KR101644847B1 - 와편모조류 검출을 위한 와편모조류 특이 단일클론 항체 및 이것의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 선박평형수 내 와편모조류(Dinoflagellate)를 검출하기 위한 것으로, 더욱 상세하게는 와편모조류에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 이를 이용한 와편모조류 검출용 키트에 대한 것이며, 이러한 단일클론 항체는 해양생물인 와편모조류 뿐만 아니라 규조류까지 검출할 수 있어서, 선박평형수 내의 다양한 미생물을 검출하기 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

와편모조류 검출을 위한 와편모조류 특이 단일클론 항체 및 이것의 용도{A Dinoflagellate-specific monoclonal antibodies for the detection of dinoflagellate and the detecting kits comprising the same}

본 발명은 선박평형수 내 와편모조류(Dinoflagellate)를 검출하기 위한 것으로, 와편모조류에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체와 상기 단일클론 항체를 포함하는 와편모조류 검출용 키트 및 이를 이용한 와편모조류 검출 방법 등에 대한 것이다.

선박평형수(ballast water)는 선박으로부터 화물의 반출시 부력에 의해 선박의 무게중심이 높아짐에 따라 선박안정성이 낮아지는 것을 방지하기 위하여 화물반출량에 비례하여 선박 내에 저장되는 해수를 말한다. 반대로 선박에 화물을 적재할 때에는 선박평형수를 배출하게 되는데, 배출량 역시 화물의 적재량에 비례하게 된다. 이와 같이 선박 운항에 반드시 필요한 선박평형수는 국제 간 교역량의 증가에 따라 선박평형수에 포함된 생물 개체의 지리적 이동을 초래하게 되었고, 이러한 해양생물 개체의 이동이 해양 생태계를 교란하는 원인으로 지목되었다.

지구상에서 생산되는 재화의 80%가 선박에 의해 국제적으로 이동되고 있으며, 이러한 선박의 안전하고 효율적인 운항을 위해 채우는 선박평형수에 의해 매년 약 50억 톤 이상의 해수가 국제적으로 이동되고 있고, 이로 인해 약 7,000 여종의 해양생물이 운반되고 있는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 선박에 의한 재화의 국제적 이동으로 선박 외부에 부착되거나 선박평형수에 포함되어 전이된 외래 해양생물은 지역 해양생태계를 위협하고 있는 실정이다. 이러한 경로를 통한 외래종의 유입은 해양생태계를 교란하는 요인 중 하나로 인식되고 있으며, 해양생태계의 교란은 토착 생물의 멸종은 물론 해양생태환경을 파괴할 수 있다는 관점에서 단순한 해양오염보다 더 심각한 현실로 받아들여지고 있다.

선박평형수의 배출로부터 기인하는 외국의 또는 다른 지역의 해양생물 종은 해당 배출지역의 환경에 적응하게 되는 경우, 왕성한 번식이 발생함으로써 해당 해역에 자연스럽게 토착화되며, 동시에 인근의 해역으로 확산된다. 상황에 따라 외래종과 토착종 사이에서 균형상태가 이루어져 유리한 상황이 전개될 수도 있으나, 현실은 그렇지 못하여 해당 해역의 생태계는 먹이사슬에서 야기되는 큰 변화가 일어날 수 있으며, 이에 따라 어종 변화로 인하여 경제적인 측면은 물론 종류별 수산물 생산에도 결정적인 문제가 야기될 수 있다. 결론적으로, 외래 해양생물 종의 유입은 원치 않는 해양생태계의 변화를 유도하게 된다.

그러므로, 이 같은 선박평형수 이동에 의해 발생할 수 있는 생태적, 경제적 피해를 막고, 생물 다양성을 보전하기 위해 국제해사기구(IMO)는 2004년 2월 '선박 평형수 관리협약'을 채택하여 2012년부터는 건조되는 모든 선박에, 2016년부터는 운항하는 모든 선박에 의무적으로 선박평형수 처리장치를 탑재하도록 규정하고 있다.

인천항과 부산항에서 조사된 뉴질랜드, 타이완, 홍콩, 싱가폴, 북태평양, 파키스탄과 일본 근해 등지에서 유입된 선박평형수 중의 해양미생물종인 식물 플랑크톤, 원생동물 플랑크톤, 후생동물 플랑크톤, 기타 플랑크톤 등을 종, 속, 또는 상위 단계 분류군으로 구분하여 보면, 전체 분류군의 수는 7 내지 53개의 범위를 보이고 있다. 한편, 분류된 해양미생물의 출현 분류군 수는 모두 170개(식물 플랑크톤: 돌말류와 와편모조류 및 기타 90개, 후생동물 플랑크톤 56개, 원생동물플랑크톤 24개)이다(Yoo et al. 2006. Marine plankton in ballast water of ship entering Korea. Ocean Polar Res. 28:57-65.). 이 중 대량 발생으로 적조를 일으켜 연안의 양식 어류의 대량폐사를 일으켜 심각한 경제적 손실을 초래하는 원인 해양미세조류인 와편모조류(Dinoflagellate)는 운동방향이 다른 두 개의 편모를 가진단세포 생물로 온대해역의 표영 생태계에서 돌말류 다음으로 많이 출현하는 종이다. 약 2,000 종이 알려져 있으며 이중 40-60%가 광합성에 참여하고 있다. 이들의 대번식이 일어나면 근처의 해수가 붉은 색 또는 짙은 갈색으로 변화하며 이 중 몇몇의 와편모조류는 스스로 독소를 생성함으로써, 이를 섭취한 다양한 생물들의 폐사를 유발한다.

선박평형수 내의 해양생물 각각은 취수해역에 따른 분포로서 알 수 있으나,선박평형수의 교환작업에서 선박평형수는 서로 완전히 교체되는 것이 아니므로 상호 혼재한 상태로 존재하게 된다. 따라서 문제가 발생하였을 경우, 어느 지역에서옮겨온 것인지, 그리고 어느 선박에 의해 옮겨진 것인지에 대한 판단이 매우 어렵기 때문에 일차적으로 선박평형수 내의 생물 제거를 위한 처리가 중요하며, 처리이후 처리수 내에 생존하고 있는 생물에 대한 확인도 매우 중요하다.

이에, 본 발명자들은 선박평형수내에 존재하는 와편모조류의 신속 검출을 위한 방법의 개발을 위해, 와편모조류 중에 하나인 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin)을 클로닝하였으며, 이를 항원으로 사용하여 제작한 단일클론 항체가 와편모조류를 특이적으로 검출함을 확인하였고, 일부 단일클론 항체의 경우 와편모조류 뿐만 아니라 규조류까지 특이적으로 검출함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 헤테로캅사 트리퀘트라 유래 알파-튜불린에 대한 단일클론 항체가 선박평형수 내의 잔류 생물 생존 유무를 측정하는데 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 와편모조류 또는 와편모조류와 규조류에 특이적인 단일클론 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 단일클론 항체를 포함하는 와편모조류 또는 와편모조류와 규조류 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 와편모조류 또는 와편모조류와 규조류 검출용 조성물을 포함하는 검출 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 와편모조류 또는 와편모조류와 규조류에 대한 항체를 생성하는 비장세포와 골수종 세포주를 융합시키고 와편모조류 또는 와편모조류와 규조류에 특이적인 단클로날 융합 세포주를 선별하여 융합 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 와편모조류 또는 와편모조류와 규조류에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 진단 키트를 이용하여 와편모조류 또는 와편모조류와 규조류 검출을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양태로 본 발명은 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 및 이의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 단일클론 항체는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 특이적이므로 본 발명에 따른 단일클론 항체를 이용하면 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류를 특징적으로 스크리닝해 낼 수 있다.

여기서, 본 발명은 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra) 유래 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 면역학적 활성 단편일 수 있다. 그래서, 상기 와편모조류는 와편모조류의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질인 것이 가능하다. 또한, 상기 알파-튜불린(α-tubulin)은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 단일클론 항체(#3H8, #1B4, #6G4)는 모두 와편모조류인 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 아카시우 상기니아(Akashiwo sanguinea) 및 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans)를 특이적으로 인식하였고, 그 중 #6G4와 #3H8의 두 항체는 규조류인 탈라씨오시라 알레니(Thalassiosira allenii)까지도 인식하였으며, #1B4의 항체는 규조류를 인식하지 못하였다(도 8 참조). 또한, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질을 5 ng까지 인식할 수 있어서, 결합 특이도 및 민감도가 매우 높음을 보여주었다(도 4 참조).

본 명세서에서 사용된 용어, "항체" 및 "면역글로불린(Ig)"은 동일한 구조 특징을 가진 당단백질이다. 항체들은 항원에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 면역글로불린은 항체와 항원 특이성이 결손된 그 외 항체 유사 분자 둘 다를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는 예컨대, 림프계에서 낮은 수준으로 생산되며, 골수종에서 높은 수준으로 생산된다. "항체"는 광의적으로는 자연적으로 형성되는 항체 형태들 및 재조합 항체들, 예컨대 단쇄 항체들, 키메라 및 인간화된 항체들, 다중 특이성 항체들 및 전술한 것들의 단편 및 유도체들을 포함하며, 상기 단편 및 유도체들은 항원 결합 부위를 1곳 이상 가지고 있다. 항체 유도체들은 항체에 접합된 단백질 또는 화학 모이어티를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체"는 본 명세서에서 광의의 의미로 사용되며, 완전히 조합된 항체, 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예, Fab', F'(ab)2, Fv, 단쇄 항체, 디아바디(diabody)), 및 전술한 것을 포함하는 재조합 펩티드를 포괄한다. 본원에서, 단일클론 항체, 또는 그것의 변이체나 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 단쇄 항체 및 모 항체의 항원 결합 기능을 유지하는 그것의 단편을 포함한다.

"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이형사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유결합성 이황화 결합에 의해 중쇄와 연결되어 있으며, 서로 다른 면역글로불린 이소타입의 중쇄에 따라 이황화 결합의 수는 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄에는 일정한 간격의 체인내(intrachain) 이황화 브릿지가 있다. 각각의 중쇄는 다수개의 불변 도메인 다음에 한쪽 말단에 가변성 도메인(VH)를 가지고 있다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변성 도메인(V)과 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지고 있으며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되어 있으며, 경쇄의 가변성 도메인은 중쇄의 가변성 도메인과 정렬되어 있다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄의 가변성 도메인과 중쇄의 가변성 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 생각된다.

본원에 사용되는 용어,“단일클론 항체”는 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 결정기(epitope)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론 항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 융합 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다. 문맥상 별다른 의의가 없는 한 본원에 사용되는 용어, "본 발명에 따른 단일클론 항체" 및 "헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질에 대한 단일클론 항체"는 "와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 특이적인 단일클론 항체" 와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 #3H8, #1B4 및/또는 #6G4일 수 있다. 각각의 단일클론 항체는 본 발명자들에 의해 제조된 융합 세포에서 생산되고, #1B4의 경우 와편모조류에만 특이성을 갖는 에피토프를 가지고 있으며, #3H8 및 #6G4의 경우 와편모조류와 규조류에 특이적인 범용성을 갖는 에피토프를 가지고 있는 것으로 판단된다.

본원에서 사용되는 용어, "에피토프"는 항체를 만들고 항체가 결합하게 되는 항원성 분자의 일부분이다. 그래서, "본 발명에 따른 에피토프"는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 특이적인 단일클론 항체가 결합하는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류의 일부분을 포함할 수 있다. 에피토프는 선형 아미노산 잔기(즉, 선형으로 에피토프 잔기가 순차적으로 교대로 정렬되어 있음), 비선형 아미노산 잔기(즉, 에피토프가 순차적으로 정렬되어 있지 않음), 또는 선형 및 비선형 아미노산 잔기 둘 다를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 특이적인 단일클론 항체에 결합하는 에피토프를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 포함한다. 이들 폴리펩티드는 단일클론 항체에 결합하는 항원(즉, 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류)의 일부분에 해당된다.

본 발명에 따른 단일클론 항체는 전체 면역글로불린과 Fab, F(ab')2, Fv와 같은 단편, 및 항체의 항원 결합 기능을 보유하는 그 외의 것을 포함하는 것이 가능하다. 단일클론 항체는 하나의 항원성 부위, 즉 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 내 특정 에피토프에 대한 높은 특이성을 가지고 있다.

"항체 단편"은 완전한 항체의 일부, 바람직하기로는 항원-결합부 또는 완전한 항체의 가변부를 포함한다. 항체 단편의 예는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로 형성된 다중 특이성 항체들이 있다. 항체를 파파인으로 분해하면, 각각이 단일 항원-결합부를 가지고 있는 두 개의 동일한 항원-결합 단편, 즉, "Fab" 단편과, 쉽게 결정화되는 그것의 능력이 이름에 반영된 "Fc" 단편이 형성된다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위를 가지며 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 얻어진다.

"Fv"는 완전한 항원 인지 부위와 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 2쇄의 Fv 종에서, 이 영역은 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 영역이 비공유 결합으로 단단하게 결부된 이량체로 구성되어 있다. 단쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변성 도메인은 유연한 펩티드 링커에 의해 공유결합으로 연결되어, 경쇄 및 중쇄가 2쇄 Fv 종과 유사한 "이량성" 구조로 조합될 수 있다. 이러한 배위에 의해 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 규정짓게 된다. 총괄적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변성 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포 함하는 절반의 Fv)도, 전체 결합 부위보다는 친화성이 적지만, 항원을 인지하고 항원에 결합하는 능력을 가지고 있다.

또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인과, 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab1 단편은 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 항체 힌지 영역의 하나 이상의 시스테인을 포함하여 몇개의 잔기가 첨가되어 있다는 점에서, Fab' 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'을 나타내는 것이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 단편들 사이에 힌지 시스테인을 가지고 있는 Fab' 단편 쌍으로 만들어졌다.

본 발명에 따른 단일클론 항체 단편들은 전장 항체의 원하는 친화성을 보유하고 있다면 본 발명에 포함된다. 따라서, 본 발명에 따른 단일클론 항체 단편이 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류의 항원에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 이러한 단편은 해당되는 전장 항체와 유사한 특성이 특징이며, 즉 상기 단편은 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 특이적으로 결합할 것이다. 이러한 단편은 "항원-결합성" 단편으로 본 명세서에 언급된다.

항체의 적정 항원-결합성 단편은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그것의 항원-결합성 부위 또는 가변부를 포함한다. 항체 단편의 예로, Fab, F(ab')2, 및 Fv 단편과 단쇄 항체 분자가 있으나, 이로 한정되지 않는다. "Fab"은 경쇄와 중쇄 일부분으로 구성된 면역글로불린의 일가 항원-결합성 단편을 의미한다. F(ab')2는 경쇄 양쪽과 중쇄 양쪽의 일부분을 포함하는 면역글로불린의 이가 항원-결합성 단편을 의미한다. "단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단편으로, 상기 도메인은 폴리펩티드 단일쇄로 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 sFv가 항원 결합에 적합한 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 링커를 더 포함한다.

다른 태양으로, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 다음 단계를 포함하여 제조될 수 있다:

(a) 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에서 항원을 정제하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 항원에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포를 제조하고 이로부터 단일클론 항체를 생산하는 단계;

(c) 상기 (c)단계의 단일클론 항체에서 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 항원에 대한 반응성이 높은 항체를 선별하는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 항체에 대한 특이 항원을 분리정제하는 단계; 및

(e) 상기 (d)단계의 특이 항원을 이용하여 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 단일클론 항체를 분리하는 단계.

상기 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976)European Journal of Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991 등 참조) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 전형적으로, 항원이 함유된 용액으로 마우스를 면역화한다. 면역화는 염수, 바람직하기로는 프레운드의 완전보강체와 같은 보강체 중에 항원-함유 용액을 혼합하거나 또는 유화하고, 이 혼합물 또는 유화액을 비경구 주입함으로써 수행할 수 있다. 당업계에 공지된 모든 면역화 방법을 본 발명의 단일클론 항체를 수득하기 위해 사용할 수도 있다. 동물을 면역화한 다음, 비장(및 선택적으로 수개의 거대 림프절)을 적출하고 단일 세포로 분리한다. 세포 현탁물을 대상 항원이 코팅된 플레이트 또는 웰에 적용함으로써 비장 세포를 스크리닝할 수 있다. 항원에 특이적인 막 결합성 면역글로불린을 발현하는 B세포(즉, 항체 생산 세포)는 플레이트에 결합하여 세정하여 제거되지 않는다. 수득되는 B 세포 또는 분리시킨 모든 비장 세포를 골수종 세포와 융합되게 하여, 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포를 만들고, 이를 선별 배지에서 배양한다. 수득되는 세포를 연속 희석하여 평판 배양하고, 목적 항원에 특이적으로 결합하는 (무관련 항원에는 결합하지 않는) 항체 생산에 대해 분석한다. 이후, 선택된 단일클론 항체(mAb) 분비성 하이브리도마를 시험관내(예, 조직 배양 병 또는 중공 사(hollow fiber) 반응기), 또는 생체 내(마우스의 복수)에서 배양한다. 또한, 단일클론 항체는 RIMMS 기법(Repetitive Immunizations Multiple Site)으로 제조할 수 있다.

아울러, 항체 단편의 경우에도 제조를 위한 다양한 기법이 개발되어 있고, 현재 이들 단편은 재조합 숙주 세포에서 직접적으로 제조할 수 있다. 예컨대, 항체 단편은 전술한 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 대안으로, Fab'-SH 단편은 E. coli로 부터 직접 회수하고 화학적으로 커플링시켜, F(ab')2 단편을 만들 수 있다.

다른 방법으로, 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 F(ab')2 단편을 분리할 수 있다. 그외 항체 단편 제조 기법은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)에서 RNA를 추출하고 이를 이용해 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자를 증폭한 후(도 1 참조) 클로닝 벡터에 삽입하여 플라스미드를 제작하였다. 제작한 클로닝 벡터를 대장균에 형질도입하여 플라스미드에 삽입된 유전자 단편의 염기서열을 분석하여 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자임을 확인하였다(서열번호 1). 상기 클로닝 벡터를 다시 제한효소로 절단하여 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자를 분리하여 발현 벡터에 삽입하여 재조합 유전자를 완성하였다. 완성된 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질 발현 재조합 유전자를 대장균에 형질도입하여 대량 발현시켜 단백질의 크기를 확인하였다(도 3 참조). 상기 단백질을 항원으로 이용해서 면역시킨 생쥐로부터 비장을 떼어내어 B 림프구를 분리하였고, 이것을 별도로 배양한 myeloma 세포(sp2/0)와 융합시키어 하이브리도마 세포를 제작하였으며, 이렇게 얻어진 hybridoma 세포 중에서 항원과 반응하는 항체를 생산하는 세포를 ELISA법으로 확인하였다(표 3 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 ELISA법으로 확인한 하이브리도마 세포에 대하여 추가로 웨스턴 블롯을 수행하여 항체 생산능이 우수한 세포주를 선별하였다. 이를 통해, 세포 배양액 내의 항체 양이 적은 #2E2, #3H7, #3H8, #4C4, #5B11, #6B7등 6종의 세포주를 제외하고, 항체 양이 많은 #1B4, #1D6, #2D11, #3H8, #6G4, #7A3, #7H2등의 7종의 세포주 중에서 특별히 항체 생산능이 뛰어난 세포주 #3H8, #1B4, #6G4를 최종적으로 선별하였다(도 4, 5, 6, 7 참조).

상기 세포주 #3H8, #1B4, #6G4는 각각 한국세포주연구재단의 지원을 받는 한국세포주은행(KCLB)에 수탁번호 KCLRF-BP-00299, KCLRF-BP-00301, KCLRF-BP-00300 으로 기탁하였다(2013. 10. 11).

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 최종적으로 선별된 3개의 세포주 항체의 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 대한 특이성을 확인하기 위하여 3종의 와편모조류 및 1종의 규조류에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과, 3종류의 단일클론 항체(#1B4, #6G4 및 #3H8) 모두 H. triquetra, A. sanguinea 및 P. micans 등 3 종의 와편모조류를 인식하였고, 규조류인 T. allenii의 경우 #6G4 와 #3H8의 두 항체에서는 신호가 검출된 반면, #1B4 항체에서는 신호가 검출되지 않았음을 확인하였다(도 8 참조).

이에 따라, 본 발명에 따른 3종류의 단일클론 항체 중 #1B4는 와편모조류 특이성을 갖는 것으로 판단되며, 나머지 #6G4 및 #3H8는 와편모조류와 규조류 모두를 인식하는 것으로 판단된다. 이에 따라, 상기 각 단일클론 항체들은 서로 다른 epitope를 갖고 있는 것으로 보여지고, 이들을 조합하여 활용하면 더욱 특이성을 높일 수 있을 것으로 예상된다.

다른 양태로, 본 발명은 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에만 특이적인 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포를 제공할 수 있다.

바람직하게는, 상기 융합 세포는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 대한 항체를 생성하는 비장세포와 골수종 세포주를 융합시켜 수득된 세포주로서 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 특이적인 단클로날 항체를 생성할 수 있는 융합 세포를 말한다.

상기 융합 세포는 와편모조류 또는 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질을 검체에서 배양 후 정제하여 생쥐에 면역화하여 얻은 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 제조할 수 있다. 따라서 다른 양태로, 본 발명은 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 대한 항체를 생성하는 비장세포와 골수종 세포주를 융합시키고 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 특이적인 단클로날 융합 세포주를 선별하여 융합 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본원의 구체적인 실시예에서는, 정제된 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질을 4마리의 생쥐(BALB/c)의 복강에 주사하여 면역화시키고, 비장을 적출하여 단일 세포화 한 후, 골수종세포와 반응시켜 융합 세포를 만들었다. 이렇게 만든 융합 세포를 안정한 단클론 세포주가 얻어질 때까지 클로닝을 반복하여 단일클론 항체를 생산하는 융합 세포주를 제조하였다.

상술한 융합 세포에서 생산된 본원 발명에 따른 단일클론 항체는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 검출을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 단일클론 항체(#1B4, #6G4 및/또는 #3H8)를 포함하는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 검출용 조성물 및 이를 이용한 진단 키트를 제공할 수 있다.

다른 양태로, 본 발명은 상기 단일클론 항체를 포함하는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 검출용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 단일클론 항체, 바람직하게는 단일클론 항체 #1B4, #6G4 및/또는 #3H8는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류의 항원을 직접 검출하는 데에 사용될 수 있다.

본원에서 사용한 용어, "검출"은 개체의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상, 상기 검출은 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류의 존재 또는 존재양을 확인하는 것이다.

다른 양태로, 본 발명은 상기 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 진단용 조성물을 포함하는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 진단 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다. 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay: ICA)을 이용한 진단은 그 신속함과 간편함 때문에 래피드 테스트(rapid test)라고도 불리는데, 이는 검체의 혈청 중에 들어 있는 항체가 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)에 결합된 표식자 항원(tracer antigen)과 반응한 다음 모세관 현상에 의해 니트로 셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인의 미세구멍(micropore)을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 포획체(capture)와 결합하여 발색 띠를 형성함으로써 양성 및 음성을 육안으로 판별하는 방법이다.

본 발명의 상기 진단 키트에서, 항원-항체 복합체는 색채입자결합법으로 검출하며, 색채입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함한다. 본 발명에서는 바람직하게 금 콜로이드를 이용한다. 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 진단 키트에서 콜로이드성 금 입자와 결합하는 축합체 (conjugate)로는 항 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 단일클론 항체(#1B4, #6G4 및/또는 #3H8)를 이용한 것이다.

다른 양태로, 본 발명은 상기 진단 키트를 이용하여 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류 검출을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로 상기 방법은, a) 생물학적 시료를 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 단일클론 항체와 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 항체의 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류과의 결합을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 방법은 생물학적 시료를 본 발명의 상기 진단 키트의 샘플 적하부에 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류를 포함하는 것으로 추정되는 채취된 시료(예를 들어, 선박평형수)를 용액과 섞어 흡수되도록 방치한 후, 반응이 종료된 진단 키트의 검사선의 유무에 따라 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류의 존재 여부를 판단하는 방법이다.

본원에서 사용한 용어, “생물학적 시료”는 와편모조류 또는 와편모조류 및 규조류를 포함하는 것으로 예상되거나 검사하려는 해수를 포함한 선박평형수 등을 말하며, 본 발명에서는 편의상 “시료” 또는 “샘플”이라고 지칭하기도 한다. 상기 생물학적 시료는 본 발명의 진단 키트의 샘플 적하부에 접촉하기 전에 희석하여 사용할 수 있다.

이러한 본 발명에 따른 와편모조류에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 선박평형수에 의해 이동될 수 있는 해양미세조류 중에 적조를 일으켜 연안 생태계를 위협하는 와편모조류인 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 아카시우 상기니아(Akashiwo sanguinea), 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans)를 특이적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 와편모조류 뿐만 아니라 탈라씨오시라 알레니(Thalassiosira allenii)와도 특이적으로 결합함으로서, 와편모조류와 함께 규조류(diatom)까지 함께 검출할 수 있어서, 선박평형수 내의 다양한 미생물을 검출하기 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 PCR로 증폭한 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자를 아가로즈 젤로 확인한 사진이다.
도 2는 pGEM-T Easy vector 내에 삽입되어 있는 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra) 유전자를 Ndel 및 EcoRⅠ 제한효소로 처리한 후 아가로즈 젤로 확인한 사진이다(화살표: 플라스미드에서 절단되어 나온 헤테로캅사 트리퀘트라의 알파-튜불린 유전자).
도 3은 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 재조합 유전자가 형질도입된 대장균을 정상 상태 및 변형된 상태로 파쇄한 후, 각각에 대한 세포파쇄액, 1차 세척액, 수세한 용액 및 단백질 용출 용액을 10% SDS-PAGE 젤에 전기영동하여 Coomassie 염색을 하여 알파-튜불린 재조합 단백질을 확인한 사진이다(화살표: 알파-튜불린 크기의 밴드);
M : protein size marker,
1 : cell lysate urea total 40㎖ 중 10㎕,
2 : cell lysate urea supernatant 40㎖ 중 10㎕,
3~5 : flow through 80㎖ 중 10㎕ ,
6~9 : wash 20㎖ 중 10㎕,
10~13 : elution 15㎖ 중 10㎕,
14-17 : elution 25㎖ 중 10㎕,
18 : elution 310㎖ 중 10㎕.
도 4는 한계희석법에 의한 1차 및 2차 스크리닝(screening)을 통하여 선별된 20개의 세포주에 대한 웨스톤 블롯 분석(Western blot analysis) 결과를 나타내는 것으로, 세포 배양액 내의 항체 양이 적은 #2E2, #3H7, #3H8, #4C4, #5B11, #6B7등 6종의 세포주를 확인한 사진이다(×: 항체 양이 적은 6종의 세포주).
도 5는 세포 배양액 내 항체 양이 많은 것으로 선별된 7종의 세포주(#1B4, #1D6, #2D11, #3H8, #6G4, #7A3, #7H2)에 대한 추가 웨스톤 블롯 분석(Western blot analysis) 결과를 나타내는 것으로, 항체 생산능이 뛰어난 세포주 #3H8, #1B4, #6G4를 확인한 사진이다;
1 : #1D6,
2 : #3H8,
3 : #7A3,
4 : #1B4,
5 : #6G4,
6 : #2D11,
7 : #7H2.
도 6은 하이브리도마 세포주 #1B4를 주입한 생쥐로부터 채취한 복수에서의 항체 생성량을 측정한 것으로, 대조군으로 이용된 BGG 단백질의 양과 비교하여 생성된 항체의 농도는 약 3 mg/ml인 것을 확인한 사진이다;
1 : BGG 1㎍,
2 : Ascites 1㎕,
3 : Ascites 1/2 dilution 1㎕,
4 : Ascites 1/4 dilution 1㎕,
5 : Ascites 1/8 dilution 1㎕.
도 7은 하이브리도마 세포주 #3H8, #1B4, #6G4에 대한 IgG 정제 이후의 Anti-α-tubulin 을 확인한 사진이다. .
1 : BGG 0.5㎍,
2 : BGG 1.0㎍,
3 : Anti-a-tubulin (#1B4) 0.5㎍,
4 : Anti-a-tubulin (#1B4) 1.0㎍,
5 : Anti-a-tubulin (#1B4) 2.0㎍,
6 : Anti-a-tubulin (#6G4) 0.5㎍,
7 : Anti-a-tubulin (#6G4) 1.0㎍,
8 : Anti-a-tubulin (#6G4) 2.0㎍,
9 : Anti-a-tubulin (#3H8) 0.5㎍,
10 : Anti-a-tubulin (#3H8) 1.0㎍,
11 : Anti-a-tubulin (#3H8) 2.0㎍.
도 8은 본 발명의 항체를 이용한 와편모조류 3종 및 규조류 1종 추출물에 대한 웨스턴 블롯분석을 수행한 젤의 사진이다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 헤테로캅사 트리퀘트라( Heterocapsa triquetra )의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자 클로닝 및 확인

본 발명자들은 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자를 클로닝 벡터에 클로닝하여 플라스미드를 제작하였다.

구체적으로, 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 RNA를 Thanh 등(Mol. Biotechnol. 43: 148-153, 2009)의 방법에 의해 추출하였다. 이렇게 수득한 RNA 1㎍을 주형으로 하여 oligo-d(T)₁₅ 프라이머 및 Reverse Transcription System(Promega, USA)을 이용해 first-strand cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA에서 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자를 증폭하기 위하여 GenBank/EMBL/DDBJ에 등록되어 있는 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자 염기서열을 확인하여 포워드 프라이머 5'-CGT AGC CAT TTT GGC TCA AGC-3'(서열번호 3) 및 리버스 프라이머 5'-CCA TCC ATC ACC TGC GGC GTG-3'(서열번호 4)를 디자인하고 합성하였다.

헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자의 증폭을 위해 10X PCR 버퍼 4 ㎕, 주형 DNA(상기에서 합성한 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 cDNA) 10 ㎕(5 ng), dNTP 2 ㎕, 상기에서 합성한 포워드 프라이머 1 ㎕(10 μM), 리버스 프라이머 1 ㎕(10 μM), Taq 중합효소 0.5㎕ 및 DDW 21.5 ㎕의 조성으로, 반응 전 95 ℃에서 10분 전변성, [95 ℃에서 30초변성, 50-55 ℃에서 30초간 붙임, 72 ℃에서 30초간 연장]을 35회 반복한 다음, 72℃에서 10분 동안 후연장하는 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 결과 얻어진 증폭된 유전자 단편을 아가로즈 젤에 전기영동하였으며(도 1), 목적한 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자의 길이와 일치하는 밴드를 Qiagen사의 Gel extraction kit을 이용하여 아가로즈 젤로부터 추출하였다. 추출한 유전자 단편을 pGEM-T Easy 벡터(Promega, USA)에 삽입하여 플라스미드를 제작하였다.

또한, 상기 제작한 플라스미드를 대장균에 형질전환하여 이를 37 ℃에서 17시간 동안 배양하였다. 배양한 형질전환된 대장균들로부터 플라스미드를 추출하여정제하였으며, 상기 정제된 플라스미드에 삽입된 유전자 단편의 염기서열을 ABI 3100 DNA Sequencing System(Applied Biosystems Inc., USA)을 이용하여 분석하였고(서열번호 1), 이로부터 아미노산 서열을 유추하였다(서열번호 2).

그 결과, pGEM-T Easy 벡터 내에 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자가 삽입되어 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 2 : 재조합 유전자의 제조

본 발명자들은 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자 단편을 단백질로 발현시키기 위하여 발현 벡터인 pET-17b에삽입하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제작한 pGEM-T Easy 벡터 내에 삽입되어 있는 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra) 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자를 분리하기 위하여 Ndel 및 EcoRI 제한효소로 상기 플라스미드를 처리하였다. 제한 효소를 처리한 플라스미드는 아가로즈 젤에 전기영동되었으며, 제한 효소에 의해 절단된 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 유전자 단편을 확인할 수 있었다(도 2). 분리된 유전자 단편을 Qiagen사의 Gel extraction kit을 이용하여 아가로즈 젤로부터 추출 및 정제하였으며, 정제된 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra) 알파-튜불린(α-tubulin)유전자 단편을 발현 벡터인 pET-17b에 삽입하여 재조합 유전자를 완성하였다.

실시예 3 : 단백질 발현 및 정제

본 발명자들은 단일클론항체 생산을 위한 항원으로 사용하기 위하여 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질을 발현시켜 정제하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2에서 제작한 재조합 유전자를 대장균에 형질도입하여 목적 단백질의 대량 발현을 유도하였다. 발현된 단백질을 확인하기 위해 상기 형질전환된 대장균을 정상 상태 및 변성된 상태로 파쇄한 후, 각각에 대한 세포 파쇄액, 1차 세척액, 수세한 용액 및 단백질을 용출한 용액을 10% SDS-PAGE 젤에 전기영동하였다. 전기영동하여 단백질들이 분리된 젤을 0.25% Coomassie brilliant blue R-250으로 2시간 동안 염색한 후, 여분의 염색액은 탈색용액(destaining solution-50% methanol, 7% acetic acid)으로 제거하였다. Coomassie brilliant blue R-250으로 단백질들이 염색된 상기 젤에서 53.4 KDa 크기의 밴드를 확인하였으며, 이것이 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질임을 알 수 있었다(도 3).

아울러, 상기 확인한 밴드에 속한 단백질들을 정제하여 약 9.6 mg의 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질을 얻었고, 이들을 50 mM의 NaH₂PO₄ (pH 8.0), 300 mM NaCl 및 10% glycerol에 보관하였으며, 이를 단일클론항체 생산을 위한 항원으로 활용하였음

실시예 4 : 단일클론 항체 제작

본 발명자들은 재조합 유전자 기술로 발현 및 정제한 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질을 이용하여, 융합 세포를 제작함으로서, 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra) 유래 알파-튜불린(α-tubulin)에 대한 단일클론 항체를 수득하였다.

구체적으로, 상기 실시예 3에서 제작한 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질을 항원으로 adjuvant(Sigma)와 혼합해서 4마리의 생쥐(BALB/c)에 주사하고, 상기 생쥐의 혈액을 채취하여 항체 생성여부를 ELISA법으로 확인하였다. 상기 항원과 adjuvant의 혼합액을 2회 면역 후, 항체의 역가(1:10,000)가 적정하게 증가하여 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질이 면역된 생쥐로부터 비장을 떼어내어 B 림프구를 분리하였고, 이것을 별도로 배양한 myeloma 세포(sp2/0)와 융합시키었다. 그리고, 융합된 세포를 hypoxanthin, aminopterine, thymidine이 첨가되어 있는 배지(HAT medium)에서 배양하여 myeloma와 B 림프구만이 융합된 하이브리도마(hybridoma) 세포를 선택적으로 선별하여 배양하였다. 이렇게 얻어진 hybridoma 세포 중에서 항원과 반응하는 항체를 생산하는 세포를 ELISA법을 이용하여 확인하였다. 이때, ELISA 양성반응인 세포를 한계희석법(limiting dilution method)을 이용하여 양성세포와 음성세포를 분리하는 과정(cloning)을 반복함으로서, 항원에 반응하는 항체를 생산하는 단일클론 세포를 생산하였다.

실시예 4-1 : 혈청 내 항체의 역가 측정

상기한 바와 같이, 생쥐 4마리들을 대상으로 최초 면역반응을 진행한 다음 채혈한 혈청에 대하여 항체의 형성 및 그 역가를 ELISA법으로 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 1(최초 면역반응 이후 1차 혈청의 역가)에 나타난 바와 같다.

Sample	Dilution factor	#1	#2	#3	#4
pre-Immune	1:100	0.132	0.065	0.091	0.104
Test serum	1:100	2.062	2.117	2.124	2.005
	1:1000	2.215	2.175	2.146	2.103
	1:5000	2.239	2.040	1.976	2.025
	1:10000	2.090	2.015	1.833	2.024
	1:50000	1.764	1.676	1.234	1.793
	1:100000	1.555	1.480	0.870	1.640

상기와 같이 최초 면역반응을 유도한 4마리의 생쥐에 대하여 추가로 면역반응을 진행하였고, 추가 면역반응 이후 채혈한 혈청을 대상으로 항체의 형성 및 그 역가를 ELISA법으로 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 2(추가 면역반응 이후 2차 혈청의 역가)에 나타난 바와 같다.

Sample	Dilution factor	#2	#3
pre-Immune	1:100	0.095	0.094
Test serum	1:100	2.470	2.559
	1:1000	2.554	2.576
	1:5000	2.531	2.536
	1:10000	2.504	2.472
	1:50000	2.311	2.194
	1:100000	2.113	1.990

즉, 상기 표 2에 나타난 바와 같이 최초 면역반응을 진행한 2마리의 생쥐(#2, #3)에서, 1차 혈청에서보다 역치가 높아진 것을 확인할 수 있다. 다른 2마리의 개체(#1, #4)에 대해서도 추가 면역 및 추가 fusion을 진행하여 유사한 결과를 얻었다.

실시예 4-2 : 한계희석법(limiting dilution method)에 의한 하이브리도마 세포의 선별

상기한 바와 같이 얻어진 hybridoma 세포 중에서 항원과 반응하는 항체를 생산하는 세포를 ELISA법을 이용하여 1차로 확인하였고, 그 결과 항원과 특이적으로 반응하는 56개의 클론을 1차로 선정하였으며, 이들을 24구 세포배양용기에 옮겨 재확인하였다.

1차로 선정한 56개의 클론에 대하여 2차 스크리닝(screening)을 하였고, 그 결과 표 3에 나타난 바와 같이 항원과 반응하는 positive clone 20개를 2차로 선정하였다. 표 3에서 2차로 선정된 20개의 클론은 볼드체(bold)로 굵게 표시하였다.

a-Tubulin
Clone No.	OD	Clone No.	OD
1B4	2.403	3 H7	0.788
1 D6	2.441	3 H8	2.196
1 G1	2.269	3H10	0.152
1G6	0.139	4 C4	1.792
2A3	0.192	4 C12	2.426
2B9	0.156	4 D8	2.301
2C12	0.115	5A2	2.115
2 E2	0.801	5B6	2.450
2E9	0.174	5B11	0.714
2G8	0.136	6A11	0.103
2GH8	0.133	6A12	0.097
2H9	0.128	6B7	0.599
2H11	0.106	6F4	2.220
3A12	0.109	6F11	1.918
3B10	0.159	6 G4	1.997
3B12	0.117	6 G6	1.738
3C6	0.156	6H6	0.118
3C8	0.148	7A1	0.105
3D5	0.127	7A3	2.270
3D8	0.115	7B4	0.111
3D11	0.111	7B10	0.114
3D12	0.132	7C6	0.107
3E10	0.137	7D2	0.124
3G2	0.148	7 D7	2.457
3G6	0.143	7 H2	2.392

실시예 4-3 : 웨스턴 블롯(western blot)에 의한 하이브리도마 세포의 선별

상기 실시예 4-2를 통하여 선별한 하이브리도마 세포에 대하여 추가로 웨스턴 블롯을 수행하여 항체 생산능이 우수한 세포주를 선별하였다.

가) SDS-PAGE

SDS-PAGE는 재조합기법을 통해 발현시킨 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질 5 ng에 SDS 샘플 버퍼를 각각 넣고 10% SDS-PAGE 젤에 로딩하여 전기영동을 실시한 후에, 0.25% Coomassie brilliant blue R-250으로 2시간 동안 염색하고, 탈색용액(destaining solution-50% methanol, 7% acetic acid)으로 여분의 염색액을 제거한 다음, 단백질의 존재를 확인하였다.

나) Western blot analysis

상기한 바와 같이 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra)의 알파-튜불린(α-tubulin) 단백질 5 ng으로 SDS-PAGE(10%)를 실시한 후, 트랜스퍼 키트(Hoefer Scientific Instruments)를 사용하여 4 ℃에서 1시간 30분 동안 60 V로 PVDF 막(GE healthcare)에 트랜스퍼시켰다. 막으로 옮겨간 단백질들을 폰슈(Ponceau) S로 염색하여 단백질의 존재 여부를 확인한 후 단백질이 트랜스퍼된 막을 1X TBST 버퍼(40 mM Tris, 300 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5% Tween20)로 3회 수세하였으며 이를 4% 스킴밀크로 차단(blocking)하였다. 그 후, 일차 항체로 상기 실시예 4-2를 통하여 선별한 하이브리도마 세포 20개 각각이 포함된 용액에 상기 막을 1시간 동안 반응시킨 다음 1X TBST로 3회 수세 하였으며, 그 다음에 1:8000으로 희석된 mouse IgG-HRP(Santa Cruz)를 이차 항체로 사용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 1X TBST로 3회 수세 한 후 ECL plus kit(GE healthcare)를 사용하여 발광시킨 뒤 필름에 감광시켜 발색을 확인하였다.

그 결과, 세포 배양액 내의 항체 양이 적은 #2E2, #3H7, #3H8, #4C4, #5B11, #6B7등 6종의 세포주를 제외하였다(도 4 참조). 그리고, 항체 양이 많은 것으로 선별된 세포주 중 #1B4, #1D6, #6G4, #7A3, #7H2등 5개의 세포주를 대상으로 1차 cloning을 수행하였고, #1B4, #1D6, #7A3, #7H2등의 4개 positive clone들에 대해 2차 cloning 실시하여 세포주를 선별한 후 cloning을 종료하였다. #6G4에 대해서는 3차 cloning 진행하여 24 well에 expansion 시키고 cloning을 종료하였다. 추가로 확인된 #2D11, #3H8에 대해서는 1, 2, 3차 cloning을 통해 적절한 세포주을 선별하여 cloning을 종료하였다.

이를 통하여, #1B4, #1D6, #2D11, #3H8, #6G4, #7A3, #7H2등의 7종의 hybridoma를 선별하였고, 선별된 7종의 hybridoma의 항체 생산능을 상술한 바와 같은 western blot 방법으로 확인하였다(도 5 참조). Western blot 결과 항체 생산능이 뛰어난 세포주 #3H8, #1B4, #6G4를 최종적으로 선별하였다.

그리고, 최종적으로 선별된 #3H8, #1B4, #6G4 세포주들을 mouse에 주사하여 항체의 대량 생산을 유도하였다. 구체적으로는, 10주령의 BALB/c mouse에 pristine을 주사하고, 이것의 복강에 상기 최종적으로 선별된 3종의 세포주를 각각 주사하였다. 이렇게 생성된 ascite를 복강에서 채취하였고, 3000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 얻은 다음, 이들을 SDS-PAGE법으로 생성된 항체의 양을 측정하였다(도 6 참조).

대조군으로 이용된 BGG 단백질의 양과 비교하여, 생성된 항체의 농도는 약 3 mg/ml로 추정되었고, 생성된 복수를 이용하여 추가 정제를 수행하였다. #1B4이외의 #3H8 및 #6G4에 대해서도 동일한 과정을 진행하였으며, Ascites(#1B4, #3H8 및 #6G4)들을 대상으로 IgG 정제를 수행하였다(도 7 참조).

최종적으로 Anti-a-tubulin (#1B4) 20 mg, Anti-a-tubulin (#6G4) 14 mg, Anti-a-tubulin (#3H8) 20 mg을 본 발명에 따른 단일클론 항체로 얻었으며, 각각의 농도는 5mg/ml였다.

실험예 1 : 단일클론 항체의 결합 특이성 및 범용성 확인

실험예 1-1 : 와편모조류 3종 추출물 시료 준비

본 발명에 따른 단일클론 항체의 결합 특이성 및 범용성을 확인하기 위하여, 와편모조류 3종 및 규조류 1종의 추출물을 준비하였다.

구체적으로, 생산된 항체의 활용성을 검증하고자, 상기에서 수득한 혈청을 이용하여 와편모조류인 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 아카시우 상기니아(Akashiwo sanguinea) 및 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans)에 대한 항체의 특이성과 규조류인 탈라씨오시라 알레니(Thalassiosira allenii)에 대한 항체의 범용성을 확인하기 위해, 배양한 상기 와편모조류 3종 및 규조류 1종을 현미경 검경을 통해 세포 수를 결정한 후(약 300.000 세포), 원심분리하였다. 상기 세포와 세포 양의 2배의 PRO-PREP TM protein extraction buffer(iNtRON)를 glass homogenizer에 넣고 세포를 완전히 파쇄하였다. 파쇄된 조직액은 13000 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하고 상등액을 취하여 새로운 튜브로 옮겨졌다.

실험예 1-2 : 와편모조류에 대한 Western blot 분석

상기 실험예 1-1에서 준비한 와편모조류 3종(H. triquetra , A. sanguinea 및 P. micans)과 규조류 1종(T. allenii)으로부터 정제 및 적정된 추출물 시료를 이요하여, 본 발명에 따른 단일클론 항체의 특이성 및 범용성을 확인하였다.

구체적으로, 와편모조류인 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 아카시우 상기니아(Akashiwo sanguinea) 및 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans) 3종과 규조류인 탈라씨오시라 알레니(Thalassiosira allenii) 1종의 추출물 시료에 포함되어 있는 단백질을 확인하기 위하여, 상기 추출물 시료에 SDS 샘플 버퍼를 각각 넣고 10% SDS-PAGE 젤에 로딩하여 전기영동을 실시한 후에 0.25% Coomassie brilliant blue R-250으로 2시간 동안 염색하고, 탈색용 액(destaining solution-50% methanol, 7% acetic acid)으로 제거하여 단백질의 존재를 확인하였다.

단백질의 존재를 확인한 후, 상기 시료들을 총 단백질 양이 약 5㎍에 해당하는 양으로 희석하였다. 이와 같이 희석한 시료를 10% SDS-PAGE 젤에 로딩하여 전기영동을 실시한 후 분리된 단백질들을 트랜스퍼 키트(Hoefer Scientific Instruments)를 사용하여 4 ℃에서 1시간 30분 동안 60 V로 PVDF 막(GE healthcare)에 트랜스퍼시켰다. 막으로 옮겨간 단백질들을 폰슈(Ponceau) S로 염색하여 단백질의 존재 여부를 확인한 후 단백질이 트랜스퍼된 막을 1X TBST 버퍼(40 mM Tris, 300 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5% Tween20)로 3회 수세하였으며 이를 4% 스킴밀크로 차단(blocking)하였다. 그 후, 일차 항체로 본 발명에서 제작한 3종류의 단일클론 항체(#1B4, #3H8 및 #6G4) 각각을 1:2500으로 희석한 용액에 상기 막을 1시간 동안 반응시킨 다음 1X TBST로 3회 수세 하였으며, 그 다음에 1:5000으로 희석된 goat anti-rabbit IgG1-HRP(Santa Cruz)를 이차 항체로 사용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 1X TBST로 3회 수세 한 후 ECL plus kit(GE healthcare)를 사용하여 발광시킨 뒤 필름에 감광시켜 본 발명에서 제작한 항체의 와편모조류에 대한 검출 여부를 확인하였다.

그 결과, 3종류의 단일클론 항체(#1B4, #6G4 및 #3H8) 모두 H. triquetra, A. sanguinea 및 P. micans 등 3 종의 와편모조류를 인식하였다. 규조류인 T. allenii의 경우 #6G4 와 #3H8 의 두 항체에서는 신호가 검출된 반면, 단일클론항체 #1B4에서는 검출되지 않았다(도 8 참조).

본 발명에 따른 3종류의 단일클론 항체 중 #1B4는 와편모조류 특이성을 갖는 것으로 판단되며, 나머지 #6G4 및 #3H8는 와편모조류와 규조류 모두를 인식하는 것으로 판단된다. 이에 따라, 상기 각 단일클론 항체들은 서로 다른 epitope를 갖고 있는 것으로 보여지고, 이들을 조합하여 활용하면 더욱 특이성을 높일 수 있을 것으로 예상된다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

한국세포주연구재단 KCLRFBP00300 20131011 한국세포주연구재단 KCLRFBP00299 20131011 한국세포주연구재단 KCLRFBP00301 20131011

<110> Korea Institute of Ocean Science & Technology <120> A Dinoflagellate-specific monoclonal antibodies for the detection of dinoflagellate and the detecting kits comprising the same <130> P13-0002 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1362 <212> DNA <213> Heterocapsa triquetra <400> 1 atgcgtgagg cgctttgcat ccacattggc caagccggag tgcagatcgg taacgcgtgc 60 tgggagctgt tctgcctgga gcacggcatc cagccggatg gtcagatgcc cagcgacaag 120 accattggcg gcggcgacga tgccttcaac accttcttca gcgagacggg tgcgggcaag 180 cacgtgccgc gctgcgtcat ggtggatctg gagcccacgg tggtcgatga ggtgcgcacg 240 ggcacctacc gccagctgtt ccacccggag cagctcatct ccggcaagga ggacgctgcg 300 aacaacttcg cgcgcggcca ctacaccatt ggcaaggaga tcgtggacct ggtgctggac 360 cgcatccgca agctcgcgga caactgcacg ggtctgcagg gcttcatgat ctacaacgcg 420 gtgggtggcg gcaccggctc cggccttggc tgcctgatgc tggagcgcct gtccgtggac 480 tacggcaaga agtcgaagat ttcgttcaca gtctgggcct gcccgcaggt ggccaccgca 540 gttgtggagc cgtacaacac ggtgctctgc gtgcactcgc ttctggagca cacggatgtg 600 acgatcatgt acgacaacga ggccctgtac gacatctgcc gcaggaacct ggacattgag 660 cgccccacgt acacgaacct gaaccgtctg ctgggccaga tcatctcttc tctgacggcc 720 tcgctgcgct tcgacggtgc cctgaacgta gatattactg agttccaaac gaaccttgtg 780 ccgtacccac gcatccactt catgctttcg agttacgcgc cgatcatctc tgcggagaag 840 gcataccacg agcagctctc cgtggcggag atcacgatga gcgtcttcga gccagcctcg 900 atgttcgtga agtgcgaccc gcgccatggc aagtacatgg cgtgctgtat gatgtaccgc 960 ggcgatgtgg tgccgaagga cgtgaacgcc tccgtggcca cgatcaagac gaagcgcacg 1020 atccagttcg tggactggtg cccgaccggc ttcaagtgtg gcatcaatta ccagccgccg 1080 acggtggtgc ctggcggtga cctggcgaag gtgatgcgcg cgtgctgcat gatcagcaac 1140 tctacggcga ttgcggaggt tttctcgcgc atcgaccaca agttcgacct catgtactcg 1200 aagcgcgcct tcgtccactg gtacgtcggc gagggcatgg aggagggcga gttctccgag 1260 gcgcgcgagg acctggcggc cctggagaag gactacgagg aggtcggcat cgagacggcc 1320 gagggcgagg gcgaggagga gggctatggc gacgagttct ga 1362 <210> 2 <211> 453 <212> PRT <213> Heterocapsa triquetra <400> 2 Met Arg Glu Ala Leu Cys Ile His Ile Gly Gln Ala Gly Val Gln Ile 1 5 10 15 Gly Asn Ala Cys Trp Glu Leu Phe Cys Leu Glu His Gly Ile Gln Pro 20 25 30 Asp Gly Gln Met Pro Ser Asp Lys Thr Ile Gly Gly Gly Asp Asp Ala 35 40 45 Phe Asn Thr Phe Phe Ser Glu Thr Gly Ala Gly Lys His Val Pro Arg 50 55 60 Cys Val Met Val Asp Leu Glu Pro Thr Val Val Asp Glu Val Arg Thr 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Arg Gln Leu Phe His Pro Glu Gln Leu Ile Ser Gly Lys 85 90 95 Glu Asp Ala Ala Asn Asn Phe Ala Arg Gly His Tyr Thr Ile Gly Lys 100 105 110 Glu Ile Val Asp Leu Val Leu Asp Arg Ile Arg Lys Leu Ala Asp Asn 115 120 125 Cys Thr Gly Leu Gln Gly Phe Met Ile Tyr Asn Ala Val Gly Gly Gly 130 135 140 Thr Gly Ser Gly Leu Gly Cys Leu Met Leu Glu Arg Leu Ser Val Asp 145 150 155 160 Tyr Gly Lys Lys Ser Lys Ile Ser Phe Thr Val Trp Ala Cys Pro Gln 165 170 175 Val Ala Thr Ala Val Val Glu Pro Tyr Asn Thr Val Leu Cys Val His 180 185 190 Ser Leu Leu Glu His Thr Asp Val Thr Ile Met Tyr Asp Asn Glu Ala 195 200 205 Leu Tyr Asp Ile Cys Arg Arg Asn Leu Asp Ile Glu Arg Pro Thr Tyr 210 215 220 Thr Asn Leu Asn Arg Leu Leu Gly Gln Ile Ile Ser Ser Leu Thr Ala 225 230 235 240 Ser Leu Arg Phe Asp Gly Ala Leu Asn Val Asp Ile Thr Glu Phe Gln 245 250 255 Thr Asn Leu Val Pro Tyr Pro Arg Ile His Phe Met Leu Ser Ser Tyr 260 265 270 Ala Pro Ile Ile Ser Ala Glu Lys Ala Tyr His Glu Gln Leu Ser Val 275 280 285 Ala Glu Ile Thr Met Ser Val Phe Glu Pro Ala Ser Met Phe Val Lys 290 295 300 Cys Asp Pro Arg His Gly Lys Tyr Met Ala Cys Cys Met Met Tyr Arg 305 310 315 320 Gly Asp Val Val Pro Lys Asp Val Asn Ala Ser Val Ala Thr Ile Lys 325 330 335 Thr Lys Arg Thr Ile Gln Phe Val Asp Trp Cys Pro Thr Gly Phe Lys 340 345 350 Cys Gly Ile Asn Tyr Gln Pro Pro Thr Val Val Pro Gly Gly Asp Leu 355 360 365 Ala Lys Val Met Arg Ala Cys Cys Met Ile Ser Asn Ser Thr Ala Ile 370 375 380 Ala Glu Val Phe Ser Arg Ile Asp His Lys Phe Asp Leu Met Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Arg Ala Phe Val His Trp Tyr Val Gly Glu Gly Met Glu Glu Gly 405 410 415 Glu Phe Ser Glu Ala Arg Glu Asp Leu Ala Ala Leu Glu Lys Asp Tyr 420 425 430 Glu Glu Val Gly Ile Glu Thr Ala Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly 435 440 445 Tyr Gly Asp Glu Phe 450 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 cgtagccatt ttggctcaag c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 ccatccatca cctgcggcgt g 21

Claims (15)

1. 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 아카시우 상기니아(Akashiwo sanguinea) 및 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans)에 특이적인 단일클론 항체를 생산하는, 하이브리도마 세포주(수탁번호 KCLRF-BP-00299).
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 하이브리도마 세포주(수탁번호 KCLRF-BP-00299)는 탈라씨오시라 알레니(Thalassiosira allenii)에 특이적인 단일클론 항체를 생산하는, 하이브리도마 세포주(수탁번호 KCLRF-BP-00299).
   
   
3. 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 아카시우 상기니아(Akashiwo sanguinea) 및 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans)에 특이적인 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(수탁번호 KCLRF-BP-00300).
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 하이브리도마 세포주(수탁번호 KCLRF-BP-00300)는 탈라씨오시라 알레니(Thalassiosira allenii)에 특이적인 단일클론 항체를 생산하는, 하이브리도마 세포주(수탁번호 KCLRF-BP-00300).
   
   
5. 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 아카시우 상기니아(Akashiwo sanguinea) 및 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans)에 특이적인 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(수탁번호 KCLRF-BP-00301).
   
6. 제1항 또는 제2항에 따른 하이브리도마 세포주로부터 생산된 단일클론 항체.
   
7. 제6항에 따른 단일클론 항체 또는 상기 항체의 항원결합부위가 포함된 단편을 포함하는 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 아카시우 상기니아(Akashiwo sanguinea), 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans) 및 탈라씨오시라 알레니(Thalassiosira allenii) 검출용 조성물.
   
8. 제5항에 따른 하이브리도마 세포주로부터 생산된 단일클론 항체.
   
9. 제8항에 따른 단일클론 항체 또는 상기 항체의 항원결합부위가 포함된 단편을 포함하는 헤테로캅사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 아카시우 상기니아(Akashiwo sanguinea) 및 프로로센트럼 미칸스(Prorocentrum micans) 검출용 조성물.
   
   
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