по сравнению с контрольными клетками HEK-MOCK как для scFv-hERG1-G3-Alexa488, так и для scFv-hERG1- D8CysAlexa488.
Чтобы оценить и сравнить потенциальное применение in vivo scFv-hERG1-G3-Alexa488 и scFvhERG1-D8Cys-Alexa488 в качестве молекулярных инструментов, оба антитела использовали для IF на живых клетках (фиг. 4 А и В).
Эксперимент подтвердил результаты, полученные при окрашивании на фиксированных клетках; Клетки hEKG3 HEK293, по-видимому, имеют более сильный сигнал по сравнению с клетками отрицательного контроля HEK293 MOCK. Клетки hEK 293 HEK, по-видимому, имеют более специфическое пятнистое мечение клеток, в то время как клетки HEK-MOCK имеют неспецифический диффузный фон. По этой причине было представлено светлопольное изображение того же участка.
6. Ингибирование жизнеспособности антителами scFv-hERG1-D8Cys и тест сфероидов.
На этой стадии было дополнительно изучено потенциальное свойство scFv-hERG1-D8Cys ингибировать рост клеток на панели неопластических клеточных линий. Как показано на фиг. 5, значительное дозозависимое ингибирование пролиферации клеток наблюдалось для НСТ-116, MDA-MB 231, Mia Раса2, HEK 293 HERG1, PANC-1 и ВхРс3. Клетки обрабатывали с использованием моноклонального антитела против hERG1 (100 мкг/мл) и scFv-hERG1-D8Cys (10; 20 мкг/мл). Как и ожидалось, не было обнаружено существенного снижения жизнеспособности клеток в клетках HEK-MOCK, которые не экспрессируют hERG1.
Чтобы исследовать влияние scFv-hERG1-D8Cys на трехмерную клеточную модель, мы протестировали три различные концентрации scFv-hERG1-D8Cys (10; 20; 40 мкг/мл) на сфероидах.
На фиг. 6 показан график, демонстрирующий по оси Y объем сфероидов (мм3), тогда как по оси X сообщаются различные моменты времени (24 ч, 48 ч и 72 ч).
На фиг. 6 на панели А представлен график, полученный для сфероидов, полученных из HEK293hERG1. Объем сфероидов, обработанных 20 мкг/мл и 40 мкг/мл scFv-hERG1-D8Cys, меньше по сравнению с контролем в каждый момент времени.
Вместо этого на панели В показана кривая роста сфероидов HEK-MOCK, в которой не было обнаружено различий для обработанных сфероидов при всех трех протестированных концентрациях scFvhERG1-D8Cys по сравнению с контролем. Панели А и В также показывают репрезентативное изображение в светлом поле контрольных сфероидов HEK293-hERG1 и HEK-MOCK, соответственно, как они выглядят после 72-часового культивирования.
На панели С показано влияние, оказываемое на клетки протоковой аденокарциномы поджелудочной железы Mia Раса 2. Уменьшение объема сфероидов наблюдалось как для клеток, обработанных 20 мкг/мл, так и для 40 мкг/мл scFv-hERG1-D8Cys, с более выраженным эффектом, полученным при самой высокой тестируемой концентрации по сравнению с контролями, в каждый момент времени. Изображения, сделанные через 72 ч, показанные в правой части фигуры, показывают снимок контрольного сфероида Mia Раса 2, сделанный при 4-кратном увеличении; при этом на правом изображении показан снимок сфероида Mia Paca2, обработанного scFv-hERG1-D8Cys 40 мкг/мл, сделанный при 10-кратном увеличении. На самом деле, невозможно было получить снимки сфероидов Mia Раса 2 для контроля через 72 ч с 10-кратным увеличением, так как объем был слишком увеличен, чтобы обеспечить надлежащую фокусировку; в то время как сфероиды Mia Раса 2 через 72 ч, обработанные scFv-hERG1-D8Cys, можно визуализировать с использованием 10-кратного увеличения, поскольку их объем по сравнению с контролем сильно уменьшен.
На панели D показаны сфероиды MDA-MB 231: заметный эффект уменьшения объема наблюдается для всех трех концентраций scFv-hERG1-D8Cys (10, 20, 40 мкг/мл) по сравнению с контролем. Сделать вывод об уменьшении объема также можно сделать из изображений сфероидов MDA-MB 231, приведенных на правой стороне фигуры.
На фиг. 7 показаны результаты, полученные при анализе жизнеспособности клеток Calcein AM, проведенном на сфероидах через 72 ч. Зеленое окрашивание представляет живые клетки, в то время как красное окрашивание представляет мертвые клетки. Изображение слева (панель А) представляет собой изображения контроля для каждой клеточной линии, в то время как справа (панель В) есть изображения сфероидов, обработанных 40 мкг/мл scFv-hERG1-D8Cys. Из изображения можно отметить уменьшение объема для сфероидов, обработанных антителом, особенно для сфероидов Mia Раса 2, MDA МВ-231 и PANC-1 и, кроме того, увеличенное количество мертвых клеток, особенно для MDA МВ-231 и сфероидов PANC-1, обработанных scFv-hERG1-D8Cys.
- 9 045298
7. scDb-hERGl-βΙ.
Было разработано биспецифическое антитело (bsAb), содержащее одноцепочечное антитело, направленное против в1-интегрина (scFv-TS2/16) и scFv-hERG1-Cys или scFv-hERG1 (как описано выше).
Нуклеотидная последовательность, кодирующая домен VL TS2/16, представляет собой SEQ ID NO: 23; нуклеотидная последовательность, кодирующая домен VH TS2/16, представляет собой SEQ ID NO: 25 (см. фиг. 8); соответственно, аминокислотная последовательность VL TS2/16 является SEQ ID NO: 24, а аминокислотная последовательность VH TS2/16 является SEQ ID NO: 26.
Формат биспецифического антитела представляет собой одноцепочечное диатело (scDb), которое включает вариабельные домены (VH и VL) двух антител, связанных пептидными линкерами, как показано на фиг. 9. На верхней панели фигуры представлены два одноцепочечных антитела, анти-hERG1 scFv и анти-в1-интегрин TS2/16, scFv.
На нижней панели схематически представлена конечная структура биспецифического антитела антиhERG1-β1-интегрин, которая была собрана с использованием вариабельных доменов двух антител в следующем порядке: антитело VH scFv-hERG1 (SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 2), VL scFv-TS2/16 антитело (SEQ ID NO: 24), VH scFv-TS2/16 антитело (SEQ ID NO: 26), VL scFv-hERG1 антитело (SEQ ID NO: 4).
Антитело VL scFv-TS2/16 (SEQ ID NO: 24) и антитело VH scFv-TS2/16 (SEQ ID NO: 26) связаны пептидным линкером.
Антитело VH scFv-hERG1 (SEQ ID NO: 2 или 8) и антитело VL scFv-TS2/16 (SEQ ID NO: 24) связаны пептидным линкером.
Антитело VH scFv-TS2/16 (SEQ ID NO: 26) и антитело VL scFv-hERG1 (SEQ ID NO: 4) связаны пептидным линкером.
На 5' и 3' концах были вставлены сайты рестрикции FspI и AvrII (подчеркнуты ниже)
VLFspI:
AAAATGCGCAGACTACAAAGATATTGTGATGACACAGAC (SEQ ID No: 27)
VHAvrII:
GGGGCCTAGGATAGACAGATGGGGGTGTCGCGACACCCCCATCTGTCTAT (SEQ ID No: 28).
Следующая последовательность (SEQ ID NO: 29) является полной нуклеотидной последовательностью, кодирующей scDb-hERG1-e1 (SEQ ID NO: 30): при этом последовательность VH scFv-hERG1-Cys выделена серым цветом, последовательность VL scFv-TS2/16 выделена подчеркнутым курсивом, жирным шрифтом выделена последовательность линкера А, М, В, подчеркнутым жирным курсивом последовательность VH антитела scFv-TS2/16, подчеркнутым серым цветом последовательность scFv-hERG1-Cys.
Мус-метка отмечена жирным курсивом, а His-метка - подчеркнутым жирным шрифтом. Сайты рестрикции подчеркнуты.
- 10 045298
SEQ ID № 29:
GAGGCTGAGTGCGCAGACGAGGTCCAACTGCAACAGTCTGGACCTGAACTGG TGAAGCCTGGGGCTTCTGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCAGGATACACATTCACTG AATACACCGTTCACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAATGGATTGGA GGCATTAATCCTAATGGTGGTACTACCTATAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAC ATTGACTATTGACAAGTCCTCCAGCTCAGCCTTCATGGAGCTCCGCAGCCTGACATC TGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAACAGGTTGGGGACCTGACTACTGGGGCCA AGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACT GGCCCCTGGCTCGAGTGA TA TTGTGA TGACACAGACTCCAACCACCA TGGCTGCA TCTC CCGGGGACAAGA TCACTA TCACCTGCAGTGTCAGTTCAA TTA TAAGTTCCAATTACCTGCA TTGGTA TAGTCAGAAGCCAGGA TTCTCCCCTAAACTCTTGA TTTA TAGGACA TCCAA TCTG GCTTCTGGAGTCCCACCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACA A TTGGCACCA TGGAGGCTGAAGA TGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTTCTGA TATTC CACTCACGTTCGGTGA TGGGACCAAGCTGGACCTGAAACGGGCTGA TGCTGCACCAACT GTHTUCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGT GGAGGAGGAACCGAGGTGAAGGTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGG AGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATG TCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATAAGTAGT GGTGGTTCTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAG ACAAAGCCAAGAACACCCTGTATTTGCAAATGGGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGC CATGTATTACTGTACAAGAATAGGTTACGACGAAGATTATGCTATGGACCACTGGGGT CAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATAGTG CACTGGATATTGTGCTGACACAATCTCCACTCACTTTGTCGGTTAACATTGGTCAACC AGCCTCTATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATACTAATGGAAAAACCTA TTTTAATTGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGT GTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAG ATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATTTGGGAGTTTATTACTGCG CGCAAGGTACACATTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAAATCAAA CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAA GAGGArCrGAATGGGGCCCCTAGGCATCATCACCATCACCATCATCACTAATAG
Последовательность была клонирована с использованием сайтов рестрикции, указанных выше, в коммерчески доступный вектор pPIC9K (Life Technologies).
8. scDb-hERG1-Phe-e1: экспрессия и характеризация
Конструкция, экспрессирующая антитело против hERG1-Phe-e1-scDb, была клонирована в экспрессирующий вектор pPIC9K, который является вектором, подходящим для экспрессии в клетках дрожжей Pichia pastoris.
Штамм GS115 Pichia pastoris трансформировали в соответствии с протоколом сферопластирования, и 96 клонов подвергали скринингу на чашках с YPD-агаром, содержащих G418, для селекции. Шесть клонов затем индуцировали в небольшом масштабе и очищали с использованием шариков Sepharose Ni (GE Healthcare) с использованием гистидиновой метки, введенной с вектором pPIC9K. Окрашивание Кумасси показано на фиг. 11, панель А, и оно демонстрирует одну полосу, выделенную стрелкой, с молекулярной массой (около 60 кДа), совпадающей с ожидаемой для анти-hERG1-Phe-β1-scDb антитела, соответствующего клону G5.
Затем была проведена крупномасштабная экспрессия клона G5 анти-hERG1-Phe-β1-scDb, адаптирующая протокол индукции для больших объемов культуры.
Надосадочную жидкость, полученную из 1 л культуры клеток Pichia pastoris, очищали с использованием AKTA Pure (GE Healthcare). Результаты представлены на фиг. 11, на которой показана как хроматограмма, полученная в результате очистки антител (панель В), так и окрашивание Кумасси (панель С), где были проанализированы элюции, лежащие под синей областью. В соответствии с тем, что ожидалось, для каждого элюирования была обнаружена одна полоса, соответствующая очищенному антиhERG1-Phe-e1-scDb.
- 11 045298
AHTu-hERGl-ei-scDb фракции 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 18; 20 человек были собраны вместе и диализированы против PBS 1X. Таким образом, была начата детальная характеризация антитела.
Одной из важных стадий был выбор подходящей модели для тестирования анти-hERG1-Phe-β1scDb антитела. Таблица ниже суммирует профиль экспрессии, связанный с hERG1 и в1-интегрином для клеточных линий, выбранных для экспериментов по характеризации.
Таблица 4
Профиль экспрессии HEK 293 hERG1, HEK 293 WT и GD25, ________________относительно hERG1 и в1-интегрина________________
| ЭКСПРЕССИЯ HERG1 | Экспрессия βΐ-интегрина | |
| НЕК 293 HERG1 | + | + |
| НЕК 293 ДИКИЙ ТИП | - | + |
| GD25 | - | - |
BsAb сначала анализировали на клетках hEKG1 HEK 293, которые экспрессируют оба антигена hERG1 и β1. Проводили клеточный ELISA, результаты которого представлены на фиг. 12. Клеточный ELISA показал определенную дозозависимую пропорциональность для связывания с нативным антигеном, с более высоким OD450 для клеток, экспрессирующих оба антигена hERG1 и β 1, как и ожидалось.
Более того, биспецифическое антитело против hERG1-e1-scDb показало способность связывать антиген в нативных условиях, как и в случае антигена, эндогенно экспрессируемого клетками. Специфичность связывания анти-hERG1-Phe-β1-scDb биспецифического антитела также подтверждается сравнением одинакового количества (0,5 мкг) анти-hERG1-Phe-β1-scDb и анти-scFv-hERG1-Phe, которое является одним из двух одноцепочечных антител, которые образуют биспецифическое антитело. Фактически, сигнал, полученный после инкубации с анти-hERG1-Phe-β1-scDb, выше, чем сигнал, полученный с использованием анти-scFv-hERG1-Phe. Такой результат соответствует ожидаемому, поскольку сигнал, полученный с помощью анти-hERG1-Phe-β1-scDb, является результатом связывания обоих антигенов, hERG1 и β1; тогда как сигнал, полученный с использованием scFv-hERG1, является результатом только связывания с антигеном hERG1.
Также была оценена иммунореактивность анти-hERG1-Phe-β1-scDb антитела с помощью IF на клетках, выращенных на субстратах BSA (фиг. 13, панель А и В) и фибронектине (FN) (фиг. 13, панель С и D). Фактически было показано, что образование комплекса β1 усиливается FN-зависимой активацией интегрина. Как видно из фиг. 13, на панелях С и D, отображается сильный мембранный сигнал в клетках HEK293-hERG1, высеянных на фибронектине, из-за строгого комплексообразования. Сигнал был проанализирован с использованием программного обеспечения ImageJ, и результаты представлены на графике.
Чтобы дополнительно подтвердить доказательства, полученные из предыдущих экспериментов, было оценено связывание анти-hERG1-Phe-β1-scDb на клетках HEK293-hERG1, вводящих перед инкубацией антител избыток пептида S5PORO, на который было нацелено антитело scFv-hERG1. Как можно понять из фиг. 14, панели А и В, на клетках HEK293-hERG1, инкубированных с анти-hERG1-Phe-β1scDb, подтверждается сигнал благодаря связыванию как с hERG1, так и с β 1-интегрином. Панель С демонстрирует отрицательный контроль, тогда как панели D и Е демонстрируют результаты, полученные после инкубации с пептидом S5PORO; ясно видно, что происходит снижение сигнала, что соответствует ожидаемому. Фактически, клетки HEK293-hERG1, которые являются положительными по обоим антигенам, после инкубации с пептидом демонстрируют снижение интенсивности окрашивания, вероятно, изза насыщения сайтов связывания антигена hERG1; таким образом, сигнал, который является видимым, является сигналом, возникающим только в результате связывания с антигеном β1. Такие результаты суммированы на графике, полученном из количественного определения интенсивности флуоресценции с помощью ImageJ.
9. scDb-hERG1-Cys-e1: экспрессия и характеризация.
Конструкция, экспрессирующая антитело scDb-hERG1-Cys-e1, клонированное в экспрессирующий вектор pPIC9K, который является вектором, подходящим для экспрессии в клетках дрожжей Pichia pastoris, трансформированных в клетки дрожжей GS115.
Клоны, полученные в результате трансформации scDb-hERG1-Cys-e1, были подвергнуты скринингу в соответствии с протоколом, ранее описанным для антитела scDb-hERG1-Phe-e1.
Надосадочную жидкость, полученную из 1 л культуры клеток Pichia pastoris, очищали с использованием АКТА Pure (GE Healthcare). Результаты представлены на фиг. 15, на которой показаны как хроматограмма, полученная в результате очистки антител (панель А), так и окрашивание Кумасси (панель В). Элюции, соответствующие синей области, были проанализированы, и, в соответствии с тем, что ожидалось, для каждой элюции была обнаружена единичная полоса с молекулярной массой примерно
- 12 045298 кДа, соответствующая очищенному scDb-hERGl-Cys-βΙ.
После успешной очистки белка антитело было проверено на прямую иммунофлюоресценцию (IF) после прямой конъюгации с Alexa488. Результаты представлены на фиг. 16 для клеток GD25 WT, HEK 293 WT и HEK 293-hERG1. Изображения показывают, что клетки GD25 WT, панель А (отрицательные по экспрессии hERG1 и в1-интегрина), не демонстрируют значительного окрашивания после инкубации с антителом scDb-hERG1-Cys-e1, в то время как панель В показывает четкое мембранное окрашивание для клеток HEK 293-hERG1 (которые экспрессируют оба антигена), высеянные на фибронектин (FN), который усиливает образование комплекса hERG1-e1, с более высоким значением сигнала флуоресценции (~17 A.U.) по сравнению с клетками, посеянными на BSA, используемыми в качестве контроля (~10 A.U.). Панель С показывает флуоресцентное окрашивание, полученное на клетках HEK 293 WT (которые экспрессируют только в1-интегрин), показывая более высокие значения сигнала флуоресценции для клеток, посеянных на FN (~12 A.U.), по сравнению с клетками, посеянными на BSA (~7 A.U.). IC50 было определено для обеих клеточных линий, как показано на фиг. 17, панели А и В. Влияние на жизнеспособность клеток было очевидно при 24 мкг/мл для клеток PANC-1 и 42 мкг/мл для клеток MDA-MB 231. Такие результаты согласуются с паттерном экспрессии hERG1, экспрессия которого преобладает в клетках PANC-1, по сравнению с клетками MDA-MB 231.
Соответственно, было протестировано влияние scDb-hERG1-Cys-e1 на миграционное поведение раковых клеток посредством анализа латеральной подвижности. Эксперименты были выполнены на клетках MDA-MB 231, MDA-MB 231-hERG1, PANC-1 и НСТ116. Результаты представлены на графиках на Фиг. 18. Наблюдается явное снижение индекса подвижности (MI) в обработанных клетках по сравнению с контролем. Такой эффект более выражен в отношении MDA MB 231-hERG1 по сравнению с клетками MDA-MB 231, что свидетельствует о hERG1-зависимом влиянии антитела на миграцию клеток.
Обнадеживающие результаты были также получены на клетках PANC-1 и НСТ116 с уменьшением подвижности в обработанных клетках по сравнению с контролем.
Материалы и методы
10. Клонирование тяжелой и легкой цепи антитела к hERG1. Тяжелая и легкая цепь моноклонального антитела против hERG1 (hERG1-mAb) были выделены из кДНК, полученной из мРНК, очищенной из гибридом, выделяющих hERG1-mAb. Для амплификации областей VH и VL, были выбраны 5' праймер, который гибридизуется на каркасе 1 (FR1) вариабельного домена каждой цепи (прямой праймер), и праймер, который гибридизуется на константной области рядом с вариабельным доменом каждой цепи (обратный праймер). Для VL был разработан вырожденный праймер, который гибридизуется на каппалегкой цепи, поскольку это фенотип иммуноглобулина, более выраженный у мышей (Honjo and Alt, 1995). Тяжелую цепь (VH) антитела амплифицировали с помощью ПНР с использованием следующего набора праймеров:
degVH вперед, 5 'GAGGTCCARCTGCAACARTC 3' (SEQ ID NO: 11) и
IgG2 обратный, 5 'AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGG 3' (SEQ ID NO: 12) (Wang, 2000).
Следующий набор праймеров использовали для ПЦР-амплификации легкой цепи (VL) антитела: degVL (K), 5 'GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA 3' (SEQ ID NO: 13) и
K обратный, 5 'GGATACAGTTGGTGCAGCATC 3' (SEQ ID NO: 14) (Wang, 2000).
кДНК амплифицировали с использованием высококачественной ДНК-полимеразы Phusion® (реагенты Finnzymes). Условия проведения циклов: начальное плавление при 94°С в течение 2 мин, а затем 25 циклов трехступенчатой программы (94°С, 30 с; 56°С (VH); 48°С (VL), 1 мин и 72°С, 1 мин. Реакции затем проводили при 72°С в течение 10 мин и охлаждали до 4°С.
Фрагменты антител (VH и VL), выделенные из электрофореза в агарозном геле, очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR Purification (QIAGEN) и затем вставляли в вектор pCR™Blunt (Invitrogen), следуя инструкциям производителя. Рекомбинантную плазмиду секвенировали с помощью сервиса автоматического секвенирования ДНК (PRIMM).
Затем фрагменты VH и VL были клонированы в экспрессирующий вектор pHENIX, который содержит линкерную последовательность (Gly4Ser)3 между двумя различными сайтами клонирования. Были сконструированы праймеры с соответствующими сайтами рестрикции для клонирования фрагментов антител в вектор pHenIX.
Праймеры VL:
прямой VL-ApaLI, 5 'acgcgtgcactgGATATTGTGCTGACACAATCTCCA 3' (SEQ ID NO: 15); обратный VL-NotI, 5 'ataagaatgcggccgcGGATACAGTTGGTGCAGCATC 3' (SEQ ID NO: 16).
VH праймеры:
прямой VH-Salk, 5 'acgcgtcgacGAGGTCCAACTGCAACAGTC 3' (SEQ ID NO: 17);
обратный VH-XhoI, 5 'ccgctcgagccAGGGGCCAGTGGATAGACTGATGG 3' (SEQ ID NO: 18).
Продукты ПЦР расщепляли либо рестриктазами ApaLI и NotI (для VH), либо SalI и XhoI (для VL) (New England BioLabs) и лигировали в вектор pHENIX в совместимых сайтах клонирования. Гидролиз проводили 2 ч при 37°С. Чтобы избежать повторного лигирования совместимых концов, 5'-фосфатную группу удаляли с 5'-конца вектора, используя фосфатазу кишечника теленка (CIP) в соответствии со сле
- 13 045298 дующим протоколом: вектор pHENIX (50 нг/мкл), буфер 3 (New England BioLabs) 1X и CIP (0,5 ед./Мкг вектора). Реакцию дефосфорилирования инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Фосфорилированный вектор очищали с помощью набора для очистки QIAquick PCR (QIAGEN).
Лигирование между фрагментом scFv-hERG1 и pHENIX проводили в смеси буфера 2 (New England BioLabs) и лигазы Т4. В смеси для лигирования устанавливали соотношение вектор: scFv 1: 3 и 1:10, и проводили инкубацию 15 мин при 25°С.
мкл смеси для лигирования электропорировали в клетки Е. coli TOP10F' и НВ2151 (импульс 2500 мВ). Электропорированные клетки извлекали с помощью 450 мкл среды SOC (среда SOB с добавлением 1 мМ MgSO4, 1 мМ MgCl2) и инкубировали 1 ч при 37°С при встряхивании. Бактерии высевали в предварительно прогретые чашки с LB-агаром, содержащие антибиотик, и инкубировали крышкой вниз в течение ночи при 37°С.
11. Клонирование scFv-hERG1-G3 в экспрессирующий вектор pPIC9K.
Экспрессирующую кассету scFv-hERG1 клонировали в трансформирующий вектор pPIC9K (любезно предоставлен профессором Ermanno Gherardi, Университет Павии), который содержит метку 6xHis. Конструкцию scFv выделяли и амплифицировали из вектора pHENIX с помощью ПЦР с использованием праймеров, которые обеспечивают добавление сайтов рестрикции FspI и AvrII соответственно на 3' и 5' концах последовательности (прямой VH-FspI, AAAATGCGCAGAGGTCCAACTGCAACAGTC (SEQ ID NO: 19);
обратный VL-AvrII, GGGGCCTAGGGGATACAGTTGGTGCAGCATC (SEQ ID NO: 20)).
Вектор pPIC9 состоит из промотора АОХ1, терминатора транскрипции 3' АОХ1 (ТТ) и сайта мультиклонирования, в который вставлен чужеродный ген.
Экспрессирующую кассету разрезали с помощью FspI и AvrII и клонировали в pPIC9K, разрезанную с помощью рестриктаз Есо53К1 и AvrII (New England BioLabs).
12. Мутагенез scFv-hERG1
Мутагенез проводили на экспрессирующей кассете scFv-hERG1, клонированной в pPIC9K, с использованием набора для направленного мутагенеза QuikChange® XL (Stratagene, Agilent Technologies). Подходящие праймеры для введения аминокислоты Cys были сконструированы в соответствии с указаниями производителя и разработаны Primm Biotech, левый праймер: GGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAACAGGTTGGGGACCTG (SEQ ID NO: 21);
правый праймер: CAGGTCCCCAACCTGTTGCACAGTAATAGACTGCAGAATCC (SEQ ID NO: 22)).
Образец реакции готовили следующим образом: 5 мкл 10Х реакционного буфера; 1 мкл матрицы дцДНК scFv-hERG1 (13 нг/мкл); 1,84 мкл (125 нг) левого праймера; 1,84 мкл (125 нг) правого праймера; 1 мкл смеси dNTP; 3 мкл QuickSolution; 36, 32 мкл ddH2O. Затем добавляли 1 мкл ДНК-полимеразы PfUTurbo (2,5 Ед/мкл). Условия проведения циклов были скорректированы: начальное плавление проводили при 95°С в течение 1 мин, затем следовали 18 циклов трехступенчатой программы (95°С, 50 с; 60°С, 50 с и 68°С, 4 мин). Затем реакционную смесь выдерживали при 68°С в течение 7 мин и охлаждали до 4°С.
После реакции амплификации 1 мкл рестриктазы DnpI (10 Ед/мкл) добавляли непосредственно к реакционной смеси, которую инкубировали сразу после этого при 37°С в течение 1 ч для гидролиза первичного.
На этом этапе бактериальные ультракомпетентные клетки DH5a трансформировали тепловым шоком. Клетки осторожно размораживали на льду и 2 мкл ДНК, обработанной DpI, переносили в отдельную аликвоту 200 мкл ультракомпетентных клеток. Реакционную смесь инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем пробирку подвергали тепловому импульсу при 42°С в сухой бане в течение 45 с. Пробирку инкубировали на льду в течение 2 мин. Клетки извлекали с помощью 450 мкл среды SOC (среда SOB с добавлением 1 мМ MgSO4, 1 мМ MgCl2) и инкубировали 1 ч при 37°С при встряхивании. Бактерии высевали в предварительно нагретые чашки с LB-агаром, содержащие антибиотик ампициллин (50 мкг/мл), и инкубировали крышкой вниз в течение ночи при 37°С.
На следующий день выросло несколько колоний, и некоторые из них были отобраны, а ДНК была извлечена и секвенирована для проверки наличия желаемой мутации. Полученная конструкция была названа scFv-hERG1-Cys.
13. Экспрессия scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys в Pichia Pastoris.
Линеаризованные scFv-hERG1 и scFv-hERG1-Cys гидролизовали с помощью SalI и трансформировали в штамм Pichia Pastoris GS115 путем сферопластирования с образованием трансформантов Mut +. При трансформации мы сверялись с указаниями набора Pichia Expression Kit (Invitrogen).
Через пять дней после трансформации отдельные колонии были видны невооруженным глазом, 92 клона и 4 отрицательных контроля были отобраны и перенесены в три разных 96-луночных планшета с различной концентрацией G418: без G418, 5 мг/мл, 15 мг/мл. Селекцию G418 проводили с использованием характеристики, согласно которой pPIC9K содержит бактериальный ген канамицина, который придает устойчивость к Geneticin® в Pichia. Уровень устойчивости к Geneticin® приблизительно зависит от количества интегрированных генов канамицина. Одна копия pPIC9K, интегрированная в геном Pichia, придает устойчивость к Geneticin® до уровня ~0,25 мг/мл. Множественные интегрированные копии
- 14 045298 pPIC9K могут повысить уровень устойчивости к Geneticin® с 0,5 мг/мл (1-2 копии) до 4 мг/мл (7-12 копий). Из-за генетической связи между геном канамицина и кассетой экспрессии (оба под промотором РАОХ1) можно сделать вывод, что устойчивые к Geneticin® клоны содержат несколько копий представляющего интерес гена. По этой же причине экспрессия секретируемого белка может увеличиваться из-за эффекта дозы гена. Таким образом, присутствие pPIC9K использовалось в качестве инструмента для выявления трансформантов pPIC9K, которые содержат множество копий представляющих интерес генов, scFv-hERG1 и scFv-hERG1-Cys.
После двух дней роста при 30°С шесть наиболее выращенных клонов из чашек G418 с концентрацией 15 мг/мл отбирали и оценивали по их способности экспрессировать интересующий белок, создавая жидкую культуру небольшого масштаба, согласно протоколу набора Pichia Expression Kit (Invitrogen).
Образцы из культуры каждого клона собирали в разные моменты времени: 24 ч, 48 ч, 72 ч. После трех дней индукции 100% метанолом с 0,5% конечной концентрацией надосадочные жидкости собирали и тестировали с помощью блоттинга.
14. Слот-блот анализ.
Дрожжевые надосадочные жидкости собирали и тестировали на экспрессию белка с помощью блоттинга; 200 мкл каждой надосадочной жидкости наносили на PVDF-мембрану (Amersham), помещенную в устройстве слот-блоттинга, между двумя квадратами ватмановской бумаги 3 мм. Образцы оставляли в инкубаторе на 15 мин, затем для сушки образцов применяли вакуум. Мембрану извлекали и промывали T-PBS. Блокирование осуществляли с помощью T-PBS 5% BSA в течение 45 мин, а затем промывали 10 мин с помощью T-PBS. Мембрану инкубировали в течение 1 ч с конъюгированным антителом против 6xHis-HRP (Sigma), разведенным 1: 2000, в 15 мл Т-PBS 5% BSA.
15. Очистка на Ni-сефарозе.
Надосадочные жидкости, полученные при скрининге клонов после дрожжевой трансформации, инкубировали в течение ночи перемешивая с Ni Sepharose 6 Fast Flow (Ge Healthcare) в соответствии с инструкциями производителя. После этого проводили две стадии промывания с помощью 500 мкл промывочного буфера (20 мМ фосфата натрия, 500 мМ NaCl, pH 7,3) и проводили элюирование с использованием 250 мкл буфера для элюции (20 мМ фосфата натрия, 500 мМ имидазола, рН 7,3).
16. Очистка АКТА.
Очистку 1 литра дрожжевой надосадочной жидкости scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys, соответственно, выполняли с помощью аффинной хроматографии с использованием системы очистки белка АКТА (Ge Healthcare Life Sciences) с колонками HisTrap HP 1 мл. Стадии промывки и уравновешивание выполняли в соответствии с инструкциями производителя, используя промывочный буфер (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, pH 7,3); элюирование проводили с использованием линейного градиента буфера для элюции (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, рН 7,3). Анализ проводили с использованием программного обеспечения UNICORN 7.0.
17. Гель-фильтрация.
Образцы, полученные в результате очистки обоих антител, подвергали гель-фильтрации с использованием Superdex 75 HR 10/30 (Ge Healthcare Life Sciences). Состав промывочного буфера (20 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,3) регулировали для оптимизации условий протокола. Элюции анализировали с помощью SDS-PAGE.
18. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).
Каждый образец наносили с одинаковым объемом 15 мкл на стекинг- гель (400 мкл акриламида (40%) - бисакриамида (0,8%), 1 мл 0,5 М Трис-HCl, рН 6,8, 40 мкл 10% SDS, 20 мкл 10 % персульфата аммония, 4 мкл ТЕМЕД, 2,54 мл Н2О). Стекинг гель добавляли на разделяющий гель (2,6 мл акриламида (40%) - бисакриамида (0,8%), 1,75 мл, 1,5 М трис-HCl, рН 8,8, 70 мкл 10% SDS, 35 мкл 10% персульфата аммония, 3,5 мкл TEMED, 2,55 мл Н2О). Электрофоретический прогон проводили при 150 В. Гели окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым или переносили на мембраны из PVDF для вестерн-блоттинга для оценки присутствия белка (около 30 кДа).
19. Вестерн-блоттинг.
После SDS-PAGE гели переносили на мембрану PVDF (Amersham) в буфере для переноса (14,4 г, 3,03 г TrisHCl, 200 мл метанола, 800 мл Н2О) при 100 В в течение одного часа. Мембраны отмывали в TPBS (PBS 0,1% Tween) и затем блокировали T-PBS 5% BSA в течение ночи. Мембраны подвергали воздействию первичного антитела, связанного с перекисным окислением (Sigma), разведенного в T-PBS 5% BSA в течение одного часа при комнатной температуре. После трехкратной промывки мембран в течение десяти минут сигналы визуализировали с использованием реагента ECL (Amersham).
WB выполняли, используя следующие антитела: anti-myc (1: 1000) и антитело против 6xHis-HRP (Sigma).
20. Количественная оценка scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys, анализ ELISA и анализ Biacore.
scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys собирали вместе и диализовали против PBS 1X с использованием диализных кассет Slide-A-Lyzer ™ (Thermo Fisher). Измеряли поглощение белка при 280 нм и применяли уравнение Ламберта-Бера.
- 15 045298
Чтобы оценить, обладают ли два сконструированных антитела, scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1D8Cys, способностью связывать антиген, а затем исследовать различную аффинность двух антител, анализы ELISA проводили с использованием планшетов, покрытых пептидом S5-поры (последовательность: EQPHMDSRIGWLHN), на который нацелено антитело. Этот пептид такой же, какой мы использовали для скрининга анти-hERG1 А7-антитела.
21. Мечение антител с помощью Alexa 488.
scFv-hERG1-G3 и scFv-hERG1-D8Cys были конъюгированы с помощью набора для мечения белков Alexa Fluor® 488 Microscale Protein Labeling Kit (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с указаниями протокола.
22. Иммунофлуоресценция на фиксированных клетках.
HEK 293 hERG1 (HEK293, стабильно трансфицированные конструкцией кДНК pcDNA3.1-hERG1) и HEK-MOCK (HEK 293, стабильно трансфицированные кДНК pcDNA 3.1), выращивали в среде DMEM с 10% сывороткой FBS EU в инкубаторе при 37°С с 5% СО2. Клетки высевали на ночь на стеклянные покровные стекла и затем один раз промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 мин при комнатной температуре. Блокирование осуществляли с помощью 10% BSA в течение 2 ч при комнатной температуре. Инкубацию антител проводили с использованием scFv-hERG1-G3, scFv-hERG1D8Cys, разбавляли 1:20 в блокирующем растворе и инкубировали в течение 2 с половиной часов с последующей инкубацией против His (1: 250; Abcam) в течении ночи в блокирующем растворе. На следующий день клетки трижды промывали PBS и инкубировали с антителом с Alexa488 против мышиных антител (Invitrogen) в течение 1 ч.
При этом scFv-hERG1-G3-Alexa488 и scFv-hERG1-D8Cys-Alexa488, разведенные 1:20 в блокирующем растворе, инкубировали в течение ночи при 4°С.
Для выявления клетки инкубировали с Hoechst (1: 1000) в течение 30 мин и затем заключали в пропилгаллат. Клетки визуализировали на конфокальном микроскопе (Nikon, С1).
Иммунофлуоресцентное количественное определение проводили с использованием программного обеспечения ImageJ: для каждого изображения выполняли измерение трех различных областей и вычисляли среднее значение.
23. Иммунофлуоресценция на живых клетках.
Клетки выращивали в течение ночи на 60 мм чашках (Sarstedt) с использованием кольца агарозы (15 г/л), чтобы изолировать клетки и минимизировать объемы реагентов, необходимые для инкубации. Клетки инкубировали с scFv-hERG1-G3-Alexa488 и scFv-hERG1-D8Cys-Alexa488, разведенными 1:20 в полной культуральной среде в инкубаторе при 37°С с 5% СО2 в течение 4 ч. Выравнивание было выполнено с использованием Hoechst, как описано ранее. Клетки визуализировали с помощью инвертированной световой микроскопии (Nikon, Eclipse TE300).
24. Жизнеспособность клеток.
Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа с трипановым синим; кратко клетки НСТ116, MDA-MB231, MIA PACA2, HEK293 hERG1, HEK-MOCK, FLG 29.1, PANC-1, ВХРС3 при плотности 5 χ 103 клеток/лунку высевали в 96-луночный планшет. Через 24 ч среду заменяли на 100 мкл свежей среды, содержащей различные концентрации антитела scFv-hERG1-D8Cys (10 мкг/мл и 20 мкг/мл). Полный иммуноглобулин, моноклональное антитело против hERG1, тестировали в концентрации 100 мкг/мл. Клетки культивировали 24 ч в увлажненном инкубаторе при 37°С и 5% СО2. После обработки клетки отделяли и подсчитывали жизнеспособные клетки. Эксперименты проводились в трех повторах.
25. 3D-культура сфероидов и тест scFv-hERG1 на сфероидах.
HEK-293 hERG1, HEK-MOCK, MDA-MB231, MIA PACA2 и PANC-1 высевали в 96-луночный планшет с плотностью 103 клеток/лунку для каждой лунки на 1,5% агарозном базовом слое. 100 мкл свежей среды добавляли в каждую лунку и клетки оставляли расти в течение 72 ч в инкубаторе при 37°С с 5% СО2. Через 72 ч сфероиды становились видными, и среду заменяли на 100 мкл свежей среды, содержащей различные концентрации антитела scFv-hERG1-D8Cys (10 мкг/мл, 20 мкг/мл и 40 мкг/мл).
Снимки были сделаны с использованием Nikon, Eclipse ТЕ300 каждые 24 ч до 72 ч, когда был проведен анализ жизнеспособности клеток Calcein AM.
Объем сфероидов оценивали, анализируя снимки, сделанные через 24 ч, 48 ч и 72 ч с использованием программного обеспечения MATLAB.
Эксперимент проводился в трех повторах.
26. в1-интегрин mAb: обратная транскрипция РНК.
РНК TS2/16 и BV7 подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием олиго (dT) праймеров (Invitrogen) и обратной транскриптазы Superscript® II (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя в общем объеме 40 мкл.
- 16 045298
| Компонент РНК | Концентрация стока | Конечная концентцация 100 | Количество 4 мкг |
| нг/мкл | |||
| Олиго (дТ) 12-18 | 500 мкг/мл | 25 мкг/мл | 2 мкл |
| dNTPmix | 10 мМ каждый | 0,5 мм | 2 мкл |
| Н2О категории ПНР | — | — | 18 мкл |
Смесь инкубировали в ПЦР-амплификаторе при 65 °С в течение 5 мин, а затем быстро охлаждали на льду и добавляли следующие компоненты:___________________________________________
| Компонент 5х буфер первой нити | Стоковая концентрация 5х | Конечная концентрация 1х | Количество 8 мкл |
| Н2О категории ПНР | — | — | 6 мкл |
Затем смесь нагревали при 42°С в течение 2 минут после чего добавляли фермент: Компонент Концентрация стока Конечная Количество концентрация
SuperScript ™ II RT 200 Ед/мкл 5 Ед/мкл 2 мкл
Смесь (40 мкл) затем инкубировали при 42°С в течение 50 мин и затем реакционную смесь инактивировали при 70°С в течение 15 мин.
27. в1-интегрин mAb: выделение вариабельных доменов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Для выделения вариабельных доменов антител (VL и VH) проводили ПЦР с праймерами, описанными в Wang et al. (2000) с изменениями (табл. 2).
Таблица 2
Праймеры, используемые для выделения вариабельных доменов VL и VH, из Wang et al., (2000) с модификациями
| Каппа легкая цепь | Название учебника | Последовательность |
| Прямой праймер | ' degKappadir ' GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ Ш No: 31) | |
| Обратный праймер | Kapparev | GGATACAGTTGGTGCAGCATC (SEQ ID No: 32) |
| Тяжелая цепь | Название | Последовательность |
| Прямой | degHldir | CAGGTTACTCTGAAAGWGTSTG (SEQ ID No: 33) |
| Прямой | degH2dir | GAGGTCCARCTGCAACARTC (SEQ ID No: 34) |
| Прямой | degH3dir | CAGGTCCAAACTUCAGCARCC (SEQ ID No: 35) |
| Прямой | degH4dir | GAGGTGAASSTGGTGGAATC (SEQ ID No: 36) |
| Прямой | degH5dir | GATGTGAACTTGGAAGTGTC (SEQ ID No: 37) |
| Обратный праймер | IgGlrev | GGAAGATCTATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (SEQ ID No: 38) |
Существует два класса легких цепей: каппа и лямбда; но поскольку 95% антител мыши имеют легкую цепь каппа (Honjo and Alt, 1995), были выбраны праймеры, специфичные для легкой цепи каппа, игнорирующие лямбда-тип. Прямые праймеры конструировали с использованием выравнивания белковой последовательности Framework1 (FRW1) каждой вариабельной области цепи. Обратные праймеры конструировали в константной области (СН1) рядом с концом вариабельного домена каждой цепи (легкая цепь каппа или тяжелая цепь IgG1). Для легкой цепи каппа использовали только одну пару праймеров, тогда как для тяжелой цепи были использованы 5 пар праймеров, составленных из IgG1rev в комбинации с 5 прямыми праймерами.
Для выделения VH как TS2/16, так и BV7 была выбрана пара праймеров IgG1rev-degH4dir.
Чтобы предотвратить мутацию, вызванную ДНК-полимеразой, были использованы ДНКполимераза высокой точности с корректирующей активностью: ДНК-полимераза KOD Hot Start (Novagen) с использованием следующего протокола:
- 17 045298
| Компонент Юх буфера | Запас концентрации Юх | Конечная концентрация 1х | Сумма 5 мкл |
| MgSO 4 | 25 мм | 1,5 мм | 3 мкл |
| dNTP | 2 мМ каждый | 0,2 мМ каждый | 5 мкл |
| Прямой праймер | 10 мкМ | 0,3 мкл | 1,5 мкл |
| Обратный праймер | 10 мкМ | 0,3 мкл | 1,5 мкл |
| ДНК | — | — | 10 иг |
| ДНК-полимераза для горячего старта KOD 1 Ед/мкл | 0.02 Ед/мкл | 1 мкл | |
| Н2О категории ПЦР — | — | до 50 мкл |
Смесь инкубировали в ПЦР-амплификаторе по следующему протоколу:
| Стадия 1 | Температура 95 °C | Время 2 мин |
| 2 | 95°С | 20 сек |
| 3 | 54 °C (VH) или 46 °C (VL) | 10 сек |
| 4 | 70°С | 10 сек |
| 5 | 70°С | 5 минут |
Стадии 2-4 повторяли 30 раз.
28. в1-интегрин mAb: клонирование вариабельных доменов без применения рестриктаз Для последовательности VH и VL вариабельные домены клонировали без применения рестрикционных ферментов в векторе, подходящем для секвенирования ДНК Мы использовали наборы TA-Cloning Kit или ZeroBlunt Cloning Kit (Invitrogen), следуя инструкциям производителя.
Электрофорез ДНК и очистка из агарозового геля.
ДНК-электрофорез использует электрическое поле для перемещения отрицательно заряженной ДНК к положительному электроду через матрицу из агарозного геля. Продукты ПЦР и расщепленную рестриктазой ДНК обрабатывали на агарозном геле (1,5% агарозы в буфере ТАЕ (трис, уксусная кислота, EDTA)), окрашенном бромидом этидия, вместе с маркером 21og DNA ladder (NEB) для разделения фрагментов разного размера. Электрофорез проводился при 100 В. Таким образом, представляющая интерес полоса была удалена из геля чистым скальпелем и очищена с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick (QIAGEN), следуя инструкциям производителя. Очищенную ДНК элюировали с помощью 30 мкл Н2О для ПНР.
Сплайсинг с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами (SOE-PCR) ScFv-конструкцию собирали путем сплайсинга с помощью ПЦР с удлинением внахлест (SOE-PCR) в порядке VL-линкер-VH, используя праймеры, описанные в (Wang et al 2000) с модификациями (табл. 3). Полипептидный линкер, соединяющий вариабельные домены, конструировали в виде четырех GGGGS-повторов.
Табл. 3 Праймер предназначен для сборки конструкции VL-линкер-VH с помощью SOE-PCR (VLREVSOE и VHFORSOE) и клонирования последовательности в вектор pHenIX (VLFORSFI и VHREVNOT) или в вектор scFv-hERG-pHenIX (VLFORXHO и VHREVAPALI). Курсивом обозначены участки праймеров, отжигающиеся на матрице, последовательности, добавленные для клонирования конструкции в рамке с экспрессирующей кассетой в pHenIX или в векторе scFv-hERG1-pHenIX выделены серым цветом, подчеркнуты сайты рестрикции, серое - последовательности, добавленные для облегчения гидролиза ферментами, и полужирный шрифт представляет последовательности, которые перекрываются в SOE-PCR.
- 18 045298
Таблица 3
| Название | Последовательность |
| VLFORSFI | |
| VLREVSOE | GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAA CCACCACCACCGGATACAGTTGGTGCAGCATC |
| VHFORSOE | GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAG GTGAAGGTGGTGGAATC (SEQ ID No: 41) |
| VHREVNOT | |
| VLFORXHO | |
| VHREVAPALI |
Протокол состоит из двух стадий, описанных на фиг. 10. Первая стадия позволяет добавить: на 3'конце VL последовательность, которая кодирует первые три GGGGS-повторов линкера, а на 5'-конце VH последовательности, которая кодирует последние два GGGGS-повтора линкера. На этой стадии также будут присоединены на 5'-конце VL и на 3'-конце VH сайты рестрикции, которые будут использоваться для клонирования конструкции VL-линкер-VH в экспрессирующем векторе. Вторая стадия позволяет объединить два продукта ПЦР благодаря перекрывающимся последовательностям (15 п.н.) на 3'-конце VL и на 5'-конце VH.
На первой стадии были проведены две параллельные ПЦР:
одна с парой праймеров VLFORSFI-VLREVSOE и матрицей pCRII-VL; и другая с парой праймеров VHFORSOE-VHREVNOT и матрицей pCRII-VH.
Протокол ПЦР с использованием ДНК-полимеразы KOD проводили, как описано ранее.
На второй стадии мы рассчитали SOE-PCR, используя в качестве матрицы 1 мкл каждой реакции
ПЦР, проведенной на первой стадии, и , пару праймеров VLFORSFI- VHREVNOT, следуя протоколу ниже.
| Компонент Юх буфера | Стоковая концентрация Юх | Конечная концентрация 1х | Сумма 5 мкл |
| MgSO 4 | 25 мм | 1,5 мм | 3 мкл |
| dNTP | 2 мМ каждый | 0,2 мМ каждый | 5 мкл |
| праймер VLFORSFI | 10 мкМ | 0,3 мкл | 1,5 мкл |
| праймер VHREVNOT | 10 мкМ | 0,3 мкл | 1,5 мкл |
| ПЦР ВЛ (ШАГ 1) | — | — | 1 мкл |
| ПЦР VH (СТАДИЯ 1) | — | — | 1 мкл |
| ДНК-полимераза для горячего старта KOD 1 Ед/мкл | 0,02 Ед/мкл | 1 мкл | |
| Н2О категории ПЦР — | — | до 50 мкл |
Смесь (50 мкл) инкубировали в ПЦР-амплификаторе в соответствии с протоколом ниже.
| Стадия 1 | Температура 95 °C | Время 2 мин |
| 2 | 95°С | 20 сек |
| 3 | 70°С | 10 сек |
| 4 | 70°С | 10 сек |
| 5 | 70°С | 5 минут |
Стадии 2-4 повторяли 30 раз.
29. Получение и характеристика антитела против hERG1-e1 с одной цепью (scDb) - scDb-hERG1-e1.
Конструкцию hERG1-31-scDb трансформировали в штамм GS115 Pichia pastoris в соответствии с ранее описанной методикой сферопластирования, и белок экспрессировали и очищали с использованием протокола экспрессии и очистки, ранее описанного для антител scFv-hERG1 и scFv-hERG1-Cys.
- 19 045298
Клеточный ELISA.
Клеточный ELISA на живых клетках проводили согласно Sette et al., (2013). Клетки HEK 293 WT (hERG1-/e 1+) и HEK 293-hERG1 (hERG1+/e 1+) высевали до полуконфлюентности в 96-луночном планшете в DMEM плюс 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% СО2. После трех промывок PBS анти-hERG1-β1-scDb разводили в различных концентрациях в культуральной среде и добавляли к клеткам в течение двух 2 часов при комнатной температуре. Следующие стадии были такими же, как описано выше.
Иммунофлуоресценция (IF).
IF проводили в соответствии с протоколом, который был описан ранее. Покровные стекла покрывали BSA и фибронектином в течение двух часов. IF выполняли на клетках HEK 293 WT (hERG1-/e 1+), HEK 293-hERG1 (hERG1+/e 1+) и GD25 WT (hERG1-/e1-).
30. Получение и предварительная характеристика анти-hERG1-β1 одноцепочечного диатела (scDb) - scDb-hERG1-Cys-e1- антитела.
Мутагенез scDb-hERG1-e1.
Мутагенез проводили на экспрессирующей кассете scDb-hERG1-e1, клонированной в pPIC9K, с использованием набора для направленного мутагенеза QuikChange® XL (Stratagene, Agilent Technologies). Подходящие праймеры для введения аминокислоты Cys были сконструированы в соответствии с указаниями производителя и разработаны Primm Biotech, левый праймер: GGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAACAGGTTGGGGACCTG (SEQ ID NO: 21);
правый праймер: CAGGTCCCCAACCTGTTGCACAGTAATAGACTGCAGAATCC (SEQ ID NO: 22)).
Образец реакции готовили следующим образом: 5 мкл 10Х реакционного буфера; 1 мкл матрицы дцДНК scFv-hERG1 (13 нг/мкл); 1,84 мкл (125 нг) левого праймера; 1,84 мкл (125 нг) правого праймера; 1 мкл смеси dNTP; 3 мкл QuickSolution; 36, 32 мкл ddH2O. Затем добавляли 1 мкл ДНК-полимеразы PfuTurbo (2,5 Ед/мкл). Условия проведения циклов были скорректированы: начальное плавление проводили при 95°С в течение 1 мин, затем следовали 18 циклов трехступенчатой программы (95°С, 50 с; 60°С, 50 с и 68°С, 4 мин). Реакционную смесь затем выдерживали при 68°С в течение 7 мин и охлаждали до 4°С.
После реакции амплификации 1 мкл рестриктазы DnpI (10 Ед/мкл) добавляли непосредственно к реакционной смеси, которую инкубировали сразу после этого при 37°С в течение 1 ч для гидролиза родительского раствора. В этот момент бактериальные ультра компетентные клетки DH5a трансформировали с помощью теплового шока. Клетки осторожно размораживали на льду и 2 мкл ДНК, обработанной DpI, переносили в отдельную аликвоту 200 мкл ультракомпетентных клеток. Реакционную смесь инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем пробирку подвергали тепловому импульсу при 42°С в сухой бане в течение 45 с. Пробирку инкубировали на льду в течение 2 мин. Клетки извлекали с помощью 450 мкл среды SOC (среда SOB с добавлением 1 мМ MgSO4, 1 мМ MgCl2) и инкубировали 1 ч при 37°С при встряхивании. Бактерии высевали в предварительно нагретые чашки с LB-агаром, содержащие антибиотик ампициллин (50 мкг/мл), и инкубировали крышкой вниз в течение ночи при 37°С.
На следующий день выросло несколько колоний, и некоторые из них были отобраны, а ДНК была извлечена и секвенирована для проверки наличия желаемой мутации. Полученную конструкцию назвали scDb-hERG1-Cys-e1.
Экспрессия и очистка антитела scDb-hERG1-Cvs-e1.
scDb-hERG1-Cys-e1 трансформировали в дрожжевом штамме GS115 Pichia Pastoris в соответствии с ранее описанной методикой сферопластирования, а белок экспрессировали и очищали с использованием протокола экспрессии и очистки, ранее описанного для антител scFv-hERG1 и scFv-hERG1-Cys. с использованием AKTA Pure (Ge Healthcare). Хроматограммы анализировали с использованием программного обеспечения Unicorn 7.0.
Иммунофлуоресценция (IF).
IF проводили соответствии с протоколом, который был описан ранее. Покровные стекла покрывали BSA и фибронектином в течение двух часов. IF выполняли на клетках GT25 WT (hERG1-/e 1-), HEK 293 WT (hERG1-/e 1+), HEK 293-hERG1 (hERG1+/e 1+) в соответствии с ранее описанным протоколом. IF выполняли с использованием scDb-hERG1-Cys-e1, конъюгированного с флуорофором Alexa488.
Анализ жизнеспособности.
Клетки PANC-1 (аденокарцинома протоков поджелудочной железы) и клетки MDA-MB 231 (рак молочной железы) высевали при 5x105 в 96-луночные планшеты и давали расти в течение ночи. На следующий день клетки обрабатывали scDb-hERG1-Cys- β1 в разных разведениях (0, 10, 20, 40, 100 мкг/мл) и инкубировали с антителом в течение 24 ч. Каждое условие было выполнено в трех повторах.
После инкубации клетки отделяли и подсчитывали, для определения IC50 применяли программное обеспечение Origin.
3D-сфероиднαя культура.
103 клетки PANC-1 и MDA-MB 231 высевали на агарозный базовый слой (1,5 г/л) в 96-луночный планшет и выращивали в течение 72 ч в увлажненном инкубаторе при 37°С и 5% СО2. Затем вводили
-
Claims (21)
- scDb-hERGl-Cys-βΙ (40 мкг/мл), разведенную в культуральной среде, в то время как свежую среду без антител добавляли в лунки, содержащие клетки, обработанные как отрицательные контроли. Фотографии получали через 24 ч для мониторинга роста клеток с помощью микроскопа Nikon, Eclipse TE300.Анализ латеральной подвижности.Клетки высевали в чашки Петри диаметром 35 мм при начальной плотности 5x105 и оставляли на 24 ч.Латеральная подвижность оценивалась с помощью однослойного раневого анализа (Silletti et al, 1995; Peck and Isacke, 1996). Ширина раны определялась сразу после этого (0 ч) путем измерения ширины раны в 45 фиксированных точках.Клеточную подвижность определяли количественно как индекс подвижности (MI), определяемый следующим образом:MI=l-(Wt/Wo)MI=0 указывает на отсутствие движения клеток, тогда как значения MI=1 указывают на полное закрытие раныБиораспределение антител scFv-hERG1-D8Cys и scDb-hERG1-Cys-e1.160 мкг каждого антитела инъецировали двум мышам Balb/c, в.в. Образцы крови отбирали у каждой мыши в разные моменты времени после в.в.: 5, 10, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 6 ч, 24 ч после инъекции. Образцы крови обрабатывали и выделяли плазму. ELISA-тест на образцах плазмы проводили в соответствии с протоколом, ранее описанным в этом разделе, t1/2 рассчитывали с использованием программного обеспечения Precise PK Pharmacokinetic.ЭКГ-измерения.Измерения ЭКГ выполняли до введения антител и непрерывно после в.в. инъекции антитела в течение 15 мин.Эксперименты in vivo.Анализ in vivo.Мечение scFv-hERG1-D8Cys с помощью Alexa 750: 150 мкг scFv-hERG1-D8Cys в концентрации 2 мг/мл в растворе PBS и 0,1 М буфера бикарбоната натрия, рН 8,3, инкубировали в течение 1 ч при 22°С при перемешивании с 12 мкл сложного эфира Alexa Fluor® 750 NHS (сукцинимидиловый эфир) (Thermo Fisher Scientific), ресуспендировали в DMSO в концентрации 10 мг/мл. Реакцию блокировали в течение 5 мин на льду, и меченый белок очищали с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке с сефадексом G25 (Sigma), уравновешенной PBS.Визуализация in vivo. Трем шести недельным иммунодефицитным бестимусным самкам Nude-Foxnl nu/nu вводили внутривенно 50 мкл (1 нм краситель/мышь) scFv-hERG1-D8Cys, меченных флуорофором Alexa 750, и измеряли флуоресценцию через 5, 10, 60 мин и 24 ч после введения антитела. Одну контрольную мышь обрабатывали стерильным раствором PBS. Все спектры флуоресцентной эмиссии были измерены с использованием фотонного томографа (Biospace Lab). В тепловизоре был лазерный источник для возбуждения флуоресценции (=679 нм), эмиссионный фильтр (=702 нм) для обнаружения флуоресценции и компьютер для анализа данных.Мышиная модель: клеточную линию MIAPaCa-2 использовали для имплантации опухолевых клеток, как описано в Lastraioli et al., 2015. Клетки культивировали в DMEM с добавлением L-глутамина (4 мМ), 10% эмбриональной бычьей сыворотки и генетицина (G418) (2,4 мг/мл) (Gibco) при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО2. Клетки MIAPaCa-2-luc инъецировали в поджелудочную железу мышей nu/nu, и животных контролировали (как описано в [17]), и через 45 дней после клеточного инокулята мышам вводили антитело scFv-hERG1-D8Cys-Alexa750.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Биспецифическое анти-hERG1 и анти-в1-интегрин антитело (Ab), содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) из анти-hERG1 антитела, которые связывают внеклеточный домен S5-P hERG1 и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) из анти- в1-интегрин антитела, которые связывают внеклеточный домен β1 интегрина, где вариабельный домен тяжелой цепи (VH) анти-hERG1 антитела имеет SEQ ID NO: 8, где остаток в положении 95 является Cys; вариабельный домен легкой цепи (VL) анти-hERG1 антитела имеет SEQ ID NO: 4; вариабельный домен (VH) тяжелой цепи анти-в1-интегрин антитела имеет SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 46, а вариабельный домен легкой цепи (VL) анти-в1-интегрин антитела имеет SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 48.
- 2. Биспецифическое антитело по п.1 имеет формат, выбранный из группы, состоящей из тандемных scFv, формата диатела, одноцепочечных диател, тандемных диател (TandAb) и переориентирующихся молекул с двойной аффинностью (DART).
- 3. Биспецифическое антитело по п.2, включающее первый вариабельный домен (VH) тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, где остаток в положении 95 представляет собой Cys, и первый домен VL, имеющий SEQ ID NO: 4, и второй домен, имеющий VH SEQ ID NO: 26, и второй домен VL, имеющий SEQ- 21 045298ID NO: 24.
- 4. Биспецифическое антитело по п.3, где домены собраны в следующем порядке: домен VH антиhERG1-Cys, связанный первым линкером с доменом VL анти-в1-интегрин, связанным вторым линкером с доменом VH анти-в1-интегрин, связанным третьим линкером с доменом VL анти-hERG1-Cys.
- 5. Молекула анти-hERG1 антитела (Ab), содержащая вариабельный домен (VH) тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 8, где остаток в положении 95 представляет собой Cys, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий SEQ ID NO: 4, где указанная молекула обладает специфичностью в отношении внеклеточного домена S5-P hERG1.
- 6. Молекула анти-hERG1 антитела по п.5, которая представляет собой полностью гуманизированное рекомбинантное антитело, scFv, Fab, Fv-форму простой цепи scFv, диатело, триатело, минитело или антитело фагового дисплея.
- 7. Молекула анти-hERG1 антитела по п.6, которая представляет собой ScFv, в котором VH и VL связаны пептидным линкером.
- 8. Биспецифическое антитело по п.4 или молекула анти-hERG1 антитела по п.7, где линкерами являются мотивы (Gly4Ser)3.
- 9. Молекула анти-hERG1 антитела по любому из пп.5-8, имеющая SEQ ID NO: 10.
- 10. Ahtu-OERGI конъюгат, содержащий молекулу анти-hERG1 антитела по любому из пп.5-9, которая помечена флуорофором или радионуклидом.
- 11. Применение биспецифического антитела по любому из пп.1-4 и 8, или молекулы антитела по любому из пп.5-9, или конъюгата по п.10 в качестве лекарственного средства.
- 12. Применение биспецифического антитела по любому из пп.1-4 и 8, или молекулы антитела по любому из пп.5-9, или конъюгата по п.10 в качестве диагностического средства
- 13. Применение по п.11 или 12, где биспецифическое антитело, или молекула антитела, или конъюгат предназначены для применения при лечении или диагностике всех тех патологий, которые характеризуются сверхэкспрессией или неправильной экспрессией белка hERG1, предпочтительно опухолей, неврологических заболеваний, эндокринных заболеваний и нейроэндокринных заболеваний.
- 14. Фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело по любому из пп.1-4 и 8 или молекулу анти-hERG1 антитела по любому из пп.5-9 или конъюгат по п.10 и, по меньшей мере, другой фармацевтически приемлемый ингредиент.
- 15. Последовательность нуклеотидов, кодирующих биспецифическое антитело по любому из пп.1-4 и 8 или молекулу антитела по любому из пп.5-9.
- 16. Экспрессирующий вектор, содержащий последовательность нуклеотидов по п.15.
- 17. Экспрессирующий вектор по п.16, где вектор является плазмидой.
- 18. Генетически модифицированный микроорганизм для экспрессии биспецифического антитела по любому из пп.1-4 и 8, или молекулы анти- hERG1 антитела по любому из пп.5-9, содержащий экспрессирующий вектор по любому из пп.16-17.
- 19. Микроорганизм по п.18, который представляет собой клетку.
- 20. Набор для диагностики in vitro, содержащий части для одновременного, раздельного или последовательного применения, указанный набор применяется при диагностике патологий, характеризующихся сверэкспрессией или неправильной экспрессией белка hERG1, характеризующийся тем, что указанный набор включает контейнер, содержащий анти-hERG1-Cys молекулу антитела по любому из пп.5-9 или конъюгат по п.10; и/или контейнер, содержащий биспецифическое антитело по любому из пп.1-4 и 8.
- 21. Набор по п.20, где набор также содержит контейнер, содержащий интактное моноклональное анти-hERG1 антитело в качестве эталонного контроля.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102017000083637 | 2017-07-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045298B1 true EA045298B1 (ru) | 2023-11-14 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11466085B2 (en) | Anti-PD-L1 nanobody, coding sequence and use thereof | |
| US20210238291A1 (en) | Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same | |
| JP7011574B2 (ja) | Ｆｌｔ３及びｃｄ３に対する抗体構築物 | |
| JP7026610B2 (ja) | メソテリン及びｃｄ３に結合する二重特異性抗体構築物 | |
| KR102404077B1 (ko) | Dll3 및 cd3에 결합하는 이중특이적인 항체 작제물 | |
| JP6879998B2 (ja) | Ｃｄ７０及びｃｄ３に対する抗体構築物 | |
| JP6907124B2 (ja) | Ｃｄｈ３及びｃｄ３に対する二重特異性抗体構築物 | |
| US20220298254A1 (en) | Cd47 antigen-binding molecules | |
| CA2953530C (en) | Antibody constructs for cdh19 and cd3 | |
| MX2010011955A (es) | Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas. | |
| JP2023134497A (ja) | Ｍｕｃ１７及びｃｄ３に向けられる二重特異性抗体コンストラクト | |
| WO2022194201A1 (zh) | 一种靶向cldn18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
| WO2022143550A1 (zh) | 间皮素结合分子及其应用 | |
| EP4321535A1 (en) | Anti-cntn4 antibody and use thereof | |
| US20230203167A1 (en) | Anti-pd-l1 and pd-l2 antibody and derivatives and use thereof | |
| US11572406B2 (en) | Mono and bispecific antibody binding to hERG1 and hERG1/integrin beta 1 | |
| EA045298B1 (ru) | Моно и биспецифичные антитела, связывающиеся с hergi и hergi/интегрином бета 1 | |
| CN114685667A (zh) | 间皮素结合分子及其应用 | |
| CN116023497B (zh) | 抗ddr1抗体及其用途 | |
| WO2024131846A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| EP4269437A1 (en) | Pd-1 binding molecule and application thereof | |
| AU2021446021A1 (en) | Anti-bcam antibody or antigen-binding fragment thereof | |
| CN116023497A (zh) | 抗ddr1抗体及其用途 | |
| JP2022512636A (ja) | 二重特異性抗体コンストラクトの下流プロセシング |