CN102772483A - 微波辅助双水相-反胶束萃取分离苦参生物碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了微波辅助双水相-反胶束萃取分离苦参生物碱的方法，以苦参或山豆根药材为原料，利用微波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系进行萃取，苦参生物碱在双水相间分配萃取到上相，得到初步纯化；再利用SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束体系对苦参生物碱选择性萃取，得到杂质含量低的苦参生物碱粗品，然后分离纯化得苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱。本发明方法将反胶束萃取与微波辅助萃取、双水相萃取技术联用，实现优势互补，方法简单、快速有效、无污染对设备要求低，易于连续生产和放大，萃取得到的苦参生物碱，纯度可达90.92%以上，其收率高达55.38mg/g；本发明分离纯化得到的苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱单体纯度高，达94%以上，且有机溶剂残留少。

Description

微波辅助双水相-反胶束萃取分离苦参生物碱的方法

技术领域

本发明涉及一种生物碱的提取方法，尤其涉及微波辅助双水相-反胶束萃取分离苦参生物碱的方法。

背景技术

目前，双水相体系（ATPS）用于中草药有效成分分离纯化的研究报道还较少。林强等利用乙醇/磷酸氢二钾的新型体系萃取甘草中的有效成分，对溶剂、盐的种类等因素进行考察，优化了萃取条件，在最优萃取条件下，甘草酸盐在两相中的分配系数可以达到12.8，收率高达98.3%，方法简单易行。此外，ATPS也被用于黄酮类化合物的提取分离中。张春秀等采用PEG/磷酸盐体系对银杏叶浸提液中的黄酮类化合物进行了分离富集，并对PEG的分子量及浓度，磷酸盐的浓度以及温度对萃取的影响。最终选择了PEG1500，并在25℃下进行萃取，黄酮类化合物的萃取率可达到98.2%。彭胜等采用PEG4000/葡聚糖40000（D40）研究了萃取分离杜仲黄酮的工艺条件，考察了ATPS的形成、相图，以及各影响因素对杜仲黄酮萃取效果的影响。结果表明当质量分数为11%的PEG4000和质量分数为8%的D40最佳萃取工艺条件下，杜仲黄酮的萃取率为75.82%。不难发现，用于萃取纯化分离天然产物有效成分的ATPS多为高聚物/高聚物或高聚物/无机盐等传统的双水相体系，采用低分子量有机溶剂/无机盐的新型双水相体系萃取生物碱类有效成分的研究还未见有报道。

反胶束体系，其中的表面活性剂的极性头排列在一起形成一个极性内核，该核溶解了水后形成“水池”，可通过静电作用力选择性的增溶带异种电荷的物质，且可使目标物与外界的有机溶剂隔绝开来，萃取环境温和，可保持生物活性物质的活性。因此广泛应用于蛋白质和氨基酸等极性物质的分离纯化。

在国外，目前反胶束还是主要用于蛋白质和氨基酸以及核酸等生物大分子的萃取和分离，并逐渐有新反胶束体系被报道。Goto等用AOT/DOLPA混合反胶束萃取α-胰凝乳蛋白酶，发现混合反胶束体系的萃取能力高于单一的AOT反胶束体系。

在国内，反胶束萃取也发展得十分迅速，陈复生等首次应用反胶束萃取技术同时分离花生中的油和蛋白；张洁等采用SDS/异辛烷/正辛醇反胶束体系对大豆蛋白进行萃取，并用响应面实验对影响萃取的因素进行考察和优化，得到了最佳萃取工艺。此外，超声波等也被用于辅助反胶束萃取，孟宪锋等利用超声波辅助AOT/异辛烷反胶束萃取红花饼粕蛋白，分析和讨论了超声萃取时间、温度、饼粕量以及增溶水量W₀对萃取的影响，得到在最优萃取工艺，在最佳萃取工艺下蛋白质萃取率达到58.3%。

目前，反胶束萃取也开始应用于植物小分子有效成分的萃取分离方面的研究。陈明拓等人用AOT/异辛烷反胶束对粗苦参碱中的苦参碱进行了萃取研究，通过正交实验优化萃取工艺和条件，得出影响生物碱萃取的主要因素为水相酸度，次要因素为水相的温度，而反胶束的W₀及离子强度对萃取率的影响较小，在最优萃取工艺下苦参碱的萃取率为70.3%。首次应用反胶束萃取生物碱类有效成分，为生物碱的提取分离提供了新的思路。但该研究仅以AOT反胶束进行了萃取，未考察比较不同反胶束体系对苦参生物碱的萃取，所得萃取率也较低，纯度不高，有待改善和提高。

苦参为豆科槐属植物来源的常用中药，是植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根，含有喹诺里西啶类生物碱、异戊烯基类黄酮和齐墩果烯型三萜等成分。苦参生物碱主要包括苦参碱和氧化苦参碱，此外还含有槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱、羟基苦参碱、n-甲基金雀花碱、安那吉碱、巴普叶碱和去氢苦参碱（苦参烯碱）等。

发明内容

本发明的目的在于提供微波辅助双水相-反胶束萃取分离苦参生物碱的方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案为：

微波辅助双水相-反胶束萃取分离苦参生物碱的方法，包括以下步骤：

1)  制备乙醇-硫酸铵双水相萃取剂，其中硫酸铵质量分数为18%，乙醇质量分数为28%；制备SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂；

2)  将苦参或山豆根粉碎，与乙醇-硫酸铵双水相萃取剂混合，微波辅助提取，提取液冷却后，离心分相，上相旋干；

3)  旋干后的残渣用酸溶解，水稀释并调节pH至5，得苦参生物总碱水溶液；

4)  将苦参生物总碱水溶液、SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂混合，搅拌萃取，静置分相，上层为反胶束层，下层为水相，将反胶束层与KCl溶液混合，搅拌反萃取，静置，合并下层水相，旋蒸，除盐，过滤，洗涤，取滤液旋干，干燥得苦参生物总碱粗品；

5)  采用硅胶柱层析法分离苦参生物总碱粗品，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集洗脱液，采用薄层层析法合并各洗脱液，浓缩，分别重结晶，真空干燥，得苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱单体。

优选的，SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂中含水量为1.25 mol/L，SDBS浓度为0.05mol/L，KCl浓度为0.05 mol/L ，异辛烷、正辛醇的体积比4：1。 

优选的，步骤2）微波辅助提取条件：微波功率780 W、温度90 ℃、提取时间5 min。

优选的，步骤2）粉碎后的苦参或山豆根与乙醇-硫酸铵双水相萃取剂按1 g：60 mL比例混合。

优选的，以生物碱苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱和氧化槐果碱总量计，步骤3）苦参生物总碱水溶液浓度为0.2～0.3 mg/mL。

优选的，步骤4）苦参生物总碱水溶液与SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂按1：1的体积比混合。

优选的，步骤4）搅拌萃取时间为5 min，搅拌反萃取时间为20 min。

优选的，步骤4）反胶束层与1 mol/L KCl溶液按1：1的体积比混合。

优选的，步骤4）将苦参生物总碱水溶液、SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂混合，搅拌萃取，静置分相，上层为反胶束层，下层水相重复萃取，合并反胶束层，并与KCl溶液混合，搅拌反萃取，静置，重复反萃取，合并下层水相，旋蒸，除盐，过滤，洗涤，取滤液旋干，干燥得苦参生物总碱粗品。

优选的，氯仿-甲醇系统梯度洗脱：氯仿:甲醇的体积比为9:1～7:3。

优选的，薄层层析法以体积比为7:3:0.05的氯仿:甲醇:浓氨水为展开剂，改良碘化铋钾为显色剂。

本发明方法采用了乙醇-硫酸铵双水相体系，不仅加入了极性较小的乙醇，而且加入了强电解质硫酸铵，增强体系的介电常数，在微波辅助作用下，硫酸铵可瞬间极化，加强体系对微波的吸收，可看作是一个特殊的微波介质。采用该双水相体系为提取剂，在微波的辅助作用下直接从苦参或山豆根药材中萃取苦参生物碱，微波可使药材迅速细胞破壁，苦参生物碱快速溶出后由于双水相体系选择性分配的特点，进入上相，实现提取与纯化一体化，大大减少了杂质，简化了纯化步骤。

由于双水相萃取的分离原理是苦参生物碱在上下两相的选择性分配，在提取过程中一些极性相近的杂质也可随苦参生物碱一起分配到上相，因此纯化效果不能令人满意。

本发明应用的SDBS(十二烷基苯磺酸钠)-异辛烷-正辛醇反胶束体系，其极性内核带负电荷，调节pH可使苦参生物碱接受质子带正电荷，而通过静电作用力选择性增溶带正电荷的苦参生物碱，提高萃取的选择性，纯化效果较双水相萃取更好。将反胶束萃取与微波辅助萃取、双水相萃取技术联用，即可实现优势互补，可快速简便的纯化苦参生物碱，得到杂质含量低的苦参生物碱粗品。

本发明的有益效果是：

本发明方法将反胶束萃取与微波辅助萃取、双水相萃取技术联用，实现优势互补，方法简单、快速有效、无污染对设备要求低，易于连续生产和放大，萃取得到的苦参生物碱，总生物碱纯度可达90.92%以上，收率达到55.38 mg/g（以苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱总量计）；与常规萃取纯化方法比较，产品纯度可提高约40%，收率可提高2倍，产品纯度高，且有机溶剂残留少。

本发明通过分离纯化得到的苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱单体纯度可达94%以上，苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱的得率分别为10.08%、44.24%和37.12%，其纯度分别为98.07%、96.62%和94.37%。

本发明纯化过程使用有机溶剂少，萃取剂可再生重复利用，不仅可节约成本且减少了环境污染，更符合绿色化学的要求。

本发明所制备的苦参生物碱产品（苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱），可广泛应用于制备抗癌、抗心率失常、抗炎抑菌、抗肝损伤等药物中，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明方法提取苦参生物碱技术路线图； 

图2为分离得到的氧化苦参碱的高效液相色谱图；

图3为分离得到的槐定碱的高效液相色谱图；

图4为分离得到的苦参碱的高效液相色谱图。

具体实施方式

下对结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。

微波辅助双水相-反胶束萃取分离苦参生物碱的方法，包括以下步骤：

（1）制备乙醇-硫酸铵双水相萃取剂：

称取硫酸铵，加水超声溶解，并加入一定体积的无水乙醇，搅匀，静置，分相，得乙醇-硫酸铵双水相萃取剂，其中的硫酸铵质量分数为18%，乙醇质量分数为28%。

（2）制备SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂：

将SDBS加入溶剂异辛烷及助溶剂正辛醇（异辛烷与正辛醇体积比为4:1），超声溶解后加入浓度为0.05 mol/L的KCl水溶液，在25℃下以180 r/min恒温振摇2 h，静置过夜，得含水量1.25 mol/L，SDBS浓度为0.05 mol/L，KCl浓度为0.05 mol/L 的SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂。

（3）微波辅助双水相萃取苦参生物碱：

将苦参粉碎至80目，与乙醇-硫酸铵双水相萃取剂按1 g：60 mL混合，在微波功率为780W、温度为90℃下微波提取5 min，提取液冷却后，以3500 r/min转速离心5 min分相，上相旋干。

（4）样品处理：

旋干后的残渣用pH=2的盐酸溶液溶解（以恰好溶解为宜），加水稀释（控制所含苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱和氧化槐果碱的总浓度为0.2～0.3 mg/mL），调节pH至5，得苦参生物总碱水溶液。

此步骤得到的苦参生物总碱水溶液经HPLC分析，得总生物碱收率高达55.38 mg/g（即每克苦参提取到55.38毫克总生物碱），纯度均可达90.92%以上（即总生物碱中各生物碱的纯度均可达90.92%以上），所述总生物碱由苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱和氧化槐果碱五种生物碱组成。可见，本发明将反胶束萃取与微波辅助萃取、双水相萃取技术联用能达到较高提取率，较高纯度。

（5）反胶束萃取分离苦参生物总碱：

将苦参生物总碱水溶液、SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂按1：1体积比混合，在室温下电磁搅拌萃取5 min，静置分相，重复萃取一次，将合并的上层反胶束层与1 mol/L KCl溶液按1：1体积比混合，搅拌反萃取20 min，静置，重复反萃取两次，合并下层水相，将下层水相旋转蒸发，加入甲醇盐析，过滤，洗涤，取滤液旋干，真空干燥得苦参生物总碱粗品。

（6）苦参生物总碱的分离纯化：

采用硅胶柱层析法分离精制苦参生物碱。干法上样：准确称取2.5 g苦参生物总碱粗品，加入5 g100目硅胶，溶于氯仿-甲醇（V/V=9:1）中，搅匀，水浴挥干得到样品胶（棕色）。在层析柱下端装入脱脂棉，取50 g 300～400目硅胶，氯仿溶解，边搅拌边装入层析柱中，洗耳球敲实。打开阀，使上端液面与硅胶面相切，关阀，均匀装入样品胶后再在上层装入一层2～3 cm硅胶。洗脱：采用氯仿:甲醇=9:1～7:3（V/V）进行洗脱，分别收集洗脱液。各洗脱液采用薄层层析法（TLC）法点样分析，以氯仿-甲醇-浓氨水（氯仿:甲醇:浓氨水体积比为7:3:0.05）为展开剂，以改良碘化铋钾为显色剂。依据TLC分析结果，合并各洗脱液，减压浓缩，水浴挥干，称重。以石油醚重结晶苦参碱，正己烷重结晶槐定碱，氧化苦参碱以丙酮重结晶，结晶经低温真空干燥分别得苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱单体。

（8）反胶束溶液的纯化再生

取反萃取后上层反胶束层置于具塞三角瓶中，按含水量1.25 mol/L，滴加适量的水于三角瓶中，在25 ℃下以180 r/min振摇2 h，再转入分液漏斗中静置，放出下层微量水，重复操作两次，得纯化后的反胶束体系。取该纯化后的反胶束按（5）相同方法重复用于苦参生物碱的萃取分离。

实施例分离得到的苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱3种单体经红外光谱分析和标准品对比，证明为与标准品为同一物质。

实施例将苦参生物总碱粗品通过硅胶柱层析法进行纯化，获得了苦参碱、槐定碱以及氧化苦参碱3种苦参生物碱单体，通过HPLC及红外光谱分析、标准品确证，分离结果见表1和图1。图2～图4分别为分离得到的氧化苦参碱、槐定碱和苦参碱3种单体的高效液相色谱图。

由表1可知，将经过双水相/反胶束联合萃取得到的苦参生物碱粗产品，在硅胶柱中可方便快捷的分离得到苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱单体，洗脱顺序依次为苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱，3种生物碱的单体得率分别为10.08%、44.24%和37.12%（以苦参生物总碱粗品质量计算）。

经重结晶后3种生物碱单体经HPLC分析（见图2～图4），各单体均为单一色谱峰，且测得其纯度分别为98.07%、96.62%和94.37%。

Claims (10)

1.微波辅助双水相-反胶束萃取分离苦参生物碱的方法，包括以下步骤：

1)制备乙醇-硫酸铵双水相萃取剂，其中硫酸铵质量分数为18%，乙醇质量分数为28%；制备SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂；

2)将苦参或山豆根粉碎，与乙醇-硫酸铵双水相萃取剂混合，微波辅助提取，提取液冷却后，离心分相，上相旋干；

3)旋干后的残渣用酸溶解，水稀释并调节pH至5，得苦参生物总碱水溶液；

4)将苦参生物总碱水溶液、SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂混合，搅拌萃取，静置分相，上层为反胶束层，下层为水相，将反胶束层与KCl溶液混合，搅拌反萃取，静置，合并下层水相，旋蒸，除盐，过滤，洗涤，取滤液旋干，干燥得苦参生物总碱粗品；

5)采用硅胶柱层析法分离苦参生物总碱粗品，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集洗脱液，采用薄层层析法合并各洗脱液，浓缩，分别重结晶，真空干燥，得苦参碱、氧化苦参碱和槐定碱单体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂中含水量为1.25 mol/L，SDBS浓度为0.05mol/L，KCl浓度为0.05 mol/L ，异辛烷、正辛醇的体积比4：1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）微波辅助提取条件：微波功率780 W、温度90 ℃、提取时间5 min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）粉碎后的苦参或山豆根与乙醇-硫酸铵双水相萃取剂按1 g：60 mL比例混合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以生物碱苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱和氧化槐果碱总量计，步骤3）苦参生物总碱水溶液浓度为0.2～0.3 mg/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）苦参生物总碱水溶液与SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂按1：1的体积比混合。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）搅拌萃取时间为5 min，搅拌反萃取时间为20 min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）反胶束层与1 mol/L KCl溶液按1：1的体积比混合。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）将苦参生物总碱水溶液、SDBS-异辛烷-正辛醇反胶束萃取剂混合，搅拌萃取，静置分相，上层为反胶束层，下层水相重复萃取，合并反胶束层，并与KCl溶液混合，搅拌反萃取，静置，重复反萃取，合并下层水相，旋蒸，除盐，过滤，洗涤，取滤液旋干，干燥得苦参生物总碱粗品。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：氯仿-甲醇系统梯度洗脱：氯仿:甲醇的体积比为9:1～7:3。

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