CN114555633A - 用于靶向扩增免疫效应细胞的方法和材料 - Google Patents

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艾丽莎·凯瑟琳·伦纳德
马雷克·科瓦
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Abstract

本文件涉及用于靶向扩增免疫效应(Eff)T细胞的方法和材料。例如，含有一种或更多种可以与包含白细胞介素‑2受体‑β(IL‑2Rβ)多肽和共同γ链(γc)多肽的异源二聚体受体结合的氨基酸链(例如一种或更多种单链抗体/细胞因子融合蛋白(免疫细胞因子))的组合物(例如IL‑2Rβ/γc多肽复合物)可以被施用于哺乳动物以刺激该哺乳动物内的Eff以活化该哺乳动物中的免疫应答。在一些情况下，提供了可以用于治疗患有可以受益于活化免疫应答的状况(例如癌症和/或感染性疾病)的哺乳动物的方法和材料。例如，含有一种或更多种可以与IL‑2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于患有癌症和/或感染性疾病的哺乳动物以治疗该哺乳动物。

Description

用于靶向扩增免疫效应细胞的方法和材料
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月26日提交的美国专利申请序列第62/867,010号的权益。在先申请的公开内容被认为是本申请的公开内容的一部分(并通过引用并入本申请的公开内容)。
背景
1.技术领域
本文件涉及用于靶向扩增免疫效应细胞(Eff)的方法和材料。例如，含有一种或更多种可以与包含IL-2受体-β(IL-2Rβ)多肽和共同γ链(γc)多肽的异源二聚体受体(例如，IL-2Rβ/γc多肽复合物)结合的氨基酸链(例如，一种或更多种单链抗体/细胞因子融合蛋白(免疫细胞因子))的组合物可以被施用于哺乳动物以刺激该哺乳动物内的Eff细胞来活化该哺乳动物的免疫应答。在一些情况下，本文提供的方法和材料可以用于治疗患有可以受益于活化免疫应答的状况(例如，癌症和/或感染性疾病)的哺乳动物。例如，含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于患有癌症和/或感染性疾病的哺乳动物以治疗该哺乳动物。
2.背景信息
IL-2是协调免疫细胞的分化、增殖、存活和活性的多功能细胞因子。由于其对免疫应答的有效活化，高剂量IL-2疗法已在临床上用于刺激抗癌免疫，并于1992年获得FDA批准用于治疗转移性肾细胞癌，以及于1998年获得FDA批准用于转移性黑色素瘤(Liao等人,Immunity.38(1):13–25(2013))。通过活化患者自身的免疫系统，IL-2疗法在5％-10％的患者中引发完全和持久的应答(Rosenberg等人,Sci Transl Med.4(127):127ps8(2012))。然而，IL-2同时活化Eff(例如，自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、CD4+效应T细胞和CD8+效应T细胞)和调节性T细胞(TReg)二者，限制了功效并导致有害的脱靶效应和毒性，最突出的是严重的血管渗漏综合征，其可以导致水肿、器官衰竭和死亡(Boyman等人,Nat RevImmunol.12(3):180–190(2012)；和Dhupkar等人,Adv Exp Med Biol.995:33–51(2017))。此外，IL-2的血清半衰期非常短(<5分钟)，阻碍了其临床表现(Donohue等人,J ImmunolBaltim Md 1950.130(5):2203–2208(1983))。
概述
IL-2通过由IL-2Rα、IL-2Rβ和γc链组成的高亲和力(KD≈10pM)异源三聚体受体或仅由IL-2Rβ和γc链组成的中等亲和力(KD≈1nM)异源二聚体受体活化细胞信号传导。因此，IL-2响应性由IL-2Rα亚基确定，其在TReg上高表达，但几乎不存在于天然Eff中，使得TReg对IL-2敏感度增加100倍(参见例如，Boyman等人，Nat Rev Immunol.12(3):180-90(2012)；Malek等人，Nat Rev Immunol.26:453-79(2008)；和Spangler等人,Annu Rev Immunol.33:139-67(2015))。分离和选择性调节IL-2免疫刺激活性的能力将代表免疫治疗剂开发的变革性前进，并对癌症和感染性疾病的治疗具有重要影响。
本文件提供了用于靶向扩增Eff的方法和材料。例如，本文提供了可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子。在一些情况下，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子可以包含(例如，可以被设计为包含)免疫球蛋白重链(VH)、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和免疫球蛋白轻链(VL)。本文还提供了制备和使用可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的方法。例如，含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于有相应需要的哺乳动物(例如，患有可受益于活化哺乳动物内免疫应答的状况诸如癌症和/或感染性疾病的哺乳动物)以治疗该哺乳动物。在一些情况下，含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于哺乳动物以刺激该哺乳动物内的一种或更多种Eff(例如，以活化该哺乳动物中的免疫应答)。例如，含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于患有癌症的哺乳动物以治疗该哺乳动物。例如，含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于患有感染性疾病或有发展感染性疾病的风险的哺乳动物以治疗该哺乳动物。
如本文展示的，经工程化以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子可以在体内特异性地刺激(例如，扩增)免疫Eff，并可以在体内抑制肿瘤生长。具有直接在哺乳动物(例如，人类)中刺激免疫Eff(例如，但不是TReg)的能力提供了独特且未实现的靶向细胞因子疗法，其可以安全且选择性地促进哺乳动物(例如，人类)中的有效免疫应答，并且可以用于治疗患有或怀疑患有癌症和/或感染性疾病的哺乳动物。
总的来说，本文件的一个方面特征在于单链免疫细胞因子，所述单链免疫细胞因子包含(a)免疫球蛋白重链；(b)IL-2多肽，其中IL-2多肽可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物；和(c)免疫球蛋白轻链；其中单链免疫细胞因子与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。免疫球蛋白重链可以包含可变结构域，该可变结构域与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列具有至少80％的同一性，或者与SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列具有至少80％的同一性。免疫球蛋白重链可以包含可变结构域，该可变结构域具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。免疫球蛋白重链可以包含γ重链恒定结构域。γ重链恒定结构域可以与SEQID NO:5中列出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。免疫球蛋白重链可以包含恒定结构域，该恒定结构域具有SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列。免疫球蛋白重链可以包含信号序列。信号序列可以包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。免疫球蛋白重链可以包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列。IL-2多肽可以包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。IL-2多肽可以包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列。根据权利要求1所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含可变结构域，该可变结构域与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性或与SEQ IDNO:29中列出的氨基酸序列具有至少80％的同一性。免疫球蛋白轻链可以包含可变结构域，该可变结构域具有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列。免疫球蛋白轻链可以包含kappa(κ)轻链恒定结构域。κ轻链恒定结构域可以与SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。免疫球蛋白轻链可以包含恒定结构域，该恒定结构域具有SEQID NO:11中列出的氨基酸序列。免疫球蛋白轻链可以包含信号序列。信号序列可以包含SEQID NO:7中列出的氨基酸序列。免疫球蛋白轻链可以包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。IL-2多肽和免疫球蛋白轻链可以是融合多肽。IL-2多肽可以包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。IL-2多肽可以包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列。免疫球蛋白轻链可以包含可变结构域，该可变结构域与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性或与SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列具有至少80％的同一性。免疫球蛋白轻链可以包含可变结构域，该可变结构域具有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列。免疫球蛋白轻链可以包含κ轻链恒定结构域。κ轻链恒定结构域可以与SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。免疫球蛋白轻链可以包含可变结构域，该可变结构域具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列。IL-2多肽和免疫球蛋白轻链可以经由接头融合。接头可以是可以包含10个至60个氨基酸的肽接头。接头可以是(Gly4Ser)2接头。免疫球蛋白轻链可以包含信号序列。信号序列可以包含SEQ IDNO:8中列出的氨基酸序列。免疫球蛋白轻链可以包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列。单链免疫细胞因子可以具有约5分钟至约6个月的半衰期。单链免疫细胞因子可以具有对IL-2Rβ多肽约300nM KD至约1pMKD的亲和力。单链免疫细胞因子可以具有对IL-2Rα多肽大于约10nM KD的亲和力。在一些情况下，单链免疫细胞因子可以与人类IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。在一些情况下，单链免疫细胞因子不与非人类IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。
在另一方面，本文件特征在于编码单链免疫细胞因子的核酸，所述单链免疫细胞因子包含(a)免疫球蛋白重链；(b)IL-2多肽，其中IL-2多肽可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物；和(c)免疫球蛋白轻链；其中单链免疫细胞因子与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。该核酸可以包括第一核酸和第二核酸，其中第一核酸可以编码免疫球蛋白重链，并且其中第二核酸可以编码融合到免疫球蛋白轻链的IL-2多肽。
在另一方面，本文件特征在于用于治疗患有癌症的哺乳动物的方法。该方法可以包括或基本上由以下组成：向患有癌症的哺乳动物施用包含一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物，所述单链免疫细胞因子包含(a)免疫球蛋白重链；(b)IL-2多肽，其中IL-2多肽可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物；和(c)免疫球蛋白轻链；其中单链免疫细胞因子与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合，或者向患有癌症的哺乳动物施用包含编码单链免疫细胞因子的核酸的组合物，所述单链免疫细胞因子包含(a)免疫球蛋白重链；(b)IL-2多肽，其中IL-2多肽可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物；和(c)免疫球蛋白轻链；其中单链免疫细胞因子与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。哺乳动物可以是人类。癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、口腔癌、膀胱癌、结肠直肠癌、宫颈癌、食管癌或子宫癌。该方法还可以包括在其中哺乳动物中存在的癌细胞数量减少的条件下向哺乳动物施用一种或更多种癌症治疗。该方法基本上不活化调节性T细胞。
在另一方面，本文件特征在于用于刺激哺乳动物中效应细胞的方法。该方法可以包括或基本上由以下组成：向哺乳动物施用包含一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物，所述单链免疫细胞因子包含(a)免疫球蛋白重链；(b)IL-2多肽，其中IL-2多肽可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物；和(c)免疫球蛋白轻链；其中单链免疫细胞因子与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合，或者向患有癌症的哺乳动物施用包含编码单链免疫细胞因子的核酸的组合物，所述单链免疫细胞因子包含(a)免疫球蛋白重链；(b)IL-2多肽，其中IL-2多肽可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物；和(c)免疫球蛋白轻链；其中单链免疫细胞因子与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。哺乳动物可以是人类。该方法基本上不活化调节性T细胞。
在另一方面，本文件特征在于用于治疗患有感染性疾病的哺乳动物的方法。该方法可以包括或基本上由以下组成：向患有感染性疾病的哺乳动物施用包含一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物，所述单链免疫细胞因子包含(a)免疫球蛋白重链；(b)IL-2多肽，其中IL-2多肽可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物；和(c)免疫球蛋白轻链；其中单链免疫细胞因子与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合，或者向患有感染性疾病的哺乳动物施用包含编码单链免疫细胞因子的核酸的组合物，所述单链免疫细胞因子包含(a)免疫球蛋白重链；(b)IL-2多肽，其中IL-2多肽可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物；和(c)免疫球蛋白轻链；其中单链免疫细胞因子与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。哺乳动物可以是人类。感染性疾病可以是人类免疫缺陷病毒、疟疾、流感、埃博拉、结核病、麻疹、狂犬病、登革热、沙门氏菌病、百日咳、鼠疫或西尼罗热。该方法基本上不活化调节性T细胞。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可以用于实践本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献均通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，应以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实例仅为说明性的而并非意图限制。
在以下的附图和说明中阐述了本发明的一种或更多种实施方案的细节。本发明的其他特征、目标和优势将由说明书和附图，以及由权利要求书而明显。
附图说明
图1A–图1C.细胞因子-抗体融合(免疫细胞因子，IC)表达。图1A含有IL-2-602免疫细胞因子布局的示意图。IL-2细胞因子被融合到全长602抗体的轻链(LC)的N末端，通过柔性接头连接。图1B含有IL-2抗体免疫细胞因子的小规模表达滴定的SDS-PAGE分析。示出了HC与IL-2复合的LC的DNA转染比例。在预期分子量(MW)处观察到条带。图1C含有来自免疫细胞因子的FPLC纯化的尺寸排阻色谱迹线。SDS-PAGE分析显示蛋白被纯化至均一。
图2.IC表现出偏倚的IL-2受体结合。hIL-2和602IC对固定的人类IL-2Rα或IL-2Rβ受体亚基的结合滴定，如通过生物层干涉测量术测量的。
图3.602IC重演了细胞因子/抗体复合物的信号传送行为。在有(上图)或没有(下图)IL-2Rα的YT-1细胞上响应于IL-2、IL-2/602复合物或602IC的STAT5活化，如通过流式细胞术测量的。
图4A-图4B.IL-2/602复合物刺激Eff活性。图4A含有显示持续4天每天用PBS、IL-2/602复合物或IL-2/S4B6处理的小鼠的脾中的记忆表型(MP)CD8+效应T细胞的相对扩增的图。图4B含有接种后第20天从小鼠提取的B16F10黑色素瘤的图像。小鼠每周两次用PBS或IL-2/602复合物处理。
图5A-图5B.具有各种接头长度的602IC的表达。图5A显示了来自具有10个、15个、25个和35个氨基酸的接头长度的重组产生的602IC的尺寸排阻色谱迹线。注意到较早的峰(峰1和峰2)对应于寡聚IC，而峰3对应于单体IC。图5B显示了重组表达的602抗体(Ab)、602IC LN15、602IC LN25和602IC LN35的非还原和还原SDS-PAGE分析。
图6.接头长度变体IC表现出预期的IL-2受体结合特性。图6显示了IL-2、602抗体(Ab)、IL-2+602Ab复合物(2:1比例，在37℃预孵育30分钟)、602IC变体和无关的阴性对照蛋白对固定的hIL-2Rβ的结合滴定，如通过生物层干涉测量术测量的。
图7A-图7C.602IC表现出有利于免疫效应细胞的偏倚的信号传导。图7A显示了在表达IL-2Rα的YT-1人类NK细胞(TReg细胞的代表)上响应于IL-2、IL-2+602抗体(Ab)复合物(1:1比例，在室温预孵育30分钟)或602IC变体的STAT5活化，如通过流式细胞术测量的。图7B显示了在不表达IL-2Rα的YT-1人类NK细胞(免疫效应细胞的替代物)上响应于IL-2、IL-2+602Ab复合物(1:1比例，在室温预孵育30分钟)或602IC变体的STAT5活化，如通过流式细胞术测量的。图7C是描绘IL-2、IL-2+602Ab和602IC变体在IL-2Rα-对比IL-2Rα+YT-1人类NK细胞上的信号传导效力的比例的条形图。
图8A-图8C.经工程化的602Ic变体显示了改进的与IL-2的结合和与IL-2Rα的竞争。图8A显示了可溶性IL-2对酵母展示的602单链可变片段(scFv)或基于602scFv的第5轮后演化的易错文库(EP602)的基于流式细胞术的酵母表面滴定。图8B显示了基于流式细胞术的竞争研究，其中将饱和浓度的可溶性IL-2(10nM)和指示浓度的IL-2Rα与展示602scFv或基于602scFv的第5轮后演化的易错文库(EP602)的酵母细胞共孵育。图8C显示了基于流式细胞术的竞争研究，其中将饱和浓度的可溶性IL-2(5nM)和指示浓度的IL-2Rα与展示602scFv或演化的F10 scFv(602scFv的变体)的酵母细胞共孵育。
图9A-图9B.IC变体的表达。图9A显示了来自重组产生的602IC LN35、表示为F10IC LN35的602IC变体和包含连接到无关的抗体的IL-2的融合蛋白(Irrel.Ab IC LN35)的尺寸排阻色谱迹线。图9B显示了重组表达的602IC LN35、F10 IC LN35和Irrel.Ab IC LN35的非还原和还原SDS-PAGE分析。
图10A-图10C.经工程化的602IC变体表现出预期的IL-2细胞因子和受体结合特性。图10A显示了IL-2、602抗体(Ab)、IL-2+602Ab复合物(2:1比例，在37℃预孵育30分钟)、602IC变体和无关的阴性对照蛋白对固定的hIL-2的结合滴定，如通过生物层干涉测量术测量的。图10B显示了IL-2、602Ab、IL-2+602Ab复合物(2:1比例，在37℃预孵育30分钟)、602IC变体和无关的阴性对照蛋白对固定的hIL-2Rα的结合滴定，如通过生物层干涉测量术测量的。图10C显示了IL-2、602Ab、IL-2+602Ab复合物(2:1比例，在37℃预孵育30分钟)、602IC变体和无关的阴性对照对固定的hIL-2Rβ的结合滴定，如通过生物层干涉测量术测量的。
图11A-图11C.与亲本IC相比，经工程化的602IC变体表现出对免疫效应细胞的优越的偏倚。图11A显示了在表达IL-2Rα的YT-1人类NK细胞(代表TReg细胞)上响应于IL-2、包含连接到无关的抗体的IL-2的融合蛋白(Irrel.Ab IC LN35)、IL-2+602抗体(Ab)复合物(1:1比例，在室温预孵育30分钟)、602IC LN35或602IC变体F10 IC LN35的STAT5活化，如通过流式细胞术测量的。图11B显示了在不表达IL-2Rα的YT-1人类NK细胞(免疫效应细胞的替代物)上响应于IL-2、Irrel.Ab IC LN35、IL-2+602Ab复合物(1:1比例，在室温预孵育30分钟)、602IC LN35或F10 IC LN35的STAT5活化，如通过流式细胞术测量的。图11C是描绘了IL-2、Irrel.Ab IC LN35、IL-2+602Ab、602IC LN35和F10 IC LN35在IL-2Rα-对比IL-2Rα+YT-1人类NK细胞上的信号传导效力的比例的条形图。
图12.示例性重组抗体重链的序列(SEQ ID NO:1)，其包含信号序列(粗体)、602VH(斜体)和小鼠IgG2a CH1、CH2和CH3(粗体和斜体)。
图13.示例性重组抗体轻链的序列(SEQ ID No:2)，其包含信号序列(粗体)、602VL(斜体)和κCL(粗体和斜体)。
图14.示例性免疫细胞因子轻链(对应于602IC LN10)的序列(SEQ ID NO:3)，其包含信号序列(粗体)、人类IL-2(普通文本)、接头(加下划线的)、602VL(斜体)和κCL(粗体和斜体)。
图15.示例性免疫细胞因子轻链(对应于602IC LN15)的序列(SEQ ID NO:23)，其包含信号序列(粗体)、人类IL-2(普通文本)、接头(加下划线的)、602VL(斜体)和小鼠κCL(粗体和斜体)。
图16.示例性免疫细胞因子轻链(对应于602IC LN25)的序列(SEQ ID NO:24)，其包含信号序列(粗体)、人类IL-2(普通文本)、接头(加下划线的)、602VL(斜体)和小鼠κCL(粗体和斜体)。
图17.示例性免疫细胞因子轻链(对应于602IC LN35)的序列(SEQ ID NO:25)，其包含信号序列(粗体)、人类IL-2(普通文本)、接头(加下划线的)、602VL(斜体)和小鼠κCL(粗体和斜体)。
图18.示例性免疫细胞因子重链(对应于F10 IC LN35)的序列(SEQ ID No:26)，其包含信号序列(粗体)、602VH(斜体)和小鼠IgG2a CH1、CH2和CH3(粗体和斜体)。突出了相对于602VH的突变。
图19.示例性免疫细胞因子轻链(对应于F10 IC LN35)的序列(SEQ ID NO:27)，其包含信号序列(粗体)、人类IL-2(普通文本)、接头(加下划线的)、602VL(斜体)和小鼠κCL(粗体和斜体)。突出了相对于602VL的突变。
详细描述
本文件提供了用于靶向扩增Eff的方法和材料。例如，本文提供了可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子。在一些情况下，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子可以包含(例如，可以被设计为包含)免疫球蛋白重链、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和免疫球蛋白轻链。本文还提供了用于制备和使用可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的方法。例如，含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于有相应需要的哺乳动物(例如，人类)(例如，患有可受益于活化哺乳动物内免疫应答的状况诸如癌症和/或感染性疾病的哺乳动物)以治疗该哺乳动物。在一些情况下，含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于哺乳动物以刺激哺乳动物内的Eff(例如，以活化该哺乳动物中的免疫应答)。可以由本文描述的可以与IL-2Rβ多肽结合的单链免疫细胞因子刺激的Eff的实例包括但不限于CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、记忆表型CD8+效应T细胞、NK细胞和NKT细胞。例如，含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于患有癌症的哺乳动物以治疗该哺乳动物。例如，含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物可以被施用于患有感染性疾病或有发展感染性疾病的风险的哺乳动物以治疗该哺乳动物。
如本文所用，本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的单链免疫细胞因子)是融合蛋白，该融合蛋白包含融合(例如，遗传融合)到抗体或其片段的细胞因子(例如，细胞因子/抗体融合蛋白)。在一些情况下，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含融合到抗细胞因子抗体或其片段(例如，抗IL-2抗体或其片段)的细胞因子。在一些情况下，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含融合到抗体的细胞因子，使得细胞因子和抗体在免疫细胞因子内分子内结合。在一些情况下，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含融合到抗体的一端或更多端(例如，抗体重链的N末端或C末端和/或抗体轻链的N末端或C末端)的细胞因子。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以是融合多肽，其包含融合到IL-2多肽(或其片段)的免疫球蛋白重链(例如，来自抗细胞因子抗体的免疫球蛋白重链)，所述IL-2多肽可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物，融合到免疫球蛋白轻链(例如，来自抗细胞因子抗体的免疫球蛋白轻链)。
本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以与来自任何适合来源的IL-2Rβ/γc多肽复合物(例如，来自任何适合的哺乳动物诸如人类或小鼠)结合。在一些情况下，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以与人类IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。在一些情况下，当可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)与来自第一物种的哺乳动物的IL-2Rβ/γc多肽复合物结合时，该可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)不与来自第二物种的哺乳动物的IL-2Rβ/γc多肽复合物交叉反应。例如，当可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)与人类IL-2Rβ/γc多肽复合物结合时，该可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)不与来自非人类物种的IL-2Rβ/γc多肽复合物(例如，小鼠IL-2Rβ/γc多肽复合物)交叉反应。
本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以包含任何适合的免疫球蛋白(Ig)重链。免疫球蛋白重链可以来自任何适合的同种型免疫球蛋白(例如，IgA免疫球蛋白、IgD免疫球蛋白、IgE免疫球蛋白、IgG免疫球蛋白和IgM免疫球蛋白)。在一些情况下，免疫球蛋白重链可以是IgG重链(例如，IgG2a重链)。免疫球蛋白重链可以来自任何适合的类别的免疫球蛋白(例如，γ、σ、α、μ和ε)。免疫球蛋白重链可以具有任何适合的重链可变结构域(VH)。免疫球蛋白重链可以具有任何适合的重链恒定结构域(CH)。在一些情况下，免疫球蛋白重链可以是具有三个恒定结构域(例如，CH1、CH2和CH3)的免疫球蛋白，诸如γ重链、α重链或δ重链。在一些情况下，免疫球蛋白重链可以是具有四个恒定结构域(例如，CH1、CH2、CH3和CH4)的免疫球蛋白，诸如μ重链或ε重链。免疫球蛋白重链可以来自任何适合的免疫球蛋白。在一些情况下，免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白重链恒定结构域可以来自相同的免疫球蛋白。在一些情况下，免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白重链恒定结构域可以来自不同的免疫球蛋白。在一些情况下，免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白重链恒定结构域可以来自天然存在的免疫球蛋白(例如，可以源自天然存在的免疫球蛋白)。在一些情况下，免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白重链恒定结构域可以是合成的。其重链可变结构域和/或免疫球蛋白重链恒定结构域可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白的实例包括但不限于单克隆抗体602(MAB602，本文称为“602”)重链(参见，例如，R&D systems#MAB602-SP)。在一些情况下，其重链可变结构域和/或重链恒定结构域可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白可以如别处描述的(参见，例如，Krieg等人,Proc Natl Acad Sci U SA.107(26):11906-11(2010))。免疫球蛋白重链可以包含任何适合的序列(例如，氨基酸序列)。在一些情况下，免疫球蛋白重链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列具有至少约80％同一性(例如，约82％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域。在一些情况下，免疫球蛋白重链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列具有至少约80％同一性(例如，约82％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域。在一些情况下，免疫球蛋白重链恒定结构域可以包含与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列具有至少约70％同一性(例如，约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链恒定结构域。在一些情况下，免疫球蛋白重链也可以包含信号序列。信号序列可以是任何适合的信号序列(例如，SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7)。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的信号序列的免疫球蛋白重链。
可以用于本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的示例性免疫球蛋白重链可以是如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:26中列出的。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白重链可以包含信号序列、来自602抗体的可变结构域和IgG2a恒定结构域(例如，小鼠IgG2a恒定结构域)。在一些情况下，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白重链可以包含具有SEQ IDNO:6中列出的氨基酸序列的信号序列、具有SEQ ID NO:4中列出氨基酸序列的可变结构域和具有SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的恒定结构域。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白重链可以包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白重链可以包含具有SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的信号序列、具有SEQ ID NO:28中列出氨基酸序列的可变结构域和具有SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的恒定结构域。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白重链可以包含SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列。在一些情况下，免疫球蛋白重链可以具有对氨基酸序列的一个或更多个修饰(例如，对SEQ ID NO:1的一个或更多个修饰或对SEQ ID NO:26的一个或更多个修饰)。在一些情况下，对包含在本文描述的单链免疫细胞因子中的重链的氨基酸序列的修饰可以改变单链免疫细胞因子的细胞因子亲和力。在一些情况下，对包含在本文描述的单链免疫细胞因子中的重链的氨基酸序列的修饰可以改变单链免疫细胞因子的受体竞争(例如，可以改变结合特性)。
本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以包含可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的任何适合的IL-2多肽(或其片段)。可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以来自任何来源。在一些情况下，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以是可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的天然存在的IL-2多肽(或其片段)。在一些情况下，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以是合成的。可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以具有任何适合的序列。在一些情况下，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少约80％同一性(例如，约82％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链恒定结构域。在一些情况下，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以具有对氨基酸序列的一个或更多个修饰(例如，对SEQ ID NO:9的一个或更多个修饰)。在一些情况下，对包含在本文描述的单链免疫细胞因子中的可以结合IL-2Rβ/γc的IL-2多肽(或其片段)的氨基酸序列的修饰可以减轻单链免疫细胞因子分子内组装的破坏。在一些情况下，对包含在本文描述的单链免疫细胞因子中的重链的氨基酸序列的修饰可以增强单链免疫细胞因子的活性(例如，信号传导活性)。
本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以包含任何适合的免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白轻链可以来自任何适合类型的免疫球蛋白轻链(例如，kappa(κ)轻链和lambda(λ)轻链)。在一些情况下，免疫球蛋白轻链可以是κ轻链。免疫球蛋白轻链可以具有任何适合的轻链可变结构域(VL)。免疫球蛋白轻链可以具有任何适合的轻链恒定结构域(CL)。免疫球蛋白轻链可以来自任何适合的免疫球蛋白。在一些情况下，免疫球蛋白轻链可变结构域和免疫球蛋白轻链恒定结构域可以来自相同的免疫球蛋白。在一些情况下，免疫球蛋白轻链可变结构域和免疫球蛋白轻链恒定结构域可以来自不同的免疫球蛋白。在一些情况下，免疫球蛋白轻链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链恒定结构域可以来自天然存在的免疫球蛋白(例如，可以源自天然存在的免疫球蛋白)。在一些情况下，免疫球蛋白轻链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链恒定结构域可以是合成的。其轻链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链恒定结构域可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白的实例包括但不限于602轻链(参见，例如，R&D systems#MAB602-SP)。在一些情况下，其轻链可变结构域和/或轻链恒定结构域可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白可以如别处描述的(参见，例如，Krieg等人,Proc NatlAcad Sci U S A.107(26):11906-11(2010))。免疫球蛋白重链可以包含任何适合的序列(例如，氨基酸序列)。免疫球蛋白轻链可以包含任何适合的序列(例如，氨基酸序列)。在一些情况下，免疫球蛋白轻链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少约80％同一性(例如，约82％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域。在一些情况下，免疫球蛋白轻链可变结构域可以包含与SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列具有至少约80％同一性(例如，约82％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域。在一些情况下，免疫球蛋白轻链恒定结构域可以包含与SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列具有至少约70％同一性(例如，约75％、约80％、约85％、约88％、约90％、约93％、约95％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链恒定结构域。在一些情况下，免疫球蛋白轻链也可以包含信号序列。信号序列可以是任何适合的信号序列(例如，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列的信号序列的免疫球蛋白轻链。
可以用于本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的示例性免疫球蛋白轻链可以是如SEQ ID NO:2中列出的。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含信号序列、来自602抗体的可变结构域和κ恒定结构域。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含具有SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列的信号序列、具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列的可变结构域和具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列的恒定结构域。在一些情况下，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含SEQ IDNO:2中列出的氨基酸序列。在一些情况下，免疫球蛋白轻链可以具有对氨基酸序列的一个或更多个修饰(例如，对SEQ ID NO:2的一个或更多个修饰)。在一些情况下，对包含在本文描述的单链免疫细胞因子中的轻链的氨基酸序列的修饰可以改变单链免疫细胞因子的细胞因子亲和力。在一些情况下，对包含在本文描述的单链免疫细胞因子中的轻链的氨基酸序列的修饰可以改变单链免疫细胞因子的受体竞争(例如，可以改变结合特性)。
在一些情况下，免疫球蛋白轻链可以包含可以结合本文描述的IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)。在免疫球蛋白轻链包含可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)的情况下，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以处于免疫球蛋白轻链内的任何适合的位置。在一些情况下，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以被融合到免疫球蛋白轻链(例如，免疫球蛋白轻链可变结构域)。当可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和免疫球蛋白轻链可变结构域是融合多肽时，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和免疫球蛋白轻链可变结构域可以经由接头融合。接头可以是任何适合的接头。在一些情况下，接头可以是柔性的(例如，以允许分子内相互作用)。在一些情况下，接头可以是肽接头。肽接头可以包含任何适合数量的氨基酸。例如，肽接头可以包含约10个氨基酸至约60个氨基酸(例如，约10个氨基酸至约50个氨基酸、约10个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约20个氨基酸至约60个氨基酸、约30个氨基酸至约60个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸，约50个氨基酸至约60个氨基酸，约15个氨基酸至约55个氨基酸，约20个氨基酸至约50个氨基酸，约30个氨基酸至约40个氨基酸，约20个氨基酸至约40个氨基酸，约30个氨基酸至约50个氨基酸，或约40个氨基酸至约60个氨基酸)。肽接头可以包含任何适合的氨基酸。例如，肽接头可以包含一个或更多个甘氨酸(Gly)残基和/或一个或更多个丝氨酸(Ser)残基。可以用于将可以结合IL-2Rα/IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)融合到免疫球蛋白轻链可变结构域的接头的实例包括但不限于(Gly4Ser)2接头(SEQ ID NO:12)、(Gly4Ser)3接头(SEQ ID NO:13)、(Gly4Ser)4接头(SEQ ID NO:14)、(Gly4Ser)5接头(SEQ IDNO:15)、(Gly4Ser)6接头(SEQ ID NO:16)、(Gly4Ser)7接头(SEQ ID NO:17)、(Gly4Ser)8接头(SEQ ID NO:18)、(Gly4Ser)9接头(SEQ ID NO:19)、(Gly4Ser)10接头(SEQ ID NO:20)、(Gly4Ser)11接头(SEQ ID NO:21)和(Gly4Ser)12接头(SEQ ID NO:22)。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以包含具有可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)的免疫球蛋白轻链，所述IL-2多肽(或其片段)经由具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列的接头与免疫球蛋白轻链可变结构域融合。在一些情况下，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以具有对氨基酸序列的一个或更多个修饰(例如，对SEQ ID NO:12的一个或更多个修饰或对SEQ ID NO:13的一个或更多个修饰)。在一些情况下，对接头的氨基酸序列的修饰可以改变接头的长度、电荷、结构和/或组成。
示例性免疫球蛋白轻链可以是如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25或SEQ ID NO:27中任一个中列出的，所述示例性免疫球蛋白轻链包含可以用于本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ多肽结合的单链免疫细胞因子)的可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含信号序列、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)、接头、来自602抗体的可变结构域和κ恒定结构域。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列的信号序列、具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的IL-2多肽、具有SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的接头、具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列的可变结构域和具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列的恒定结构域。在一些情况下，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列的信号序列、具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的IL-2多肽、具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列的接头、具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列的可变结构域和具有SEQ IDNO:11中列出的氨基酸序列的恒定结构域。在一些情况下，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列的信号序列、具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的IL-2多肽、具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的接头、具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列的可变结构域和具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列的恒定结构域。在一些情况下，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列的信号序列、具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的IL-2多肽、具有SEQ IDNO:17中列出的氨基酸序列的接头、具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列的可变结构域和具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列的恒定结构域。在一些情况下，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。例如，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列的信号序列、具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的IL-2多肽、具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的接头、具有SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列的可变结构域和具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列的恒定结构域。在一些情况下，可以用于本文描述的单链免疫细胞因子的免疫球蛋白轻链可以包含SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列。在一些情况下，免疫球蛋白轻链可以具有对氨基酸序列的一个或更多个修饰(例如，对SEQ ID NO:3的一个或更多个修饰、对SEQ ID NO:23的一个或更多个修饰、对SEQ ID NO:24的一个或更多个修饰、对SEQ ID NO:25的一个或更多个修饰或对SEQ ID NO:27的一个或更多个修饰)。在一些情况下，对包含在本文描述的单链免疫细胞因子中的轻链的氨基酸序列的修饰可以改变单链免疫细胞因子的细胞因子亲和力。在一些情况下，对包含在本文描述的单链免疫细胞因子中的轻链的氨基酸序列的修饰可以改变单链免疫细胞因子的受体竞争(例如，可以改变结合特性)。
在一些情况下，本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以是稳定的分子(例如，如相比于不存在于本文描述的单链免疫细胞因子中的可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的分子)。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可具有以下半衰期(例如，体内半衰期诸如血清半衰期或血浆半衰期)：约5分钟至约6个月(例如，约15分钟至约6个月、约30分钟至约6个月、约1小时至约6个月、约24小时至约6个月、约3天至约6个月、约7天至约6个月，约1个月至约6个月、约3个月至约6个月、约5分钟至约3个月、约5分钟至约1个月、约5分钟至约2周、约5分钟至约7天、约5分钟至约3天、约5分钟至约24小时、约5分钟至约12小时、约5分钟至约60分钟、约30分钟至约3天、约3天至约1周、约1周至约1个月或约1个月至约3个月)。例如，本文描述的单链免疫细胞因子在标准室温条件(例如，约25℃)可以具有约1天至约1个月(例如，约1天至约2周、约1天至约1周、约1天至约5天、约4天至约1个月、约1周至约1个月、约2周至约1个月、约3天至约2周、约2天至约5天，约5天至约2周或约1周至约3周)的保质期。例如，热漂移(thermal shift)测定、蛋白稳定性曲线分析、尺寸排阻色谱和/或动态光散射可以用于确定本文描述的单链免疫细胞因子的稳定性。
在一些情况下，本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以与IL-2Rβ多肽具有增强的相互作用(例如，对其较强的结合亲和力)(例如，相比于不存在于本文描述的单链免疫细胞因子中的可以与IL-2Rβ多肽复合物结合的分子)。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以具有对IL-2Rβ/γc多肽复合物约300nM KD至约1pM KD的亲和力。
在一些情况下，本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以具有与IL-2Rα多肽减少或消除的相互作用(例如，对其较弱的结合亲和力)(例如，相比于不存在于本文描述的单链免疫细胞因子中的可以与IL-2Rα多肽复合物结合的分子)。例如，本文描述的单链免疫细胞因子可以具有对IL-2Rα多肽大于约10nM KD的亲和力。
可以使用任何适合的方法来确定本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ多肽结合的单链免疫细胞因子)与IL-2Rβ多肽和/或IL-2Rα多肽之间的结合亲和力。例如，亲和力滴定研究、表面等离子体共振、等温量热法和/或生物层干涉测量术可以用于确定本文描述的单链免疫细胞因子与IL-2Rβ多肽和/或IL-2Rα多肽之间的结合亲和力。
在一些情况下，本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以活化的TReg的数量减少或消除(例如，相比于不存在于本文描述的单链免疫细胞因子中的可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的分子)。例如，本文描述的单链免疫细胞因子基本上不活化TReg(例如，不将TReg活化至可检测水平和/或足以阻抑或下调Eff的活化的水平)。可以使用任何适合的方法来确定TReg的存在、不存在、量或活性。例如，对TReg标志物(例如，CD4、IL-2Rα和/或Foxp3)进行免疫染色和/或基于ELISA或信号转导及转录活化因子(STAT)5磷酸化进行活性评估可以用于确定TReg的存在、不存在、量或活性。
本文件还提供了用于制备本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的方法和材料。例如，本文件还提供了可以编码可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子的多肽的核酸(例如，核酸载体)。在一些情况下，可以用于产生可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的核酸可以编码免疫球蛋白重链、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和/或免疫球蛋白轻链。例如，第一核酸可以编码免疫球蛋白重链，并且第二核酸可以编码融合到免疫球蛋白轻链的可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)。
编码一种或更多种多肽(例如，免疫球蛋白重链，可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和/或免疫球蛋白轻链)的核酸(例如，核酸载体)可以是任何适合的核酸，所述核酸可以用于产生可以用于产生本文描述的单链免疫球细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的多肽。核酸可以是DNA(例如，DNA构建体)、RNA(例如，mRNA)或其组合。在一些情况下，编码一种或更多种多肽的核酸可以是载体(例如，表达载体或质粒)，所述核酸可以用于产生可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子的多肽。
在一些情况下，编码一种或更多种多肽(例如，免疫球蛋白重链、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和/或免疫球蛋白轻链)的核酸也可以包含一种或更多种调节元件(例如，以调节氨基酸链的表达)，所述核酸可以用于产生可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的多肽。可以被包含在编码一种或更多种多肽的核酸中的调节元件的实例包括但不限于启动子(例如，组成型启动子、组织/细胞特异性启动子和诱导型启动子诸如化学活化启动子和光活化启动子)和增强子，所述核酸可以用于产生可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子的多肽。
在一些情况下，由本文描述的核酸编码的一种或更多种多肽(例如，免疫球蛋白重链、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和/或免疫球蛋白轻链)可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)。例如，包含免疫球蛋白重链、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和免疫球蛋白轻链的两种或更多种多肽可以组装(例如，可以自组装)为本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)。在一些情况下，由第一核酸编码的免疫球蛋白重链和由第二核酸编码的融合到免疫球蛋白轻链的可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)可以组装(例如，可以自组装)为本文描述的单链免疫细胞因子。当包含免疫球蛋白重链、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和免疫球蛋白轻链的两种或更多种多肽组装为本文描述的单链免疫细胞因子时，这两种或更多种多肽可以在体内或在体外组装。
在一些情况下，本文描述的单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)或编码一种或更多种多肽(例如，免疫球蛋白重链、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和/或免疫球蛋白轻链)的核酸可以被纯化，所述核酸可以用于产生可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子的多肽。“纯化的”多肽或核酸是指在组分混合物中构成主要组分的多肽或核酸，例如，按重量计30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、或99％或更多。例如，纯化的单链免疫细胞因子可以构成含有一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物的按重量计约30％或更多。多肽可以通过包括但不限于亲和色谱和免疫吸附亲和柱的方法纯化。例如，纯化的编码可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子的一种或更多种多肽的核酸可以构成含有可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子的一条或更多条氨基酸链的组合物的按重量计约30％或更多。核酸可以通过包括但不限于苯酚-氯仿提取和柱纯化(例如，小柱(mini-column)纯化)的方法纯化。
本文还提供了用于治疗有相应需要的哺乳动物(例如，人类)(例如，患有可以受益于活化哺乳动物内免疫应答的状况诸如癌症和/或感染性疾病的哺乳动物)的方法和材料。在一些情况下，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)或编码一种或更多种多肽(例如，免疫球蛋白重链、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和/或免疫球蛋白轻链)的核酸的组合物可以用于治疗患有癌症的哺乳动物，所述一种或更多种多肽可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子。例如，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子或编码一种或更多种多肽的核酸的组合物可以施用于患有癌症的哺乳动物以治疗该哺乳动物，所述一种或更多种多肽可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子。在一些情况下，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)或编码一种或更多种多肽(例如，免疫球蛋白重链、可以结合IL-2Rβ/γc多肽复合物的IL-2多肽(或其片段)和/或免疫球蛋白轻链)的核酸的组合物可以用于治疗患有感染性疾病的哺乳动物，所述一种或更多种多肽可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子。例如，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子或编码一种或更多种多肽的核酸的组合物可以施用于患有感染性疾病的哺乳动物以治疗该哺乳动物，所述一种或更多种多肽可以用于产生本文描述的单链免疫细胞因子。
患有或怀疑患有癌症的任何适合的哺乳动物都可以如本文描述的治疗(例如，通过施用含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物)。可以如本文描述的治疗的哺乳动物的实例包括但不限于灵长类动物(例如，人类和猴)、犬、猫、马、牛、猪、绵羊、兔、小鼠和大鼠。例如，患有癌症的人类可以用含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物来治疗。
当如本文描述的治疗患有或怀疑患有癌症的哺乳动物时(例如，通过施用含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物)，该哺乳动物可以患有或怀疑患有任何类型的癌症。癌症可以包括一种或更多种实体瘤。癌症可以是血液癌症。可以如本文描述的治疗的癌症的实例包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、黑色素瘤、口腔癌、膀胱癌、宫颈癌、食管癌和子宫癌。
任何适合的方法都可以用于鉴定患有癌症的哺乳动物(例如，人类)。例如，成像技术、活检技术和/或血液测试可以用于鉴定患有癌症的哺乳动物(例如，人类)。
当如本文描述的治疗患有或怀疑患有感染性疾病的哺乳动物时(例如，通过施用含有一种或更多种可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子的组合物)，该哺乳动物可以患有或怀疑患有任何类型的感染性疾病。可以如本文描述的治疗的感染性疾病的实例包括但不限于人类免疫缺陷病毒、疟疾、流感、埃博拉、结核病、麻疹、狂犬病、登革热、沙门氏菌病、百日咳、鼠疫和西尼罗热。
任何适合的方法都可以用于鉴定患有感染性疾病或有发展感染性疾病的风险的哺乳动物(例如，人类)。例如，尿液测试、咽拭子、粪便样品和/或血液测试可以用于鉴定患有感染性疾病或有发展感染性疾病的风险的哺乳动物(例如，人类)。
一旦鉴定为患有癌症和/或患有感染性疾病或有发展感染性疾病的风险，哺乳动物(例如，人类)可以被施用或被指示自我施用含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的组合物。在一些情况下，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物可以用于减少患有癌症的哺乳动物中存在的癌细胞的数量。在一些情况下，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物可以用于减少患有癌症的哺乳动物内肿瘤的尺寸(例如，体积)。在一些情况下，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物可以用于减少患有感染性疾病的哺乳动物内存在的感染性微生物的数量。
在一些情况下，本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以作为用于治疗患有癌症和/或感染性疾病的哺乳动物的唯一活性成分，被施用于患有癌症的哺乳动物。
在一些情况下，当向患有癌症的哺乳动物施用本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)时，本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子可以与用于治疗癌症的一种或更多种另外的癌症治疗和/或用于增强免疫应答的一种或更多种另外的治疗一起作为联合疗法被施用。例如，用于治疗癌症的联合疗法可以包括向哺乳动物(例如，人类)施用本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子和一种或更多种癌症治疗诸如手术、化疗、放射、施用疫苗、过继细胞转移、施用细胞疗法、施用靶向疗法和/或施用免疫疗法。例如，用于增强免疫应答的联合疗法可以包括向哺乳动物(例如，人类)施用本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子和一种或更多种用于增强免疫应答的另外的治疗诸如施用疫苗、过继细胞转移、施用免疫检查点抑制剂(例如，通过免疫检查点阻断起作用的药物)和/或施用细胞疗法。
在一些情况下，当向患有感染性疾病的哺乳动物施用本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)时，本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子可以与用于治疗感染性疾病的一种或更多种另外的感染性疾病治疗和/或用于增强免疫应答的一种或更多种另外的治疗一起作为联合疗法被施用。例如，用于治疗感染性疾病的联合疗法可以包括向哺乳动物(例如，人类)施用本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子和一种或更多种感染性疾病治疗诸如抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂和/或抗寄生虫剂。例如，用于增强免疫应答的联合疗法可以包括向哺乳动物(例如，人类)施用本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子和一种或更多种用于增强免疫应答的另外的治疗诸如施用疫苗、过继细胞转移、施用免疫检查点抑制剂(例如，通过免疫检查点阻断起作用的药物)和/或施用细胞疗法。
在本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子与一种或更多种另外的治疗联合使用的情况下，一种或更多种另外的治疗可以被同时或独立地施用。例如，可以首先施用本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子，并且然后施用一种或更多种另外的治疗，反之亦然。
在一些情况下，本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)可以被配制到组合物中(例如，药学上可接受的组合物)，用于施用于有相应需要的哺乳动物(例如，患有可以受益于活化哺乳动物内免疫应答的状况诸如癌症和/或感染性疾病的哺乳动物)。例如，治疗有效量的本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子可以与一种或更多种药学上可接受的运载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。药物组合物可以配制用于以任何适合的剂型施用。剂型的实例包括固体或液体形式，包括但不限于凝胶、胶囊、片剂(例如，咀嚼片和肠溶包衣片)、栓剂、液体、灌肠剂、混悬剂、溶液(例如，无菌溶液)、持续释放制剂、延迟释放制剂、丸剂、粉末和颗粒。可以用于本文描述的药物组合物的药学上可接受的运载体、填充剂和媒介物包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人类血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇(诸如维生素E TPGS)、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的组合物(例如，药物组合物)，可以被设计用于口服或肠胃外(包括皮下、肿瘤内、肌肉内、静脉内和皮内)施用。当口服施用时，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子的药物组合物可以是丸剂、片剂或胶囊的形式。适于肠胃外施用的组合物包括可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使得制剂与预期的接受者的血液等张的溶质的水性和非水性的无菌注射溶液；以及可以包含助悬剂和增稠剂的水性或非水性的无菌混悬剂。制剂可以呈现在单位剂量或多剂量容器中，例如，密封的安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件中，仅需要在临使用之前添加无菌液体运载体例如注射用水。即时(extemporaneous)注射溶液和混悬剂可以由无菌粉末、颗粒和片剂来制备。
含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的组合物(例如，药物组合物)，可以局部或全身施用。例如，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物可以通过口服施用或通过注射向哺乳动物(例如，人类)全身施用。
本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的有效剂量可以根据癌症的严重程度、施用途径、受试者的年龄和一般健康状况、赋形剂的使用、与其他治疗方法(诸如使用其他药物)共同使用的可能性和/或治疗医生的判断而变化。
含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的组合物的有效量可以是可以治疗哺乳动物(例如，患有癌症和/或患有感染性疾病或有发展感染性疾病的风险的哺乳动物)而不对该哺乳动物产生显著毒性的任何量。本文描述的单链免疫细胞因子的有效量可以是任何适合的量。在一些情况下，本文描述的单链免疫细胞因子的有效量可以是哺乳动物(例如，人类)每千克体重约0.05毫克(mg)至约500mg(mg/kg；例如，约0.05mg/kg至约400mg/kg，约0.05mg/kg至约300mg/kg，约0.05mg/kg至约200mg/kg，约0.05mg/kg至约100mg/kg，约0.05mg/kg至约50mg/kg，约0.5mg/kg至约500mg/kg，约1mg/kg至约500mg/kg，约50mg/kg至约500mg/kg，约100mg/kg至约500mg/kg，约200mg/kg至约500mg/kg，约300mg/kg至约500mg/kg，约400mg/kg至约500mg/kg，约0.5mg/kg至约400mg/kg，约1mg/kg至约300mg/kg，约50mg/kg至约200mg/kg，约1mg/kg至约100mg/kg，约100mg/kg至约200mg/kg，约200mg/kg至约300mg/kg或约300mg/kg至约400mg/kg体重)。有效量可以保持不变或者可以根据哺乳动物对治疗的响应调整为浮动比例(sliding scale)或可变剂量。各种因素可以影响用于特定应用的实际有效量。例如，施用频率、治疗持续时间、多种治疗剂的使用、施用途径和/或状况(例如，癌症)的严重程度可能要求增加或降低施用的实际有效量。
含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的组合物的施用频率可以是可以治疗哺乳动物(例如，患有癌症和/或患有感染性疾病或有发展感染性疾病的风险的哺乳动物)而不对哺乳动物产生显著毒性的任何频率。例如，施用频率可以是约一天三次至约一周一次，约一天两次至约一周两次，或约一天一次至约一周两次。给药频率可以保持不变或在治疗持续时间期间可以是可变化的。用含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物治疗的过程可以包括休息时间(rest period)。例如，含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子的组合物可以在两周时间内每天施用，然后是两周的休息时间，并且这样的方案可以重复多次。与有效量一样，各种因素可以影响用于特定应用的实际施用频率。例如，有效量、治疗持续时间、多种治疗剂的使用、施用途径和/或状况(例如，癌症)的严重程度可能要求增加或降低施用频率。
施用含有本文描述的一种或更多种单链免疫细胞因子(例如，可以与IL-2Rβ/γc多肽复合物结合的单链免疫细胞因子)的组合物的有效持续时间可以是治疗哺乳动物(例如，患有癌症和/或患有感染性疾病或有发展感染性疾病的风险的哺乳动物)而不对该哺乳动物产生显著毒性的任何持续时间。例如，有效持续时间可以从几天至几周、几个月或几年变化。在一些情况下，癌症治疗的有效持续时间可以在约1个月至约10年的持续时间范围内。多种因素可以影响用于特定治疗的实际有效持续时间。例如，有效持续时间可以随施用频率、有效量、多种治疗剂的使用、施用途径和/或所治疗状况的严重程度而变化。
在一些情况下，可以监测哺乳动物内存在的癌症，和/或正在治疗的癌症的一种或更多种症状的严重程度。例如，可以监测正在治疗的哺乳动物内的癌细胞数量和/或肿瘤尺寸。可以使用任何适合的方法来确定哺乳动物内存在的癌细胞数量和/或肿瘤尺寸是否减少。例如，成像技术可以用于评估哺乳动物内存在的癌细胞数量。
可选地，本文描述的方法和材料可以用于治疗患有另一种状况的哺乳动物(例如，人类)，该状况可受益于在哺乳动物内刺激一种或更多种Eff和/或活化免疫应答。
将在以下实施例中进一步描述本发明，实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1：用于靶向扩增免疫效应T细胞的经工程化的细胞因子-抗体融合
抗体介导的免疫偏倚为靶向细胞因子疗法提供了令人兴奋的机会。事实上，IL-2和抗IL-2抗体S4B6之间的复合物在小鼠中诱导有效的抗肿瘤活性而不存在通常与全身性IL-2施用相关的副作用。然而，细胞因子/抗体复合物的临床转化受到后勤障碍的阻碍，诸如给药比例优化，以及对复合物稳定性的担忧，因为解离会诱发来自游离细胞因子的危险毒性。而且，S4B6识别小鼠IL-2(mIL-2)并且与人类IL-2(hIL-2)具有有限的交叉反应性。
本实施例描述了临床相关单链融合蛋白的工程化，该临床相关单链融合蛋白特异性刺激免疫效应T细胞以促进抗癌免疫。
材料和方法
蛋白表达和纯化
602抗体的VH和VL序列通过对602杂交瘤细胞进行PCR扩增来确定。将重组抗体配制成小鼠免疫球蛋白(IgG)2aκ同种型以匹配亲本克隆(图12，SEQ ID NO:1；和图13，SEQ IDNO:2)。将602抗体的重链(HC)和轻链(LC)分别克隆到gWiz载体(Genlantis)中。经由编码HC和LC的质粒的瞬时共转染，在人类胚胎肾(HEK)293F细胞中重组表达抗体。在小规模共转染测试中滴定HC和LC质粒以确定用于大规模表达的最佳比例。转染后5天，经由蛋白G亲和色谱，然后在FPLC仪器上进行尺寸排阻色谱，从细胞上清液中纯化分泌的抗体。通过SDS-PAGE分析验证纯度(>99％)。对于野生型602免疫细胞因子(IC)及其变体，将hIL-2细胞因子在LC的N-末端融合到完整的602抗体，通过柔性的(G4S)2、(G4S)3、(G4S)5或(G4S)7接头连接以允许分子内相互作用(图14，SEQ ID NO:3；图15，SEQ ID NO:23；图16，SEQ ID NO:24；和图17，SEQ ID NO:25)。将这些融合了hIL-2的602LC构建体也克隆到gWiz载体(Genlantis)中。通过瞬时共转染HEK 293F细胞表达IC，并按照针对602抗体所描述的进行纯化。如针对602和IC所描述的，经由HEK 293F细胞的瞬时转染产生含C末端六组氨酸标签的hIL-2细胞因子和hIL-2Rα和hIL-2Rβ受体细胞外结构域，并经由Ni-NTA亲和色谱随后在FPLC仪器上进行尺寸排阻色谱进行纯化。所有蛋白都储存在HEPES缓冲盐水中(HBS，10mM HEPES pH 7.3中150mMNaCl)。通过SDS-PAGE分析验证纯度(>99％)。
对于生物素化的hIL-2、hIL-2Rα和hIL-2Rβ的表达，表达含有C末端生物素受体肽(BAP；SEQ ID NO:30)的蛋白和经由Ni-NTA亲和色谱纯化，并且然后用0.5mM Bicine pH8.3中的可溶性BirA连接酶、100mM ATP、100mM乙酸镁和500mM生物素(Sigma)生物素化。在Superdex 200柱上通过尺寸排阻色谱除去过量的生物素。
细胞系
将HEK 293F细胞在补充有10U/mL青霉素-链霉素(Gibco)的Freestyle 293表达培养基(Thermo)中培养。将未修饰的YT-114和IL-2Rα+YT-1人类自然杀伤细胞在RPMI完全培养基(补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、最少非必需氨基酸、丙酮酸钠、25mM HEPES和青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基[Gibco])中培养，并在37℃保持在具有5％CO2的加湿气氛中。
生物层干涉测量术结合研究
对于IL-2对比免疫细胞因子亲和力滴定研究，将生物素化的人类IL-2Rα和IL-2Rβ受体固定到链霉抗生物素蛋白包被的尖端，用于在
Figure BDA0003494601640000291
Red96生物层干涉测量(BLI)仪器(ForteBio)上分析。固定少于5个信号单位(nm)的受体以使质量传递效应最小化。在96孔板中，将尖端暴露于系列稀释的hIL-2、602Ab、与602Ab复合的hIL-2(通过在室温以2:1比例预孵育hIL-2和602Ab 30分钟而形成)、602IC或对照IC(包含融合到无关的抗荧光素抗体[4-4-20]的轻链的N末端的hIL-2，具有与602的框架序列相同的框架序列)上300秒，并测量解离600秒。在参考孔中包含无关的蛋白(人类单克隆抗体曲妥珠单抗)以减去非特异性结合。所有相互作用的表面再生使用暴露于pH 3.0的0.1M甘氨酸15秒进行。实验在PBSA(pH7.3的磷酸盐缓冲盐水，添加0.1％牛血清白蛋白[BSA，Thermo Fisher Scientific])中于25℃进行。使用
Figure BDA0003494601640000301
Data Analysis软件7.1版(Molecular Devices)对数据进行可视化和处理。平衡滴定曲线拟合和KD值确定使用GraphPad Prism实现，假设所有结合相互作用为一级。实验重复了两次，具有相似结果。
YT-1细胞STAT5磷酸化研究
将约2×105个IL-2Rα-YT-1或IL-2Rα+YT-1细胞铺在96孔板的每个孔中，并重悬在含有系列稀释的hIL-2、hIL-2/602复合物或各种IC的RPMI完全培养基中。通过在室温以抗体或抗体片段与hIL-2的1:1摩尔比将602Ab与IL-2一起孵育30分钟来形成复合物。将细胞在37℃刺激15分钟，并立即通过将甲醛添加到1.5％来固定，并在室温孵育10分钟。通过在4℃重悬于冰冷的100％甲醇中30分钟来实现细胞的透化。用FACS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水[PBS]pH 7.2，含0.1％BSA[Thermo Fisher Scientific])洗涤固定和透化的细胞两次，并在室温与稀释在FACS缓冲液中的Alexa
Figure BDA0003494601640000302
647复合的抗STAT5 pY694(BDBiosciences)一起孵育2小时。然后将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次，并且在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman-Coulter)上确定MFI。将剂量-响应曲线拟合到逻辑模型，并且在减去未刺激细胞的平均荧光强度(MFI)并针对最大信号强度归一化后，使用GraphPad Prism数据分析软件计算半最大有效浓度(EC50)。实验一式三份地进行，并且进行三次，具有相似结果。
小鼠中免疫细胞亚群扩增研究
为了确定免疫复合物是否使免疫应答向有利于效应细胞扩增偏倚，向12周龄C57BL/6小鼠(每组3只)每天腹膜内(i.p.)注射PBS或hIL-2/602或mIL-2/S4B6复合物(通过将hIL-2[eBioscience]与602或S4B6以2:1细胞因子:抗体摩尔比在PBS中一起预孵育30分钟制备)，持续4天。在第5天通过颈椎脱位处死小鼠并收获脾。通过机械均质化制备单细胞悬浮液，并通过自动细胞计数器(Vicell，Beckman Coulter)评估每个脾的脾细胞绝对计数。将细胞重悬于PBS中，并随后在冰上用荧光团复合的抗小鼠单克隆抗体(mAb)染色30分钟，用于使用BV605复合的抗CD4(Biolegend，克隆RM4-5)、PeCy7复合的抗IL-2Rα(eBioscience，克隆PC61.5)、PerCP-Cy5.5复合的抗CD8(eBioscience，克隆53-6.72)和mAb对TReg(CD4+IL-2Rα+Foxp3+)或CD8+效应T细胞(CD8+)进行表型分型。可固定蓝色死细胞染色试剂盒(Fixable Blue Dead Cell Stain Kit，Life Techonologies)用于评估活细胞。然后用FACS缓冲液(1％BSA，1％叠氮化钠)洗涤细胞两次，并在冰上在FoxP3转录因子固定/透化缓冲液(eBioscience)中固定30分钟。在透化缓冲液(eBioscience)中洗涤两次后，将TReg细胞在冰上用FITC复合的抗小鼠/大鼠Foxp3 mAb(eBioscience，克隆FJK-16s)染色1小时。在透化缓冲液中进行最后两次洗涤，并将细胞重悬于FACS缓冲液中，用于在LSRII(BDBiosciences)上进行流式细胞术分析。使用FlowJo X软件(Tree Star)分析数据。展示了相对于PBS对照细胞，MP CD8+效应T细胞的丰度。实验进行三次，具有相似结果。
小鼠中肿瘤疗法研究
对于小鼠同基因黑色素瘤模型，将1×106个B16F10肿瘤细胞皮下(s.c.)接种到C57BL/6雄性小鼠(6-8周龄，每个治疗组n＝8)中。从接种后第4天开始，每周两次向小鼠腹膜内注射PBS或hIL-2/602复合物(通过将hIL-2与602以2:1细胞因子:抗体摩尔比一起预孵育30分钟制备)。每天追踪肿瘤尺寸和体重，以评估细胞因子/抗体复合物的功效。在第20天处死小鼠用于肿瘤切除和分析。
602scFv变体的诱变酵母展示文库(EP602)的产生
602抗体的单链可变片段(scFv)版本(由重链可变结构域随后轻链可变结构域组成，由(G4S)3接头分开)在酵母上展示，通过重链可变结构域的N末端融合到Aga2的C末端，并且两者由(G4S)3接头分开，带有3C和因子Xa裂解位点。包括C末端c-Myc标签用于检测。
产生了诱变重链和轻链可变结构域的CDR1和CDR3的靶向易错文库，以保持现有的IL-2相互作用，同时允许结合中潜在有益的、保守的改变。使用Taq聚合酶(New EnglandBiolabs)，用标准1×Taq缓冲液、2mM氯化锰(II)、7mM氯化镁、0.2mM的dATP和dGTP、1mMdCTP和dTTP、0.5μM的每种引物和0.2ng/μL的模板，通过易错PCR扩增四个靶向CDR。在五个扩增循环后，将混合物转移并以1:5稀释到缺乏模板的新鲜混合物中。继续进行另外五个循环，并且转移和稀释再重复两次，使最终转移总共经历20个扩增循环。
使用Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo Scientific)扩增了与靶向CDR相邻的五个框架序列。这些框架片段通过用Phusion聚合酶进行的顺序、成对重叠延伸PCR与相邻的诱变片段组装在一起。最终的组装片段含有完整的602scFv以及两端的同源序列(≥97nt)，这将提供与切割酵母展示载体pCT3CBN的重叠。
如先前描述的1,2，在存在线性骨架和片段的情况下电穿孔EBY100酵母后，通过酵母同源重组组装切割载体和诱变片段。该文库产生1.4×107个转化体，并在SDCAA培养基中生长48小时，然后传代，随后在初始OD为1后在SGCAA中诱导24小时。重组质粒的样品通过酵母质粒miniprep(Zymogen)提取，以证实片段正确地插入骨架。观察到约6％的产生误差率，即导致氨基酸序列变化的DNA突变。
EP602文库选择
每轮选择染色和分选足够的酵母，以确保剩余克隆的10倍覆盖率。将从每轮中选择的酵母在30℃在SDCAA液体培养基(pH 4.5)中生长过夜，持续2天，然后在20℃在SGCAA液体培养基(pH 4.5)中诱导2天。
通过消除Alexa Fluor 647-缀合的链霉抗生物素蛋白(SA-AF647)(ThermoScientific)的特异性变体，并选择结合IL-2的变体，使天然EP602文库在第一轮磁活化细胞选择(MACS)中减量(debulk)。所有染色均在PBE溶液(磷酸盐缓冲盐水pH 7.2，0.1％BSA和1mM乙二胺四乙酸(EDTA))中进行。在第一个MACS步骤中，将酵母与20μg/mL的SA-AF647在4℃一起孵育1小时，洗涤，并且然后与1:20的抗Cy5/抗Alexa Fluor 647微珠(MiltenyiBiotec)在4℃一起孵育20分钟，洗涤，并且然后根据制造商的方案在LS MACS分离柱(Miltenyi Biotec)上运行。收集流过柱的酵母(即非SA-AF647结合物)，并为第二个MACS步骤做准备。将生物素化的IL-2与在PBE中稀释的SA-647混合(4:1摩尔比；Thermo FisherScientific)并一起孵育15分钟以形成四聚体，并且将酵母与四聚体在4℃一起孵育2小时，以及然后洗涤并与之前一样与抗Cy5/抗Alexa Fluor 647微珠一起孵育。再次，将酵母在LSMACS分离柱上运行，但是在该步骤中，收集移除柱后从磁体上洗脱的细胞，并在被诱导用于下一轮选择之前如描述地生长。
第二轮选择通过使用MACS选择c-Myc的存在来分离全长602scFv变体。将酵母与在PBE中1:100稀释的Alexa Fluor 647缀合的抗-c-Myc抗体(克隆9B11，Cell SignalingTechnologies)在4℃一起孵育2小时，与抗Cy5/抗Alexa Fluor 647微珠一起孵育，并在LSMACS分离柱上运行。如以上描述的收集洗脱的细胞。
最后三轮选择通过在FACSymphony S6细胞分选仪(Becton Dickinson)上的荧光活化细胞分选(FACS)进行，在存在大量过量的IL-2Rα的情况下使用降低量的IL-2来选择竞争性阻断IL-2与IL-2Rα亚基相互作用的变体。这些竞争FACS选择中的第一轮使用50nM IL-2和1.5μM IL-2Rα，以及第二轮和第三轮都使用30nM IL-2和0.3μM IL-2Rα，但是与前两轮选择不同，第三轮选择通过与IL-2一起孵育、洗涤，并且然后在室温与IL-2Rα一起孵育2小时(允许IL-2解离)来选择具有低解离率的变体。在所有FACS选择中，仅收集了IL-2结合的前5％的变体。
酵母表面scFv结合研究
将展示scFvs的酵母(每孔2×105个)铺在96孔板中，并在含有生物素化的IL-2的PBE缓冲液中，在存在或不存在IL-2Rα的情况下在室温孵育4小时。然后洗涤细胞并用在PBSA中1:200稀释的AlexaFluor 647复合的链霉抗生物素蛋白(Thermo FisherScientific)在4℃染色15分钟。最后一次洗涤后，使用CytoFLEX流式细胞仪(BeckmanCoulter)分析细胞的靶结合。用一级结合模型拟合减去背景和归一化的结合曲线，并用GraphPad Prism软件确定平衡解离常数(KD)值。
结果
602免疫细胞因子由哺乳动物细胞稳健地产生。
为了将细胞因子的效力与抗体的药代动力学有利特性相结合，将hIL-2融合到细胞因子偏倚的602抗体(图1A)以产生免疫细胞因子(IC)。开发了一种快速的小规模HEK293F细胞转染测定来优化免疫细胞因子的表达。在6孔板中用预先明确的比例的HC和IL-2融合的LC质粒DNA转染细胞。孵育3天后，用蛋白G树脂从上清液中捕获分泌的蛋白，用0.1M甘氨酸pH 2.0洗脱，并经由SDS-PAGE分析。该测定使用包含在LC N末端融合到小鼠IgG2a抗体的hIL-2的免疫细胞因子来验证。HC:LC比例的滴定揭示了最佳表达条件(图1B)。免疫细胞因子表达在HEK 293F细胞中按比例放大，并且分泌的蛋白经由蛋白G色谱然后通过尺寸排阻色谱进行纯化。602IC在FPLC仪器上纯化至均一(图1C)。
免疫细胞因子选择性地偏倚受体结合和细胞信号传导。
使用
Figure BDA0003494601640000341
平台上的生物层干涉测量术，固定人类IL-2Rα和IL-2Rβ受体，并且将可溶性IC的测量结合与hIL-2细胞因子进行比较。由于抗体阻断，602IC不与IL-2Rα相互作用，但是相对于未拴系的hIL-2，IL-2Rβ结合被增强(图2)，确认了分子内抗体/细胞因子复合物的功能性形成。
分析IL-2响应性免疫细胞上对IC刺激的下游信号传导响应，以评估IC功能。为了表征由经工程化的IC介导的免疫偏倚，使用了诱导表达IL-2Rα的人类YT-1自然杀伤(NK)细胞系。进行基于流式细胞术的研究以定量由IL-2、细胞因子/抗体复合物(通过以1:1的化学计量等摩尔比预孵育IL-2和602抗体来制备)或602IC在未诱导的IL-2Rα-与诱导的IL-2Rα+YT-1细胞(作为Eff的替代物)上引发的STAT5磷酸化对比TReg活化。未拴系的IL-2刺激IL-2Rα+和IL-2Rα-细胞二者，并且hIL-2/602复合物对IL-2Rα+和IL-2Rα-YT-1细胞二者表现出受损的活性。观察到602IC有效地重演了hIL-2/602复合物的细胞信号传导特性(图3)，表明与混合的复合物一样，602IC使细胞因子信号传导向Eff偏倚。
IL-2/602复合物在体内扩增Eff并抑制肿瘤生长。
为了确定IL-2/602复合物是否能在活的动物中扩增Eff(特别是MP CD8+效应T细胞)，向小鼠注射PBS或不同浓度的hIL-2/602或mIL-2/S4B6复合物。观察到hIL-2/602复合物扩增MP CD8+效应T细胞，尽管比mIL-2/S4B6复合物的效力低(图4A)。进一步显示，在小鼠同基因黑色素瘤模型(B16F10)中，每周两次施用hIL-2/602复合物显著抑制肿瘤生长(图4B)。
修改接头长度优化了602免疫细胞因子的产生和功能。
为了提高602IC的表达、稳定性和功能，调整了免疫细胞因子内IL-2细胞因子和602抗体之间的分子内接头的长度。具体地，创建了具有15个(SEQ ID NO:23，602IC LN15)、25个(SEQ ID NO:24，602IC LN25)和35个(SEQ ID NO:25，602IC LN35)氨基酸的接头的602IC变体。所有构建体都经由用602重链和IL-2融合的602轻链以及适合长度的接头瞬时共转染HEK293F细胞来表达。如图5A中示出的，通过尺寸排阻色谱显示3个峰。前2个峰(峰1和峰2)对应于高分子量寡聚物，而峰3对应于单体IC。随着接头长度的增加，单体的级分也增加，并且602IC LN35几乎排他地处于单体状态。因此，我们基于35个氨基酸的接头构建继续进一步表征免疫细胞因子。经由非还原和还原SDS-PAGE分析，所有602IC变体以预期分子量迁移(图5B)。
使用
Figure BDA0003494601640000351
平台，经由生物层干涉测量研究，验证了正确的组装并询问了602IC变体的结合特性。固定人类IL-2Rβ并测量IL-2、602抗体、IL-2+602Ab复合物(通过在室温以2:1的化学计量比预孵育IL-2和602抗体30分钟制备)、602IC变体和无关的阴性对照蛋白的结合。如基于免疫细胞因子内IL-2和602之间的分子内相互作用所预期的，与未缀合的IL-2相比，IC与IL-2Rβ的相互作用增强，表明602IC的正确的组装和生物物理行为(图6)。
在IL-2响应性免疫细胞上评估对用IC变体的刺激的下游信号传导响应，以评估功能。使用有和没有IL-2Rα表达的人类YT-1NK细胞来模拟TReg对比免疫效应细胞的响应。在用IL-2、IL-2+602Ab复合物(通过在室温以1:1的化学计量比预孵育IL-2和602抗体30分钟制备)或602IC变体刺激后，通过流式细胞术定量IL-2介导的STAT5磷酸化(图7)。未栓系的IL-2显示出对IL-2Rα+TReg样细胞活化的3-4倍的偏倚，而主要的IC即602IC LN35将这种偏倚逆转至有利于IL-2Rα-Eff样细胞。注意到，由IC介导的偏倚超过了由IL-2+602Ab复合物介导的偏倚。
602IC的经工程化版本改进了对效应细胞的偏倚。
为了进一步使602IC的活性偏向Eff而不是TReg细胞，产生了易错的诱变文库，该文库随机化了602可变重链和轻链的互补决定环(CDR)。然后，通过迭代轮次的磁活化细胞分选(MACS)和荧光活化细胞分选(FACS)，针对人类IL-2使该文库演化，并选择对于细胞因子接合成功地胜过可溶性IL-2Rα的克隆。在5轮选择后，演化的文库显示与IL-2的结合显著改进(图8A)并增强了与IL-2Rα受体亚基的竞争(图8B)。对来自该文库的单个克隆进行表征，发现最有效的突变体是F10表示的变体(SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29)。如图8C中示出的，与亲本602scFv相比，F10抗体(单链可变片段[scFv]形式)表现出与IL-2更强的结合以及与IL-2Rα更强的竞争。使用优化的35个氨基酸的接头将F10抗体重新格式化为IC。经由抗体重链和IL-2融合的抗体轻链的瞬时共转染，从HEK 293F细胞表达F10 IC LN35。如图9A中示出的，大多数分泌的蛋白是单体的。还制备了由融合到IL-2的无关的抗体和35个氨基酸的接头组成的IC构建体作为实验对照(Irrel.Ab IC LN35)。经由非还原和还原SDS-PAGE，F10IC LN35和无关的抗体以预期的分子量迁移(图9B)。
为了验证F10 IC LN35的组装和正确的结合行为，使用
Figure BDA0003494601640000361
仪器进行了生物层干涉术测量实验。固定人类IL-2、IL-2Rα和IL2Rβ受体，并测量602抗体、IL-2+602Ab复合物(通过在室温以2:1的化学计量比预孵育IL-2和602抗体30分钟制备)、602IC LN35、F10 ICLN35和无关的阴性对照蛋白的结合。与未缀合的602抗体相比，由于来自IC内分子内相互作用的竞争，IC与IL-2的相互作用大大减弱(图10A)。此外，与602IC LN35一样，F10 IC LN35由于IL-2细胞因子结合的抗体阻断而表现出与IL-2Rα的最小结合，并且如所设计的，对于受体来说，F10 IC LN35比602IC LN35更具竞争性(图10B)。对于602IC LN35和F10 IC LN35二者，与未缀合的IL-2相比，与IL-2Rβ的结合增强(图10C)。总的来说，这些结合研究表现出经工程化的IC变体F10 IC LN35的分子内组装和生物物理功能性。
使用YT-1人类NK细胞系证明了相比于IL-2Rα+TReg样细胞，F10LN35 IC对IL-2Rα-Eff样细胞的优越的偏倚。用IL-2、无关的抗体Ab IC LN35、IL-2+602Ab复合物(通过在室温以1:1的化学计量比预孵育IL-2和602抗体30分钟制备)、602IC LN35或F10 LN35刺激有和没有IL-2Rα的YT-1。经由流式细胞术检测STAT5磷酸化，作为IL-2诱导的信号传导的读出(图11)。尽管IL-2和对照无关的抗体Ab IC LN35对IL-2Rα+TReg样细胞而不是IL-2Rα-Eff样细胞显示出显著的偏倚，但F10 IC LN35逆转了这种偏好，并稍微胜过亲本602IC LN35。与IL-2+602复合物相比，F10 IC LN35和602IC LN35二者对Eff样细胞表现出对比TReg样细胞显著更强的偏好。
小结
这些结果表明，IL2/602免疫细胞因子可以刺激免疫效应细胞活性，并且可以用于治疗患有癌症和/或感染性疾病的哺乳动物。
其他实施方案
应当理解，虽然本发明结合其详细描述被描述，前述的描述意图是说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求书的范围内。
序列表自由文本：
SEQ ID NO：1
信号序列-602VH-小鼠IgG2a CH1、CH2和CH3
Figure BDA0003494601640000381
SEQ ID NO：2
信号序列-602VL-小鼠κCL
Figure BDA0003494601640000382
SEQ ID NO：3
信号序列-hIL-2-接头-602VL-小鼠κCL
Figure BDA0003494601640000383
SEQ ID NO：4
602HC可变结构域
Figure BDA0003494601640000384
SEQ ID NO：5
602HC恒定结构域
Figure BDA0003494601640000391
SEQ ID NO：6
信号序列
Figure BDA0003494601640000392
SEQ ID NO：7
信号序列
Figure BDA0003494601640000393
SEQ ID NO：8
信号序列
Figure BDA0003494601640000394
SEQ ID NO：9
人类IL-2
Figure BDA0003494601640000395
SEQ ID NO：10
602LC可变结构域
Figure BDA0003494601640000396
SEQ ID NO：11
602LC恒定结构域
Figure BDA0003494601640000401
SEQ ID NO：12
接头
Figure BDA0003494601640000402
SEQ ID NO：13
接头
Figure BDA0003494601640000403
SEQ ID NO：14
接头
Figure BDA0003494601640000404
SEQ ID NO：15
接头
Figure BDA0003494601640000405
SEQ ID NO：16
接头
Figure BDA0003494601640000406
SEQ ID NO：17
接头
Figure BDA0003494601640000407
SEQ ID NO：18
接头
Figure BDA0003494601640000411
SEQ ID NO：19
接头
Figure BDA0003494601640000412
SEQ ID NO：20
接头
Figure BDA0003494601640000413
SEQ ID NO：21
接头
Figure BDA0003494601640000414
SEQ ID NO：22
接头
Figure BDA0003494601640000415
SEQ ID NO：23
信号序列-hIL-2-接头-602VL-小鼠κCL
Figure BDA0003494601640000416
SEQ ID NO：24
信号序列-hIL-2-接头-602VL-小鼠κCL
Figure BDA0003494601640000421
SEQ ID NO：25
信号序列-hIL-2-接头-602VL-小鼠κCL
Figure BDA0003494601640000422
SEQ ID NO：26
信号序列-602变体F10 VH-小鼠IgG2a GH1、CH2和CH3
Figure BDA0003494601640000423
SEQ ID NO：27
信号序列-hIL-2-接头-602变体F10 VL-小鼠κCL
Figure BDA0003494601640000431
SEQ ID NO：28
602变体F10 VH
Figure BDA0003494601640000432
SEQ ID NO：29
602变体F10 VL
Figure BDA0003494601640000433
SEQ ID NO：30
生物素受体肽
Figure BDA0003494601640000434
序列表
<110> 约翰霍普金斯大学
<120> 用于靶向扩增免疫效应细胞的方法和材料
<130> 44807-0333WO1
<150> 62/867,010
<151> 2019-06-26
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 重组抗体重链多肽序列
<400> 1
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
35 40 45
Ser Leu Thr Asn Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Gly Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Arg Thr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
195 200 205
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
210 215 220
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
225 230 235 240
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
260 265 270
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
275 280 285
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
290 295 300
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
325 330 335
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
355 360 365
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
370 375 380
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
385 390 395 400
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
420 425 430
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
435 440 445
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
450 455 460
Lys
465
<210> 2
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 重组抗体轻链多肽序列
<400> 2
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Ala Gly Ser Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser
20 25 30
Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
35 40 45
Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser
165 170 175
Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu
195 200 205
Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser
210 215 220
Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 3
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫细胞因子轻链多肽序列
<400> 3
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val
165 170 175
Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile
180 185 190
Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg
195 200 205
Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser
225 230 235 240
Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Gly
245 250 255
Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
260 265 270
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
290 295 300
Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn
305 310 315 320
Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
325 330 335
Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His
340 345 350
Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile
355 360 365
Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
370 375
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫球蛋白602重链可变结构域多肽序列
<400> 4
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gln Gly Arg Thr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ala
<210> 5
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫球蛋白602重链恒定结构域多肽序列
<400> 5
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 信号序列
<400> 6
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 信号序列
<400> 7
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys
20
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 信号序列
<400> 8
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫球蛋白602轻链可变结构域多肽序列
<400> 10
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫球蛋白602轻链恒定结构域多肽序列
<400> 11
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 17
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 18
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 19
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 20
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 21
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55
<210> 22
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 多肽接头
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
<210> 23
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫细胞因子轻链多肽序列
<400> 23
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro
165 170 175
Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys
180 185 190
Ala Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
195 200 205
Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
210 215 220
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr
225 230 235 240
Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
245 250 255
Gln Gln Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
260 265 270
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
275 280 285
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
290 295 300
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
305 310 315 320
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
325 330 335
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
340 345 350
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
355 360 365
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
370 375 380
<210> 24
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫细胞因子轻链多肽序列
<400> 24
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser
180 185 190
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile Tyr
195 200 205
Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu
210 215 220
Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
225 230 235 240
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu
245 250 255
Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Gly Thr
260 265 270
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp
275 280 285
Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr
290 295 300
Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys
305 310 315 320
Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly
325 330 335
Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
340 345 350
Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn
355 360 365
Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val
370 375 380
Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
385 390
<210> 25
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫细胞因子轻链多肽序列
<400> 25
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Val
180 185 190
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr
195 200 205
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr
210 215 220
Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr
225 230 235 240
Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala
260 265 270
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
275 280 285
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
290 295 300
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
305 310 315 320
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
325 330 335
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
340 345 350
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
355 360 365
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
370 375 380
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
385 390 395 400
Glu Cys
<210> 26
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫细胞因子重链多肽序列
<400> 26
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
35 40 45
Ser Leu Thr Asn Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Gly Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Arg Ser Pro Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
195 200 205
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
210 215 220
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
225 230 235 240
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
260 265 270
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
275 280 285
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
290 295 300
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
325 330 335
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
355 360 365
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
370 375 380
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
385 390 395 400
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
420 425 430
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
435 440 445
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
450 455 460
Lys
465
<210> 27
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫细胞因子轻链多肽序列
<400> 27
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Val
180 185 190
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr
195 200 205
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr
210 215 220
Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr
225 230 235 240
Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala
260 265 270
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asp Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
275 280 285
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
290 295 300
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
305 310 315 320
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
325 330 335
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
340 345 350
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
355 360 365
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
370 375 380
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
385 390 395 400
Glu Cys
<210> 28
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫球蛋白602 F10变体重链可变结构域多肽序列
<400> 28
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gln Gly Arg Ser Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ala
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 免疫球蛋白602 F10变体轻链可变结构域多肽序列
<400> 29
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asp Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 生物素受体肽
<400> 30
Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10

Claims (50)

1.一种单链免疫细胞因子，所述单链免疫细胞因子包含：
免疫球蛋白重链；
IL-2多肽，其中所述IL-2多肽可以结合包含白细胞介素-2受体-β(IL-2Rβ)多肽和共同γ链(γc)多肽的多肽复合物(IL-2Rβ/γc多肽复合物)；和
免疫球蛋白轻链；
其中所述单链免疫细胞因子与所述IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。
2.根据权利要求1所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白重链包含可变结构域，所述可变结构域与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性或与SEQ IDNO:28中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性。
3.根据权利要求2所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白重链包含可变结构域，所述可变结构域具有SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白重链包含γ重链恒定结构域。
5.根据权利要求4所述的单链免疫细胞因子，其中所述γ重链恒定结构域与SEQ IDNO:5中列出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白重链包含恒定结构域，所述恒定结构域具有SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白重链包含信号序列。
8.根据权利要求7所述的单链免疫细胞因子，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白重链包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的单链免疫细胞因子，其中所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的单链免疫细胞因子，其中所述IL-2多肽包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含可变结构域，所述可变结构域与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性或与SEQ IDNO:29中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性。
13.根据权利要求12所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含可变结构域，所述可变结构域具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含κ轻链恒定结构域。
15.根据权利要求14所述的单链免疫细胞因子，其中所述κ轻链恒定结构域与SEQ IDNO:11中列出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含可变结构域，所述可变结构域具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含信号序列。
18.根据权利要求17所述的单链免疫细胞因子，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。
20.根据权利要求1所述的单链免疫细胞因子，其中所述IL-2多肽和所述免疫球蛋白轻链是融合多肽。
21.根据权利要求20所述的单链免疫细胞因子，其中所述IL-2多肽包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的单链免疫细胞因子，其中所述IL-2多肽包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列。
23.根据权利要求20所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含可变结构域，所述可变结构域与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性或与SEQID NO:29中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性。
24.根据权利要求23所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含可变结构域，所述可变结构域具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列。
25.根据权利要求23-24中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含κ轻链恒定结构域。
26.根据权利要求25所述的单链免疫细胞因子，其中所述κ轻链恒定结构域与SEQ IDNO:11中列出的氨基酸序列具有至少70％的同一性。
27.根据权利要求25-26中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含可变结构域，所述可变结构域具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述IL-2多肽和所述免疫球蛋白轻链经由接头融合。
29.根据权利要求28所述的单链免疫细胞因子，其中所述接头是包含10个至60个氨基酸的肽接头。
30.根据权利要求29所述的单链免疫细胞因子，其中所述接头是(Gly4Ser)2接头。
31.根据权利要求20-30中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含信号序列。
32.根据权利要求31所述的单链免疫细胞因子，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。
33.根据权利要求20-32中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述免疫球蛋白轻链包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中任一项中列出的氨基酸序列。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述单链免疫细胞因子具有约5分钟至约6个月的半衰期。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述单链免疫细胞因子具有对IL-2Rβ多肽约300nM KD至约1pM KD的亲和力。
36.根据权利要求1-33中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述单链免疫细胞因子具有对IL-2Rα多肽大于约10nM KD的亲和力。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的单链免疫细胞因子，其中所述单链免疫细胞因子与人类IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。
38.根据权利要求37所述的单链免疫细胞因子，其中所述单链免疫细胞因子不与非人类IL-2Rβ/γc多肽复合物结合。
39.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-38中任一项所述的单链免疫细胞因子。
40.根据权利要求39所述的核酸，所述核酸包含第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸可以编码所述免疫球蛋白重链，以及其中所述第二核酸可以编码融合到所述免疫球蛋白轻链的所述IL-2多肽。
41.一种用于治疗患有癌症的哺乳动物的方法，所述方法包括：
向所述哺乳动物施用包含根据权利要求1-38中任一项所述的单链免疫细胞因子的组合物或包含根据权利要求39-40中任一项所述的核酸的组合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
43.根据权利要求41-42中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤、口腔癌、膀胱癌、结肠直肠癌、宫颈癌、食管癌和子宫癌。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，所述方法还包括在其中所述哺乳动物中存在的癌细胞数量减少的条件下向所述哺乳动物施用一种或更多种癌症治疗。
45.一种用于刺激哺乳动物中效应细胞的方法，所述方法包括：
向所述哺乳动物施用包含根据权利要求1-38中任一项所述的单链免疫细胞因子的组合物或包含根据权利要求39-40中任一项所述的核酸的组合物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
47.一种用于治疗患有感染性疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括：
向所述哺乳动物施用包含根据权利要求1-38中任一项所述的单链免疫细胞因子的组合物或包含根据权利要求39-40中任一项所述的核酸的组合物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
49.根据权利要求47-48中任一项所述的方法，其中所述感染性疾病选自由以下组成的组：人类免疫缺陷病毒、疟疾、流感、埃博拉、结核病、麻疹、狂犬病、登革热、沙门氏菌病、百日咳、鼠疫和西尼罗热。
50.根据权利要求41-49中任一项所述的方法，其中所述方法基本上不活化调节性T细胞。
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