KR20220054579A - 면역 효과기 세포의 표적화된 확장을 위한 방법 및 재료 - Google Patents

면역 효과기 세포의 표적화된 확장을 위한 방법 및 재료 Download PDF

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자쿠브 토말라
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세스 루드빅
엘리사 캐슬린 레오나드
마렉 코바
지리나 코바로바
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

본 문서는 면역 효과기(Eff) T 세포의 표적화된 확장을 위한 방법 및 재료에 관한 것이다. 예를 들어, 인터루킨-2 수용체-β(IL-2Rβ) 폴리펩티드 및 공통 감마 사슬(γc) 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 수용체(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체)에 결합할 수 있는 하나 이상의 아미노산 사슬(예를 들어, 하나 이상의 단일쇄 항체/사이토카인 융합 단백질(면역사이토카인))을 함유하는 조성물이 포유동물 내의 Eff를 자극시켜 상기 포유동물에서 면역 반응을 활성화시키기 위해 포유동물에 투여될 수 있다. 일부 경우에, 면역 반응의 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환(예를 들어, 암 및/또는 감염성 질병)을 갖는 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있는 방법 및 재료가 제공된다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물이 포유동물을 치료하기 위해 암 및/또는 감염성 질병을 갖는 포유동물에 투여될 수 있다.

Description

면역 효과기 세포의 표적화된 확장을 위한 방법 및 재료
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2019년 6월 26일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 62/867,010호의 이익을 주장한다. 선행 출원의 개시는 본 출원의 개시의 일부로 간주된다(그리고 참조로서 본 출원의 개시에 포함된다).
1. 기술 분야
본 문서는 면역 효과기 세포(Eff)의 표적화된 확장을 위한 방법 및 재료에 관한 것이다. 예를 들어, 인터루킨-2 수용체-β(IL-2Rβ) 폴리펩티드 및 공통 감마 사슬(γc) 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 수용체(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체)에 결합할 수 있는 하나 이상의 아미노산 사슬(예를 들어, 하나 이상의 단일쇄 항체/사이토카인 융합 단백질(면역사이토카인))을 함유하는 조성물은 포유동물 내의 Eff 세포를 자극시켜 상기 포유동물에서 면역 반응을 활성화시키기 위해 포유동물에 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법 및 재료는 면역 반응(예를 들어, 암 및/또는 감염성 질병)의 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 갖는 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 암 및/또는 감염성 질병을 갖는 포유동물에 투여될 수 있다.
2. 배경 정보
IL-2는 면역 세포의 분화, 증식, 생존 및 활성을 조율하는 다기능성 사이토카인이다. 이의 면역 반응의 강력한 활성화로 인해, 고용량 IL-2 요법은 항암 면역을 자극하기 위해 임상적으로 사용되었으며, 1992년에 전이성 신장 세포 암종의 치료를 위해 그리고 1998년에 전이성 흑색종에 대해 FDA 승인을 받았다(Liao et al., Immunity. 38(1):13-25 (2013)). 환자 자신의 면역계를 활성화시킴으로써, IL-2 요법은 환자의 5-10%에서 완전하고 지속적인 반응을 유도한다(Rosenberg et al., Sci Transl Med. 4(127):127ps8 (2012)). 그러나, IL-2는 Eff(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, CD4+ 효과기 T 세포 및 CD8+ 효과기 T 세포) 및 조절 T 세포(TReg) 둘 모두를 동시에 활성화시키며, 이는 효능을 제한하고 유해한 표적-외 효과 및 독성, 가장 현저하게는 심각한 혈관 누출 증후군을 발생시키며, 이는 부종, 장기 부전 및 사망을 초래할 수 있다(Boyman et al., Nat Rev Immunol. 12(3):180-190 (2012); 및 Dhupkar et al., Adv Exp Med Biol. 995:33-51 (2017)). 더욱이, IL-2의 소실될 정도로 짧은 반감기(<5분)는 이의 임상 성능을 방해한다(Donohue et al., J Immunol Baltim Md 1950. 130(5):2203-2208 (1983)).
IL-2는 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 γc 사슬로 구성된 고친화성(KD
Figure pct00001
10 pM) 이종삼량체 수용체, 또는 IL-2Rβ 및 γc 사슬로만 구성된 중간 친화성(KD
Figure pct00002
1 nM) 이종이량체 수용체를 통해 세포 신호전달을 활성화시킨다. 결과적으로, IL-2 반응성은 IL-2Rα 서브유닛에 의해 결정되는데, 이는 TReg에서 고도로 발현되지만, 나이브 Eff에서는 사실상 부재하여 TReg를 IL-2에 100배 더 민감하게 만든다(예를 들어, 문헌[Boyman et al., Nat Rev Immunol. 12(3):180-90 (2012); Malek, Annu Rev Immunol. 26:453-79 (2008); 및 Spangler et al., Annu Rev Immunol. 33:139-67 (2015)] 참조). IL-2의 면역자극 활성을 분리하고 선택적으로 조정하는 능력은 암 및 감염성 질병의 치료에 중요한 의미를 갖는 면역치료 발달을 위한 변형적 진보를 나타낼 것이다.
본 문서는 Eff의 표적화된 확장을 위한 방법 및 재료를 제공한다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인이 본원에 제공된다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인은 면역글로불린 중쇄(VH), IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편), 및 면역글로불린 경쇄(VL)를 포함할 수 있다(예를 들어, 이를 포함하도록 설계될 수 있다). IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인을 제조하고 사용하기 위한 방법이 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 이를 필요로 하는 포유동물(예를 들어, 암 및/또는 감염성 질병과 같은 포유동물 내에서 면역 반응을 활성화시킴으로써 이익을 얻을 수 있는 질환을 갖는 포유동물)에 투여될 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물 내에서 하나 이상의 Eff를 자극하기 위해(예를 들어, 상기 포유동물에서 면역 반응을 활성화시키기 위해) 포유동물에 투여될 수 있다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 암을 갖는 포유동물에 투여될 수 있다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 감염성 질병을 갖거나 감염성 질병이 발병할 위험이 있는 포유동물에 투여될 수 있다.
본원에서 입증된 바와 같이, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합하도록 조작된 단일쇄 면역사이토카인은 생체 내에서 면역 Eff를 특이적으로 자극(예를 들어, 확장)할 수 있고, 생체 내에서 종양 성장을 억제할 수 있다. 포유동물(예를 들어, 인간)에서 직접 면역 Eff(예를 들어, TReg가 아님)를 자극하는 능력을 갖는 것은 포유동물(예를 들어, 인간)에서 효과적인 면역 반응을 안전하고 선택적으로 촉진할 수 있는 독특하고 실현되지 않은 표적화된 사이토카인 요법을 제공하며, 암 및/또는 감염성 질병을 갖거나 암 및/또는 감염성 질병을 가질 것으로 의심되는 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 문서의 일 양태는 (a) 면역글로불린 중쇄; (b) IL-2 폴리펩티드(여기서, IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있음); 및 (c) 면역글로불린 경쇄를 포함하는 단일쇄 면역사이토카인을 특징으로 하며, 상기 단일쇄 면역사이토카인은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합한다. 면역글로불린 중쇄는 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 γ 중쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. γ 중쇄 불변 도메인은 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 가질 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 신호 서열을 포함할 수 있다. 신호 서열은 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:26에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. IL-2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. IL-2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인. 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 카파(κ) 경쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. κ 경쇄 불변 도메인은 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 가질 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 신호 서열을 포함할 수 있다. 신호 서열은 SEQ ID NO:7에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:2에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. IL-2 폴리펩티드 및 면역글로불린 경쇄는 융합 폴리펩티드일 수 있다. IL-2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. IL-2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 κ 경쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. κ 경쇄 불변 도메인은 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 가질 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. IL-2 폴리펩티드 및 면역글로불린 경쇄는 링커를 통해 융합될 수 있다. 링커는 10 내지 60개의 아미노산을 포함할 수 있는 펩티드 링커일 수 있다. 링커는 (Gly4Ser)2 링커일 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 신호 서열을 포함할 수 있다. 신호 서열은 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 단일쇄 면역사이토카인은 약 5분 내지 약 6개월의 반감기를 가질 수 있다. 단일쇄 면역사이토카인은 약 300 nM KD 내지 약 1 pM KD의 IL-2Rβ 폴리펩티드에 대한 친화성을 가질 수 있다. 단일쇄 면역사이토카인은 약 10 nM KD 초과의 IL-2Rα 폴리펩티드에 대한 친화성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 단일쇄 면역사이토카인은 인간 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 단일쇄 면역사이토카인은 비-인간 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합하지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 문서는 (a) 면역글로불린 중쇄; (b) IL-2 폴리펩티드(여기서, IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있음); 및 (c) 면역글로불린 경쇄를 포함하는 단일쇄 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산을 특징으로 하며, 상기 단일쇄 면역사이토카인은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합한다. 핵산은 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함할 수 있으며, 상기 제1 핵산은 면역글로불린 중쇄를 인코딩할 수 있고, 상기 제2 핵산은 면역글로불린 경쇄에 융합된 IL-2 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 문서는 암을 갖는 포유동물을 치료하기 위한 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (a) 면역글로불린 중쇄; (b) IL-2 폴리펩티드(여기서, IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있음); 및 (c) 면역글로불린 경쇄를 포함하는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 포함하는 조성물(여기서, 단일쇄 면역사이토카인은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합함), 또는 (a) 면역글로불린 중쇄; (b) IL-2 폴리펩티드(여기서, IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있음); 및 (c) 면역글로불린 경쇄를 포함하는 단일쇄 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물(여기서, 단일쇄 면역사이토카인은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결함함)을 암을 갖는 포유동물에 투여하는 것을 포함하거나, 이를 필수적 요소로 하여 구성(consist essentially of)될 수 있다. 포유동물은 인간일 수 있다. 암은 유방암, 난소암, 전립선암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 구강암, 방광암, 결장직장암, 자궁경부암, 식도암 또는 자궁암일 수 있다. 상기 방법은 또한 포유동물에 존재하는 암세포의 수가 감소되는 조건하에 포유동물에 하나 이상의 암 치료를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 조절 T 세포를 실질적으로 활성화시키지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 문서는 포유동물에서 효과기 세포를 자극하기 위한 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (a) 면역글로불린 중쇄; (b) IL-2 폴리펩티드(여기서, IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있음); 및 (c) 면역글로불린 경쇄를 포함하는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 포함하는 조성물(여기서, 단일쇄 면역사이토카인은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합함), 또는 (a) 면역글로불린 중쇄; (b) IL-2 폴리펩티드(여기서, IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있음); 및 (c) 면역글로불린 경쇄를 포함하는 단일쇄 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물(여기서, 단일쇄 면역사이토카인은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결함함)을 포유동물에 투여하는 것을 포함하거나, 이를 필수적 요소로 하여 구성될 수 있다. 포유동물은 인간일 수 있다. 상기 방법은 조절 T 세포를 실질적으로 활성화시키지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 문서는 감염성 질병을 갖는 포유동물을 치료하기 위한 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 (a) 면역글로불린 중쇄; (b) IL-2 폴리펩티드(여기서, IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있음); 및 (c) 면역글로불린 경쇄를 포함하는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 포함하는 조성물(여기서, 단일쇄 면역사이토카인은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합함), 또는 (a) 면역글로불린 중쇄; (b) IL-2 폴리펩티드(여기서, IL-2 폴리펩티드는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있음); 및 (c) 면역글로불린 경쇄를 포함하는 단일쇄 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물(여기서, 단일쇄 면역사이토카인은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결함함)을 감염성 질병을 갖는 포유동물에 투여하는 것을 포함하거나, 이를 필수적 요소로 하여 구성될 수 있다. 포유동물은 인간일 수 있다. 감염성 질병은 인간 면역결핍 바이러스, 말라리아, 인플루엔자, 에볼라, 결핵, 홍역, 광견병, 뎅기열, 살모넬라증, 백일해, 페스트 또는 웨스트 나일 열(West Nile fever)일 수 있다. 상기 방법은 조절 T 세포를 실질적으로 활성화시키지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 발명의 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 단지 예시이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 하기 수반되는 도면 및 설명에 기재된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a - 1c. 사이토카인-항체 융합체(면역사이토카인, IC) 발현. 도 1a는 IL-2-602 면역사이토카인 레이아웃의 개략도를 포함한다. IL-2 사이토카인은 가요성 링커에 의해 연결된 전장 602 항체의 경쇄(LC)의 N-말단에 융합된다. 도 1b는 IL-2-항체 면역사이토카인의 소규모 발현 적정의 SDS-PAGE 분석을 포함한다. HC 대 IL-2-복합체화 LC의 DNA 형질감염 비율이 표시된다. 밴드는 예상 분자량(MW)에서 관찰된다. 도 1c는 면역사이토카인의 FPLC 정제로부터의 크기 배제 크로마토그래피 트레이스(trace)를 포함한다. SDS-PAGE 분석은 단백질이 균질성으로 정제되었음을 제시한다.
도 2. IC는 편향된 IL-2 수용체 결합을 나타낸다. 생물층 간섭계에 의해 측정된 바와 같은 고정된 인간 IL-2Rα 또는 IL-2Rβ 수용체 서브유닛에 대한 hIL-2 및 602 IC의 결합 적정.
도 3. 602 IC는 사이토카인/항체 복합체의 신호전달 거동을 반복(recapitulate)한다. 흐름세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 IL-2Rα가 있거나(상단) 없는(하단) YT-1 세포에서 IL-2, IL-2/602 복합체 또는 602 IC에 대해 반응한 STAT5 활성화.
도 4a-4b. IL-2/602 복합체는 Eff 활성을 자극한다. 도 4a는 4일 동안 매일 PBS, IL-2/602 복합체 또는 IL-2/S4B6으로 처리된 마우스의 비장에서 기억 표현형(MP) CD8+ 효과기 T 세포의 상대적 확장을 제시하는 그래프를 포함한다. 도 4b는 접종 후 20일에 마우스로부터 추출된 B16F10 흑색종 종양의 이미지를 포함한다. 마우스는 PBS 또는 IL-2/602 복합체로 매주 2회 처리되었다.
도 5a-5b. 다양한 링커 길이를 갖는 602 IC의 발현. 도 5a는 10, 15, 25 및 35개 아미노산의 링커 길이를 갖는 재조합적으로 생성된 602 IC로부터의 크기 배제 크로마토그래피 트레이스를 제시한다. 초기 피크(피크 1 및 2)는 올리고머 IC에 해당하는 반면, 피크 3은 단량체 IC에 해당하는 것을 주목한다. 도 5b는 재조합적으로 발현된 602 항체(Ab), 602 IC LN15, 602 IC LN25 및 602 IC LN35의 비-환원 및 환원 SDS-PAGE 분석을 제시한다.
도 6. 링커 길이 변이체 IC는 예상되는 IL-2 수용체 결합 특성을 나타낸다. 도 6은 생물층 간섭계에 의해 측정된 바와 같은 고정된 hIL-2Rβ에 대한 IL-2, 602 항체(Ab), IL-2+602 Ab 복합체(2:1 비율, 37℃에서 30분 동안 사전 인큐베이션됨), 602 IC 변이체 및 관련되지 않은 음성 대조군 단백질의 결합 적정을 제시한다.
도 7a-7c. 602 IC는 면역 효과기 세포에 유리한 편향된 신호전달을 나타낸다. 도 7a는 흐름세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 IL-2Rα를 발현하는 YT-1 인간 NK 세포(TReg 세포의 대표)에서의 IL-2, IL-2+602 항체(Ab) 복합체(1:1 비율, 실온에서 30분 동안 사전인큐베이션됨) 또는 602 IC 변이체에 대해 반응한 STAT5 활성화를 제시한다. 도 7b는 흐름세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 IL-2Rα를 발현하지 않는 YT-1 인간 NK 세포(면역 효과기 세포에 대한 대리물)에서의 IL-2, IL-2+602 Ab 복합체(1:1 비율, 실온에서 30분 동안 사전인큐베이션됨) 또는 602 IC 변이체에 대해 반응한 STAT5 활성화를 제시한다. 도 7c는 IL-2, IL-2+602 Ab 및 602 IC 변이체에 대한 IL-2Rα- 대 IL-2Rα+ YT-1 인간 NK 세포에서의 신호전달 효능의 비율을 도시하는 막대 그래프이다.
도 8a-8c. 조작된 602 IC 변이체는 IL-2에 대한 개선된 결합 및 IL-2Rα와의 경쟁을 제시한다. 도 8a는 효모-디스플레이된 602 단일쇄 가변 단편(scFv) 또는 602 scFv를 기반으로 한 라운드 5 후 발달된 오류-빈발 라이브러리(EP602)에 대한 가용성 IL-2의 흐름세포측정법 기반 효모 표면 적정을 제시한다. 도 8b는 포화 농도의 가용성 IL-2(10 nM) 및 표시된 농도의 IL-2Rα가 602 scFv 또는 602 scFv를 기반으로 한 라운드 5 후 발달된 오류-빈발 라이브러리(EP602)를 디스플레이하는 효모 세포와 공동 인큐베이션된 흐름세포측정법 기반 경쟁 연구를 제시한다. 도 8c는 포화 농도의 가용성 IL-2(5 nM) 및 표시된 농도의 IL-2Rα가 602 scFv 또는 발달된 F10 scFv(602 scFv의 변이체)를 디스플레이하는 효모 세포와 공동 인큐베이션된 흐름세포측정법 기반 경쟁 연구를 제시한다.
도 9a-9b. IC 변이체의 발현. 도 9a는 재조합적으로 생성된 602 IC LN35, F10 IC LN35로 표시된 602 IC 변이체, 및 관련 없는 항체에 연결된 IL-2를 포함하는 융합 단백질(Irrel. Ab IC LN35)로부터의 크기 배제 크로마토그래피 트레이스를 제시한다. 도 9b는 재조합적으로 발현된 602 IC LN35, F10 IC LN35 및 Irrel. Ab IC LN35의 비-환원 및 환원 SDS-PAGE 분석을 제시한다.
도 10a-10c. 조작된 602 IC 변이체는 예상되는 IL-2 사이토카인 및 수용체 결합 특성을 나타낸다. 도 10a는 생물층 간섭계에 의해 측정된 바와 같은 고정된 hIL-2에 대한 IL-2, 602 항체(Ab), IL-2+602 Ab 복합체(2:1 비율, 37℃에서 30분 동안 사전 인큐베이션됨), 602 IC 변이체 및 관련되지 않은 음성 대조군 단백질의 결합 적정을 제시한다. 도 10b는 생물층 간섭계에 의해 측정된 바와 같은 고정된 hIL-2Rα에 대한 IL-2, 602 Ab, IL-2+602 Ab 복합체(2:1 비율, 37℃에서 30분 동안 사전 인큐베이션됨), 602 IC 변이체 및 관련되지 않은 음성 대조군 단백질의 결합 적정을 제시한다. 도 10c는 생물층 간섭계에 의해 측정된 바와 같은 고정된 hIL-2Rβ에 대한 IL-2, 602 Ab, IL-2+602 Ab 복합체(2:1 비율, 37℃에서 30분 동안 사전 인큐베이션됨), 602 IC 변이체 및 관련되지 않은 음성 대조군의 결합 적정을 제시한다.
도 11a-11c. 조작된 602 IC 변이체는 모 IC에 비해 면역 효과기 세포에 대한 우수한 편향을 나타낸다. 도 11a는 흐름세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 IL-2Rα를 발현하는 YT-1 인간 NK 세포(TReg 세포의 대표)에서의 IL-2, 관련 없는 항체에 연결된 IL-2를 포함하는 융합 단백질(Irrel. Ab IC LN35), IL-2+602 항체(Ab) 복합체(1:1 비율, 실온에서 30분 동안 사전 인큐베이션됨), 602 IC LN35 또는 602 IC 변이체 F10 IC LN35에 대해 반응한 STAT5 활성화를 제시한다. 도 11b는 흐름세포측정법에 의해 측정된 바와 같은 IL-2Rα를 발현하지 않는 YT-1 인간 NK 세포(면역 효과기 세포에 대한 대리물)에서의 IL-2, Irrel. Ab IC LN35, IL-2+602 Ab 복합체(1:1 비율, 실온에서 30분 동안 사전인큐베이션됨), 602 IC LN35 또는 F10 IC LN35에 대해 반응한 STAT5 활성화를 제시한다. 도 11c는 IL-2, Irrel. Ab IC LN35, IL-2+602 Ab, 602 IC LN35 및 F10 IC LN35에 대한 IL-2Rα- 대 IL-2Rα+ YT-1 인간 NK 세포에서의 신호전달 효능의 비율을 도시하는 막대 그래프이다.
도 12. 신호 서열(굵은 글씨), 602 VH(이탤릭체) 및 마우스 IgG2a CH1, CH2 및 CH3( 굵은 이탤릭체 )를 포함하는 예시적 재조합 항체 중쇄의 서열(SEQ ID NO:1).
도 13. 신호 서열(굵은 글씨), 602 VL(이탤릭체) 및 카파 CL( 굵은 이탤릭체 )을 포함하는 예시적 재조합 항체 경쇄의 서열(SEQ ID NO:2).
도 14. 신호 서열(굵은 글씨), 인간 IL-2(일반 텍스트), 링커(밑줄), 602 VL(이탤릭체) 및 카파 CL( 굵은 이탤릭체 )을 포함하는 예시적 면역사이토카인 경쇄(602 IC LN10에 해당)의 서열(SEQ ID NO:3).
도 15. 신호 서열(굵은 글씨), 인간 IL-2(일반 텍스트), 링커(밑줄), 602 VL(이탤릭체) 및 마우스 카파 CL( 굵은 이탤릭체 )을 포함하는 예시적 면역사이토카인 경쇄(602 IC LN15에 해당)의 서열(SEQ ID NO:23).
도 16. 신호 서열(굵은 글씨), 인간 IL-2(일반 텍스트), 링커(밑줄), 602 VL(이탤릭체) 및 마우스 카파 CL( 굵은 이탤릭체 )을 포함하는 예시적 면역사이토카인 경쇄(602 IC LN25에 해당)의 서열(SEQ ID NO:24).
도 17. 신호 서열(굵은 글씨), 인간 IL-2(일반 텍스트), 링커(밑줄), 602 VL(이탤릭체) 및 마우스 카파 CL( 굵은 이탤릭체 )을 포함하는 예시적 면역사이토카인 경쇄(602 IC LN35에 해당)의 서열(SEQ ID NO:25).
도 18. 신호 서열(굵은 글씨), 602 VH(이탤릭체) 및 마우스 IgG2a CH1, CH2 및 CH3( 굵은 이탤릭체 )를 포함하는 예시적 면역사이토카인 중쇄(F10 IC LN35에 해당)의 서열(SEQ ID NO:26). 602 VH에 대한 돌연변이가 강조된다.
도 19. 신호 서열(굵은 글씨), 인간 IL-2(일반 텍스트), 링커(밑줄), 602 VL(이탤릭체) 및 마우스 카파 CL( 굵은 이탤릭체 )을 포함하는 예시적 면역사이토카인 경쇄(F10 IC LN35에 해당)의 서열(SEQ ID NO:27). 602 VL에 대한 돌연변이가 강조된다.
본 문서는 Eff의 표적화된 확장을 위한 방법 및 재료를 제공한다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인이 본원에 제공된다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인은 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편), 및 면역글로불린 경쇄를 포함할 수 있다(예를 들어, 이를 포함하도록 설계될 수 있다). IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인을 제조하고 사용하기 위한 방법이 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 이를 필요로 하는 포유동물(예를 들어, 인간)(예를 들어, 암 및/또는 감염성 질병과 같은 포유동물 내에서 면역 반응을 활성화시킴으로써 이익을 얻을 수 있는 질환을 갖는 포유동물)에 투여될 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물 내에서 Eff를 자극하기 위해(예를 들어, 상기 포유동물에서 면역 반응을 활성화시키기 위해) 포유동물에 투여될 수 있다. 본원에 기재된 IL-2Rβ 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인에 의해 자극될 수 있는 Eff의 예는 비제한적으로 CD4+ 효과기 T 세포, CD8+ 효과기 T 세포, 기억 표현형 CD8+ 효과기 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 암을 갖는 포유동물에 투여될 수 있다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 감염성 질병을 갖거나 감염성 질병이 발병할 위험이 있는 포유동물에 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 사이토카인/항체 융합 단백질)에 융합된(예를 들어, 유전적으로 융합된) 사이토카인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 항-사이토카인 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 항-IL-2 항체 또는 이의 단편)에 융합된 사이토카인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 사이토카인 및 항체가 면역사이토카인 내에서 분자 내 결합하도록 항체에 융합된 사이토카인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 항체의 하나 이상의 말단(예를 들어, 항체 중쇄의 N- 또는 C-말단 및/또는 항체 경쇄의 N- 또는 C-말단)에 융합된 사이토카인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 면역글로불린 경쇄(예를 들어, 항-사이토카인 항체로부터의 면역글로불린 경쇄)에 융합된 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)에 융합된 면역글로불린 중쇄(예를 들어, 항-사이토카인 항체로부터의 면역글로불린 중쇄)를 포함하는 융합 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 임의의 적절한 공급원(예를 들어, 인간 또는 마우스와 같은 임의의 적절한 포유동물)으로부터의 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 인간 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)가 포유동물의 제1 종으로부터의 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합하는 경우, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 포유동물의 제2 종으로부터의 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체와 교차-반응하지 않는다. 예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)가 인간 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합하는 경우, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 비-인간 종으로부터의 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체(예를 들어, 마우스 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체)와 교차-반응하지 않는다.
본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 임의의 적절한 면역글로불린(Ig) 중쇄를 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 임의의 적절한 동형 면역글로불린(예를 들어, IgA 면역글로불린, IgD 면역글로불린, IgE 면역글로불린, IgG 면역글로불린 및 IgM 면역글로불린)으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄는 IgG 중쇄(예를 들어, IgG2a 중쇄)일 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 임의의 적절한 부류의 면역글로불린(예를 들어, γ, σ, α, μ 및 ε)으로부터 유래될 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 임의의 적절한 중쇄 가변 도메인(VH)을 가질 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 임의의 적절한 중쇄 불변 도메인(CH)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄는 γ중쇄, α 중쇄 또는 δ 중쇄와 같은 3개의 불변 도메인(예를 들어, CH1, CH2 및 CH3)을 갖는 면역글로불린일 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄는 μ 중쇄 또는 ε 중쇄와 같은 4개의 불변 도메인(예를 들어, CH1, CH2, CH3 및 CH4)을 갖는 면역글로불린일 수 있다. 면역글로불린 중쇄는 임의의 적절한 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 동일한 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 상이한 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및/또는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 천연 발생 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 천연 발생 면역글로불린으로부터 파생될 수 있다). 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및/또는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 합성일 수 있다. 중쇄 가변 도메인 및/또는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에서 사용될 수 있는 면역글로불린의 예는 비제한적으로 모노클로날 항체 602(MAB602, 본원에서 "602"로 지칭됨) 중쇄(예를 들어, R&D systems #MAB602-SP 참조)를 포함한다. 일부 경우에, 중쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 불변 도메인이 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에서 사용될 수 있는 면역글로불린은 다른 곳에 기재된 바와 같을 수 있다(예를 들어, 문헌[Krieg et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 107(26):11906-11 (2010)] 참조). 면역글로불린 중쇄는 임의의 적절한 서열(예를 들어, 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일성(예를 들어, 약 82%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 93%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일성(예를 들어, 약 82%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 93%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일성(예를 들어, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 93%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄는 또한 신호 서열을 포함할 수 있다. 신호 서열은 임의의 적절한 신호 서열(예를 들어, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7)일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)에 사용될 수 있는 예시적 면역글로불린 중쇄는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:26에 제시된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 중쇄는 신호 서열, 602 항체로부터의 가변 도메인, 및 IgG2a 불변 도메인(예를 들어, 마우스 IgG2a 불변 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 중쇄는 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열, SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 중쇄는 SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 중쇄는 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열, SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 중쇄는 SEQ ID NO:26에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 중쇄는 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형(예를 들어, SEQ ID NO:1에 대한 하나 이상의 변형 또는 SEQ ID NO:26에 대한 하나 이상의 변형)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 포함된 중쇄의 아미노산 서열에 대한 변형은 단일쇄 면역사이토카인의 사이토카인 친화성을 변경할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 포함된 중쇄의 아미노산 서열에 대한 변형은 단일쇄 면역사이토카인의 수용체 경쟁을 변경할 수 있다(예를 들어, 결합 특성을 변경할 수 있다).
본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 임의의 적절한 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)를 포함할 수 있다. IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 천연 발생 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)일 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 합성일 수 있다. IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 임의의 적절한 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일성(예를 들어, 약 82%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 93%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형(예를 들어, SEQ ID NO:9에 대한 하나 이상의 변형)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 포함된 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)의 아미노산 서열에 대한 변형은 단일쇄 면역사이토카인의 분자 내 조립의 파괴를 완화시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 포함된 중쇄의 아미노산 서열에 대한 변형은 단일쇄 면역사이토카인의 활성(예를 들어, 신호전달 활성)을 향상시킬 수 있다.
본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 임의의 적절한 면역글로불린 경쇄를 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 임의의 적절한 유형의 면역글로불린 경쇄(예를 들어, (κ) 경쇄 및 람다(λ) 경쇄)로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄는 κ 경쇄일 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 임의의 적절한 경쇄 가변 도메인(VL)을 가질 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 임의의 적절한 경쇄 불변 도메인(CL)을 가질 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 임의의 적절한 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인은 동일한 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인은 상이한 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및/또는 면역글로불린 경쇄 불변 도메인은 천연 발생 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 천연 발생 면역글로불린으로부터 파생될 수 있다). 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및/또는 면역글로불린 경쇄 불변 도메인은 합성일 수 있다. 경쇄 가변 도메인 및/또는 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에서 사용될 수 있는 면역글로불린의 예는 비제한적으로 602 경쇄(예를 들어, R&D systems #MAB602-SP 참조)를 포함한다. 일부 경우에, 경쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 불변 도메인이 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에서 사용될 수 있는 면역글로불린은 다른 곳에 기재된 바와 같을 수 있다(예를 들어, 문헌[Krieg et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 107(26):11906-11 (2010)] 참조). 면역글로불린 중쇄는 임의의 적절한 서열(예를 들어, 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄는 임의의 적절한 서열(예를 들어, 아미노산 서열)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일성(예를 들어, 약 82%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 93%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일성(예를 들어, 약 82%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 93%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄 불변 도메인은 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일성(예를 들어, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 93%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄는 또한 신호 서열을 포함할 수 있다. 신호 서열은 임의의 적절한 신호 서열(예를 들어, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8)일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)에 사용될 수 있는 예시적 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:2에 제시된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 신호 서열, 602 항체로부터의 가변 도메인, 및 κ 불변 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열, SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:2에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄는 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형(예를 들어, SEQ ID NO:2에 대한 하나 이상의 변형)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 포함된 경쇄의 아미노산 서열에 대한 변형은 단일쇄 면역사이토카인의 사이토카인 친화성을 변경할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 포함된 경쇄의 아미노산 서열에 대한 변형은 단일쇄 면역사이토카인의 수용체 경쟁을 변경할 수 있다(예를 들어, 결합 특성을 변경할 수 있다).
일부 경우에, 면역글로불린 경쇄는 본원에 기재된 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)를 포함할 수 있다. 면역글로불린 경쇄가 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)를 포함하는 경우, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 면역글로불린 경쇄 내의 임의의 적절한 위치에 있을 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 면역글로불린 경쇄(예를 들어, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인)에 융합될 수 있다. IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이 융합 폴리펩티드인 경우, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인은 링커를 통해 융합될 수 있다. 링커는 임의의 적절한 링커일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 가요성(예를 들어, 분자 내 상호작용(들)을 허용하기 위해)일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 펩티드 링커일 수 있다. 펩티드 링커는 임의의 적절한 수의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커는 약 10개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산(예를 들어, 약 10개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 10개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 40개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 50개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산, 약 15개의 아미노산 내지 약 55개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 20개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산, 약 30개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산 또는 약 40개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 펩티드 링커는 임의의 적절한 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커는 하나 이상의 글리신(Gly) 잔기 및/또는 하나 이상의 세린(Ser) 잔기를 포함할 수 있다. IL-2Rα/IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)를 면역글로불린 경쇄 가변 도메인에 융합시키기 위해 사용될 수 있는 링커의 예는 비제한적으로 (Gly4Ser)2 링커(SEQ ID NO:12), (Gly4Ser)3 링커(SEQ ID NO:13), (Gly4Ser)4 링커(SEQ ID NO:14), (Gly4Ser)5 링커(SEQ ID NO:15), (Gly4Ser)6 링커(SEQ ID NO:16), (Gly4Ser)7 링커(SEQ ID NO:17), (Gly4Ser)8 링커(SEQ ID NO:18), (Gly4Ser)9 링커(SEQ ID NO:19), (Gly4Ser)10 링커(SEQ ID NO:20), (Gly4Ser)11 링커(SEQ ID NO:21) 및 (Gly4Ser)12 링커(SEQ ID NO:22)를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 링커를 통해 면역글로불린 경쇄 가변 도메인에 융합된 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)를 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 경우에, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형(예를 들어, SEQ ID NO:12에 대한 하나 이상의 변형 또는 SEQ ID NO:13에 대한 하나 이상의 변형)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 링커의 아미노산 서열에 대한 변형은 링커의 길이, 전하, 구조 및/또는 조성을 변경할 수 있다.
본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)에 사용될 수 있는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)를 포함하는 예시적 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27 중 어느 하나에 제시된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 신호 서열, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편), 링커, 602 항체로부터의 가변 도메인, 및 κ 불변 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열, SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 IL-2 폴리펩티드, SEQ ID NO:12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 링커, SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:3에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열, SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 IL-2 폴리펩티드, SEQ ID NO:13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 링커, SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:23에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열, SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 IL-2 폴리펩티드, SEQ ID NO:15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 링커, SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:24에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열, SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 IL-2 폴리펩티드, SEQ ID NO:17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 링커, SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:25에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 신호 서열, SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 갖는 IL-2 폴리펩티드, SEQ ID NO:17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 링커, SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 사용될 수 있는 면역글로불린 경쇄는 SEQ ID NO:27에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역글로불린 경쇄는 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형(예를 들어, SEQ ID NO:3에 대한 하나 이상의 변형, SEQ ID NO:23에 대한 하나 이상의 변형, SEQ ID NO:24에 대한 하나 이상의 변형, SEQ ID NO:25에 대한 하나 이상의 변형, 또는 SEQ ID NO:27에 대한 하나 이상의 변형)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 포함된 경쇄의 아미노산 서열에 대한 변형은 단일쇄 면역사이토카인의 사이토카인 친화성을 변경할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 포함된 경쇄의 아미노산 서열에 대한 변형은 단일쇄 면역사이토카인의 수용체 경쟁을 변경할 수 있다(예를 들어, 결합 특성을 변경할 수 있다).
일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 안정한 분자(예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 존재하지 않은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 분자에 비함)일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 약 5분 내지 약 6개월(예를 들어, 약 15분 내지 약 6개월, 약 30분 내지 약 6개월, 약 1시간 내지 약 6개월, 약 24시간 내지 약 6개월, 약 3일 내지 약 6개월, 약 7일 내지 약 6개월, 약 1개월 내지 약 6개월, 약 3개월 내지 약 6개월, 약 5분 내지 약 3개월, 약 5분 내지 약 1개월, 약 5분 내지 약 2주, 약 5분 내지 약 7일, 약 5분 내지 약 3일, 약 5분 내지 약 24시간, 약 5분 내지 약 12시간, 약 5분 내지 약 60분, 약 30분 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 1주, 약 1주 내지 약 1개월 또는 약 1개월 내지 약 3개월)의 반감기(예를 들어, 혈청 반감기 또는 혈장 반감기와 같은 생체 내 반감기)를 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 표준 실온 조건(예를 들어, 약 25℃)에서 약 1일 내지 약 1개월(예를 들어, 약 1일 내지 약 2주, 약 1일 내지 약 1주, 약 1일 내지 약 5일, 약 4일 내지 약 1개월, 약 1주 내지 약 1개월, 약 2주 내지 약 1개월, 약 3일 내지 약 2주, 약 2일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 2주 또는 약 1주 내지 약 3주) 동안의 저장 수명을 가질 수 있다. 예를 들어, 열 이동 검정, 단백질 안정성 곡선 분석, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 동적 광 산란은 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인의 안정성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 IL-2Rβ 폴리펩티드와 향상된 상호작용(예를 들어, 이에 대한 더 강한 결합 친화성)(예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 존재하지 않은 IL-2Rβ 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 분자에 비함)을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 약 300 nM KD 내지 약 1 pM KD의 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 대한 친화성을 가질 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 IL-2Rα 폴리펩티드와 감소되거나 제거된 상호작용(예를 들어, 이에 대한 더 약한 결합 친화성)(예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 존재하지 않은 IL-2Rα 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 분자에 비함)을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 약 10 nM KD 초과의 IL-2Rα 폴리펩티드에 대한 친화성을 가질 수 있다.
본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)과 IL-2Rβ 폴리펩티드 및/또는 IL-2Rα 폴리펩티드 사이의 결합 친화성을 결정하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인과 IL-2Rβ 폴리펩티드 및/또는 IL-2Rα 폴리펩티드 사이의 결합 친화성을 결정하기 위해 친화성 적정 연구, 표면 플라즈몬 공명, 등온 열량측정법 및/또는 생물층 간섭계가 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 감소되거나 제거된 수의 TReg(예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 존재하지 않은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 분자에 비함)를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인은 TReg를 실질적으로 활성화시키지 않는다(예를 들어, 검출 가능한 수준 및/또는 Eff의 활성화를 억제하거나 하향조절하기에 충분한 수준으로 TReg를 활성화시키지 않는다). TReg의 존재, 부재, 양 또는 활성을 결정하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, TReg의 존재, 부재, 양 또는 활성을 결정하기 위해 TReg 마커(예를 들어, CD4, IL-2Rα 및/또는 Foxp3)에 대한 면역염색 및/또는 ELISA 또는 신호 변환기 및 전사 활성제(signal transducer and activator of transcription; STAT) 5 인산화에 기초한 활성 평가가 사용될 수 있다.
본 문서는 또한 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 제조하기 위한 방법 및 재료를 제공한다. 예를 들어, 본 문서는 또한 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 핵산(예를 들어, 핵산 벡터)을 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편), 및/또는 면역글로불린 경쇄를 인코딩할 수 있으며, 이는 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 핵산은 면역글로불린 중쇄를 인코딩할 수 있고, 제2 핵산은 면역글로불린 경쇄에 융합된 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)를 인코딩할 수 있다.
본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 생성시키는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드를 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및/또는 면역글로불린 경쇄)를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 핵산 벡터)은 임의의 적절한 핵산일 수 있다. 핵산은 DNA(예를 들어, DNA 작제물), RNA(예를 들어, mRNA) 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드를 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 벡터(예를 들어, 발현 벡터 또는 플라스미드)일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 생성시키는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드를 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및/또는 면역글로불린 경쇄)를 인코딩하는 핵산은 또한 하나 이상의 조절 요소(예를 들어, 아미노산 사슬의 발현을 조절하기 위함)를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드를 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 포함될 수 있는 조절 요소의 예는 비제한적으로 프로모터(예를 들어, 항시성 프로모터, 조직/세포-특이적 프로모터 및 유도성 프로모터, 예를 들어, 화학적으로 활성화된 프로모터 및 광 활성화된 프로모터) 및 인핸서를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 핵산에 의해 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및/또는 면역글로불린 경쇄)는 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 생성시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 2개 이상의 폴리펩티드는 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)에 조립될 수 있다(예를 들어, 자가 조립될 수 있다). 일부 경우에, 제1 핵산에 의해 인코딩되는 면역글로불린 중쇄, 및 제2 핵산에 의해 인코딩되는 면역글로불린 경쇄에 융합된 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합될 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편)는 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인에 조립될 수 있다(예를 들어, 자가 조립될 수 있다). 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 2개 이상의 폴리펩티드가 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인으로 조립되는 경우, 2개 이상의 폴리펩티드는 생체 내 또는 시험관 내에서 조립될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인), 또는 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드를 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및/또는 면역글로불린 경쇄)를 인코딩하는 핵산은 정제될 수 있다. "정제된" 폴리펩티드 또는 핵산은 성분의 혼합물에서, 예를 들어, 30 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 95 중량% 이상 또는 99 중량% 이상으로 주요 성분을 구성하는 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 정제된 단일쇄 면역사이토카인은 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물의 약 30 중량% 이상을 구성할 수 있다. 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피 및 면역흡착 친화성 컬럼을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 방법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성하는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 정제된 핵산은 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 아미노산 사슬을 함유하는 조성물의 약 30 중량% 이상을 구성할 수 있다. 핵산은 페놀-클로로포름 추출 및 컬럼 정제(예를 들어, 미니-컬럼 정제)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법에 의해 정제될 수 있다.
치료를 필요로 하는 포유동물(예를 들어, 인간)(예를 들어, 암 및/또는 감염성 질병과 같은 포유동물 내에서 면역 반응을 활성화시킴으로써 이익을 얻을 수 있는 질환을 갖는 포유동물)을 치료하기 위한 방법 및 재료가 또한 본원에 제공된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인), 또는 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및/또는 면역글로불린 경쇄)를 인코딩하는 핵산을 함유하는 조성물은 암을 갖는 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인, 또는 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 암을 갖는 포유동물에 투여될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인), 또는 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 중쇄, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 IL-2 폴리펩티드(또는 이의 단편) 및/또는 면역글로불린 경쇄)를 인코딩하는 핵산을 함유하는 조성물은 감염성 질병을 갖는 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인, 또는 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인을 생성시키는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 감염성 질병을 갖는 포유동물에 투여될 수 있다.
암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 임의의 적절한 포유동물은 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있다(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물을 투여함에 의함). 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있는 포유동물의 예는 비제한적으로 영장류(예를 들어, 인간 및 원숭이), 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 토끼, 마우스 및 래트를 포함한다. 예를 들어, 암을 갖는 인간은 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물로 치료될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 포유동물을 치료(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물을 투여함에 의함)하는 경우, 포유동물은 임의의 유형의 암을 갖거나 갖는 것으로 의심될 수 있다. 암은 하나 이상의 고형 종양을 포함할 수 있다. 암은 혈액암일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있는 암의 예는 비제한적으로 유방암, 난소암, 전립선암, 결장직장암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암(예를 들어, 비-소세포폐암), 흑색종, 구강암, 방광암, 자궁경부암, 식도암 및 자궁암을 포함한다.
암을 갖는 포유동물(예를 들어, 인간)을 확인하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 암을 갖는 포유동물(예를 들어, 인간)을 확인하기 위해 영상화 기술, 생검 기술 및/또는 혈액 검사가 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 감염성 질병을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 포유동물을 치료(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물을 투여함에 의함)하는 경우, 포유동물은 임의의 유형의 감염성 질병을 갖거나 갖는 것으로 의심될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있는 감염성 질병의 예는 비제한적으로 인간 면역결핍 바이러스, 말라리아, 인플루엔자, 에볼라, 결핵, 홍역, 광견병, 뎅기열, 살모넬라증, 백일해, 페스트 및 웨스트 나일 열을 포함한다.
포유동물(예를 들어, 인간)을 감염성 질병을 갖거나 감염성 질병이 발병할 위험이 있는 것으로 확인하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간)을 감염성 질병을 갖거나 감염성 질병이 발병할 위험이 있는 것으로 확인하기 위해 소변 검사, 인후 면봉, 대변 샘플 및/또는 혈액 검사가 사용될 수 있다.
암을 갖고/갖거나 감염성 질병을 갖거나 감염성 질병이 발병할 위험이 있는 것으로 확인되면, 포유동물(예를 들어, 인간)에는 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 함유하는 조성물이 투여될 수 있거나 이를 자가 투여하도록 지시받을 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 암을 갖는 포유동물에 존재하는 암세포의 수를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 암을 갖는 포유동물 내의 종양의 크기(예를 들어, 부피)를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 감염성 질병을 갖는 포유동물에 존재하는 감염성 미생물의 수를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 암 및/또는 감염성 질병을 갖는 포유동물을 치료하는 데 사용되는 유일한 활성 성분으로서 암을 갖는 포유동물에 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)이 암을 갖는 포유동물에 투여되는 경우, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인은 암을 치료하는 데 사용되는 하나 이상의 추가적 암 치료 및/또는 면역 반응을 향상시키는 데 사용되는 하나 이상의 추가적 치료와의 조합 요법으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 암을 치료하는 데 사용되는 조합 요법은 포유동물(예를 들어, 인간)에게 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인 및 수술, 화학요법, 방사선, 백신 투여, 입양 세포 전달, 세포 요법의 제공, 표적화된 요법의 제공 및/또는 면역요법의 제공과 같은 하나 이상의 암 치료를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 향상시키기 위해 사용되는 조합 요법은 포유동물(예를 들어, 인간)에게 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인 및 백신의 투여, 입양 세포 전달, 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 면역 체크포인트 차단을 통해 작용하는 약물)의 투여 및/또는 세포 요법의 제공과 같은 면역 반응을 향상시키는 데 사용되는 하나 이상의 추가 치료를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)이 감염성 질병을 갖는 포유동물에 투여되는 경우, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인은 감염성 질병을 치료하는 데 사용되는 하나 이상의 추가적 감염성 질병 치료 및/또는 면역 반응을 향상시키는 데 사용되는 하나 이상의 추가적 치료와의 조합 요법으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 감염성 질병을 치료하는 데 사용되는 조합 요법은 포유동물(예를 들어, 인간)에게 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인 및 항생제, 항-바이러스제, 항-진균제 및/또는 항-기생충제와 같은 하나 이상의 감염성 질병 치료를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 향상시키기 위해 사용되는 조합 요법은 포유동물(예를 들어, 인간)에게 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인 및 백신의 투여, 입양 세포 전달, 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 면역 체크포인트 차단을 통해 작용하는 약물)의 투여 및/또는 세포 요법의 제공과 같은 면역 반응을 향상시키는 데 사용되는 하나 이상의 추가 치료를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인이 하나 이상의 추가 치료와 조합하여 사용되는 경우, 하나 이상의 추가 치료는 동시에 또는 독립적으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인은 먼저 투여될 수 있고, 하나 이상의 추가 치료가 둘째로 제공될 수 있거나, 그 반대로 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)은 이를 필요로 하는 포유동물(예를 들어, 암 및/또는 감염성 질병과 같은 포유동물 내에서 면역 반응을 활성화시키는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 갖는 포유동물)에 투여하기 위한 조성물(예를 들어, 약학적으로 허용되는 조성물)로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인의 치료적 유효량은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제형화될 수 있다. 약학적 조성물은 임의의 적절한 투여 형태로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 투여 형태의 예는 비제한적으로 검, 캡슐, 정제(예를 들어, 씹을 수 있는 정제 및 장용 코팅된 정제), 좌약, 액체, 관장제, 현탁액, 용액(예를 들어, 멸균 용액), 지속-방출 제형, 지연-방출 제형, 환약, 분말 및 과립을 포함하는 고체 또는 액체 형태를 포함한다. 본원에 기재된 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체, 충전제 및 비히클은 비제한적으로 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예를 들어, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어, 프로타민 설페이트, 디소듐 하이드로겐 포스페이트, 포타슘 하이드로겐 포스페이트, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어, 비타민 E TPGS, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 및 양모 지방을 포함한다.
본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 함유하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)은 경구 또는 비경구(피하, 종양 내, 근육 내, 정맥 내 및 피내를 포함함) 투여용으로 설계될 수 있다. 경구 투여되는 경우, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 약학적 조성물은 환약, 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있다. 비경구 투여에 적합한 조성물은 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제형이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위-용량 또는 다수-용량 용기, 예를 들어, 밀봉 앰풀 및 바이알 내에 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조(동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 함유하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)은 국소적 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 포유동물(예를 들어, 인간)로의 경구 투여에 의해 또는 주사에 의해 전신적으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)의 유효 용량은 암의 중증도, 투여 경로, 대상체의 연령 및 일반적인 건강 상태, 부형제 사용, 다른 제제의 사용과 같은 다른 치료적 치료와의 공동 사용 가능성, 및/또는 치료 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 함유하는 조성물의 유효량은 포유동물에게 유의한 독성을 발생시키지 않으면서 포유동물(예를 들어, 암을 갖고/갖거나 감염성 질병을 갖거나 감염성 질병이 발병할 위험이 있는 포유동물)을 치료할 수 있는 임의의 양일 수 있다. 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인의 유효량은 임의의 적절한 양일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 단일쇄 면역사이토카인의 유효량은 포유동물(예를 들어, 인간)의 체중 kg 당 약 0.05 밀리그램(mg) 내지 약 500 mg(mg/kg; 예를 들어, 약 0.05 mg/kg 내지 약 400 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 50 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 100 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 200 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 300 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 400 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 400 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 약 50 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 100 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 200 mg/kg 내지 약 300 mg/kg 또는 약 300 mg/kg 내지 약 400 mg/kg 체중)일 수 있다. 유효량은 일정하게 유지될 수 있거나, 치료에 대한 포유동물의 반응에 따라 슬라이딩 스케일(sliding scale) 또는 가변 용량으로 조정될 수 있다. 다양한 요인이 특정 용도에 사용되는 실제 유효량에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도, 치료 기간, 다중 치료제의 사용, 투여 경로 및/또는 질환(예를 들어, 암)의 중증도는 투여되는 실제 유효량의 증가 또는 감소를 요구할 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 함유하는 조성물의 투여 빈도는 포유동물에게 유의한 독성을 발생시키지 않으면서 포유동물(예를 들어, 암을 갖고/갖거나 감염성 질병을 갖거나 감염성 질병이 발병할 위험이 있는 포유동물)을 치료할 수 있는 임의의 빈도일 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도는 1일에 약 3회 내지 1주일에 약 1회, 1일에 약 2회 내지 1주일에 약 2회, 또는 1일에 약 1회 내지 1주일에 약 2회일 수 있다. 투여 빈도는 일정하게 유지되거나 치료 기간 동안 가변적일 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물을 이용한 치료 과정은 휴식 기간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인을 함유하는 조성물은 2주 기간에 걸쳐 매일 투여될 수 있고 이어서 2주 휴식 기간이 이어질 수 있으며, 이러한 요법은 다수의 횟수로 반복될 수 있다. 유효량과 마찬가지로, 다양한 요인이 특정 적용에 사용되는 실제 투여 빈도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유효량, 치료 기간, 다중 치료제의 사용, 투여 경로 및/또는 질환(예를 들어, 암)의 중증도는 투여 빈도의 증가 또는 감소를 요구할 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 단일쇄 면역사이토카인(예를 들어, IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 단일쇄 면역사이토카인)을 함유하는 조성물을 투여하기 위한 효과적인 기간은 포유동물에게 유의한 독성을 발생시키지 않으면서 포유동물(예를 들어, 암을 갖고/갖거나 감염성 질병을 갖거나 감염성 질병이 발병할 위험이 있는 포유동물)을 치료하는 임의의 기간일 수 있다. 예를 들어, 유효 기간은 며칠에서 몇 주, 몇 개월 또는 몇 년까지 다양할 수 있다. 일부 경우에, 암의 치료를 위한 유효 기간은 약 1개월 내지 약 10년의 기간의 범위일 수 있다. 다수의 요인이 특정 치료에 사용되는 실제 유효 기간에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유효 기간은 투여 빈도, 유효량, 다중 치료제의 사용, 투여 경로 및/또는 치료되는 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다.
일부 경우에, 포유동물 내에 존재하는 암, 및/또는 치료되는 암의 하나 이상의 증상의 중증도가 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 치료되는 포유동물 내에 존재하는 암세포의 수 및/또는 크기 또는 종양이 모니터링될 수 있다. 포유동물 내에 존재하는 암세포의 수 및/또는 종양의 크기가 감소되는지의 여부를 결정하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 내에 존재하는 암세포의 수를 평가하기 위해 영상화 기술이 사용될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 방법 및 재료는 하나 이상의 Eff를 자극하고/하거나 포유동물 내에서 면역 반응을 활성시킴으로써 이익을 얻을 수 있는 또 다른 질환을 갖는 포유동물(예를 들어, 인간)을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지는 않는 하기 실시예에서 추가로 기재될 것이다.
실시예
실시예 1: 면역 효과기 T 세포의 표적화된 확장을 위한 조작된 사이토카인-항체 융합
항체-매개 면역 편향은 표적화된 사이토카인 요법에 대한 흥미로운 기회를 제공한다. 실제로, IL-2와 항-IL-2 항체 S4B6 사이의 복합체는 전형적으로 전신 IL-2 투여와 관련된 부작용의 부재하에 마우스에서 강력한 항-종양 활성을 유도한다. 그러나, 사이토카인/항체 복합체의 임상적 해석은 해리가 유리 사이토카인으로부터 위험한 독성을 유발할 수 있기 때문에 투여 비율 최적화와 같은 기호논리학적 장애물뿐만 아니라 복잡한 안정성에 대한 우려에 의해 방해를 받는다. 더욱이, S4B6은 마우스 IL-2(mIL-2)를 인식하고, 인간 IL-2(hIL-2)와 제한된 교차-반응성을 갖는다.
본 실시예는 항암 면역을 촉진하기 위해 면역 효과기 T 세포를 특이적으로 자극하는 임상적으로 관련된 단일쇄 융합 단백질의 조작을 기재한다.
재료 및 방법
단백질 발현 및 정제
602 항체의 VH 및 VL 서열을 602 하이브리도마 세포에 대해 PCR 증폭을 수행하여 결정하였다. 재조합 항체를 모 클론과 일치시키기 위해 마우스 면역글로불린(IgG) 2a 카파 동형으로 제형화하였다(도 12, SEQ ID NO:1; 및 도 13, SEQ ID NO:2). 602 항체의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 gWiz 벡터(Genlantis)에 개별적으로 클로닝하였다. 항체를 HC 및 LC를 인코딩하는 플라스미드의 일시적 공동-형질감염을 통해 인간 배아 신장(HEK) 293F 세포에서 재조합적으로 발현시켰다. HC 및 LC 플라스미드를 대규모 발현을 위한 최적 비율을 결정하기 위해 소규모 공동-형질감염 시험에서 적정하였다. 분비된 항체를 단백질 G 친화성 크로마토그래피에 이어 FPLC 기기에서 크기-배제 크로마토그래피를 통해 형질감염 5일 후 세포 상층액으로부터 정제하였다. 순도(>99%)를 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다. 야생형 602 면역사이토카인(IC) 및 이의 변이체의 경우, hIL-2 사이토카인을 LC의 N-말단에서 전체 602 항체에 융합시켰으며, 이는 분자 내 상호작용을 허용하기 위해 가요성 (G4S)2, (G4S)3, (G4S)5 또는 (G4S)7 링커에 의해 연결되었다(도 14, SEQ ID NO: 3; 도 15, SEQ ID NO: 23; 도 16, SEQ ID NO: 24; 및 도 17, SEQ ID NO: 25). 이들 hIL-2-융합된 602 LC 작제물을 또한 gWiz 벡터(Genlantis)에 클로닝하였다. IC를 HEK 293F 세포의 일시적 공동-형질감염을 통해 발현시켰고, 602 항체에 대해 기재된 바와 같이 정제하였다. hIL-2 사이토카인 및 C-말단 헥사히스티딘 태그를 함유하는 hIL-2Rα 및 hIL-2Rβ 수용체 세포 외 도메인을 602 및 IC에 대해 기재된 바와 같이 HEK 293F 세포의 일시적 형질감염을 통해 생성시키고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 이어 FPLC 기기에서의 크기-배제 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 모든 단백질을 HEPES-완충 식염수(HBS, 10 mM HEPES pH 7.3 중 150 mM NaCl)에 저장하였다. 순도(>99%)를 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다.
비오티닐화된 hIL-2, hIL-2Rα 및 hIL-2Rβ의 발현을 위해, C-말단 비오틴 수용체 펩티드(BAP; SEQ ID NO:30)를 함유하는 단백질을 발현시키고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 통해 정제한 후, 0.5 mM 비신(Bicine) pH 8.3, 100 mM ATP, 100 mM 마그네슘 아세테이트 및 500 mM 비오틴(Sigma) 중 가용성 BirA 리가제 효소로 비오티닐화시켰다. Superdex 200 컬럼에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과량의 비오틴을 제거하였다.
세포주
HEK 293F 세포를 10 U/mL 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 Freestyle 293 발현 배지(Thermo)에서 배양하였다. 변형되지 않은 YT-114 및 IL-2Rα+ YT-1 인간 자연 살해 세포를 RPMI 완전 배지(10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민, 최소 비-필수 아미노산, 소듐 피루베이트, 25 mM HEPES 및 페니실린-스트렙토마이신[Gibco]이 보충된 RPMI 1640 배지)에서 배양하고, 5% CO2를 갖는 가습된 대기에서 37℃에서 유지시켰다.
생물층 간섭계 결합 연구
IL-2 대 면역사이토카인 친화성 적정 연구의 경우, 비오티닐화된 인간 IL-2Rα 및 IL-2Rβ 수용체를 Octet®Red96 생물층 간섭계(BLI) 기기(ForteBio)에서의 분석을 위해 스트렙타비딘-코팅된 팁에 고정시켰다. 물질 전달 효과를 최소화하기 위해 5 미만의 신호 단위(nm)의 수용체를 고정시켰다. 팁을 300초 동안 96-웰 플레이트에서 hIL-2, 602 Ab, 602 Ab와 복합체화된 hIL-2(실온에서 30분 동안 2:1 비율로 hIL-2 및 602 Ab를 사전 인큐베이션함으로써 형성됨), 602 IC, 또는 대조군 IC(602의 것과 동일한 프레임워크 서열을 갖는, 관련 없는 항-플루오레세인 항체 [4-4-20]의 경쇄의 N 말단에 융합된 hIL-2로 구성됨)의 연속 희석액에 노출시키고, 해리를 600초 동안 측정하였다. 관련 없는 단백질(인간 모노클로날 항체 트라스투주맙(trastuzumab))을 참조 웰에 포함시켜 비특이적 결합을 제거하였다. 모든 상호작용에 대한 표면 재생을 0.1 M 글리신 pH 3.0에 대한 15초 노출을 사용하여 수행하였다. 실험을 25℃에서 PBSA(포스페이트-완충 식염수, pH 7.3 + 0.1% 소 혈청 알부민[BSA, Thermo Fisher Scientific])에서 수행하였다. 데이터를 Octet® Data Analysis 소프트웨어 버전 7.1(Molecular Devices)을 사용하여 시각화하고 처리하였다. 모든 결합 상호작용이 1차인 것으로 가정하고 GraphPad Prism을 사용하여 평형 적정 곡선 적합화 및 KD 값 결정을 구현하였다. 실험은 유사한 결과로 두 번 재현되었다.
YT-1 세포 STAT5 인산화 연구
대략 2×105개의 IL-2Rα- YT-1 또는 IL-2Rα+ YT-1 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 플레이팅하고, hIL-2, hIL-2/602 복합체 또는 다양한 IC의 연속 희석액을 함유하는 RPMI 완전 배지에 재현탁시켰다. 실온에서 30분 동안 1:1 몰비의 항체 또는 항체 단편 대 hIL-2로 602 Ab와 IL-2를 인큐베이션함으로써 복합체를 형성시켰다. 세포를 37℃에서 15분 동안 자극하고, 1.5%로의 포름알데하이드의 첨가 및 실온에서의 10분 인큐베이션에 의해 즉시 고정시켰다. 세포의 투과화는 4℃에서 30분 동안 얼음-저온 100% 메탄올에 재현탁함으로써 달성되었다. 고정되고 투과화된 세포를 FACS 완충액(0.1% BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수[PBS] pH 7.2 [Thermo Fisher Scientific])으로 2회 세척하고, 실온에서 2시간 동안 FACS 완충액에 희석된 Alexa Fluor® 647-복합체화 항-STAT5 pY694(BD Biosciences)와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 FACS 완충액에서 2회 세척하고, MFI를 CytoFLEX 흐름세포측정기(Beckman-Coulter)에서 결정하였다. 용량-반응 곡선을 로지스틱 모델에 맞추고, 자극되지 않은 세포의 평균 형광 강도(MFI)의 공제 및 최대 신호 강도로의 표준화 후 GraphPad Prism 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 절반-최대 유효 농도(EC50)를 계산하였다. 실험을 3중으로 수행하였고, 유사한 결과로 3회 수행하였다.
마우스에서의 면역 세포 서브셋 확장 연구
면역 복합체가 효과기 세포 확장에 유리하도록 면역 반응을 편향시키는 지의 여부를 결정하기 위해, 12주령의 C57BL/6 마우스(코호트 당 3마리)에 4일 동안 매일 PBS 또는 hIL-2/602 또는 mIL-2/S4B6 복합체(30분 동안 PBS 중 2:1 사이토카인:항체 몰비로 hIL-2[eBioscience]와 602 또는 S4B6를 사전 인큐베이션함으로써 제조됨)를 i.p. 주사하였다. 경추 탈구에 의해 마우스를 5일에 희생시키고, 비장을 수확하였다. 단일-세포 현탁액을 기계적 균질화에 의해 제조하고, 비장세포의 절대 수를 자동화된 세포 계수기(Vicell, Beckman Coulter)에 의해 각각의 비장에 대해 평가하였다. 세포를 PBS에 재현탁시킨 후, BV605-복합체화된 항-CD4(Biolegend, clone RM4-5), PeCy7-복합체화된 항-IL-2Rα(eBioscience, 클론 PC61.5), PerCP-Cy5.5-복합체화된 항-CD8(eBioscience, 클론 53-6.72) 및 mAb를 사용하여 TReg(CD4+IL-2Rα+Foxp3+) 또는 CD8+ 효과기 T 세포(CD8+)의 표현형을 분석하기 위해 형광단-복합체화된 항-마우스 모노클로날 항체(mAb)와 함께 얼음 상에서 30분 동안 염색시켰다. 고정 가능한 Blue Dead Cell Stain Kit(Life Techonologies)를 사용하여 살아 있는 세포를 평가하였다. 이후, 세포를 FACS 완충액(1% BSA, 1% 소듐 아지드)로 2회 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 FoxP3 전사 인자 고정/투과화 완충액(eBioscience)에서 고정시켰다. 투과화 완충액(eBioscience)에서 2회 세척 후, TReg 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 FITC-복합체화된 항-마우스/래트 Foxp3 mAb(eBioscience, clone FJK-16s)로 염색하였다. 투과화 완충액에서 2회의 최종 세척을 수행하고, LSRII(BD Biosciences)에서의 흐름세포측정법 분석을 위해 세포를 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 데이터를 FlowJo X 소프트웨어(Tree Star)를 사용하여 분석하였다. PBS 대조군 세포에 비한 MP CD8+ 효과기 T 세포의 풍부함이 제시된다. 실험을 유사한 결과로 3회 수행하였다.
마우스에서의 종양 요법 연구.
마우스 동계 흑색종 모델의 경우, 1×106 B16F10 종양 세포를 C57BL/6 수컷 마우스(6-8주령, 치료 코호트 당 n=8)에 s.c. 접종하였다. 접종 후 4일째에 시작하여, 마우스에 PBS 또는 hIL-2/602 복합체(30분 동안 2:1 사이토카인:항체 몰비로 hIL-2와 602를 사전 인큐베이션함으로써 제조됨)를 매주 2회 i.p. 주사하였다. 사이토카인/항체 복합체의 효능을 평가하기 위해 종양 크기 및 체중을 매일 추적하였다. 종양 절제 및 분석을 위해 20일에 마우스를 희생시켰다.
602 scFv 변이체(EP602)의 돌연변이유발 효모-디스플레이된 라이브러리의 생성
602 항체((G4S)3 링커에 의해 분리된 중쇄 가변 도메인에 이어 경쇄 가변 도메인으로 구성됨)의 단일쇄 가변 단편(scFv) 버전은 3C 및 인자 Xa 절단 부위와 함께 (G4S)3 링커에 의해 분리된 Aga2의 C-말단에 대한 중쇄의 가변 도메인의 N-말단의 융합을 통해 효모 상에 제시되었다. 검출을 위해 C-말단 c-Myc 태그를 포함시켰다.
중쇄 및 경쇄 가변 도메인 둘 모두의 CDR1 및 CDR3을 돌연변이유발하는 표적화된 오류 빈발 라이브러리를 결합에서 잠재적으로 이로운 보존적인 변경을 허용하면서 기존 IL-2 상호작용을 보존하기 위해 생성시켰다. 4개의 표적화된 CDR을 표준 1x Taq 완충액, 2mM 망간(II) 클로라이드, 7mM 염화마그네슘, 0.2mM의 dATP 및 dGTP, 1mM dCTP 및 dTTP, 0.5μM의 각각의 프라이머 및 0.2ng/μL의 주형과 함께 Taq 중합효소(New England Biolabs)를 사용한 오류 빈발 PCR에 의해 증폭시켰다. 5회의 증폭 주기 후, 혼합물을 옮기고, 주형이 없는 새로운 혼합물로 1:5로 희석하였다. 또 다른 5회 주기를 진행시켰고, 전달 및 희석을 2회 더 반복하였고, 최종 전달은 총 20회의 증폭 주기를 겪었다.
표적화된 CDR에 인접한 5개의 프레임워크 서열을 Phusion High-Fidelity DNA 중합효소(Thermo Scientific)를 사용하여 증폭시켰다. 이들 프레임워크 단편을 Phusion 중합효소를 사용한 순차적인 쌍을 이룬 중첩 연장 PCR에 의해 이웃 돌연변이유발 단편과 조립하였다. 최종 조립된 단편은 절단된 효모 디스플레이 벡터 pCT3CBN과의 중첩을 제공하는 양 말단에 상동성 서열(≥ 97nt)뿐만 아니라 전체 602 scFv를 함유하였다.
절단된 벡터 및 돌연변이유발된 단편을 이전에 기재된 바와 같이 선형 백본 및 단편의 존재하에서 EBY100 효모의 전기천공 후에 효모 상동성 재조합에 의해 조립하였다.1,2 라이브러리는 1.4×107 형질전환체를 생성시켰고, 계대 전 48시간 동안 SDCAA 배지에서 성장시킨 후, 24시간 후에 1의 초기 OD에서 SGCAA에서 유도하였다. 재조합된 플라스미드의 샘플을 효모 플라스미드 미니프렙(Zymogen)에 의해 추출하여 단편의 백본으로의 적절한 삽입을 확인하였다. 대략 6%의 생산적 오류율, 즉, 아미노산 서열의 변화를 발생시키는 DNA 돌연변이가 관찰되었다.
EP602 라이브러리 선택
각각의 라운드의 선택은 나머지 클론의 10배 범위를 보장하기에 충분한 효모를 염색하고 분류하였다. 각각의 라운드로부터 선택된 효모를 2일 동안 SDCAA 액체 배지(pH 4.5)에서 30℃에서 밤새 성장시킨 후, 20℃에서 2일 동안 SGCAA 액체 배지(pH 4.5)에서 유도하였다.
나이브 EP602 라이브러리는 Alexa Fluor 647-컨쥬게이션된 스트렙타비딘(SA-AF647)(Thermo Scientific)에 특이적인 변이체를 제거하고, IL-2에 결합된 변이체를 선택함으로써 자기-활성화된 세포 선택(MACS)의 첫 번째 라운드에서 부피가 감소되었다. 모든 염색을 PBE 용액(인산염 완충 식염수 pH 7.2, 0.1% BSA, 및 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA))에서 모든 염색을 수행하였다. 첫 번째 MACS 단계에서, 효모를 4℃에서 1시간 동안 20 μg/mL SA-AF647과 함께 인큐베이션하고, 세척한 후, 4℃에서 20분 동안 1:20 항-Cy5/항-Alexa Fluor 647 마이크로비드(Miltenyi Biotec)와 함께 인큐베이션하고, 세척한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 LS MACS 분리 컬럼(Miltenyi Biotec)에서 런닝(running)시켰다. 컬럼(즉, 비-SA-AF647 결합제)을 통해 흐르는 효모를 수집하고, 제2 MACS 단계를 위해 제조하였다. 비오티닐화된 IL-2를 PBE에 희석된 SA-647(4:1 몰비; Thermo Fisher Scientific)와 혼합하고, 15분 동안 인큐베이션하여 사량체를 형성시키고, 효모를 4℃에서 2시간 동안 사량체와 함께 인큐베이션한 후, 세척하고, 이전과 같이 항-Cy5/항-Alexa Fluor 647 마이크로비드와 함께 인큐베이션하였다. 다시, 효모를 LS MACS 분리 컬럼을 통해 런닝시켰지만, 이 단계에서, 자석으로부터 컬럼을 제거한 후 용리된 세포를 수집하고, 다음 라운드의 선택을 위해 유도되기 전에 기재된 바와 같이 성장시켰다.
두 번째 선택 라운드는 c-Myc의 존재에 대해 선택하기 위해 MACS를 사용하여 전장 602 scFv 변이체를 분리한다. 효모를 4℃에서 2시간 동안 PBE에서 Alexa Fluor 647-컨쥬게이션된 항-c-Myc 항체(클론 9B11, Cell Signaling Technologies)의 1:100 희석액과 함께 인큐베이션하고, 항-Cy5/항-Alexa Fluor 647 마이크로비드와 함께 인큐베이션하고, LS MACS 분리 컬럼에서 런닝시켰다. 상기 기재된 바와 같이 용리된 세포를 수집하였다.
IL-2Rα 서브유닛과의 IL-2 상호작용을 경쟁적으로 차단하는 변이체를 선택하기 위해 매우 과량의 IL-2Rα의 존재하에서 감소하는 양의 IL-2를 사용하여 FACSymphony S6 세포 분류기(Becton Dickinson)에서 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 최종 3라운드의 선택을 수행하였다. 이들 경쟁 FACS 선택 중 첫 번째는 1.5 μM IL-2Rα와 함께 50nM IL-2를 사용하였고, 두 번째 및 세 번째 둘 모두는 30nM IL-2및 0.3μM IL-2Rα를 사용하였지만, 처음 두 선택과 달리, 세 번째 선택은 IL-2와 인큐베이션하고, 세척한 후, 2시간 동안 실온에서 IL-2Rα와 함께 인큐베이션(IL-2 해리를 허용함)함으로써 낮은 오프-레이트(off-rate)를 갖는 변이체를 선택하였다. 모든 FACS 선택에서, IL-2 결합에 대한 상위 5%의 변이체만 수집하였다.
효모 표면 scFv 결합 연구.
scFv를 디스플레이하는 효모(웰 당 2×105)를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 실온에서 4시간 동안 IL-2Rα의 존재 또는 부재하에서 비오티닐화된 IL-2를 함유하는 PBE 완충액에서 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 세척하고, 4℃에서 15분 동안 PBSA에서 AlexaFluor 647-복합체화된 스트렙타비딘(Thermo Fisher Scientific)의 1:200 희석액으로 염색하였다. 최종 세척 후, 세포를 CytoFLEX 흐름세포측정기(Beckman Coulter)를 사용하여 표적 결합에 대해 분석하였다. 배경-공제 및 표준화된 결합 곡선을 1차 결합 모델에 적합화시키고, 평형 해리 상수(KD) 값을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
결과
602 면역사이토카인은 포유동물 세포로부터 견고하게 생성된다.
사이토카인의 효능을 항체의 약동학적으로 유리한 특성과 결합하기 위해, hIL-2를 사이토카인-편향 602 항체(도 1a)에 융합시켜 면역사이토카인(IC)을 생성시켰다. 면역사이토카인 발현을 최적화하기 위해 신속한 소규모 HEK 293F 세포 형질감염 검정을 개발하였다. 세포를 미리 정의된 비율의 HC 및 IL-2-융합 LC 플라스미드 DNA로 6-웰 플레이트에서 형질감염시켰다. 3일 인큐베이션 후, 분비된 단백질을 단백질 G 수지로 상층액으로부터 포획하고, 0.1 M 글리신 pH 2.0으로 용리시키고, SDS-PAGE를 통해 분석하였다. 이러한 검정을 LC N-말단에서 마우스 IgG2a 항체에 융합된 hIL-2로 구성된 면역사이토카인을 사용하여 검증하였다. HC:LC 비율의 적정은 최적 발현 조건을 나타내었다(도 1b). 면역사이토카인 발현을 HEK 293F 세포에서 규모 확대시켰고, 분비된 단백질을 단백질 G 크로마토그래피에 이어 크기-배제 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 602 IC를 FPLC 기기에서 균질성으로 정제하였다(도 1c).
면역사이토카인은 수용체 결합 및 세포 신호전달을 선택적으로 편향시킨다.
Octet® 플랫폼에서 생물층 간섭계를 사용하여, 인간 IL-2Rα 및 IL-2Rβ 수용체를 고정시키고, 가용성 IC의 측정된 결합을 hIL-2 사이토카인과 비교하였다. 602 IC는 항체 차단으로 인해 IL-2Rα와 상호작용하지 않았지만, IL-2Rβ 결합은 테더링되지 않은 hIL-2에 비해 향상되었으며(도 2), 이는 분자 내 항체/사이토카인 복합체의 기능적 형성을 확인한다.
IL-2-반응성 면역 세포에 대한 IC 자극에 대한 다운스트림 신호전달 반응을 분석하여 IC 기능을 평가하였다. 조작된 IC에 의해 매개되는 면역 편향을 특성규명하기 위해, IL-2Rα를 유도성으로 발현하는 인간 YT-1 자연 살해(NK) 세포주를 사용하였다. Eff 대 TReg 활성화에 대한 대리물로서 유도되지 않은 IL-2Rα- 대 유도된 IL-2Rα+ YT-1 세포에서 IL-2, 사이토카인/항체 복합체(1:1의 화학양론적으로 동일한 몰비로 IL-2 및 602 항체를 사전 인큐베이션시킴으로써 제조됨) 또는 602 IC에 의해 유도된 STAT5 인산화를 정량화하기 위해 흐름세포측정법 기반 연구를 수행하였다. 테더링되지 않은 IL-2는 IL-2Rα+ 및 IL-2Rα- 세포 둘 모두를 자극하고, hIL-2/602 복합체는 IL-2Rα+ 및 IL-2Rα- YT-1 세포 둘 모두에서 손상된 활성을 나타낸다. 602 IC가 hIL-2/602 복합체의 세포 신호전달 특성을 효과적으로 반복한 것으로 관찰되었으며(도 3), 이는 혼합 복합체와 마찬가지로 602 IC가 사이토카인 신호전달을 Eff에 편향시킨다는 것을 입증한다.
IL-2/602 복합체는 Eff를 확장하고, 생체 내에서 종양 성장을 억제한다.
IL-2/602 복합체가 살아 있는 동물에서 Eff(특히, MP CD8+ 효과기 T 세포)를 확장시키는지의 여부를 결정하기 위해, 마우스에 PBS 또는 다양한 농도의 hIL-2/602 또는 mIL-2/S4B6 복합체를 주사하였다. hIL-2/602 복합체는 비록 mIL-2/S4B6 복합체보다 덜 강력하지만 MP CD8+ 효과기 T 세포를 확장시키는 것으로 관찰되었다(도 4a). hIL-2/602 복합체의 매주 2회 투여는 마우스 동계 흑색종 모델(B16F10)에서 종양 성장을 유의하게 억제하는 것으로 추가로 나타났다(도 4b).
링커 길이를 변형시키는 것은 602 면역사이토카인 생성 및 기능을 최적화시킨다.
602 IC의 발현, 안정성 및 기능을 개선시키기 위해, 면역사이토카인 내의 IL-2 사이토카인과 602 항체 사이의 분자 내 링커의 길이를 조정하였다. 구체적으로, 15개(SEQ ID NO:23, 602 IC LN15), 25개(SEQ ID NO:24, 602 IC LN25) 및 35개(SEQ ID NO:25, 602 IC LN35)의 아미노산 링커를 갖는 602 IC 변이체를 생성시켰다. 모든 작제물을 적절한 길이의 링커를 갖는 602 중쇄 및 IL-2-융합된 602 경쇄와 HEK 293F 세포의 일시적 공동-형질감염을 통해 발현시켰다. 도 5a에 제시된 바와 같이, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 3개의 피크가 명백해졌다. 처음 2개의 피크(피크 1 및 2)는 고분자량 올리고머에 해당하는 반면, 피크 3은 단량체 IC에 해당한다. 링커 길이가 증가함에 따라, 단량체의 분율도 증가하였고, 602 IC LN35는 거의 독점적으로 단량체 상태에 있었다. 따라서, 본 발명자는 35개 아미노산 링커 구성에 기초하여 면역사이토카인을 추가로 특성규명하도록 진행하였다. 모든 602 IC 변이체는 비-환원 및 환원 SDS-PAGE 분석을 통해 예상 분자량으로 이동하였다(도 5b).
적절한 조립이 확인되었고, 602 IC 변이체의 결합 특성을 Octet® 플랫폼을 사용하는 생물층 간섭계 연구를 통해 조사하였다. 인간 IL-2Rβ를 고정시키고, IL-2, 602 항체, IL-2+602 Ab 복합체(실온에서 30분 동안 2:1 화학양론적 비율로 IL-2 및 602 항체를 사전 인큐베이션함으로써 제조됨), 602 IC 변이체 및 관련되지 않은 음성 대조군 단백질의 결합을 측정하였다. 면역사이토카인 내에서 IL-2와 602 사이의 분자 내 상호작용에 기초하여 예상된 바와 같이, IL-2Rβ와의 IC 상호작용은 컨쥬게이션되지 않은 IL-2에 비해 향상되었고, 이는 602 IC의 적절한 조립 및 생물물리학적 거동을 입증한다(도 6).
IC 변이체를 이용한 자극에 대한 다운스트림 신호전달 반응을 IL-2-반응성 면역 세포에 대해 평가하여 기능을 평가하였다. IL-2Rα 발현이 있거나 없는 인간 YT-1 NK 세포를 사용하여 TReg 대 면역 효과기 세포에 대한 반응을 모방하였다. IL-2-매개 STAT5 인산화는 IL-2, 실온에서 30분 동안 1:1 화학양론적 비율로 IL-2 및 602 항체를 사전 인큐베이션하여 제조된 IL-2+602 Ab 복합체, 또는 602 IC 변이체를 이용한 자극 후 흐름세포측정법에 의해 정량화하였다(도 7). 테더링되지 않은 IL-2는 IL-2Rα+ TReg-유사 세포의 활성화에 대한 3-4배의 편향을 나타낸 반면, 리드 IC, 602 IC LN35는 IL-2Rα- Eff-유사 세포를 선호하도록 상기 편향을 반전시켰다. IC에 의해 매개되는 편향은 IL-2+602 Ab 복합체에 의해 매개되는 것을 초과했다는 점을 주목한다.
602 IC의 조작된 버전은 효과기 세포에 대한 편향을 개선시켰다.
TReg 세포에 비한 Eff에 대한 602 IC의 활성을 추가로 왜곡시키기 위해, 602 가변 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 루프(CDR)를 무작위화하는 오류 빈발 돌연변이유발 라이브러리를 생성시켰다. 이후, 이러한 라이브러리를 자기 활성화 세포 분류(MACS) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)의 반복적 라운드를 통해 인간 IL-2에 대해 발달시켰고, 사이토카인 진입기전에 대해 가용성 IL-2Rα를 성공적으로 능가하는 클론을 선택하였다. 5라운드의 선택 후, 발달된 라이브러리는 IL-2에 대한 유의하게 개선된 결합(도 8a) 및 IL-2Rα 수용체 서브유닛과의 향상된 경쟁(도 8b)을 나타내었다. 이러한 라이브러리로부터의 개별 클론을 특성규명하였고, 가장 효과적인 돌연변이체가 F10(SEQ ID NO:28 및 SEQ ID NO:29)으로 표시된 변이체인 것으로 밝혀졌다. 도 8c에 제시된 바와 같이, F10 항체(단일쇄 가변 단편 [scFv] 형식)는 IL-2에 대한 더 강한 결합 및 모 602 scFv에 비해 IL-2Rα과 더 강력한 경쟁을 나타내었다. F10 항체는 최적화된 35개 아미노산 링커를 사용하여 IC로서 재포맷되었다. F10 IC LN35는 항체 중쇄 및 IL-2-융합된 항체 경쇄의 일시적 공동-형질감염을 통해 HEK 293F 세포로부터 발현되었다. 도 9a에 제시된 바와 같이, 분비된 단백질의 대부분은 단량체였다. 35개의 아미노산 링커와 함께 IL-2에 융합된 관련 없는 항체로 구성된 IC 작제물을 또한 실험 대조군으로 제조하였다(Irrel. Ab IC LN35). F10 IC LN35 및 관련 없는 항체는 비-환원 및 환원 SDS-PAGE를 통해 예상 분자량으로 이동하였다(도 9b).
F10 IC LN35의 조립 및 적절한 결합 거동을 확인하기 위해, Octet® 기기를 사용하여 생물층 간섭계 실험을 수행하였다. 인간 IL-2, IL-2Rα 및 IL2Rβ 수용체를 고정시키고, 602 항체, IL-2+602 Ab 복합체(실온에서 30분 동안 2:1 화학양론적 비율로 IL-2 및 602 항체를 사전 인큐베이션함으로써 제조됨), 602 IC LN35, F10 IC LN35 및 관련되지 않은 음성 대조군 단백질의 결합을 측정하였다. IL-2와의 IC 상호작용은 IC 내의 분자 내 상호작용으로부터의 경쟁으로 인해 컨쥬게이션되지 않은 602 항체에 비해 크게 약화되었다(도 10a). 더욱이, 602 IC LN35와 같이, F10 IC LN35는 IL-2 사이토카인 결합의 항체 차단으로 인해 IL-2Rα에 대한 최소 결합을 나타내었고, F10 IC LN35는 설계된 바와 같이 602 IC LN35보다 수용체와 더 경쟁적이었다(도 10b). IL-2Rβ에 대한 결합은 602 IC LN35 및 F10 IC LN35 둘 모두에 대해 컨쥬게이션되지 않은 IL-2와 비교하여 향상되었다(도 10c). 종합적으로, 이들 결합 연구는 조작된 IC 변이체 F10 IC LN35의 분자 내 조립 및 생물물리학적 기능을 입증한다.
IL-2Rα+ TReg-유사 세포와 비교하여 IL-2Rα- Eff-유사 세포에 대한 F10 LN35 IC의 우수한 편향은 YT-1 인간 NK 세포주를 사용하여 입증되었다. IL-2Rα가 있거나 없는 YT-1을 IL-2, 관련 없는 항체 Ab IC LN35, IL-2+602 Ab 복합체(실온에서 30분 동안 1:1 화학양론적 비율로 IL-2 및 602 항체를 사전 인큐베이션하여 제조됨), 602 IC LN35 또는 F10 LN35로 자극하였다. STAT5 인산화는 IL-2-유도 신호전달에 대한 판독으로서 흐름세포측정법을 통해 검출되었다(도 11). IL-2 및 대조군의 관련 없는 항체 Ab IC LN35는 IL-2Rα- Eff-유사 세포에 비해 IL-2Rα+ TReg-유사에 대해 유의한 편향을 나타낸 반면, F10 IC LN35는 이러한 선호를 반전시켰고, 모 602 IC LN35를 약간 능가하였다. F10 IC LN35 및 602 IC LN35 둘 모두는 IL-2+602 복합체에 비해 TReg-유사 세포에 비한 Eff-유사 세포에 대한 유의하게 더 강한 선호를 나타내었다.
개요
이들 결과는 IL2/602 면역사이토카인이 면역 효과기 세포 활성을 자극할 수 있고, 암 및/또는 감염성 질병을 갖는 포유동물을 치료하는 데 사용될 수 있음을 입증한다.
기타 구현예
본 발명은 이의 상세한 설명과 관련하여 기재되었으나, 상기 기재는 예시를 위한 것으로, 첨부된 청구항의 범위에 의해 규정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 기타 양태, 장점, 및 변형은 하기 청구항의 범위 내이다.
서열 목록 프리 텍스트:
SEQ ID NO:1
신호 서열 - 602 VH - 마우스 IgG2a C H 1, C H 2 및 C H 3
Figure pct00003
SEQ ID NO: 2
신호 서열 - 602 VL - 마우스 카파 C L
Figure pct00004
SEQ ID NO: 3
신호 서열 - hIL-2 - 링커 - 602 VL - 마우스 카파 C L
Figure pct00005
SEQ ID NO: 4
602 HC 가변 도메인
Figure pct00006
SEQ ID NO: 5
602 HC 불변 도메인
Figure pct00007
SEQ ID NO: 6
신호 서열
Figure pct00008
SEQ ID NO: 7
신호 서열
Figure pct00009
SEQ ID NO: 8
신호 서열
Figure pct00010
SEQ ID NO: 9
인간 IL-2
Figure pct00011
SEQ ID NO: 10
602 LC 가변 도메인
Figure pct00012
SEQ ID NO: 11
602 LC 불변 도메인
Figure pct00013
SEQ ID NO: 12
링커
Figure pct00014
SEQ ID NO: 13
링커
Figure pct00015
SEQ ID NO: 14
링커
Figure pct00016
SEQ ID NO: 15
링커
Figure pct00017
SEQ ID NO: 16
링커
Figure pct00018
SEQ ID NO: 17
링커
Figure pct00019
SEQ ID NO: 18
링커
Figure pct00020
SEQ ID NO: 19
링커
Figure pct00021
SEQ ID NO: 20
링커
Figure pct00022
SEQ ID NO: 21
링커
Figure pct00023
SEQ ID NO: 22
링커
Figure pct00024
SEQ ID NO: 23
신호 서열 - hIL-2 - 링커 - 602 VL - 마우스 카파 C L
Figure pct00025
SEQ ID NO: 24
신호 서열 - hIL-2 - 링커 - 602 VL - 마우스 카파 C L
Figure pct00026
SEQ ID NO: 25
신호 서열 - hIL-2 - 링커 - 602 VL - 마우스 카파 C L
Figure pct00027
SEQ ID NO: 26
신호 서열 - 602 변이체 F10 VH - 마우스 IgG2α C H 1, C H 2 및 C H 3
Figure pct00028
SEQ ID NO: 27
신호 서열 - hIL-2 - 링커 - 602 변이체 F10 VL - 마우스 카파 C L
Figure pct00029
SEQ ID NO: 28
602 변이체 F10 VH
Figure pct00030
SEQ ID NO: 29
602 변이체 F10 VL
Figure pct00031
SEQ ID NO: 30
비오틴 수용체 펩티드
Figure pct00032
SEQUENCE LISTING <110> The Johns Hopkins University <120> METHODS AND MATERIALS FOR TARGETED EXPANSION OF IMMUNE EFFECTOR CELLS <130> 44807-0333WO1 <150> 62/867,010 <151> 2019-06-26 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant antibody heavy chain polypeptide sequence <400> 1 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 20 25 30 Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Gly Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys 85 90 95 Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala 100 105 110 Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Arg Thr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 130 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PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 17 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 18 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 18 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 19 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 20 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 21 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 21 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 <210> 22 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide linker <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 60 <210> 23 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Immunocytokine light chain polypeptide sequence <400> 23 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro 165 170 175 Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 180 185 190 Ala Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 195 200 205 Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr 210 215 220 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr 225 230 235 240 Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 245 250 255 Gln Gln Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 260 265 270 Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 275 280 285 Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu 290 295 300 Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly 305 310 315 320 Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp 340 345 350 Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr 355 360 365 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 370 375 380 <210> 24 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Immunocytokine light chain polypeptide sequence <400> 24 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Ser Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser 180 185 190 Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile Tyr 195 200 205 Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu 210 215 220 Leu Ile Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 225 230 235 240 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu 245 250 255 Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Gly Thr 260 265 270 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp 275 280 285 Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr 290 295 300 Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys 305 310 315 320 Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly 325 330 335 Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 340 345 350 Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn 355 360 365 Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val 370 375 380 Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 385 390 <210> 25 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Immunocytokine light chain polypeptide sequence <400> 25 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Val 180 185 190 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr 195 200 205 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr 210 215 220 Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr 225 230 235 240 Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala 260 265 270 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 275 280 285 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 290 295 300 Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val 305 310 315 320 Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp 325 330 335 Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr 340 345 350 Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr 355 360 365 Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala 370 375 380 Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn 385 390 395 400 Glu Cys <210> 26 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Immunocytokine heavy chain polypeptide sequence <400> 26 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 20 25 30 Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Leu Thr Asn Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Gly Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys 85 90 95 Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala 100 105 110 Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Arg Ser Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 195 200 205 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 210 215 220 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 225 230 235 240 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 260 265 270 Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp 275 280 285 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr 290 295 300 Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val 355 360 365 Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr 370 375 380 Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr 385 390 395 400 Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 420 425 430 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 435 440 445 Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 27 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Immunocytokine light chain polypeptide sequence <400> 27 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Val 180 185 190 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr 195 200 205 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Trp Tyr 210 215 220 Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr 225 230 235 240 Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala 260 265 270 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asp Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 275 280 285 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 290 295 300 Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val 305 310 315 320 Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp 325 330 335 Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr 340 345 350 Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr 355 360 365 Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala 370 375 380 Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn 385 390 395 400 Glu Cys <210> 28 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Immunoglobulin 602 F10 variant heavy chain variable domain polypeptide sequence <400> 28 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Gln Gly Arg Ser Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ala <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Immunoglobulin 602 F10 variant light chain variable domain polypeptide sequence <400> 29 Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asp Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> biotin acceptor peptide <400> 30 Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10

Claims (50)

  1. 면역글로불린 중쇄;
    IL-2 폴리펩티드로서, 상기 IL-2 폴리펩티드가 인터루킨-2 수용체-β(IL-2Rβ) 폴리펩티드 및 공통 감마 사슬(γc) 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체(IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체)에 결합할 수 있는, IL-2 폴리펩티드; 및
    면역글로불린 경쇄를 포함하는, 단일쇄 면역사이토카인으로서,
    상기 단일쇄 면역사이토카인이 상기 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합하는, 단일쇄 면역사이토카인.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  3. 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 γ 중쇄 불변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  5. 제4항에 있어서, 상기 γ 중쇄 불변 도메인이 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 단일쇄 면역사이토카인.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 불변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 신호 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  8. 제7항에 있어서, 상기 신호 서열이 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  10. 제1항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  11. 제10항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  12. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  13. 제12항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 κ 경쇄 불변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  15. 제14항에 있어서, 상기 κ 경쇄 불변 도메인이 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 단일쇄 면역사이토카인.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 신호 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  18. 제17항에 있어서, 상기 신호 서열이 SEQ ID NO:7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  19. 제12항 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO:2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  20. 제1항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩티드 및 상기 면역글로불린 경쇄가 융합 폴리펩티드인 단일쇄 면역사이토카인.
  21. 제20항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  22. 제21항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  23. 제20항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖거나 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  24. 제23항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 갖거나 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 κ 경쇄 불변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  26. 제25항에 있어서, 상기 κ 경쇄 불변 도메인이 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 단일쇄 면역사이토카인.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 폴리펩티드 및 상기 면역글로불린 경쇄가 링커를 통해 융합되는 단일쇄 면역사이토카인.
  29. 제28항에 있어서, 상기 링커가 10 내지 60개의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커인 단일쇄 면역사이토카인.
  30. 제29항에 있어서, 상기 링커가 (Gly4Ser)2 링커인 단일쇄 면역사이토카인.
  31. 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 신호 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  32. 제31항에 있어서, 상기 신호 서열이 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  33. 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:27 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일쇄 면역사이토카인.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일쇄 면역사이토카인이 약 5분 내지 약 6개월의 반감기를 갖는 단일쇄 면역사이토카인.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일쇄 면역사이토카인이 약 300 nM KD 내지 약 1 pM KD의 IL-2Rβ 폴리펩티드에 대한 친화성을 갖는 단일쇄 면역사이토카인.
  36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일쇄 면역사이토카인이 약 10 nM KD 초과의 IL-2Rα 폴리펩티드에 대한 친화성을 갖는 단일쇄 면역사이토카인.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일쇄 면역사이토카인이 인간 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합하는 단일쇄 면역사이토카인.
  38. 제37항에 있어서, 상기 단일쇄 면역사이토카인이 비-인간 IL-2Rβ/γc 폴리펩티드 복합체에 결합하지 않는 단일쇄 면역사이토카인.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 단일쇄 면역사이토카인을 인코딩하는 핵산.
  40. 제39항에 있어서, 상기 핵산이 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함하며, 상기 제1 핵산이 상기 면역글로불린 중쇄를 인코딩할 수 있고, 상기 제2 핵산이 상기 면역글로불린 경쇄에 융합된 상기 IL-2 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 핵산.
  41. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 단일쇄 면역사이토카인을 포함하는 조성물 또는 제39항 또는 제40항의 핵산을 포함하는 조성물을 암을 갖는 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물을 치료하기 위한 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 암이 유방암, 난소암, 전립선암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 구강암, 방광암, 결장직장암, 자궁경부암, 식도암 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물에 존재하는 암세포의 수가 감소되는 조건하에 상기 포유동물에 하나 이상의 암 치료를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  45. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 단일쇄 면역사이토카인을 포함하는 조성물 또는 제39항 또는 제40항의 핵산을 포함하는 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 효과기 세포를 자극하기 위한 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  47. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 단일쇄 면역사이토카인을 포함하는 조성물 또는 제39항 또는 제40항의 핵산을 포함하는 조성물을 감염성 질병을 갖는 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물을 치료하기 위한 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 감염성 질병이 인간 면역결핍 바이러스, 말라리아, 인플루엔자, 에볼라, 결핵, 홍역, 광견병, 뎅기열, 살모넬라증, 백일해, 페스트 및 웨스트 나일 열로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 조절 T 세포를 실질적으로 활성화시키지 않는 방법.
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