JP2022538008A - 免疫エフェクター細胞をターゲット化して増殖させるための方法及び材料 - Google Patents
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Abstract
この書類は、免疫エフェクター(Eff)T細胞をターゲット化して増殖させる(targeted expansion)ための方法及び材料に関する。例えば、インターロイキン-2レセプター-β(IL-2Rβ)ポリペプチド及び共通のガンマ鎖(γc)ポリペプチドを含むヘテロ二量体レセプター(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体)に結合することができる1種以上のアミノ酸鎖(例えば、1種以上の単鎖抗体/サイトカイン融合タンパク質(免疫サイトカイン))を含む組成物を哺乳動物に投与して、前記哺乳動物内のEffsを刺激し、その哺乳動物における免疫反応を活性化することができる。いくつかの場合において、免疫反応を活性化することから利益を得ることができる症状(例えば、がん及び/又は感染性疾患)を有する哺乳動物を治療するために使用することができる方法及び材料を提供する。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、がん及び/又は感染性疾患を有する哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することができる。
Description
[関連出願の相互参照]
本出願は、2019年6月26日に出願された米国特許出願第62/867,010号の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる(及び本出願に参照により取り込まれる)。
本出願は、2019年6月26日に出願された米国特許出願第62/867,010号の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる(及び本出願に参照により取り込まれる)。
1.技術分野
この書類は、免疫エフェクター(Effs)細胞をターゲット化して増殖させる(targeted expansion)ための方法及び材料に関する。例えば、インターロイキン-2レセプター-β(IL-2Rβ)ポリペプチド及び共通のガンマ鎖(γc)ポリペプチドを含むヘテロ二量体レセプター(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体)に結合することができる1種以上のアミノ酸鎖(例えば、1種以上の単鎖抗体/サイトカイン融合タンパク質(免疫サイトカイン))を含む組成物を哺乳動物に投与して、前記哺乳動物内のEffs細胞を刺激し、その哺乳動物における免疫反応を活性化することができる。いくつかの場合において、免疫反応を活性化することから利益を得ることができる症状(例えば、がん及び/又は感染性疾患)を有する哺乳動物を治療するために使用することができる方法及び物質を、本発明は提供する。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、がん及び/又は感染性疾患を有する哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することができる。
この書類は、免疫エフェクター(Effs)細胞をターゲット化して増殖させる(targeted expansion)ための方法及び材料に関する。例えば、インターロイキン-2レセプター-β(IL-2Rβ)ポリペプチド及び共通のガンマ鎖(γc)ポリペプチドを含むヘテロ二量体レセプター(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体)に結合することができる1種以上のアミノ酸鎖(例えば、1種以上の単鎖抗体/サイトカイン融合タンパク質(免疫サイトカイン))を含む組成物を哺乳動物に投与して、前記哺乳動物内のEffs細胞を刺激し、その哺乳動物における免疫反応を活性化することができる。いくつかの場合において、免疫反応を活性化することから利益を得ることができる症状(例えば、がん及び/又は感染性疾患)を有する哺乳動物を治療するために使用することができる方法及び物質を、本発明は提供する。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、がん及び/又は感染性疾患を有する哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することができる。
2.背景情報
IL-2は、免疫細胞の分化、増殖、生存、及び活性を調整する多機能性サイトカインである。免疫反応を強力に活性化するために、高用量IL-2療法は、抗-がん免疫を刺激するために臨床的に使用され、1992年に転移性腎細胞がん(renal cell carcinoma)の治療に対して、及び1998年に転移性メラノーマの治療に対して、FDAの承認を受けた(Liao et al., Immunity. 38(1):13-25 (2013))。IL-2療法は、患者自身の免疫システムを活性化することによって、患者の5~10%において、完全で且つ持続的な応答を誘発する(Rosenberg et al., Sci Transl Med. 4(127):127ps8 (2012))。しかし、IL-2は、Effs(例えば、ナチュラル・キラー(NK)細胞、ナチュラル・キラーT(NKT)細胞、CD4+エフェクターT細胞、及びCD8+エフェクターT細胞)及び調節性T細胞(TRegS)の両方を同時に活性化するので、有効性は限定的であり、有害なオフ-ターゲット効果及び毒性がもたらされ、最も顕著には、浮腫、臓器不全、及び死亡に至ることがある重篤な血管漏出症候群(vascular leak syndrome)がもたらされる(Boyman et al., Nat Rev Immunol. 12(3):180-190 (2012); 及び Dhupkar et al., Adv Exp Med Biol. 995:33-51 (2017))。更に、IL-2は短い血清半減期(<5分)で減少していくことによって、その臨床的な働きが妨げられる (Donohue et al., J Immunol Baltim Md 1950. 130(5):2203-2208 (1983))。
IL-2は、免疫細胞の分化、増殖、生存、及び活性を調整する多機能性サイトカインである。免疫反応を強力に活性化するために、高用量IL-2療法は、抗-がん免疫を刺激するために臨床的に使用され、1992年に転移性腎細胞がん(renal cell carcinoma)の治療に対して、及び1998年に転移性メラノーマの治療に対して、FDAの承認を受けた(Liao et al., Immunity. 38(1):13-25 (2013))。IL-2療法は、患者自身の免疫システムを活性化することによって、患者の5~10%において、完全で且つ持続的な応答を誘発する(Rosenberg et al., Sci Transl Med. 4(127):127ps8 (2012))。しかし、IL-2は、Effs(例えば、ナチュラル・キラー(NK)細胞、ナチュラル・キラーT(NKT)細胞、CD4+エフェクターT細胞、及びCD8+エフェクターT細胞)及び調節性T細胞(TRegS)の両方を同時に活性化するので、有効性は限定的であり、有害なオフ-ターゲット効果及び毒性がもたらされ、最も顕著には、浮腫、臓器不全、及び死亡に至ることがある重篤な血管漏出症候群(vascular leak syndrome)がもたらされる(Boyman et al., Nat Rev Immunol. 12(3):180-190 (2012); 及び Dhupkar et al., Adv Exp Med Biol. 995:33-51 (2017))。更に、IL-2は短い血清半減期(<5分)で減少していくことによって、その臨床的な働きが妨げられる (Donohue et al., J Immunol Baltim Md 1950. 130(5):2203-2208 (1983))。
IL-2は、IL-2Rα、IL-2Rβ及びγc鎖からなる高親和性(KD≒10 pM)ヘテロ三量体レセプター、又はIL-2Rβ及びγc鎖のみからなる中間親和性(KD≒1 nM)ヘテロ二量体レセプターのいずれかを介して、細胞シグナル伝達を活性化する。その結果、IL-2応答性は、IL-2Rαサブユニットによって決まるが、これは、TRegs上で高度に発現しているが、ナイーブEffsでは実質的には存在せず、TRegsをIL-2に対して100倍高い感受性にする(例えば、Boyman et al., Nat Rev Immunol. 12(3):180-90 (2012); Malek, Annu Rev Immunol. 26:453-79 (2008); 及び Spangler et al., Annu Rev Immunol. 33:139-67 (2015)を参照). 。IL-2の免疫刺激活性を単離し、選択的に調整することができれば、免疫療法の開発に対する転換的な進歩となり、がん及び感染性疾患の治療に大きな意味をもつ。
この書類は、Effsをターゲット化して増殖させる(targeted expansion)ための方法及び材料を提供する。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインが本出願で提供される。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインは、免疫グロブリン重鎖(VH)、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)、及び免疫グロブリン軽鎖(VL)を含むことがある(例えば、含むように設計することがある)。IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインを作製し、使用するための方法もまた、本出願で提供される。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、それを必要とする哺乳動物(例えば、哺乳動物内で免疫反応を活性化することから利益を得ることができる症状[がん及び/又は感染性疾患など]を有する哺乳動物)に投与して、前記哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、哺乳動物に投与して、前記哺乳動物内で1種以上のEffsを刺激することができる (例えば、その哺乳動物において免疫反応を活性化することができる)。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、がんを有する哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することができる。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、感染性疾患を有する、又は発症するリスクがある哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することができる。
本出願で実証されるように、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合するように、工学的に操作した単鎖免疫サイトカインは、in vivoで、免疫Effsを特異的に刺激する(例えば、増殖させる(expand))ことがある、及びin vivoで腫瘍増殖を阻害することがある。哺乳動物(例えば、ヒト)において、免疫Effs(例えば、TRegSではない)を直接的に刺激する作用能があることによって、哺乳動物(例えば、ヒト)において、効果的な免疫反応を安全に及び選択的に促進する、並びに、がん及び/又は感染性疾患を有する、又は有することが疑われる哺乳動物を治療するために使用することができる、ユニークで且つ未だ実現されていない、ターゲットを定めたサイトカイン療法が提供される。
総じて、この書類の1つの態様は、(a)免疫グロブリン重鎖;(b)IL-2ポリペプチド、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る;及び(c) 免疫グロブリン軽鎖、を含む単鎖免疫サイトカイン;ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、前記IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する、を特徴とする。前記免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):4に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、又は配列番号(SEQ ID NO):28に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、可変ドメインを含むことがある。前記免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):4又は配列番号(SEQ ID NO):28に記載のアミノ酸配列を有する、可変ドメインを含むことがある。前記免疫グロブリン重鎖は、γ重鎖定常ドメインを含むことがある。前記γ重鎖定常ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):5に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有することがある。前記免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):5に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含むことがある。前記免疫グロブリン重鎖は、シグナル配列を含むことがある。前記シグナル配列は、配列番号(SEQ ID NO):6に記載のアミノ酸配列を含むことがある。前記免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):1又は配列番号(SEQ ID NO):26に記載のアミノ酸配列を含むことがある。前記IL-2ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むことがある。前記IL-2ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列を含むことがある。請求項1に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、又は配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、可変ドメインを含む。前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):10又は配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列を有する、可変ドメインを含むことがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、カッパ(κ)軽鎖定常ドメインを含むことがある。前記κ軽鎖定常ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有することがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含むことがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列を含むことがある。前記シグナル配列は、配列番号(SEQ ID NO):7に記載のアミノ酸配列を含むことがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):2に記載のアミノ酸配列を含むことがある。前記IL-2ポリペプチド及び前記免疫グロブリン軽鎖は、融合ポリペプチドであることがある。前記IL-2ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むことがある。前記IL-2ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列を含むことがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、又は配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、可変ドメインを含むことがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):10又は配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列を有する、可変ドメインを含むことがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、κ軽鎖定常ドメインを含むことがある。前記κ軽鎖定常ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有することがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含むことがある。前記IL-2ポリペプチド及び前記免疫グロブリン軽鎖は、リンカーを介して融合していることがある。前記リンカーは、10~60個のアミノ酸を含むペプチド・リンカーであることがある。前記リンカーは、(Gly4Ser)2リンカーであることがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列を含むことがある。前記シグナル配列は、配列番号(SEQ ID NO):8に記載のアミノ酸配列を含むことがある。前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):3、配列番号(SEQ ID NO):23、配列番号(SEQ ID NO):24、配列番号(SEQ ID NO):25、又は配列番号(SEQ ID NO):27の何れか1つに記載のアミノ酸配列を含むことがある。前記単鎖免疫サイトカインは、約5分~約6ヶ月の半減期を有することがある。前記単鎖免疫サイトカインは、約300 nM KD~約1 pM KDのIL-2Rβポリペプチドに対する親和性を有することがある。前記単鎖免疫サイトカインは、約10 nM KDを超えるIL-2Rαポリペプチドに対する親和性を有することがある。いくつかの場合において、前記単鎖免疫サイトカインは、ヒトIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合することがある。いくつかの場合において、前記単鎖免疫サイトカインは、非-ヒトIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合しない。
別の態様において、この書類は、(a)免疫グロブリン重鎖;(b)IL-2ポリペプチド、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る;及び(c) 免疫グロブリン軽鎖、を含む単鎖免疫サイトカインをコードする核酸;ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、前記IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する、を特徴とする。前記核酸は、第1の核酸及び第2の核酸を含むことがある、ここで、前記第1の核酸は、前記免疫グロブリン重鎖をコードすることがある、及びここで、前記第2の核酸は、前記免疫グロブリン軽鎖に融合した前記IL-2ポリペプチドをコードすることがある。
別の態様において、この書類は、がんを有する哺乳動物を治療するための方法を特徴とする。前記方法は、(a)免疫グロブリン重鎖;(b)IL-2ポリペプチド、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る;及び(c) 免疫グロブリン軽鎖、を含む1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物;ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、前記IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する、又は(a)免疫グロブリン重鎖;(b)IL-2ポリペプチド、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る;及び(c) 免疫グロブリン軽鎖、を含む単鎖免疫サイトカインをコードする核酸を含む組成物;ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、前記IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する、を、がんを有する哺乳動物に投与すること、を含むことがある、又は、から本質的になることがある。前記哺乳動物は、ヒトであることがある。前記がんは、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん(kidney cancer)、 肺がん、メラノーマ、口腔がん、膀胱がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、食道がん(esophageal cancer)、又は子宮がん(uterine cancer)であることがある。前記方法は、前記哺乳動物に存在するがん細胞の数が減少する条件下で、前記哺乳動物に1種以上のがん治療を処方することを更に含むことがある。前記方法は、調節性T細胞を実質的に活性化しない。
別の態様では、この書類は、哺乳動物においてエフェクター細胞を刺激するための方法を特徴とする。前記方法は、(a)免疫グロブリン重鎖;(b)IL-2ポリペプチド、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る;及び(c) 免疫グロブリン軽鎖、を含む1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物;ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、前記IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する、又は(a)免疫グロブリン重鎖;(b)IL-2ポリペプチド、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る;及び(c) 免疫グロブリン軽鎖、を含む単鎖免疫サイトカインをコードする核酸を含む組成物;ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、前記IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する、を、哺乳動物に投与すること、を含むことがある、又は、から本質的になることがある。前記哺乳動物は、ヒトであることがある。前記方法は、調節性T細胞を実質的に活性化しない。
別の態様では、この書類は、感染性疾患を有する哺乳動物を治療するための方法を特徴とする。前記方法は、(a)免疫グロブリン重鎖;(b)IL-2ポリペプチド、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る;及び(c) 免疫グロブリン軽鎖、を含む1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物;ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、前記IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する、又は(a)免疫グロブリン重鎖;(b)IL-2ポリペプチド、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る;及び(c) 免疫グロブリン軽鎖、を含む単鎖免疫サイトカインをコードする核酸を含む組成物;ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、前記IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する、を、感染性疾患を有する哺乳動物に投与すること、を含むことがある、又は、から本質的になることがある。前記哺乳動物は、ヒトであることがある。前記感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス、マラリア、インフルエンザ、エボラ、結核、麻疹、狂犬病、デング熱、サルモネラ症、百日咳、ペスト、又は西ナイル熱であることがある。前記方法は、調節性T細胞を実質的に活性化しない。
別段の定義をしない限り、本出願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本出願に記載されたものと類似の又は同等の方法及び材料を使用して、本発明を実施することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本出願で参照される、全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により取り込まれる。相反する場合、定義を含む本出願が優先される。更に、材料、方法、及び実施例は、ほんの例示にすぎず、限定を意図するものではない。
本発明の1つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面及び以下の明細書に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び図面、並びに特許請求の範囲、から明らかになるのであろう。
発明の詳細な説明
この書類は、Effsをターゲット化して増殖させる(targeted expansion)ための方法及び材料を提供する。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインが本出願で提供される。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインは、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)、及び免疫グロブリン軽鎖、を含むことがある(例えば、含むように設計することがある)。IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインを作製し、使用するための方法もまた、本出願で提供される。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、それを必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)(例えば、哺乳動物内で免疫反応を活性化することから利益を得ることができる症状[がん及び/又は感染性疾患など]を有する哺乳動物)に投与して、前記哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、哺乳動物に投与して、前記哺乳動物内でEffsを刺激することができる (例えば、その哺乳動物において免疫反応を活性化することができる)。本出願で記載するIL-2Rβポリペプチドに結合し得る単鎖免疫サイトカインによって刺激され得るEffsの例としては、限定されるものではないが、CD4+ エフェクターT細胞、CD8+ エフェクターT細胞、メモリー表現型CD8+ エフェクターT細胞、NK細胞、及びNKT細胞が挙げられる。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、がんを有する哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することがある。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、感染性疾患を有する、又は発症するリスクがある哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することがある。
この書類は、Effsをターゲット化して増殖させる(targeted expansion)ための方法及び材料を提供する。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインが本出願で提供される。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインは、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)、及び免疫グロブリン軽鎖、を含むことがある(例えば、含むように設計することがある)。IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインを作製し、使用するための方法もまた、本出願で提供される。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、それを必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)(例えば、哺乳動物内で免疫反応を活性化することから利益を得ることができる症状[がん及び/又は感染性疾患など]を有する哺乳動物)に投与して、前記哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、哺乳動物に投与して、前記哺乳動物内でEffsを刺激することができる (例えば、その哺乳動物において免疫反応を活性化することができる)。本出願で記載するIL-2Rβポリペプチドに結合し得る単鎖免疫サイトカインによって刺激され得るEffsの例としては、限定されるものではないが、CD4+ エフェクターT細胞、CD8+ エフェクターT細胞、メモリー表現型CD8+ エフェクターT細胞、NK細胞、及びNKT細胞が挙げられる。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、がんを有する哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することがある。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、感染性疾患を有する、又は発症するリスクがある哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することがある。
本出願で使用される場合、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、抗体又はそのフラグメントに融合した(例えば、遺伝的に融合した)サイトカインを含む融合タンパク質(例えば、サイトカイン/抗体融合タンパク質)である。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインとしては、抗-サイトカイン抗体又はそのフラグメント(例えば、抗-IL-2抗体又はそのフラグメント)に融合したサイトカイン、を挙げることができる。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインとしては、抗体に融合したサイトカイン(前記サイトカイン及び抗体が、前記免疫サイトカイン内で分子内結合する)を挙げることができる。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインとしては、抗体の1つ以上の末端(例えば、抗体重鎖のN-末端若しくはC-末端、及び/又は抗体軽鎖のN-末端若しくはC-末端)に融合したサイトカイン、を挙げることができる。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、免疫グロブリン軽鎖(例えば、抗-サイトカイン抗体由来の免疫グロブリン軽鎖)に融合した、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)に融合した免疫グロブリン重鎖(例えば、抗-サイトカイン抗体由来の免疫グロブリン重鎖)、を含む融合ポリペプチドであることがある。
本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、任意の適切な供給源に由来する(例えば、ヒト又はマウスのような任意の適切な哺乳動物に由来する)IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合することがある。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、ヒトIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る。いくつかの場合(IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド[又はそのフラグメント]が、第1の種の哺乳動物に由来するIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する場合)において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る前記IL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、第2の種の哺乳動物に由来するIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体と交差反応しない。例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)が、ヒトIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する場合、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る前記IL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、非-ヒト種に由来するIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体(例えば、マウスIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体)と交差反応しない。
本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、任意の適切な免疫グロブリン(Ig)重鎖を含むことがある。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切なアイソタイプ免疫グロブリン(例えば、IgA免疫グロブリン、IgD免疫グロブリン、IgE免疫グロブリン、IgG免疫グロブリン、及びIgM免疫グロブリン)に由来することがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン重鎖は、IgG重鎖(例えば、IgG2a重鎖)であることがある。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切なクラスの免疫グロブリン(例えば、γ、σ、α、μ、及びε)に由来することがある。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切な重鎖可変ドメイン(VH)を有することがある。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切な重鎖定常ドメイン(CH)を有することがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン重鎖は、3つの定常ドメイン(例えば、CH1、CH2、及びCH3)を有する免疫グロブリンであることがあり、例えば、γ重鎖、α重鎖、又はδ重鎖などであることがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン重鎖は、4つの定常ドメイン(CH1、CH2、CH3、及びCH 4など)を持つ免疫グロブリンであることがあり、例えば、μ重鎖、又はε重鎖などであることがある。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切な免疫グロブリンに由来することがある。いくつかの場合において、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び前記免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、同じ免疫グロブリンに由来することがある。いくつかの場合において、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び前記免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、異なる免疫グロブリンに由来することがある。いくつかの場合において、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び/又は前記免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、天然に存在する免疫グロブリンに由来することがある(例えば、天然に存在する免疫グロブリンから得ることがある)。いくつかの場合において、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び/又は前記免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、合成であることがある。重鎖可変ドメイン及び/又は免疫グロブリン重鎖定常ドメインが本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリンの例としては、限定されるものではないが、モノクローナル抗体602(MAB602、本出願では「602」と呼ぶ)の重鎖(例えば、R&Dシステム#MAB602-SPを参照のこと)が挙げられる。いくつかの場合において、重鎖可変ドメイン及び/又は重鎖定常ドメインが本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリンは、他に記載される通りであることがある(例えば、Krieg et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 107(26):11906-11 (2010)を参照のこと)。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切な配列(例えば、アミノ酸配列)を含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):4に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性(例えば、約82%、約85%、約88%、約90%、約93%、約95%、約97%、約98%、約99%、又は100%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):4に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):28に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性(例えば、約82%、約85%、約88%、約90%、約93%、約95%、約97%、約98%、約99%、又は100%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):28に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):5に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約70%の同一性(例えば、約75%、約80%、約85%、約88%、約90%、約93%、約95%、約97%、約98%、約99%、又は100%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):5に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン重鎖はまた、シグナル配列を含むこともある。シグナル配列は、任意の適切なシグナル配列(例えば、配列番号(SEQ ID NO):6及び配列番号(SEQ ID NO):7)であることがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):6に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列を有する免疫グロブリン重鎖を含むことがある。
本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)において使用され得る例示的な免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):1又は配列番号(SEQ ID NO):26に記載される通りであることがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン重鎖は、シグナル配列、602抗体由来の可変ドメイン、及びIgG2a定常ドメイン(例えば、マウスIgG2a定常ドメイン)、を含むことがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):6に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号(SEQ ID NO):4に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン、及び配列番号(SEQ ID NO):5に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメイン、を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):1に記載のアミノ酸配列を含むことがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):6に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号(SEQ ID NO):28に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン、及び配列番号(SEQ ID NO):5に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメイン、を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):26に記載のアミノ酸配列を含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン重鎖は、そのアミノ酸配列に対する1つ以上の改変(例えば、配列番号(SEQ ID NO):1に対する1つ以上の改変、又は配列番号(SEQ ID NO):26に対する1つ以上の改変)を有することがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインに含まれる重鎖のアミノ酸配列に対する改変は、前記単鎖免疫サイトカインのサイトカイン親和性を変えることがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインに含まれる重鎖のアミノ酸配列に対する改変は、前記単鎖免疫サイトカインのレセプター競合性を変えることがある(例えば、結合特性を変えることがある)。
本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る任意の適切なIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)を含むことがある。IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、任意の供給源に由来することがある。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る天然に存在するIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)であることがある。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、合成であることがある。IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、任意の適切な配列を有することがある。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性(例えば、約82%、約85%、約88%、約90%、約93%、約95%、約97%、約98%、約99%、又は100%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むことがある。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、そのアミノ酸配列に対する1つ以上の改変(例えば、配列番号(SEQ ID NO):9に対する1つ以上の改変)を有することがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインに含まれる、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)のアミノ酸配列に対する改変は、前記単鎖免疫サイトカインの分子内の会合が破壊されることを軽減することがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインに含まれる重鎖のアミノ酸配列に対する改変は、前記単鎖免疫サイトカインの活性(例えば、シグナル伝達活性)を増強することがある。
本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、任意の適切な免疫グロブリン軽鎖を含むことがある。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な種類の免疫グロブリン軽鎖(例えば、(κ)軽鎖及びラムダ(λ)軽鎖)に由来することがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン軽鎖は、κ軽鎖であることがある。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な軽鎖可変ドメイン(VL)を有することがある。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な軽鎖定常ドメイン(CL)を有することがある。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な免疫グロブリンに由来することがある。いくつかの場合において、前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン及び前記免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、同じ免疫グロブリンに由来することがある。いくつかの場合において、前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン及び前記免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、異なる免疫グロブリンに由来することがある。いくつかの場合において、前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン及び/又は前記免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、天然に存在する免疫グロブリンに由来することがある(例えば、天然に存在する免疫グロブリンから得ることがある)。いくつかの場合において、前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン及び/又は前記免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、合成であることがある。軽鎖可変ドメイン及び/又は免疫グロブリン軽鎖定常ドメインが本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリンの例としては、限定されるものではないが、602軽鎖が挙げられる (例えば、R&Dシステム#MAB602-SPを参照のこと)。いくつかの場合において、軽鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖定常ドメインが本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリンは、他に記載される通りであることがある(例えば、Krieg et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 107(26):11906-11 (2010)を参照のこと)。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切な配列(例えば、アミノ酸配列)を含むことがある。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な配列(例えば、アミノ酸配列)を含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性(例えば、約82%、約85%、約88%、約90%、約93%、約95%、約97%、約98%、約99%、又は100%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の同一性(例えば、約82%、約85%、約88%、約90%、約93%、約95%、約97%、約98%、約99%、又は100%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約70%の同一性(例えば、約75%、約80%、約85%、約88%、約90%、約93%、約95%、約97%、約98%、約99%、又は100%の配列同一性)を有するアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖定常ドメインを含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン軽鎖はまた、シグナル配列を含むことがある。シグナル配列は、任意の適切なシグナル配列(例えば、配列番号(SEQ ID NO):7及び配列番号(SEQ ID NO):8)であることがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):7に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含むことがある。
本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)において使用され得る例示的な免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):2に記載される通りであることがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列、602抗体由来の可変ドメイン、及びκ定常ドメイン、を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):7に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン、及び配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメイン、を含むことがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):2に記載のアミノ酸配列を含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン軽鎖は、そのアミノ酸配列に対する1つ以上の改変(例えば、配列番号(SEQ ID NO):2に対する1つ以上の改変)を有することがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインに含まれる軽鎖のアミノ酸配列に対する改変は、前記単鎖免疫サイトカインのサイトカイン親和性を変えることがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインに含まれる軽鎖のアミノ酸配列に対する改変は、前記単鎖免疫サイトカインのレセプター競合性を変えることがある (例えば、結合特性を変えることがある)。
いくつかの場合において、免疫グロブリン軽鎖は、本出願で記載するIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)を含むことがある。免疫グロブリン軽鎖が、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)を含む場合、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る前記IL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、前記免疫グロブリン軽鎖内の任意の適切な位置にあることがある。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、前記免疫グロブリン軽鎖(例えば、前記免疫グロブリン軽鎖の可変ドメイン)に融合していることがある。IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る前記IL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント) 及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが融合ポリペプチドである場合、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る前記IL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント) 及び前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、リンカーを介して融合していることがある。リンカーは、任意の適切なリンカーであることがある。いくつかの場合において、リンカーは、(例えば、分子内相互作用を可能にするために)可撓性であることがある。いくつかの場合において、リンカーは、ペプチド・リンカーであることがある。ペプチド・リンカーは、任意の適切な数のアミノ酸を含むことがある。例えば、ペプチド・リンカーは、約10アミノ酸~約60アミノ酸(例えば、 約 10アミノ酸~約 50アミノ酸, 約 10アミノ酸~約 40アミノ酸, 約 10アミノ酸~約 30アミノ酸, 約 20アミノ酸~約 60アミノ酸, 約 30アミノ酸~約 60アミノ酸, 約 40アミノ酸~約 60アミノ酸, 約 50アミノ酸~約 60アミノ酸, 約 15アミノ酸~約 55アミノ酸, 約 20アミノ酸~約 50アミノ酸, 約 30アミノ酸~約 40アミノ酸, 約 20アミノ酸~約 40アミノ酸, 約 30アミノ酸~約 50アミノ酸, 又は約 40アミノ酸~約 60アミノ酸)、を含むことがある。ペプチド・リンカーは、任意の適切なアミノ酸を含むことがある。例えば、ペプチド・リンカーは、1つ以上のグリシン(Gly)残基及び/又は1つ以上のセリン(Ser)残基、を含むことがある。IL-2Rα/IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)を、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインに融合させるために使用することができるリンカーの例としては、限定されるものではないが、(Gly4Ser)2リンカー(配列番号(SEQ ID NO):12)、(Gly4Ser)3リンカー(配列番号(SEQ ID NO):13)、(Gly4Ser)4リンカー(配列番号(SEQ ID NO):14)、(Gly4Ser)5リンカー(配列番号(SEQ ID NO):15)、(Gly4Ser)6リンカー(配列番号(SEQ ID NO):16)、(Gly4Ser)7リンカー(配列番号(SEQ ID NO):17)、(Gly4Ser)8リンカー(配列番号(SEQ ID NO):18)、(Gly4Ser)9リンカー(配列番号(SEQ ID NO):19)、(Gly4Ser)10リンカー(配列番号(SEQ ID NO):20)、(Gly4Ser)11リンカー(配列番号(SEQ ID NO):21)、及び(Gly4Ser)12リンカー(配列番号(SEQ ID NO):22)が挙げられる。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、配列番号(SEQ ID NO):12又は配列番号(SEQ ID NO):13に記載のアミノ酸配列を有するリンカーを介して、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインに融合したIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)を有する免疫グロブリン軽鎖を含むことがある。いくつかの場合において、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)は、そのアミノ酸配列に対する1つ以上の改変(例えば、配列番号(SEQ ID NO):12に対する1つ以上の改変、又は配列番号(SEQ ID NO):13に対する1つ以上の改変)を有することがある。いくつかの場合において、リンカーのアミノ酸配列に対する改変は、前記リンカーの長さ、電荷、構造、及び/又は組成を変えることがある。
本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβポリペプチドに結合し得る単鎖免疫サイトカイン)において使用され得る、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)を含む例示的な免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):3、配列番号(SEQ ID NO):23、配列番号(SEQ ID NO):24、配列番号(SEQ ID NO):25、又は配列番号(SEQ ID NO):27のうちの何れか1つに記載される通りであることがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)、リンカー、602抗体由来の可変ドメイン、及びκ定常ドメイン、を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):8に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号(SEQ ID NO): 9に記載のアミノ酸配列を有するIL-2ポリペプチド、配列番号(SEQ ID NO):12に記載のアミノ酸配列を有するリンカー、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン、及び配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメイン、を含むことがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):3に記載のアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):8に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号(SEQ ID NO): 9に記載のアミノ酸配列を有するIL-2ポリペプチド、配列番号(SEQ ID NO):13に記載のアミノ酸配列を有するリンカー、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン、及び配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメイン、を含むことがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):23に記載のアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):8に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号(SEQ ID NO): 9に記載のアミノ酸配列を有するIL-2ポリペプチド、配列番号(SEQ ID NO):15に記載のアミノ酸配列を有するリンカー、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン、及び配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメイン、を含むことがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):24に記載のアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):8に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号(SEQ ID NO): 9に記載のアミノ酸配列を有するIL-2ポリペプチド、配列番号(SEQ ID NO):17に記載のアミノ酸配列を有するリンカー、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン、及び配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメイン、を含むことがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):25に記載のアミノ酸配列を含むことがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):8に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号(SEQ ID NO): 9に記載のアミノ酸配列を有するIL-2ポリペプチド、配列番号(SEQ ID NO):17に記載のアミノ酸配列を有するリンカー、配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン、及び配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメイン、を含むことがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインにおいて使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):27に記載のアミノ酸配列を含むことがある。いくつかの場合において、免疫グロブリン軽鎖は、そのアミノ酸配列に対する1つ以上の改変(例えば、配列番号(SEQ ID NO):3に対する1つ以上の改変、配列番号(SEQ ID NO):23に対する1つ以上の改変、配列番号(SEQ ID NO):24に対する1つ以上の改変、配列番号(SEQ ID NO):25に対する1つ以上の改変、又は配列番号(SEQ ID NO):27に対する1つ以上の改変)を有することがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインに含まれる軽鎖のアミノ酸配列に対する改変は、前記単鎖免疫サイトカインのサイトカイン親和性を変えることがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインに含まれる軽鎖のアミノ酸配列に対する改変は、前記単鎖免疫サイトカインのレセプター競合性を変えることがある (例えば、結合特性を変えることがある)。
いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、(例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン中に存在しない、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る分子と比較した場合)安定な分子であることがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、約5分から約6ヶ月(例えば、 約 15分~約 6か月, 約 30分~約 6か月, 約 1時間~約 6か月, 約 24時間~約 6か月, 約 3日~約 6か月, 約 7日~約 6か月, 約 1か月~約 6か月, 約 3か月~約 6か月, 約 5分~約 3か月, 約 5分~約 1か月, 約 5分~約 2 週, 約 5分~約 7日, 約 5分~約 3日, 約 5分~約 24時間, 約 5分~約 12時間, 約 5分~約 60分, 約 30分~約 3日, 約 3日~約 1 週, 約 1週~約 1か月, 又は 約 1か月~約 3か月)の半減期(例えば、血清半減期又は血漿半減期などの、in vivo半減期)を有することがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、通常の室温条件(例えば、約25℃)で、約1日~約1ヶ月(例えば、 約1日~約2週, 約1日~約1週, 約1日~約5日, 約4日~約1か月, 約1週~約1か月, 約2週~約1か月, 約3日~約2週, 約2日~約5日, 約5日~約2週, 又は 約1週~約3週)の貯蔵寿命を有することがある。例えば、サーマル・シフト・アッセイ(thermal shift assay)、タンパク質安定性曲線解析、サイズ排除クロマトグラフィー、及び/又は動的光散乱を使用して、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインの安定性を決定することがある。
いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、(例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン中に存在しない、IL-2Rβポリペプチド複合体に結合し得る分子と比較した場合)IL-2Rβポリペプチドとの相互作用が増強していることがある (例えば、より強い結合親和性を有していることがある)。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、約300 nM KD~約1 pM KDの、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に対する親和性を有することがある。
いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、(例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインに存在しない、IL-2Rαポリペプチド複合体に結合し得る分子と比較した場合)IL-2Rαポリペプチドとの相互作用が低減している、又は消失していることがある(例えば、より弱い結合親和性を有していることがある)。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、約10 nM KDを超えるIL-2Rαポリペプチドに対する親和性を有することがある。
任意の適切な方法を使用して、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβポリペプチドに結合し得る単鎖免疫サイトカイン)と、IL-2Rβポリペプチド及び/又はIL-2Rαポリペプチドとの間の結合親和性を、測定することがある。例えば、親和性タイトレーション試験、表面プラズモン共鳴、等温カロリメトリー(isothermal calorimetry)、及び/又はバイオレイヤー干渉法(bio-layer interferometry)を用いて、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインと、IL-2Rβポリペプチド及び/又はIL-2Rαポリペプチドとの間の結合親和性を、測定することがある。
いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、(例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン中に存在しないIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る分子と比較した場合)活性化させるTRegSの数が減少する、又は無くなることがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインは、TRegsを実質的に活性化しない(例えば、検出可能なレベルにまで、及び/又はEffsの活性化を抑制するのに、若しくはダウンレギュレーションするのに充分なレベルにまで、TRegSを活性化しない)。任意の適切な方法を用いて、TRegsの存在、非存在、量、又は活性を測定することがある。例えば、TRegマーカー(例えば、CD4、IL-2Rα、及び/又はFoxp3)の免疫染色、及び/又はELISA又はsignal transducer and activator of transcription (STAT)5のリン酸化に基づく活性の評価、を用いて、TRegsの存在、非存在、量、又は活性を測定することがある。
この書類はまた、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を作製するための方法及び材料を提供する。例えば、この書類はまた、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る、ポリぺプチドをコードし得る核酸(例えば、核酸ベクター)を提供する。いくつかの場合において、核酸は、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)、及び/又はIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る免疫グロブリン軽鎖、をコードすることがある。例えば、第1の核酸は、免疫グロブリン重鎖をコードすることがある、及び第2の核酸は、免疫グロブリン軽鎖に融合した、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)、をコードすることがある。
本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を生成するために使用され得るポリペプチドを、生成するために使用され得る1種以上のポリペプチド (例えば、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド[又はそのフラグメント]、及び/又は免疫グロブリン軽鎖)をコードする核酸(例えば、核酸ベクター)は、任意の適切な核酸であることがある。核酸は、DNA(例えば、DNA構築物)、RNA(例えば、mRNA)、又はそれらの組み合わせであることがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得るポリペプチドを、生成するために使用され得る1種以上のポリペプチドをコードする核酸は、ベクター(例えば、発現ベクター又はプラスミド)であることがある。
いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を生成するために使用され得るポリペプチドを、生成するために使用され得る1種以上のポリペプチド(例えば、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド[又はそのフラグメント]、及び/又は免疫グロブリン軽鎖)をコードする核酸は、1つ以上の調節エレメントを(例えば、アミノ酸鎖の発現を調節するために)含むことがある。本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得るポリペプチドを、生成するために使用され得る1種以上のポリペプチドをコードする核酸に含まれ得る調節エレメントの例としては、限定されるものではないが、プロモーター(例えば、構成的プロモーター、組織/細胞特異的プロモーター、及び誘導性プロモーター[例えば、化学的に活性化されるプロモーター及び光で活性化されるプロモーター])、及びエンハンサー、が挙げられる。
いくつかの場合において、本出願で記載する核酸によってコードされる1種以上のポリペプチド(例えば、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド[又はそのフラグメント]、及び/又は免疫グロブリン軽鎖)を使用して、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を生成することがある。例えば、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)、及び免疫グロブリン軽鎖、を含む2種以上のポリペプチドを、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)として、集合化することがある(例えば、自己集合化することがある)。いくつかの場合において、第1の核酸がコードする免疫グロブリン重鎖、及び第2の核酸がコードする免疫グロブリン軽鎖に融合したIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)を、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインとして、集合化することがある(例えば、自己集合化することがある)。免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド(又はそのフラグメント)、及び免疫グロブリン軽鎖、を含む2種以上のポリペプチドを、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインとして集合化する場合、前記2種以上のポリペプチドを、in vivo又はin vivoで集合化することがある。
いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)は、又は本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得るポリペプチドを、生成するために使用され得る1種以上のポリペプチド(例えば、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド[又はそのフラグメント]、及び/又は免疫グロブリン軽鎖)をコードする核酸は、精製することがある。「精製した」ポリペプチド又は核酸とは、複数の構成要素の混合物中において、主要な構成要素を構成する(例えば、30 重量%以上、40重量%以上、50重量%以上、60重量%以上、70重量%以上、80重量%以上、90重量%以上、95重量%以上、又は99重量%以上)ポリペプチド又は核酸を指す。例えば、精製した単鎖免疫サイトカインは、1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物の中で、約30重量%以上を構成することがある。ポリペプチドを、限定されるものではないが、アフィニティー・クロマトグラフィー及びイムノソルベント・アフィニティー・カラム(immunosorbent affinity column)などの方法によって、精製することがある。例えば、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る1種以上のポリペプチドをコードする精製した核酸が、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る1種以上のアミノ酸鎖を含む組成物の約30重量%以上を構成することがある。核酸を、限定されるものではないが、フェノール-クロロホルム抽出及びカラム精製(例えば、ミニ-カラム精製)などの方法によって、精製することがある。
また、本出願において、哺乳動物(例えば、ヒト)を治療するための方法及び材料(前記哺乳動物は、それらを必要とする哺乳動物[例えば、がん及び/又は感染性疾患のような哺乳動物内の免疫反応を活性化することから利益を得ることができる症状を有する哺乳動物]である)が提供される。いくつかの場合において、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を、又は本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る1種以上のポリペプチド(例えば、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド[又はそのフラグメント]、及び/若しくは免疫グロブリン軽鎖)をコードする核酸を、含む組成物を、がんを有する哺乳動物を治療するために、使用することがある。例えば、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、又は本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る1種以上のポリペプチドをコードする核酸を、含む組成物を、がんを有する哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することがある。いくつかの場合において、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を、又は本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る1種以上のポリペプチド(例えば、免疫グロブリン重鎖、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得るIL-2ポリペプチド[又はそのフラグメント]、及び/又は免疫グロブリン軽鎖)をコードする核酸を、含む組成物を、感染性疾患を有する哺乳動物を治療するために、使用することがある。例えば、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、又は本出願で記載する単鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る1種以上のポリペプチドをコードする核酸を、含む組成物を感染性疾患を有する哺乳動物に投与して、前記哺乳動物を治療することがある。
がんを有する、又は有することが疑われる任意の適切な哺乳動物を、本出願で記載するように治療することがある(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を投与することによって、治療することがある)。本出願で記載するように治療することがある哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、霊長類(例えば、ヒト及びサル)、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス、及びラットが挙げられる。例えば、がんを有するヒトを、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む構成物で治療することがある。
本出願で記載するようながんを有する、又は有することが疑われる哺乳動物を治療する場合(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を投与することによって、治療する場合)、前記哺乳動物は、任意の型のがんを有することがある、又は有することが疑われることがある。がんとしては、1種上の固形腫瘍を挙げることができる。がんは血液がんであることがある。本出願で記載するように治療することがあるがんの例としては、限定されるものではないが、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん(kidney cancer)、肺がん(例えば、非小細胞肺がん)、メラノーマ、口腔がん、膀胱がん、子宮頸がん、食道がん(esophageal cancer)、及び子宮がん(uterine cancer)、が挙げられる。
任意の適切な方法を使用して、哺乳動物(例えば、ヒト)を、がんを有するものとして、同定することがある。例えば、イメージング技術、生検技術、及び/又は血液検査を使用して、がんを有する哺乳動物(例えば、ヒト)を同定することがある。
本出願で記載するような感染性疾患を有する、又は有することが疑われる哺乳動物を治療する場合(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を投与することによって)、前記哺乳動物は、任意の型の感染性疾患を有することがある、又は有することが疑われることがある。本出願で記載するように治療することがある感染性疾患の例としては、限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス、マラリア、インフルエンザ、エボラ、結核、麻疹、狂犬病、デング熱、サルモネラ症、百日咳、ペスト、及び西ナイル熱、が挙げられる。
任意の適切な方法を使用して、哺乳動物(例えば、ヒト)を、感染性疾患を有するものとして、又は感染性疾患を発症するリスクがあるものとして、同定することがある。例えば、尿検査、咽喉スワブ、便サンプル、及び/又は血液検査を使用して、感染性疾患を有する、又は感染性疾患を発症するリスクがある、哺乳動物(例えば、ヒト)を同定することがある。
一旦、がんを有するものとして、及び/又は感染性疾患を有するものとして、又は感染性疾患を発症するリスクがあるものとして、同定されると、哺乳動物(例えば、ヒト)は、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を含む組成物を、投与されることがある、又は自己投与するように指示されることがある。いくつかの場合において、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を使用して、がんを有する哺乳動物中に存在するがん細胞の数を減少させることがある。いくつかの場合において、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を使用して、がんを有する哺乳動物中の腫瘍の大きさ(例えば、体積)を減少させることがある。いくつかの場合において、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を使用して、感染性疾患を有する哺乳動物中に存在する感染性微生物の数を減少させることがある。
いくつかの場合において、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を、がん及び/又は感染性疾患を有する哺乳動物を治療するために使用される唯一の活性成分として、がんを有する哺乳動物に投与することがある。
いくつかの場合(本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン[例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン]を、がんを有する哺乳動物に投与する場合)において、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、がんを治療するために使用される1種以上の追加的ながん治療とともに、及び/又は免疫反応を増強するために使用される1種以上の追加的な治療とともに、併用療法として、投与することがある。例えば、がんを治療するために使用される併用療法としては、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、並びに1種以上がん治療(例えば、外科手術、化学療法、照射、ワクチンの投与、養子細胞移植、細胞療法の処方、ターゲットを定めた療法の処方、及び/又は免疫療法の処方)を、前記哺乳動物(例えば、ヒト)に処方することが挙げられる。例えば、免疫反応を増強するために使用される併用療法としては、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、並びに免疫反応を増強するために使用される1種以上の追加的な治療(例えば、ワクチンの投与、養子細胞移植、免疫チェックポイント阻害剤[例えば、免疫チェックポイントの遮断を通して作用する薬物]の投与、及び/又は細胞療法の処方)を、前記哺乳動物(例えば、ヒト)に処方することが挙げられる。
いくつかの場合(本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン[例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン]を、感染性疾患を有する哺乳動物に投与する場合)において、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、感染性疾患を治療するために使用される1種以上の追加的な感染性疾患の治療とともに、及び/又は免疫反応を増強するために使用される1種以上の追加的な治療とともに、併用療法として、投与することがある。例えば、感染性疾患を治療するために使用される併用療法としては、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、並びに1種以上の感染性疾患の治療(例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、及び/又は抗寄生虫剤)を、前記哺乳動物(例えば、ヒト)に処方することが挙げられる。例えば、免疫反応を増強するために使用される併用療法としては、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、並びに免疫反応を増強するために使用される1種以上の追加的な治療(例えば、ワクチンの投与、養子細胞移植、免疫チェックポイント阻害剤[例えば、免疫チェックポイントの遮断を通して作用する薬物]の投与、及び/又は細胞療法の処方)を、前記哺乳動物(例えば、ヒト)に処方することが挙げられる。
本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、1種以上の追加的な治療と組み合わせて使用する場合、前記1種以上の追加的な治療を、同時に又は独立して処方することがある。例えば、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを最初に投与して、次に、前記1種以上の追加的な治療を処方することがある、又はその逆であることがある。
いくつかの場合において、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を、哺乳動物に投与するための組成物(例えば、薬学的に許容可能な組成物) (前記哺乳動物は、それらを必要とする哺乳動物[例えば、がん及び/又は感染性疾患のような哺乳動物内の免疫反応を活性化することから利益を得ることができる症状を有する哺乳動物]である)に製剤化することがある。例えば、治療有効量の本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを、1種以上の薬学的に許容可能な担体(添加剤)及び/又は希釈剤と一緒に、製剤化することがある。医薬組成物を、任意の適切な剤形で投与するために、製剤化することがある。剤形の例としては、限定されるものではないが、例えば、ガム、カプセル、錠剤(例えば、咀嚼錠、及び腸溶コーティング錠)、座薬剤、液体、注腸剤、懸濁液、溶液(例えば、滅菌溶液)、徐放性製剤、遅延放出製剤、丸剤、粉末、及び顆粒などの、固体形態又は液体形態が挙げられる。本出願で記載する医薬組成物において使用され得る薬学的に許容可能な担体、充填剤、及び媒体としては、限定されるものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)、バッファー物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニル・ピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、例えば、ビタミンE TPGS、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロック・ポリマー、及び羊毛脂質、が挙げられる。
本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を含む組成物(例えば、医薬組成物)を、経口の又は非経口の(例えば、皮下、腫瘍内、筋肉内、静脈内、及び皮内など)投与用に設計することがある。経口投与する場合、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む医薬組成物は、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態であることがある。非経口投与に適した組成物としては、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、及びその製剤を意図するレシピエント(recipient)の血中と等張にする溶質、を含有することがある、水性の及び非-水性の滅菌した注射溶液;並びに懸濁剤及び増粘剤を含むことがある水性の及び非-水性の滅菌した懸濁液、が挙げられる。前記製剤を、単位用量の又は複数用量の容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアル、の中に入れることがある、並びに、使用直前に滅菌した液体担体(例えば、注射用水)を添加することだけを必要とする、凍結乾燥(freeze dried)(凍結乾燥[lyophilized])の状態で保存することがある。即時調製の注射溶液及び懸濁液を、滅菌した粉末、顆粒、及び錠剤から調製することがある。
本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を含む組成物(例えば、医薬組成物)を、局所的に又は全身的に投与することがある。例えば、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、哺乳動物(例えば、ヒト)に、経口投与することによって、又は注射することによって、全身的に投与することがある。
本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)の有効用量は、がんの重症度、投与経路、対象の年齢及び全身の健康状態、賦形剤の使用、他の薬剤の使用のような他の療法的治療との同時使用の可能性、及び/又は治療する医師の判断、に依存して、変化することがある。
本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を含む組成物の有効量は、哺乳動物(例えば、がんを有する、及び/又は感染性疾患を有する、若しくは感染性疾患を発症するリスクがある哺乳動物)を、前記哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなく、治療することができる任意の量であることがある。本出願で記載する単鎖免疫サイトカインの有効量は、任意の適切な量であることがある。いくつかの場合において、本出願で記載する単鎖免疫サイトカインの有効量は、哺乳動物(例えば、ヒト)の体重kg当たりで約0.05 ミリグラム(mg)~約500 mg (mg/kg;例えば、 約 0.05 mg/kg~約 400 mg/kg, 約 0.05 mg/kg~約 300 mg/kg, 約 0.05 mg/kg~約 200 mg/kg, 約 0.05 mg/kg~約 100 mg/kg, 約 0.05 mg/kg~約 50 mg/kg, 約 0.5 mg/kg~約 500 mg/kg, 約 1 mg/kg~約 500 mg/kg, 約 50 mg/kg~約 500 mg/kg, 約 100 mg/kg~約 500 mg/kg, 約 200 mg/kg~約 500 mg/kg, 約 300 mg/kg~約 500 mg/kg, 約 400 mg/kg~約 500 mg/kg, 約 0.5 mg/kg~約 400 mg/kg, 約 1 mg/kg~約 300 mg/kg, 約 50 mg/kg~約 200 mg/kg, 約 1 mg/kg~約 100 mg/kg, 約 100 mg/kg~約 200 mg/kg, 約 200 mg/kg~約 300 mg/kg, 又は 約 300 mg/kg~約 400 mg/kg 体重)であることがある。前記有効量は、一定のままであることがある、又は治療に対する前記哺乳動物の応答に依存する、スライディング・スケール(sliding scale)の若しくは可変の用量として、調節されることがある。様々な要因が、特定の用途に対して使用される実際の有効量に影響を及ぼすことがある。例えば、投与頻度、治療期間、複数の治療薬剤の使用、投与経路、及び/又は症状(例えば、がん)の重症度、によって、投与する実際の有効量を増やすこと、又は減らすこと、が必要になることがある。
本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を含む組成物の投与頻度は、哺乳動物(例えば、がんを有する、及び/又は感染性疾患を有する、若しくは感染性疾患を発症するリスクがある哺乳動物)を、前記哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなく、治療することができる任意の頻度であることがある。例えば、前記投与頻度は、1日に約3回~週に約1回、1日に約2回~週に約2回、又は1日に約1回~週に約2回であることがある。前記投与頻度は、一定のままであることがある、又は治療の期間中に可変的であることがある。本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を使った治療の過程は、休薬期間を含むことがある。例えば、本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカインを含む組成物を、2週間の期間にわたって毎日投与して、続いて2週間の休薬期間とすることがある、そしてこのようなレジメンを、複数回反復することがある。有効量の場合と同様に、様々な要因が、特定の用途に使用される投与の実際の頻度に影響を及ぼすことがある。例えば、有効量、治療期間、複数の治療薬剤の使用、投与経路、及び/又は症状(例えば、がん)の重症度、によって、投与頻度を増やすこと、又は減らすこと、が必要になることがある。
本出願で記載する1種以上の単鎖免疫サイトカイン(例えば、IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合し得る単鎖免疫サイトカイン)を含む組成物を投与することに関する効果的な期間は、哺乳動物(例えば、がんを有する、及び/又は感染性疾患を有する、若しくは感染性疾患を発症するリスクがある哺乳動物)を、前記哺乳動物に対して有意な毒性を生じることなく、治療することができる任意の期間であることがある。例えば、効果的な期間は、数日から数週間、数ヶ月、又は数年まで変化することがある。いくつかの場合において、がんを治療するための効果的な期間は、約1か月から約10年までの期間の範囲であることがある。複数の要因が、特定の治療に使用される実際の効果的な期間に影響を及ぼすことがある。例えば、効果的な期間は、投与頻度、有効量、複数の治療薬剤の使用、投与経路、及び/又は症状の重症度によって変化することがある。
いくつかの場合において、哺乳動物内に存在するがんを、及び/又は治療するべきがんの1種以上の症状(symptom)の重症度を、モニターすることがある。例えば、治療するべき哺乳動物内に存在する、がん細胞の数を、及び/又は腫瘍の大きさを、モニターすることがある。任意の適切な方法を使用して、哺乳動物内に存在する、がん細胞の数が、及び/又は腫瘍の大きさが、減少しているかどうかを測定することがある。例えば、イメージング技術を使用して、哺乳動物内に存在するがん細胞の数を評価することがある。
あるいは、本出願で記載する方法及び材料を、1つ以上のEffsを刺激することから、及び/又は哺乳動物内の免疫反応を活性化することから、利益を得ることができる別の症状を有する哺乳動物(例えば、ヒト)を治療するために、使用することがある。
本発明を、以下の実施例において更に説明するが、これらは本特許請求の範囲において記載する本発明の範囲を限定しない。
実施例1:免疫エフェクターT細胞をターゲット化して増殖させる(targeted expansion)ための、工学的に操作したサイトカイン-抗体融合
抗体を介した免疫バイアスは、ターゲットを定めたサイトカイン療法に対して、エキサイティング機会を提示する。実際、IL-2と抗-IL-2抗体S4B6との間の複合体は、マウスにおいて、全身性のIL-2投与に典型的に関連する有害効果が無く、強力な抗腫瘍活性を誘導する。しかし、サイトカイン/抗体複合体を臨床的にトランスレーションすることは、投薬比率の最適化などのロジスティカルなハードル(logistical hurdles)、並びに複合体の安定性に関する懸念(もし解離すると、遊離サイトカインに由来する危険な毒性が誘発されることがある、などの懸念)によって、妨げられている。更に、S4B6は、マウスIL-2(mIL-2)を認識し、ヒトIL-2(hIL-2)との交差反応性は限られている。
抗体を介した免疫バイアスは、ターゲットを定めたサイトカイン療法に対して、エキサイティング機会を提示する。実際、IL-2と抗-IL-2抗体S4B6との間の複合体は、マウスにおいて、全身性のIL-2投与に典型的に関連する有害効果が無く、強力な抗腫瘍活性を誘導する。しかし、サイトカイン/抗体複合体を臨床的にトランスレーションすることは、投薬比率の最適化などのロジスティカルなハードル(logistical hurdles)、並びに複合体の安定性に関する懸念(もし解離すると、遊離サイトカインに由来する危険な毒性が誘発されることがある、などの懸念)によって、妨げられている。更に、S4B6は、マウスIL-2(mIL-2)を認識し、ヒトIL-2(hIL-2)との交差反応性は限られている。
この実施例は、免疫エフェクターT細胞を特異的に刺激して抗がん免疫を促進する、臨床に関連した単鎖融合タンパク質を工学的に操作することについて説明する。
材料と方法
タンパク質の発現及び精製
前記602抗体のVH及びVL配列を、602ハイブリドーマ細胞に対してPCR増幅を行うことによって決定した。組換え抗体を、マウス免疫グロブリン(IgG)2aカッパ・アイソタイプとして作成して、親クローンにマッチさせた(図12、配列番号(SEQ ID NO):1;及び図13、配列番号(SEQ ID NO):2)。前記602抗体の重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を、別々にgWizベクター(Genlantis)の中にクローニングした。前記HC及びLCをコードするプラズミドを、一過性に共-トランスフェクションすることによって、ヒト胎児腎(HEK)293F細胞において、抗体を組換え発現させた。HC及びLCのプラズミドを、小規模な共-トランスフェクション試験でタイトレーションして、大規模に発現させるための最適な比率を決定した。分泌された抗体を、トランスフェクションの5日後の細胞上清から、プロテインGアフィニティー・クロマトグラフィー、続いてFPLC装置でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、精製した。純度(>99%)をSDS-PAGE解析によって検証した。野生型602免疫サイトカイン(IC)及びそのバリアントについては、hIL-2サイトカインを、分子内相互作用を可能にするために可撓性(G4S)2、(G4S)3、(G4S)5, 又は(G4S)7リンカーによって連結し、LCのN-末端で、完全な602抗体に融合させた(図14、配列番号(SEQ ID NO):3;図15、配列番号(SEQ ID NO):23;図16、配列番号(SEQ ID NO):24;及び図17、配列番号(SEQ ID NO):25)。これらのhIL-2-融合化602 LC構築物も、gWizベクター(Genlantis)の中にクローニングした。ICを、HEK 293F細胞を一過性に共-トランスフェクションすることによって、発現させ、前記602抗体について記載したように精製した。hIL-2 サイトカイン並びにC-末端ヘキサヒスチジン・タグを含むhIL-2Rα及びhIL-2Rβレセプター細胞外ドメインを、602及びICについて記載したように、HEK 293F細胞を一過性にトランスフェクションすることによって、生成し、Ni-NTAアフィニティー・クロマトグラフィー、続いてFPLC装置でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、精製した。タンパク質は全てを、HEPES緩衝生理食塩水(HBS、10 mM HEPES中150 mM NaCl、pH 7.3)中で保存した。純度(>99%)をSDS-PAGE解析によって検証した。
タンパク質の発現及び精製
前記602抗体のVH及びVL配列を、602ハイブリドーマ細胞に対してPCR増幅を行うことによって決定した。組換え抗体を、マウス免疫グロブリン(IgG)2aカッパ・アイソタイプとして作成して、親クローンにマッチさせた(図12、配列番号(SEQ ID NO):1;及び図13、配列番号(SEQ ID NO):2)。前記602抗体の重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を、別々にgWizベクター(Genlantis)の中にクローニングした。前記HC及びLCをコードするプラズミドを、一過性に共-トランスフェクションすることによって、ヒト胎児腎(HEK)293F細胞において、抗体を組換え発現させた。HC及びLCのプラズミドを、小規模な共-トランスフェクション試験でタイトレーションして、大規模に発現させるための最適な比率を決定した。分泌された抗体を、トランスフェクションの5日後の細胞上清から、プロテインGアフィニティー・クロマトグラフィー、続いてFPLC装置でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、精製した。純度(>99%)をSDS-PAGE解析によって検証した。野生型602免疫サイトカイン(IC)及びそのバリアントについては、hIL-2サイトカインを、分子内相互作用を可能にするために可撓性(G4S)2、(G4S)3、(G4S)5, 又は(G4S)7リンカーによって連結し、LCのN-末端で、完全な602抗体に融合させた(図14、配列番号(SEQ ID NO):3;図15、配列番号(SEQ ID NO):23;図16、配列番号(SEQ ID NO):24;及び図17、配列番号(SEQ ID NO):25)。これらのhIL-2-融合化602 LC構築物も、gWizベクター(Genlantis)の中にクローニングした。ICを、HEK 293F細胞を一過性に共-トランスフェクションすることによって、発現させ、前記602抗体について記載したように精製した。hIL-2 サイトカイン並びにC-末端ヘキサヒスチジン・タグを含むhIL-2Rα及びhIL-2Rβレセプター細胞外ドメインを、602及びICについて記載したように、HEK 293F細胞を一過性にトランスフェクションすることによって、生成し、Ni-NTAアフィニティー・クロマトグラフィー、続いてFPLC装置でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、精製した。タンパク質は全てを、HEPES緩衝生理食塩水(HBS、10 mM HEPES中150 mM NaCl、pH 7.3)中で保存した。純度(>99%)をSDS-PAGE解析によって検証した。
ビオチン化hIL-2、hIL-2Rα及びhIL-2Rβを発現させるために、C-末端ビオチン・アクセプター・ペプチド(BAP;配列番号(SEQ ID NO):30)を含むタンパク質を発現させ、Ni-NTAアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製し、次いで、0.5 mMビシン(pH 8.3)、100 mM ATP、100 mMマグネシウム酢酸塩、及び500 mMビオチン(シグマ)中で、水溶性BirAリガーゼ酵素を使って、ビオチン化した。過剰のビオチンを、Superdex 200カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。
細胞株
HEK 293F細胞を、10 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を添加したFreestyle 293 Expression Medium (Thermo)中で培養した。未改変のYT-114及びIL-2R+ YT-1ヒト・ナチュラル・キラー細胞を、RPMI完全培地(10%ウシ胎仔血清、2 mM L-グルタミン、最小非-必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、25 mM HEPES、及びペニシリン-ストレプトマイシン[Gibco]を添加したRPMI 1640培地)中で培養し、5% CO2を含む加湿大気中の37℃に置いた。
HEK 293F細胞を、10 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を添加したFreestyle 293 Expression Medium (Thermo)中で培養した。未改変のYT-114及びIL-2R+ YT-1ヒト・ナチュラル・キラー細胞を、RPMI完全培地(10%ウシ胎仔血清、2 mM L-グルタミン、最小非-必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、25 mM HEPES、及びペニシリン-ストレプトマイシン[Gibco]を添加したRPMI 1640培地)中で培養し、5% CO2を含む加湿大気中の37℃に置いた。
バイオレイヤー干渉法(Bio-layer interferometry)結合試験
IL-2対免疫サイトカインのアフィニティー・タイトレーション試験のために、ビオチン化ヒトIL-2Rα及びIL-2Rβレセプターを、Octet(登録商標)Red96バイオレイヤー干渉法(bio-layer interferometry)(BLI)装置(ForteBio)で解析するために、ストレプトアビジンをコートしたチップに固定化した。5シグナル・ユニット(nm)未満のレセプターを固定化して、物質移動効果(mass transfer effects)を最小限にした。チップを、段階希釈した、hIL-2、602 Ab、602 Abと複合体化したhIL-2(hIL-2及び602 Abを、2:1の比率で、30分間室温でプレ-インキュベートすることによって形成した)、602 IC、又はコントロールIC(関連性の無い抗フルオレセイン抗体[4-4-20]の軽鎖のN-末端に融合したhIL-2を含み、602のフレームワーク配列と同一のフレームワーク配列を有する)に、96ウェルプレート中で、300秒間暴露した、及び解離を600秒間測定した。非特異的結合を差し引くために、関連性の無いタンパク質(ヒトモノクローナル抗体トラスツズマブ)をレファレンス・ウェル(reference well)の中に入れた。0.1 Mグリシン(pH 3.0)に、15秒間、暴露させることによって、全ての相互作用について、表面の再生を行った。実験を、PBSA(リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.3 + 0.1%ウシ血清アルブミン[BSA、Thermo Fisher Scientific])中、25℃で、行った。データを視覚化し、Octet(登録商標)データ解析ソフトウエア・バージョン7.1(Molecular Devices)を用いて処理した。全ての結合相互作用が一次であると仮定して、GraphPad Prismを用いて、平衡タイトレーション・カーブ・フィッティング及びKD値決定を、実施した。実験を2回再現させて、同様の結果を得た。
IL-2対免疫サイトカインのアフィニティー・タイトレーション試験のために、ビオチン化ヒトIL-2Rα及びIL-2Rβレセプターを、Octet(登録商標)Red96バイオレイヤー干渉法(bio-layer interferometry)(BLI)装置(ForteBio)で解析するために、ストレプトアビジンをコートしたチップに固定化した。5シグナル・ユニット(nm)未満のレセプターを固定化して、物質移動効果(mass transfer effects)を最小限にした。チップを、段階希釈した、hIL-2、602 Ab、602 Abと複合体化したhIL-2(hIL-2及び602 Abを、2:1の比率で、30分間室温でプレ-インキュベートすることによって形成した)、602 IC、又はコントロールIC(関連性の無い抗フルオレセイン抗体[4-4-20]の軽鎖のN-末端に融合したhIL-2を含み、602のフレームワーク配列と同一のフレームワーク配列を有する)に、96ウェルプレート中で、300秒間暴露した、及び解離を600秒間測定した。非特異的結合を差し引くために、関連性の無いタンパク質(ヒトモノクローナル抗体トラスツズマブ)をレファレンス・ウェル(reference well)の中に入れた。0.1 Mグリシン(pH 3.0)に、15秒間、暴露させることによって、全ての相互作用について、表面の再生を行った。実験を、PBSA(リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.3 + 0.1%ウシ血清アルブミン[BSA、Thermo Fisher Scientific])中、25℃で、行った。データを視覚化し、Octet(登録商標)データ解析ソフトウエア・バージョン7.1(Molecular Devices)を用いて処理した。全ての結合相互作用が一次であると仮定して、GraphPad Prismを用いて、平衡タイトレーション・カーブ・フィッティング及びKD値決定を、実施した。実験を2回再現させて、同様の結果を得た。
YT-1細胞のSTAT5リン酸化研究
約2×105 個のIL-2Rα- YT-1細胞、又はIL-2Rα+ YT-1細胞を、96-ウェル・プレートの各ウェルに播種し、段階希釈したhIL-2、hIL-2/602複合体、又は様々なICを含むRPMI完全培地中で再懸濁した。602 Abを、IL-2と、抗体又は抗体フラグメント:hIL-2に関して1:1のモル比で、室温で、30分間、インキュベートすることによって、複合体を形成させた。細胞を、37℃で、15分間刺激した、及びすぐに、ホルムアルデヒドを1.5%になるまで加えて、室温で10分間、インキュベートすることによって、固定した。細胞を透過性にすることを、氷冷した100%メタノール中に、4℃で、30分間、再懸濁することによって、行った。固定化した及び透過性にした細胞を、FACSバッファー(0.1% BSA[Thermo Fisher Scientific]を含むリン酸緩衝生理食塩水[PBS] pH 7.2)で2回洗浄し、FACSバッファー中に希釈したAlexa Fluor(登録商標)647と複合体化した抗-STAT5 pY694(BD Biosciences)と共に、室温で2時間、インキュベートした。次いで、細胞をFACSバッファーで2回洗浄し、MFIをCytoFLEXフロー・サイトメーター(Beckman-Coulter)で測定した。用量-応答曲線を、ロジスティック・モデルに適合させ、そしてGraphPad Prismデータ解析ソフトウエアを使用して、非刺激細胞の平均蛍光強度(mean fluorescence intensity (MFI))を差し引いた、及び最大シグナル強度に正規化した後に、半最大有効濃度(half-maximal effective concentrations (EC 50))を計算した。実験を、3連で行い、及び3回行い、同様の結果を得た。
約2×105 個のIL-2Rα- YT-1細胞、又はIL-2Rα+ YT-1細胞を、96-ウェル・プレートの各ウェルに播種し、段階希釈したhIL-2、hIL-2/602複合体、又は様々なICを含むRPMI完全培地中で再懸濁した。602 Abを、IL-2と、抗体又は抗体フラグメント:hIL-2に関して1:1のモル比で、室温で、30分間、インキュベートすることによって、複合体を形成させた。細胞を、37℃で、15分間刺激した、及びすぐに、ホルムアルデヒドを1.5%になるまで加えて、室温で10分間、インキュベートすることによって、固定した。細胞を透過性にすることを、氷冷した100%メタノール中に、4℃で、30分間、再懸濁することによって、行った。固定化した及び透過性にした細胞を、FACSバッファー(0.1% BSA[Thermo Fisher Scientific]を含むリン酸緩衝生理食塩水[PBS] pH 7.2)で2回洗浄し、FACSバッファー中に希釈したAlexa Fluor(登録商標)647と複合体化した抗-STAT5 pY694(BD Biosciences)と共に、室温で2時間、インキュベートした。次いで、細胞をFACSバッファーで2回洗浄し、MFIをCytoFLEXフロー・サイトメーター(Beckman-Coulter)で測定した。用量-応答曲線を、ロジスティック・モデルに適合させ、そしてGraphPad Prismデータ解析ソフトウエアを使用して、非刺激細胞の平均蛍光強度(mean fluorescence intensity (MFI))を差し引いた、及び最大シグナル強度に正規化した後に、半最大有効濃度(half-maximal effective concentrations (EC 50))を計算した。実験を、3連で行い、及び3回行い、同様の結果を得た。
マウスにおける免疫細胞サブセット増殖試験
免疫複合体が、エフェクター細胞が増殖するのに有利な免疫反応に、バイアスをかけるかどうかを決定するために、12週齢のC57BL/6マウス(コホート当たり3匹)に、PBS又はhIL-2/602複合体若しくはmIL-2/S4B6複合体(PBS中で、2:1のサイトカイン:抗体のモル比で、hIL-2[eBioscience]を602又はS4B6と共に、30分間、プレ-インキュベートすることによって調製した)を、毎日4日間、腹腔内注射した。5日目にマウスを頚椎脱臼により屠殺し、脾臓を採取した。単一細胞の懸濁液を、メカニカルなホモゲナイゼーション(mechanical homogenization)によって、調製し、脾細胞の絶対数を、自動細胞カウンター(Vicell、Beckman Coulter)によって、それぞれの脾臓について、評価した。細胞を、PBS中に再懸濁し、続いて、BV605-複合体化した抗-CD4(Biolegend、クローンRM4-5)、PeCy7-複合体化した抗-IL-2Rα(eBioscience、クローンPC61.5)、PerCP-Cy5.5-複合体化した抗-CD8(eBioscience、クローン53-6.72)、及びmAbsを使用して、TReg(CD4+ IL-2Rα+ Foxp3+)又はCD8+エフェクターT細胞(CD8+)の表現型を決定するために、フルオロフォア-複合体化した抗-マウス・モノクローナル抗体(mAbs)を使って、氷上で30分間、染色した。Fixable Blue Dead Cell Stain Kit (Life Techonologies)を使用して、生細胞を評価した。次いで、細胞を、FACSバッファー(1% BSA、1%アジ化ナトリウム)で2回洗浄し、FoxP3 Transcription Factor Fixation/Permeabilization Buffer (eBioscience)中で、氷上で30分間、固定した。Permeabilization Buffer (eBioscience)で2回洗浄をした後、TReg細胞を、FITC-複合体化した抗-マウス/ラットFoxp3 mAb(eBioscience、クローンFJK-16s)を使って、氷上で1時間、染色した。Permeabilization Buffer (eBioscience)で2回の最終洗浄を行った、及び細胞を、LSRII(BD Biosciences)上でフロー・サイトメトリー解析をするために、FACSバッファーに再懸濁した。データを、FlowJo Xソフトウェア(Tree Star)を使用して解析した。PBSコントロールの細胞と比較したMP CD8+エフェクターT細胞の存在量を示す。実験を3回行い、同様の結果を得た。
免疫複合体が、エフェクター細胞が増殖するのに有利な免疫反応に、バイアスをかけるかどうかを決定するために、12週齢のC57BL/6マウス(コホート当たり3匹)に、PBS又はhIL-2/602複合体若しくはmIL-2/S4B6複合体(PBS中で、2:1のサイトカイン:抗体のモル比で、hIL-2[eBioscience]を602又はS4B6と共に、30分間、プレ-インキュベートすることによって調製した)を、毎日4日間、腹腔内注射した。5日目にマウスを頚椎脱臼により屠殺し、脾臓を採取した。単一細胞の懸濁液を、メカニカルなホモゲナイゼーション(mechanical homogenization)によって、調製し、脾細胞の絶対数を、自動細胞カウンター(Vicell、Beckman Coulter)によって、それぞれの脾臓について、評価した。細胞を、PBS中に再懸濁し、続いて、BV605-複合体化した抗-CD4(Biolegend、クローンRM4-5)、PeCy7-複合体化した抗-IL-2Rα(eBioscience、クローンPC61.5)、PerCP-Cy5.5-複合体化した抗-CD8(eBioscience、クローン53-6.72)、及びmAbsを使用して、TReg(CD4+ IL-2Rα+ Foxp3+)又はCD8+エフェクターT細胞(CD8+)の表現型を決定するために、フルオロフォア-複合体化した抗-マウス・モノクローナル抗体(mAbs)を使って、氷上で30分間、染色した。Fixable Blue Dead Cell Stain Kit (Life Techonologies)を使用して、生細胞を評価した。次いで、細胞を、FACSバッファー(1% BSA、1%アジ化ナトリウム)で2回洗浄し、FoxP3 Transcription Factor Fixation/Permeabilization Buffer (eBioscience)中で、氷上で30分間、固定した。Permeabilization Buffer (eBioscience)で2回洗浄をした後、TReg細胞を、FITC-複合体化した抗-マウス/ラットFoxp3 mAb(eBioscience、クローンFJK-16s)を使って、氷上で1時間、染色した。Permeabilization Buffer (eBioscience)で2回の最終洗浄を行った、及び細胞を、LSRII(BD Biosciences)上でフロー・サイトメトリー解析をするために、FACSバッファーに再懸濁した。データを、FlowJo Xソフトウェア(Tree Star)を使用して解析した。PBSコントロールの細胞と比較したMP CD8+エフェクターT細胞の存在量を示す。実験を3回行い、同様の結果を得た。
マウスにおける腫瘍療法の研究
マウス同系メラノーマ・モデルについては、1x106 個のB16F10腫瘍細胞をC57BL/6雄マウス(6~8週齢、治療群あたりn=8)中にs.c.接種した。接種後4日目に開始して、マウスに、PBS又はhIL-2/602複合体(2:1のサイトカイン:抗体のモル比で、hIL-2[eBioscience]を602と共に、30分間、プレ-インキュベートすることによって調製した)を、週2回、腹腔内注射した。サイトカイン/抗体複合体の有効性を評価するために、腫瘍の大きさ及び体重を毎日追跡した。腫瘍を摘出する、及び解析をするために、20日目にマウスを屠殺した。
マウス同系メラノーマ・モデルについては、1x106 個のB16F10腫瘍細胞をC57BL/6雄マウス(6~8週齢、治療群あたりn=8)中にs.c.接種した。接種後4日目に開始して、マウスに、PBS又はhIL-2/602複合体(2:1のサイトカイン:抗体のモル比で、hIL-2[eBioscience]を602と共に、30分間、プレ-インキュベートすることによって調製した)を、週2回、腹腔内注射した。サイトカイン/抗体複合体の有効性を評価するために、腫瘍の大きさ及び体重を毎日追跡した。腫瘍を摘出する、及び解析をするために、20日目にマウスを屠殺した。
602 scFvバリアント(EP602)の変異誘発酵母-ディスプレイ・ライブラリーの作成
((G4S)3リンカーによって分離された、重鎖可変ドメインとそれに続く軽鎖可変ドメインからなる)602抗体の単鎖可変フラグメント(scFv)型版を、重鎖の可変ドメインのN-末端をAga2のC-末端に融合させて、その2つを(G4S)3リンカーによって分離させて、3C及び第Xa因子切断部位と共に、酵母上にティスプレイさせた。C-末端c-Mycタグを、検出するために、含めた。
((G4S)3リンカーによって分離された、重鎖可変ドメインとそれに続く軽鎖可変ドメインからなる)602抗体の単鎖可変フラグメント(scFv)型版を、重鎖の可変ドメインのN-末端をAga2のC-末端に融合させて、その2つを(G4S)3リンカーによって分離させて、3C及び第Xa因子切断部位と共に、酵母上にティスプレイさせた。C-末端c-Mycタグを、検出するために、含めた。
重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方のCDR1及びCDR3に変異誘発をさせる、ターゲットを定めたエラーが多いライブラリー(targeted error prone library)を作製して、既存のIL-2相互作用を保存する一方で、結合においては潜在的に有利な保存的な変化が起こることを可能にした。4種のターゲット化したCDRを、Taqポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用して、標準的な1×Taqバッファー、2mM塩化マンガン(II)、7mM塩化マグネシウム、0.2mMのdATP及びdGTP、1mMのdCTP及びdTTP、0.5μMの各プライマー、並びに0.2ng/μLの鋳型を用いて、エラーを起こしやすいPCRによって、増幅した。5回の増幅サイクルの後、その混合物を、テンプレートを欠く別の新しい混合物に、移して、1:5に希釈した。更に5サイクル進行させ、移すこと及び希釈することを更に2回繰り返し、最後に移したものは、全部で20回の増幅サイクルを受けたものとした。
ターゲット化したCDRに隣接する5つのフレームワーク配列を、Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Thermo Scientific)を用いて増幅した。これらのフレームワーク・フラグメントを、Phusionポリメラーゼを用いた、連続的な、重なりを対合させる伸長PCR(sequential, pairwise overlap extension PCR)によって、隣接する変異が誘発されたフラグメントと一緒に、組み合わせて繋げた。最終的に組み合わせて繋げたフラグメントは、完全な602 scFv、並びに切断を受けた酵母ディスプレイ・ベクター(pCT3CBN)と重複するであろう相同配列(≧97nt)を両端に、含んでいた。
直鎖状の骨格及びフラグメントが存在するもとで、EBY100酵母にエレクトロポレーションした後、切断を受けたベクター及び変異が誘発されたフラグメントを、前述のように、酵母の相同組換えによって組み合わせて繋げた1, 2。そのライブラリーは、1.4×107形質転換体を産生し、48時間SDCAA培地中で増殖させ、継代し、その後、最初のODが1である24時間後にSGCAA中で誘導を掛けた。組み換えられたプラスミドのサンプルを、酵母プラスミド・ミニプレップ(Zymogen)によって抽出して、前記フラグメントが前記骨格の中に適切に挿入されていることを確認した。エラー発生率、即ち、アミノ酸配列に変化をもたらすDNA変異、は約6%であることが観察された。
EP602ライブラリーの選択
各ラウンドの選択によって、酵母を、残りのクローンの10倍を確実にカバーするのに十分に、染色し、選別した。各ラウンドで選択した酵母を、30℃で一晩、SDCAA液体培地(pH 4.5)中で2日間の間、増殖させ、続いて、SGCAA液体培地(pH 4.5)中で2日間、20℃で、誘導を掛けた。
各ラウンドの選択によって、酵母を、残りのクローンの10倍を確実にカバーするのに十分に、染色し、選別した。各ラウンドで選択した酵母を、30℃で一晩、SDCAA液体培地(pH 4.5)中で2日間の間、増殖させ、続いて、SGCAA液体培地(pH 4.5)中で2日間、20℃で、誘導を掛けた。
ナイーブなEP602ライブラリーを、第1ラウンドの磁気-活性化細胞選択(magnetic-activated cell selection (MACS))において、Alexa Fluor 647-コンジュゲート化したストレプトアビジン(SA-AF647)(Thermo Scientific)に特異的なバリアントを排除し、及びIL-2に結合したバリアントを選択すること、によって、小さくした。染色は、全て、PBE溶液(リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.2、0.1% BSA、及び1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA))中で行った。第1のMACSステップでは、前記酵母を20 μg/mLのSA-AF647と共に、4℃で1時間インキュベートし、洗浄し、次いで、1:20の抗-Cy5/抗-Alexa Fluor 647マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)と共に、4℃で20分間インキュベートし、洗浄し、次いで、製造者のプロトコルに従って、LS MACS分離カラム(Miltenyi Biotec)にかけた。前記カラムを通って流れた酵母(即ち、非-SA-AF647結合体)を回収し、第2のMACSステップ用に調製した。ビオチン化IL-2を、PBE中で希釈したSA-647(4:1モル比; Thermo Fisher Scientific)と混合し、そして15分間インキュベートし四量体を形成させた、並びに前記酵母を、4℃で2時間、前記四量体とインキュベートし、次いで、洗浄し、そして、前のように、抗-Cy5/抗-Alexa Fluor 647マイクロビーズとインキュベートした。再度、前記酵母をLS MACS分離カラムにかけたが、このステップでは、磁石からカラムを除去した後に溶出した細胞を回収し、上記のように増殖させた後、次のラウンドの選択用に誘導を掛けた。
第2ラウンドの選択によって、c-Mycが存在するものを選択するためのMACSを使用することにより、全長602 scFvのバリアントを単離する。酵母を、1:100に希釈した、Alexa Fluor 647-コンジュゲートした抗-c-Myc抗体(クローン9B11、Cell Signaling Technologies)のPBE溶液と共に、4℃で2時間、インキュベートし、抗-Cy5/抗-Alexa Fluor 647マイクロビーズと共にインキュベートし、LS MACS分離カラムにかけた。溶出した細胞を、上記のように回収した。
最終の第3ラウンドの選択を、IL-2RαサブユニットとのIL-2相互作用を競合的に遮断するバリアントを選択するために、大過剰のIL-2Rαの存在下でIL-2の量を減少させることを用いて、FACSymphony S6細胞選別機(Becton Dickinson)で蛍光活性化細胞選別(fluorescence-activated cell sorting (FACS))によって、行った。第1のこれらの競合的FACS選択では、1.5μM IL-2Rαと一緒に50nM IL-2を使用した、及び第2の選択と第3の選択の両方では、30nM IL-2と0.3μM IL-2Rαを使用した。しかし、最初の2つの選択とは異なり、第3の選択によって、IL-2とインキュベートし、洗浄し、次いで室温で2時間、IL-2Rαとインキュベートする(IL-2の解離を可能にする)ことによって、低いオフ-レート(off-rate)であるバリアントが選択された。全てのFACS選択において、IL-2結合に関して上位5%のバリアントのみを回収した。
酵母表面scFv結合試験
scFvをディスプレイする酵母(ウェル当たり2×105)を96-ウェル・プレートに播種した、及びビオチン化IL-2を含むPBEバッファー中、IL-2Rαの存在下で又は非存在下で、室温で4時間、インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、1:200に希釈したAlexaFluor 647-複合体化ストレプトアビジン(Thermo Fisher Scientific)のPBSA溶液で、4℃で15分間、染色した。最後の洗浄をした後、細胞を、CytoFLEXフロー・サイトメーター(Beckman Coulter)を使用して、ターゲット結合について解析した。バックグラウンドを差し引いて正規化した結合曲線を、一次結合モデルに当てはめ、平衡解離定数(KD)値をGraphPad Prismソフトウェアを用いて決定した。
scFvをディスプレイする酵母(ウェル当たり2×105)を96-ウェル・プレートに播種した、及びビオチン化IL-2を含むPBEバッファー中、IL-2Rαの存在下で又は非存在下で、室温で4時間、インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、1:200に希釈したAlexaFluor 647-複合体化ストレプトアビジン(Thermo Fisher Scientific)のPBSA溶液で、4℃で15分間、染色した。最後の洗浄をした後、細胞を、CytoFLEXフロー・サイトメーター(Beckman Coulter)を使用して、ターゲット結合について解析した。バックグラウンドを差し引いて正規化した結合曲線を、一次結合モデルに当てはめ、平衡解離定数(KD)値をGraphPad Prismソフトウェアを用いて決定した。
結果
602免疫サイトカインは、哺乳動物の細胞から確実に生成される。
サイトカインの効力を抗体の薬物動態学的に好ましい特性と組み合わせるために、hIL-2を、サイトカインにバイアスをかける602抗体に融合させて(図1A)、免疫サイトカイン(IC)を作製した。迅速で小規模なHEK 293F細胞トランスフェクション・アッセイを開発し、免疫サイトカインの発現を最適化した。細胞を、予め規定した比率の、HCの及びIL-2-融合化LCのプラスミドDNAで、6-ウェル・プレート中で、トランスフェクトした。3日間インキュベーションした後、その上清から、プロテインG樹脂を使って、分泌されたタンパク質を捕捉し、0.1 Mグリシン(pH 2.0)で溶出し、SDS-PAGEによって解析した。このアッセイを、LCのN-末端でマウスIgG2a抗体に融合したhIL-2を含む免疫サイトカインを用いて、検証した。HC:LC比をタイトレーションすると、最適な発現条件が明らかになった(図1B)。免疫サイトカインの発現を、HEK 293F細胞中でスケール・アップし、分泌されたタンパク質をプロテインGクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。602 ICを、FPLC装置で、均一になるように精製した(図1C)。
602免疫サイトカインは、哺乳動物の細胞から確実に生成される。
サイトカインの効力を抗体の薬物動態学的に好ましい特性と組み合わせるために、hIL-2を、サイトカインにバイアスをかける602抗体に融合させて(図1A)、免疫サイトカイン(IC)を作製した。迅速で小規模なHEK 293F細胞トランスフェクション・アッセイを開発し、免疫サイトカインの発現を最適化した。細胞を、予め規定した比率の、HCの及びIL-2-融合化LCのプラスミドDNAで、6-ウェル・プレート中で、トランスフェクトした。3日間インキュベーションした後、その上清から、プロテインG樹脂を使って、分泌されたタンパク質を捕捉し、0.1 Mグリシン(pH 2.0)で溶出し、SDS-PAGEによって解析した。このアッセイを、LCのN-末端でマウスIgG2a抗体に融合したhIL-2を含む免疫サイトカインを用いて、検証した。HC:LC比をタイトレーションすると、最適な発現条件が明らかになった(図1B)。免疫サイトカインの発現を、HEK 293F細胞中でスケール・アップし、分泌されたタンパク質をプロテインGクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。602 ICを、FPLC装置で、均一になるように精製した(図1C)。
免疫サイトカインは、レセプター結合及び細胞シグナル伝達に対して、選択的なバイアスを有する。
バイオレイヤー干渉法(bio-layer interferometry)をOctet(登録商標)プラットホームで使用して、ヒトIL-2Rα及びIL-2Rβレセプターを固定化し、可溶化ICの結合を測定し、hIL-2サイトカインと比較した。602 ICは、抗体遮断のためにIL-2Rαと相互作用しなかったが、IL-2Rβ結合は、繋がれていないhIL-2と比較して、増強され(図2)、分子内抗体/サイトカイン複合体が機能的に形成されたことが確認された。
バイオレイヤー干渉法(bio-layer interferometry)をOctet(登録商標)プラットホームで使用して、ヒトIL-2Rα及びIL-2Rβレセプターを固定化し、可溶化ICの結合を測定し、hIL-2サイトカインと比較した。602 ICは、抗体遮断のためにIL-2Rαと相互作用しなかったが、IL-2Rβ結合は、繋がれていないhIL-2と比較して、増強され(図2)、分子内抗体/サイトカイン複合体が機能的に形成されたことが確認された。
IL-2応答性免疫細胞に加えたIC刺激に対する下流シグナル伝達応答を解析し、ICの機能を評価した。その工学的に操作したICが媒介する免疫バイアスの特徴を明らかにするために、IL-2Rαを誘導的に発現する、ヒトYT-1ナチュラル・キラー(NK)細胞株を用いた。フロー・サイトメトリー-ベースの研究を行って、IL-2、サイトカイン/抗体複合体(IL-2及び602抗体を、1:1の化学量論的に等しいモル比で、プレ-インキュベートすることによって調製した)、又は602 ICが惹起するSTAT5リン酸化を、Eff活性化とTReg活性化を比較する代わりとして、誘導されていないIL-2Rα- YT-1細胞と誘導されたIL-2Rα+ YT-1細胞を比較して、定量した。繋がれていないIL-2は、IL-2Rα+とIL-2Rα-細胞の両方を刺激し、hIL-2/602複合体では、IL-2Rα+とIL-2Rα- YT-1細胞の両方に対する活性が減少した。前記602 ICでは、hIL-2/602複合体の細胞シグナル伝達特性を効果的に再現することが観察され(図3)、これにより、混合複合体と同様に、602 ICが、サイトカイン・シグナル伝達に、Effsの方へのバイアスをかけること、が実証された。
IL-2/602複合体は、Effを増殖させ、in vivoで腫瘍増殖を阻害する。
IL-2/602複合体が、生きている動物において、Eff(特にMP CD8+エフェクターT細胞)を増殖させるかどうかを決定するために、PBS又は種々の濃度のhIL-2/602複合体若しくはmIL-2/S4B6複合体のいずれかを、マウスに注射した。hIL-2/602複合体は、mIL-2/S4B6複合体よりも強力ではないが、MP CD8+エフェクターT細胞を増殖させることが観察された(図4A)。更に、マウス同系メラノーマ・モデル(B16F10)において、hIL-2/602複合体を週2回投与すると、腫瘍増殖が有意に抑制されることも示された(図4B)。
IL-2/602複合体が、生きている動物において、Eff(特にMP CD8+エフェクターT細胞)を増殖させるかどうかを決定するために、PBS又は種々の濃度のhIL-2/602複合体若しくはmIL-2/S4B6複合体のいずれかを、マウスに注射した。hIL-2/602複合体は、mIL-2/S4B6複合体よりも強力ではないが、MP CD8+エフェクターT細胞を増殖させることが観察された(図4A)。更に、マウス同系メラノーマ・モデル(B16F10)において、hIL-2/602複合体を週2回投与すると、腫瘍増殖が有意に抑制されることも示された(図4B)。
リンカー長を変更することにより、602免疫サイトカインの産生及び機能が最適化される。
602 ICの発現、安定性、及び機能を改善するために、免疫サイトカイン内のIL-2サイトカインと602抗体との間の分子内リンカーの長さを調節した。具体的には、15アミノ酸リンカー(配列番号(SEQ ID NO):23、602 IC LN15)、25アミノ酸リンカー(配列番号(SEQ ID NO):24、602 IC LN25)、及び35アミノ酸リンカー(配列番号(SEQ ID NO):25、602 IC LN35)を有する602 ICバリアントを作製した。602重鎖及び適切な長さのリンカーを有するIL-2-融合化602軽鎖をHEK 293F細胞に一過性に共-トランスフェクションすることによって、全ての構築物を発現させた。図5Aに示すように、3つのはっきりとしたピークがサイズ排除クロマトグラフィーで見られた。最初の2つのピーク(ピーク1及び2)は高分子量オリゴマーに対応し、一方、ピーク3は単量体ICに対応する。リンカー長が増加することにつれて、単量体の割合も増加し、602 IC LN35は、ほぼ全てが単量体状であった。従って、我々は、35アミノ酸リンカーの構築物に基づいて、免疫サイトカインの特徴を更に明らかにすることへと進んだ。全ての602 ICバリアントは、非-還元的SDS-PAGE解析及び還元的SDS-PAGE解析で、予想された分子量で移動した(図5B)。
602 ICの発現、安定性、及び機能を改善するために、免疫サイトカイン内のIL-2サイトカインと602抗体との間の分子内リンカーの長さを調節した。具体的には、15アミノ酸リンカー(配列番号(SEQ ID NO):23、602 IC LN15)、25アミノ酸リンカー(配列番号(SEQ ID NO):24、602 IC LN25)、及び35アミノ酸リンカー(配列番号(SEQ ID NO):25、602 IC LN35)を有する602 ICバリアントを作製した。602重鎖及び適切な長さのリンカーを有するIL-2-融合化602軽鎖をHEK 293F細胞に一過性に共-トランスフェクションすることによって、全ての構築物を発現させた。図5Aに示すように、3つのはっきりとしたピークがサイズ排除クロマトグラフィーで見られた。最初の2つのピーク(ピーク1及び2)は高分子量オリゴマーに対応し、一方、ピーク3は単量体ICに対応する。リンカー長が増加することにつれて、単量体の割合も増加し、602 IC LN35は、ほぼ全てが単量体状であった。従って、我々は、35アミノ酸リンカーの構築物に基づいて、免疫サイトカインの特徴を更に明らかにすることへと進んだ。全ての602 ICバリアントは、非-還元的SDS-PAGE解析及び還元的SDS-PAGE解析で、予想された分子量で移動した(図5B)。
適切に会合していることを検証し、Octet(登録商標)プラットホームを使用するバイオレイヤー干渉法(bio-layer interferometry)試験により、602 ICバリアントの結合特性を調べた。ヒトIL-2Rβを固定化し、IL-2、602抗体、IL-2+602 Ab複合体(IL-2及び602抗体を、2:1の化学量論比で、室温で30分間プレ-インキュベートすることにより調製した)、602 ICバリアント、及び関連性の無いネガティブ・コントロール・タンパク質、の結合を測定した。免疫サイトカイン内のIL-2と602との間の分子内相互作用に基づいて予想されるように、IL-2RβとのIC相互作用は、コンジュゲートしていないIL-2と比較して、増強し、これにより、602 ICが適切に会合していること、及び生物物理学的な挙動が実証された(図6)。
ICバリアントによる刺激に対する下流シグナル伝達応答を、IL-2応答性免疫細胞で評価し、機能を評価した。IL-2Rα発現を伴うヒトYT-1 NK細胞及び伴わないヒトYT-1 NK細胞を用いて、TRegの応答と免疫エフェクター細胞の応答とを比較することを模倣した。IL-2を介したSTAT5のリン酸化を、IL-2、IL-2+602 Ab複合体(IL-2及び602抗体を、1:1の化学量論比で、室温で30分間プレ-インキュベートすることにより調製した)、又は602 ICバリアントのいずれかを使用して刺激した後に、フロー・サイトメトリーを行うことにより、定量化した(図7)。繋がれていないIL-2は、IL-2Rα+ TReg-様細胞を活性化する方向に、3-4倍バイアスをかけることを示した。一方、リードIC、602IC LN35は、このバイアスを逆にしてIL-2Rα-Eff様細胞を指向するようにした。なお、ICが媒介するバイアスは、IL-2+602 Ab複合体が媒介するバイアスを上回ることに注意のこと。
602 ICの工学的に操作した型版は、エフェクター細胞に対するバイアスを改善した
602 ICの活性を、TReg細胞よりもEffsの方へ更に偏らせるために、エラーが多い(error-prone)変異誘発ライブラリー(mutagenic library)を作製し、602可変重鎖及び軽鎖の相補性決定ループ(complementarity-determining loops (CDRs))をランダム化した。次いで、このライブラリーを、磁気活性化細胞選別(MACS)及び蛍光活性化細胞選別(FACS)の反復ラウンドを通してヒトIL-2に対して進化させ、サイトカイン係合について可溶性IL-2Rαを上回ることができるようになったクローンを選択した。5ラウンドの選択後、その進化したライブラリーは、IL-2への結合が有意に改善し(図8A)、IL-2Rαレセプター・サブユニットとの競合が増強した(図8B)。このライブラリーに由来する個々のクローンの特徴を明らかにしたところ、最も有効な変異体が、F10と示されるバリアント(配列番号(SEQ ID NO):28及び配列番号(SEQ ID NO):29)であることが見出された。図8Cに示されるように、前記F10抗体(単鎖可変フラグメント[scFv]のフォーマットにある)は、その親である602 scFvと比較して、IL-2に対してより強力に結合し、及びIL-2Rαとより強力に競合することが、実証された。最適化された35アミノ酸リンカーを用いて、前記F10抗体をICとして再フォーマット化した。F10 IC LN35を、抗体重鎖及びIL-2-融合した抗体軽鎖を一過性に共-トランスフェクションすることによって、HEK 293F細胞で発現させた。図9Aに示すように、分泌されたタンパク質の大部分は単量体であった。35アミノ酸リンカーを使ってIL-2に融合した関連性の無い抗体からなるIC構築物もまた、実験のコントロールとして調製した(Irrel. Ab IC LN35)。F10 IC LN35及び関連性の無い抗体は、非-還元的SDS-PAGE及び還元的SDS-PAGEで、予想された分子量で移動した(図9B)。
602 ICの活性を、TReg細胞よりもEffsの方へ更に偏らせるために、エラーが多い(error-prone)変異誘発ライブラリー(mutagenic library)を作製し、602可変重鎖及び軽鎖の相補性決定ループ(complementarity-determining loops (CDRs))をランダム化した。次いで、このライブラリーを、磁気活性化細胞選別(MACS)及び蛍光活性化細胞選別(FACS)の反復ラウンドを通してヒトIL-2に対して進化させ、サイトカイン係合について可溶性IL-2Rαを上回ることができるようになったクローンを選択した。5ラウンドの選択後、その進化したライブラリーは、IL-2への結合が有意に改善し(図8A)、IL-2Rαレセプター・サブユニットとの競合が増強した(図8B)。このライブラリーに由来する個々のクローンの特徴を明らかにしたところ、最も有効な変異体が、F10と示されるバリアント(配列番号(SEQ ID NO):28及び配列番号(SEQ ID NO):29)であることが見出された。図8Cに示されるように、前記F10抗体(単鎖可変フラグメント[scFv]のフォーマットにある)は、その親である602 scFvと比較して、IL-2に対してより強力に結合し、及びIL-2Rαとより強力に競合することが、実証された。最適化された35アミノ酸リンカーを用いて、前記F10抗体をICとして再フォーマット化した。F10 IC LN35を、抗体重鎖及びIL-2-融合した抗体軽鎖を一過性に共-トランスフェクションすることによって、HEK 293F細胞で発現させた。図9Aに示すように、分泌されたタンパク質の大部分は単量体であった。35アミノ酸リンカーを使ってIL-2に融合した関連性の無い抗体からなるIC構築物もまた、実験のコントロールとして調製した(Irrel. Ab IC LN35)。F10 IC LN35及び関連性の無い抗体は、非-還元的SDS-PAGE及び還元的SDS-PAGEで、予想された分子量で移動した(図9B)。
F10 IC LN35の会合及び適切な結合挙動を検証するために、Octet(登録商標)装置を用いて、バイオレイヤー干渉法(bio-layer interferometry)実験を行った。ヒトIL-2、IL-2Rα、及びIL2Rβレセプターを固定化し、602抗体、IL-2+602 Ab複合体(IL-2及び602抗体を、2:1の化学量論比で、室温で30分間プレ-インキュベートすることにより調製した)、602 IC LN35、F10 IC LN35、及び関連性の無いネガティブ・コントロール・タンパク質、の結合を測定した。IL-2とのICの相互作用は、前記IC内の分子内相互作用に由来する競合のために、コンジュゲートしていない602抗体と比較して、大幅に減弱した(図10A)。更に、602 IC LN35と同様に、F10 IC LN35は、IL-2サイトカイン結合の抗体遮断によりIL-2Rαへの結合は最小限であり、F10 IC LN35は、設計されたように、602 IC LN35よりも、前記レセプターと競合的であった。(図10B)。IL-2Rβへの結合は、602 IC LN35及びF10 IC LN35の両方について、コンジュゲートしていないIL-2と比較して、増強した(図10C)。まとめると、これらの結合試験により、工学的に操作したICバリアントF10 IC LN35の分子内会合及び生物物理学的な機能性が実証される。
IL-2Rα+ TReg様細胞と比較してIL-2Rα-Eff様細胞の方への、F10 LN35 ICの優れたバイアスを、YT-1ヒトNK細胞株を用いて実証した。IL-2Rαを有する、及び有さないYT-1を、IL-2、関連性の無い抗体Ab IC LN35、IL-2+602 Ab複合体(IL-2及び602抗体を、1:1の化学量論比で、室温で30分間プレ-インキュベートすることにより調製した)、602 IC LN35、又はF10 LN35の何れかによって刺激した。STAT5リン酸化を、IL-2-誘導シグナル伝達のリードアウト(readout)として、フロー・サイトメトリーにより検出した(図11)。IL-2及びコントロールの関連性の無い抗体Ab IC LN35は、IL-2Rα- Eff様細胞よりもIL-2Rα+ TReg様細胞の方への、有意なバイアスを示したが、F10 IC LN35では、この指向性が逆転し、その親である602 IC LN35よりもわずかに優れていた。F10 IC LN35及び602 IC LN35の両方は、IL-2+602複合体と比較して、TReg様細胞よりもEff様細胞を有意により強く指向した。
まとめ
これらの結果は、IL2/602免疫サイトカインが免疫エフェクター細胞活性を刺激し、及びがん及び/又は感染性疾患を有する哺乳動物を治療するために使用され得ること、を実証する。
これらの結果は、IL2/602免疫サイトカインが免疫エフェクター細胞活性を刺激し、及びがん及び/又は感染性疾患を有する哺乳動物を治療するために使用され得ること、を実証する。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と一緒に説明したが、前記の説明は本発明の範囲(添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される)を例示することを意図したものであり、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明をその詳細な説明と一緒に説明したが、前記の説明は本発明の範囲(添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される)を例示することを意図したものであり、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
フリー・テキストのシーケンス・リスト:
配列番号(SEQ ID NO):6
シグナル配列
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD
シグナル配列
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD
配列番号(SEQ ID NO):7
シグナル配列
MRVPAQLLGLLLLWLPGARC
シグナル配列
MRVPAQLLGLLLLWLPGARC
配列番号(SEQ ID NO):8
シグナル配列
MYRMQLLSCIALSLALVTNS
シグナル配列
MYRMQLLSCIALSLALVTNS
配列番号(SEQ ID NO):12
リンカー
GGGGSGGGGS
リンカー
GGGGSGGGGS
配列番号(SEQ ID NO):13
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGS
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号(SEQ ID NO):14
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号(SEQ ID NO):15
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号(SEQ ID NO):16
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号(SEQ ID NO):17
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号(SEQ ID NO):18
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号(SEQ ID NO):19
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号(SEQ ID NO):20
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
リンカー
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号(SEQ ID NO):30
ビオチン・アクセプター・ペプチド
LNDIFEAQKIEWHE
ビオチン・アクセプター・ペプチド
LNDIFEAQKIEWHE
Claims (50)
- 以下を含む単鎖免疫サイトカイン:
免疫グロブリン重鎖;
IL-2ポリペプチド、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、インターロイキン-2レセプター-β(IL-2Rβ)ポリペプチド及び共通のガンマ鎖(γc)ポリペプチドを含むポリペプチド複合体(IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体)に結合することができる;並びに、
免疫グロブリン軽鎖;
ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、前記IL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する。 - 請求項1に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):4に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、又は配列番号(SEQ ID NO):28に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、可変ドメインを含む。
- 請求項2に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):4に記載のアミノ酸配列を有する、又は配列番号(SEQ ID NO):28に記載のアミノ酸配列を有する、可変ドメインを含む。
- 請求項2~3の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン重鎖は、γ重鎖定常ドメインを含む。
- 請求項4に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記γ重鎖定常ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):5に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有する。
- 請求項4~5の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):5に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含む。
- 請求項2~6の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン重鎖は、シグナル配列を含む。
- 請求項7に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記シグナル配列は、配列番号(SEQ ID NO):6に記載のアミノ酸配列を含む。
- 請求項2~8の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン重鎖は、配列番号(SEQ ID NO):1又は配列番号(SEQ ID NO):26に記載のアミノ酸配列を含む。
- 請求項1に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
- 請求項10に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列を含む。
- 請求項1に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、又は配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、可変ドメインを含む。
- 請求項12に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列を有する、又は配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列を有する、可変ドメインを含む。
- 請求項12~13の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、κ軽鎖定常ドメインを含む。
- 請求項14に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記κ軽鎖定常ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有する。
- 請求項14~15の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む。
- 請求項12~16の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列を含む。
- 請求項17に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記シグナル配列は、配列番号(SEQ ID NO):7に記載のアミノ酸配列を含む。
- 請求項12~18の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):2に記載のアミノ酸配列を含む。
- 請求項1に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記IL-2ポリペプチド及び前記免疫グロブリン軽鎖は、融合ポリペプチドである。
- 請求項20に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
- 請求項21に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記IL-2ポリペプチドは、配列番号(SEQ ID NO):9に記載のアミノ酸配列を含む。
- 請求項20に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、又は配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有する、可変ドメインを含む。
- 請求項23に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):10に記載のアミノ酸配列を有する、又は配列番号(SEQ ID NO):29に記載のアミノ酸配列を有する、可変ドメインを含む。
- 請求項23~24の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、κ軽鎖定常ドメインを含む。
- 請求項25に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記κ軽鎖定常ドメインは、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有する。
- 請求項25~26の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):11に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む。
- 請求項20~27の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記IL-2ポリペプチド及び前記免疫グロブリン軽鎖は、リンカーを介して融合している。
- 請求項28に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記リンカーは、10~60個のアミノ酸を含むペプチド・リンカーである。
- 請求項29に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記リンカーは、(Gly4Ser)2リンカーである。
- 請求項20~30の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列を含む。
- 請求項31に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記シグナル配列は、配列番号(SEQ ID NO):8に記載のアミノ酸配列を含む。
- 請求項20~32の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列番号(SEQ ID NO):3、配列番号(SEQ ID NO):23、配列番号(SEQ ID NO):24、配列番号(SEQ ID NO):25、又は配列番号(SEQ ID NO):27の何れか1つに記載のアミノ酸配列を含む。
- 請求項1~33の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、約5分~約6ヶ月の半減期を有する。
- 請求項1~33の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、約300 nM KD~約1 pM KDのIL-2Rβポリペプチドに対する親和性を有する。
- 請求項1~33の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、約10 nM KDを超えるIL-2Rαポリペプチドに対する親和性を有する。
- 請求項1~36の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、ヒトIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合する。
- 請求項37に記載の単鎖免疫サイトカイン、ここで、前記単鎖免疫サイトカインは、非-ヒトIL-2Rβ/γcポリペプチド複合体に結合しない。
- 請求項1~38の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカインをコードする核酸。
- 請求項39に記載の核酸、ここで、前記核酸は、第1の核酸及び第2の核酸を含む、ここで、前記第1の核酸は、前記免疫グロブリン重鎖をコードすることができる、及びここで、前記第2の核酸は、前記免疫グロブリン軽鎖に融合した前記IL-2ポリペプチドをコードすることができる。
- がんを有する哺乳動物を治療するための方法、ここで、前記方法は以下を含む:
請求項1~38の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカインを含む組成物、又は請求項39~40の何れか一項に記載の核酸を含む組成物、を前記哺乳動物に投与すること。 - 請求項41に記載の方法、ここで、前記哺乳動物は、ヒトである。
- 請求項41~42の何れか一項に記載の方法、ここで、前記がんは、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん(kidney cancer)、 肺がん、メラノーマ、口腔がん、膀胱がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、食道がん(esophageal cancer)、及び子宮がん(uterine cancer)からなる群より選択される。
- 請求項41~43の何れか一項に記載の方法、ここで、前記方法は、前記哺乳動物に存在するがん細胞の数が減少する条件下で、前記哺乳動物に1種以上のがん治療を処方することを更に含む。
- 哺乳動物においてエフェクター細胞を刺激するための方法、ここで、前記方法は、以下を含む:
請求項1~38の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカインを含む組成物、又は請求項39~40の何れか一項に記載の核酸を含む組成物、を前記哺乳動物に投与すること。 - 請求項45に記載の方法、ここで、前記哺乳動物は、ヒトである。
- 感染性疾患を有する哺乳動物を治療するための方法、ここで、前記方法は、以下を含む:
請求項1~38の何れか一項に記載の単鎖免疫サイトカインを含む組成物、又は請求項39~40の何れか一項に記載の核酸を含む組成物、を前記哺乳動物に投与すること。 - 請求項47に記載の方法、ここで、前記哺乳動物は、ヒトである。
- 請求項47~48の何れか一項に記載の方法、ここで、前記感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス、マラリア、インフルエンザ、エボラ、結核、麻疹、狂犬病、デング熱、サルモネラ症、百日咳、ペスト、及び西ナイル熱からなる群より選択される。
- 請求項41~49の何れか一項に記載の方法、ここで、前記方法は、調節性T細胞を実質的に活性化しない。
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