CN110090240B - 一种补骨脂总黄酮提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种补骨脂总黄酮提取物及其制备方法和应用,所述的补骨脂总黄酮提取物,是从补骨脂药材中分离提取而得,以总重量计,黄酮类指标成分的合计含量高于50%,所述黄酮类指标成分包括:补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、异补骨脂查尔酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂定、补骨脂醇A、补骨脂查尔酮;且不含补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚。实验表明:本发明提供的补骨脂总黄酮提取物的安全性显著提高,同时具有显著的减肥作用,可望用于制备治疗和/或预防肥胖症的药物,相对于现有技术,取得了显著性进步和出乎意料的效果,对研究开发具有临床应用价值的补骨脂药物制剂具有重要意义。
Description
技术领域
本发明是涉及一种补骨脂总黄酮提取物及其制备方法和应用,属于医药技术领域。
背景技术
随着中国经济的高速发展、生活水平的不断提高,肥胖人口数量急速上升,中国已经成为世界第二的肥胖大国。肥胖是一种慢性代谢类疾病,其发病机制复杂多样,同时其会引起多种疾病,包括2型糖尿病、心血管疾病、高血压、血脂紊乱等。治疗肥胖的方式主要有控制饮食、增强运动、药物治疗和手术。
目前,美国食品药品管理局(FDA)批准了五种用于长期体重管理的药物,包括脂肪酶抑制剂奥利司他、人胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物利拉鲁肽、去甲肾上腺素再摄取抑制剂盐酸芬特明-托吡酯、去甲肾上腺素促进剂纳曲酮-安非他酮、5-羟色胺2C受体激动剂罗卡西林。但这些减肥药物都存在很多隐患,不良反应较多、价格昂贵、减肥效果不明显等。
补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实,始载于《雷公炮炙论》。补骨脂主产于四川、河南、陕西等地,别名破故纸、黑胡纸等。其性辛、苦、温,归肾、脾经,具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效,可用于治疗肾阳不足、阳痿遗精、遗尿尿频、腰膝冷痛、肾虚作喘、五更泄泻。目前补骨脂在临床上广泛应用,内服主治肾虚冷泻、阳萎遗精、遗尿尿频、腰膝冷痛等;外用主治皮肤病、白癜风等。
现代化学研究表明补骨脂主要含有糖苷、香豆素、苯并呋喃、黄酮、单萜酚类成分,具有抑菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫等活性。补骨脂中含量较高的是香豆素类成分(例如:补骨脂素、异补骨脂素等)和单萜酚类成分(例如:补骨脂酚),而黄酮类成分的相对含量较低。
目前已经从补骨脂中分离得到异黄酮类、二氢黄酮类、查耳酮类、黄酮醇类等多种黄酮类化合物,其中异黄酮类化合物包括补骨脂异黄酮(Corylin)、新补骨脂异黄酮(Neobavaisoflavone)、补骨脂醇(Psoralenol)、补骨脂异黄酮苷及大豆苷等;二氢黄酮类化合物主要含有补骨脂甲素(Bavachin)、异补骨脂二氢黄酮(Isobavachin)、补骨脂二氢黄酮甲醚(Bavachinin)等;查耳酮类化合物主要包括补骨脂查耳酮(Bavachalcone)、异补骨脂查耳酮(Isobavachalcone,又名补骨脂乙素)、新补骨脂查耳酮(Neobavachalcone)、异新补骨脂查耳酮(Isoneobavachalcone)等。研究表明,补骨脂中的黄酮类成分具有多种生物活性,包括抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗骨吸收作用、神经保护作用等。
我们知道肥胖症的发病机制复杂,目前尚无一个很好的药物靶点,而中药提取物中通常可以同时含有多种有效活性成分,用于疾病的治疗时,可以对疾病多个靶点进行治疗,疗效更为显著,因此目前有许多关于中药提取物用于治疗肥胖症的相关报道,例如:专利CN200880018326.X中将灵香草提取物作为有效成分用于制备肥胖治疗药物、专利CN201510577827.3中将丝瓜提取物作为有效成分用于制备肥胖治疗药物、专利CN201611160382.X中将海南冬青提取物作为有效成分用于制备肥胖治疗药物。而目前还没有补骨脂总黄酮提取物用于制备减肥药物中的相关报道,因此,补骨脂总黄酮提取物的制备对减肥药物的制备具有重要的意义。
传统的补骨脂总黄酮提取物的制备主要是将补骨脂药材粉碎后采用煎煮法、浸渍法、回流法、超声法等进行提取,然后将粗提物通过聚酰胺或大孔树脂进行富集分离,由于黄酮类成分在补骨脂中的相对含量较低,得到的提取物中不仅黄酮类成分含量较少,通常还含有大量的香豆素类成分(例如:补骨脂素、异补骨脂素等)和/或单萜酚类成分(例如:补骨脂酚)。研究表明:补骨脂中的单萜酚类成分补骨脂酚对动物模型具有肾脏毒性,不适宜在临床中长期使用(具体见文献:补骨脂酚的化学与生物学研究进展;黄莎华、黄梦媛、贾学顺、洪然;Chinese Journal of Organic Chemistry;2014,34,2412~2423;文献:补骨脂酚研究进展;于悦、王亚静、皮佳鑫、高旭;山东中医药大学学报;第37卷第2期,2013年3月,174-176页);同时也有研究表明:补骨脂中的香豆素类成分补骨脂素具有光毒性、致癌性、生殖毒性等(具体见文献:补骨脂香豆素成分研究进展;郭洁、宋殿荣;天津中医药;2013年4月第30卷第4期;250-253页;专利CN200680024989.3的背景技术部分),也不适宜在临床中长期使用;因此,为了保证补骨脂总黄酮提取物临床使用的安全性,需要尽可能除去补骨脂总黄酮提取物中香豆素类成分和单萜酚类成分的含量。
随着对补骨脂黄酮提取物制备方法的深入研究,制备得到的补骨脂总黄酮提取物中补骨脂酚、补骨脂素、异补骨脂素的含量也大大降低,但是目前的制备方法得到的补骨脂总黄酮提取物中最多仅能将补骨脂酚、补骨脂素、异补骨脂素三者的单个含量控制在1%左右,还不能完全除去补骨脂酚、补骨脂素、异补骨脂素等有毒成分,影响了补骨脂黄酮提取物的临床应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明的目的是提供一种基本不含香豆素类成分和单萜酚类成分的补骨脂总黄酮提取物及其制备方法和应用,以拓宽补骨脂的临床应用。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种补骨脂总黄酮提取物,是从补骨脂药材中分离提取而得,以总重量计,黄酮类指标成分的合计含量高于50%,所述黄酮类指标成分包括:补骨脂二氢黄酮(bavachin、分子量为324、分子式为C20H20O4)、新补骨脂异黄酮(neobavaisoflavone、分子量为322、分子式为C20H18O4)、异补骨脂查尔酮(isobavachalcone、分子量为324、分子式为C20H20O4)、补骨脂二氢黄酮甲醚(bavachinin、分子量为338、分子式为C21H22O4)、补骨脂定(psoralidin、分子量为336、分子式为C20H16O5)、补骨脂醇A(corylifol A、分子量为390、分子式为C25H26O4)、补骨脂查尔酮(bavachalcone、分子量为338、分子式为C21H22O4);且不含补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚。
本发明所述的补骨脂总黄酮提取物的制备方法,包括如下步骤:
a)将补骨脂药材经粉碎后用石油醚脱脂2~3次;
b)将石油醚脱脂后的药渣用50~95wt%的乙醇水溶液回流提取1~3次,合并提取液,减压浓缩至无乙醇味,得乙醇提取物;
c)将乙醇提取物分散于水中,得悬浮液,所得悬浮液用乙酸乙酯萃取,得乙酸乙酯萃取物;
d)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱,以石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行梯度洗脱,收集目标流份,减压浓缩,即得补骨脂总黄酮提取物。
作为优选方案,步骤a)中,加入石油醚的重量是补骨脂药材重量的5~10倍。
作为优选方案,步骤b)中,用乙醇水溶液提取时,每次加入的乙醇水溶液的重量是药渣重量的5~10倍。
作为优选方案,步骤b)中,采用80wt%的乙醇水溶液回流提取。
作为优选方案,步骤c)中,用乙酸乙酯萃取时,每次加入的乙酸乙酯的体积是悬浮液体积的1~3倍。
作为优选方案,步骤d)中,将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱后,先用1~5倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯(10:1,v/v)洗脱,弃去,再用1~5倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯(6:1,v/v)洗脱,弃去洗脱液,再用1~5倍柱体积的乙酸乙酯洗脱,收集乙酸乙酯洗脱液,减压浓缩,得到补骨脂总黄酮提取物。
本发明所述的补骨脂总黄酮提取物的应用,是指以所述的补骨脂总黄酮提取物为活性成分用于制备治疗和/或预防肥胖症的药物。
本发明所述药物的剂型可以是多种多样的,只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都是可以的。比如可选自:片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、酊剂、口服液、气雾剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂等常见剂型或纳米制剂等缓释剂型。
与现有技术相比,本发明具有如下显著性有益效果:
1、经测试分析:本发明提供的补骨脂总黄酮提取物中,以总重量计,黄酮类指标成分的合计含量高于50%,且不含补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚,相对于现有的补骨脂总黄酮提取物,本发明制备的补骨脂总黄酮提取物不含毒性成分,安全性得到了显著提高;
2、经药物实验表明:本发明提供的补骨脂总黄酮提取物具有显著的减肥作用,说明本发明通过控制补骨脂总黄酮提取物中的黄酮类成分、香豆素类成分和单萜酚类成分的含量,不仅明显降低了毒性,提高了使用安全性,且同时具有显著的减肥作用,因此可望用于制备治疗和/或预防肥胖症的药物,相对于现有技术,取得了显著性进步和出乎意料的效果,对研究开发具有临床应用价值的补骨脂药物制剂具有重要意义;
3、另外,本发明的制备方法简单、分离量大、生产效率高,且使用的石油醚、乙醇等溶剂可回收,适用于规模化生产,具有工业应用价值。
附图说明
图1是补骨脂药材的HPLC色谱图;
图2是本发明实施例1中制备得到的补骨脂总黄酮提取物的HPLC色谱图;
图3是本发明实施例2中高脂饲料诱导肥胖小鼠模型体重变化图;
图4是本发明实施例2中对照组、高脂饲料诱导肥胖小鼠模型组、补骨脂总黄酮高低剂量组的肥胖小鼠形状体态结果图;
图5是本发明实施例2中核磁共振体成分分析小鼠体脂占体重分析图;
图6是本发明实施例2中小鼠肝脏切片苏木素伊红(HE)染色图;
图7是本发明实施例2中小鼠脂肪切片苏木素伊红(HE)染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1:补骨脂总黄酮提取物的制备
a)将补骨脂药材经粉碎后加入石油醚(选用60~90℃的石油醚)脱脂2次(可以常温静置脱脂,每次脱脂静置时间6~12小时,也可以回流脱脂,每次脱脂回流时间1~2小时),每次加入的石油醚的重量是补骨脂药材重量的8倍,过滤,得药渣;
b)将石油醚脱脂后的药渣用80wt%的乙醇水溶液回流提取2次,每次提取加入的乙醇水溶液的重量是药渣重量的8倍,合并提取液,减压浓缩至无乙醇味,得乙醇提取物;
c)将乙醇提取物分散于水中,得悬浮液,所得悬浮液用等体积乙酸乙酯萃取3次,得乙酸乙酯萃取物;
d)将乙酸乙酯萃取物加入硅胶颗粒拌样(硅胶与乙酸乙酯萃取物的质量比为6:1)后上硅胶柱,先用3倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯(10:1,v/v)洗脱,弃去;再用3倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯(6:1,v/v)洗脱,弃去洗脱液;再用3倍柱体积的乙酸乙酯洗脱,收集乙酸乙酯洗脱液,减压浓缩,即得补骨脂总黄酮提取物(以生药计产率为5%)。
以补骨脂二氢黄酮甲醚为对照品,通过高效液相色谱法(HPLC)对补骨脂总黄酮提取物中主要成分进行测定:
测定方法如下:
1)补骨脂总黄酮提取物供试品:精密称取补骨脂总黄酮提取物,用甲醇溶解配制成浓度为1mg/ml,过0.22μm微孔滤膜,取续滤液,得补骨脂总黄酮提取物供试品溶液;
2)对照品:精密仪器称定补骨脂二氢黄酮甲醚化学对照品,用甲醇溶解为0.0125mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml,使其覆盖补骨脂总黄酮浓度范围;
3)HPLC检测条件:Agilent C18(4.6*250mm,5μm);流动相为甲醇-水(v/v);检测波长245nm;柱温30;流速1.0ml/min;流动相梯度:0min(60%甲醇)~20min(70%甲醇)~40min(85%甲醇)~50min(85%甲醇)。
同时也采用相同的测试方法对补骨脂药材进行测定。
测试结果如图1、图2和表1所示。
图1是补骨脂药材的HPLC色谱图,从图1可见,补骨脂药材中含有大量的香豆素类有毒成分:补骨脂素、异补骨脂素,同时还含有大量的单萜酚类有毒成分:补骨脂酚;
图2是本实施例制备得到的补骨脂总黄酮提取物的HPLC色谱图,其中A、B、C、D、E、F、G分别代表补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、异补骨脂查尔酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂定、补骨脂醇A、补骨脂查尔酮;从图2可见,本实施例制备得到的补骨脂总黄酮提取物完全除去了补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚等有毒成分。
表1补骨脂总黄酮提取物的含量测试结果
结合图1、图2和表1可见:本发明制备得到的补骨脂总黄酮提取物中,补骨脂总黄酮质量百分含量达到50.1%,且不含补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚等有毒成分,说明采用本发明的制备方法可使制备得到的补骨脂总黄酮提取物中的有害成分显著降低,补骨脂总黄酮提取物的临床使用安全性得到提高。
实施例2:对高脂饮食诱导小鼠抗肥胖作用试验
2.1实验药物:将上述制备方法制备补骨脂总黄酮,掺入高脂饲料给药,补骨脂总黄酮低剂量组给药剂量为0.2%,补骨脂总黄酮高剂量组给药剂量为0.5%。
2.2实验动物:选用雄性6周龄C57BL/6小鼠32只,适应性饲养一周,按体重随机分组,每组8只,即模型对照组,补骨脂总黄酮低剂量组、补骨脂总黄酮高剂量组;另选8只6周龄雄性C57BL/6小鼠(同遗传品系的正常小鼠)作为正常对照组;每两天记录体重、摄食量,观察动物体重、摄食量与生理状况变化;采用核磁共振体成分分析仪,对小鼠体脂和肌肉进行分析,观察小鼠体内脂肪肌肉组成变化;对小鼠肝脏切片苏木素伊红(HE)染色,观察补骨脂总黄酮干预后对肝脏病理病变的影响;对小鼠性腺脂肪切片苏木素伊红(HE)染色,观察补骨脂总黄酮干预后对小鼠性腺脂肪细胞的影响,试验结果如图3至图7所示。
2.3实验结果:
图3是高脂饲料诱导肥胖小鼠模型体重变化图;图4是对照组、高脂饲料诱导肥胖小鼠模型组、补骨脂总黄酮高低剂量组的肥胖小鼠形状体态结果图;从图3和图4可见:在动物饲养与给药期间,高脂饮食诱导肥胖小鼠与给药组相比,有显著差异,具体的是:给药第15周,与模型组相比,补骨脂总黄酮高剂量0.5%组体重下降10g,补骨脂总黄酮低剂量0.2%组体重下降6g;这说明补骨脂总黄酮可明显抑制高脂饮食诱导肥胖模型小鼠体重增长幅度,具有减肥作用;此外,小鼠在全程饲养期间,补骨脂总黄酮低剂量组0.2%与高剂量组0.5%与正常组相比无异常毒副反应,说明本发明制备的补骨脂总黄酮提取物毒性较小,使用安全性好。
图5是核磁共振体成分分析小鼠体脂占体重分析图;从图5可见:与模型组相比,脂肪重量补骨脂总黄酮高剂量0.5%组与补骨脂总黄酮低剂量0.2%组皆有显著差异;说明补骨脂总黄酮可显著降低高脂饮食诱导肥胖模型小鼠的脂肪含量,具有减肥作用。
图6是小鼠肝脏切片苏木素伊红(HE)染色图;从图6可见:与对照组相比,模型组小鼠肝细胞排列紊乱,肝细胞体积增大,密度不匀,有脂肪变性,而补骨脂总黄酮高低剂量组均有改善,说明补骨脂总黄酮干预对高脂饮食诱导肥胖模型小鼠肝细胞脂肪变性具有一定的抑制作用。
图7是小鼠脂肪切片苏木素伊红(HE)染色图;从图7可见:与对照组相比,同一视野下模型组脂肪细胞数明显少于对照组,且脂肪细胞膨大,而对照组形态大小均一;补骨脂总黄酮干预后,同一视野下模型组脂肪细胞数明显少于补骨脂总黄酮高低剂量组,补骨脂总黄酮高低剂量组均有改善,说明补骨脂总黄酮干预对DIO饮食诱导肥胖的小鼠脂肪细胞大小有一定的抑制作用。
综上所述可见:本发明制备的补骨脂总黄酮提取物可以完全除去香豆素类成分中的补骨脂素、异补骨脂素,同时还可以完全除去单萜酚类成分中的补骨脂酚,不仅明显降低了毒性,提高了使用安全性,且同时具有显著的减肥作用;并且,本发明所述制备方法简单,易于实现规模化生产,对促进补骨脂的广泛应用具有重要价值。
最后需要在此指出的是:以上仅是本发明的部分优选实施例,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种制备补骨脂总黄酮提取物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)将补骨脂药材经粉碎后用石油醚脱脂2~3次;
b)将石油醚脱脂后的药渣用50~95wt%的乙醇水溶液回流提取1~3次,合并提取液,减压浓缩至无乙醇味,得乙醇提取物;
c)将乙醇提取物分散于水中,得悬浮液,所得悬浮液用乙酸乙酯萃取,得乙酸乙酯萃取物;
d)将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱后,先用1~5倍柱体积的v/v 为 10:1 的 石油醚-乙酸乙酯,洗脱,弃去,再用1~5倍柱体积的v/v 为 6:1 的 石油醚-乙酸乙酯,洗脱,弃去洗脱液,再用1~5倍柱体积的乙酸乙酯洗脱,收集乙酸乙酯洗脱液,减压浓缩,得到补骨脂总黄酮提取物。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤a)中,加入石油醚的重量是补骨脂药材重量的5~10倍。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤b)中,用乙醇水溶液提取时,每次加入的乙醇水溶液的重量是药渣重量的5~10倍。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤c)中,用乙酸乙酯萃取时,每次加入的乙酸乙酯的体积是悬浮液体积的1~3倍。
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CN104496783A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-04-08 | 成都普思生物科技有限公司 | 一种4’-o-甲基补骨脂查耳酮b单体的分离纯化方法 |
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Title |
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