CN111297880A - 一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物 - Google Patents

一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物，包括从金银花中提取得到的绿原酸、从黄芩中提取得到的黄芩苷，以及从连翘中提取得到的连翘酯苷A；其中，黄芩苷：绿原酸：连翘酯苷A的摩尔比为30‑50：500‑600：115‑190。本发明的新双黄连配方药物经过实验验证，其可以有效抑制CT26结肠癌细胞的增殖和迁移，因此可以有效抑制CT26结肠癌细胞的肝、肺转移，具有较好的辅助抗肿瘤效果。

Description

一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物。
背景技术
恶性肿瘤一直是威胁人类生命健康的头号杀手，由于其发展的不可控性，目前国际上对于恶性肿瘤还没有很好的治疗方法，主要以手术治疗加上化疗、放疗来延缓肿瘤细胞对于器官的侵蚀。但众所周知，化疗联合放疗在干预肿瘤细胞的同时也对人体的健康细胞产生毒副作用，进而也会影响身体的各项机能，导致免疫力下降，引发其他并发症。近些年，随着科技的发展，中药抗肿瘤研究得到了长足的进步，已明确中药中含有某些化学成分可以有效的干预肿瘤的发生、发展。依据中医“癌毒”、“壅热”等学说，很多有清热解毒、化瘀排脓等功效作用的中药被运用到肿瘤的治疗当中，显示出明确的疗效。通过组方以及配比等方法调节药性，或者在疾病治疗的不同阶段辅以不同作用的中药，在调治恶性肿瘤及其并发症中具有其独特优势，肿瘤患者运用中药组方，讲究阴阳和合，更突出“调”、“治”并重。比如：鉴于肿瘤治疗具有长期性、延续性的特点，应进行分阶段论治，即分不同治疗时段治疗，不同治疗时段的治疗目的也不同，一般分为围手术期、化疗期、放疗期、治疗间歇期、监测随诊5个阶段。围手术期、治疗间歇期应注重康复调理，而肿瘤及手术、放化疗等侵袭性治疗，暗耗气血，致使气血不足，脏腑失养，易致久病复发或致新病，故用药应以调理脾胃、补益肝肾、补养气血、扶虚补弱为主。放化疗同步治疗重在减毒增效。监测随诊阶段重在抗肿瘤复发、转移。
双黄连是由金银花、黄芩、连翘三味中药经现代化工艺制作而成，三味中药均为清热药,金银花为君药，可宣散升清；黄芩、连翘为辅，善清火热。金银花、黄芩、连翘协同，表里双解、气血两清，可用于外感风热、温病初起及多种实热证，具有良好的清热解毒功效。经研究表明，双黄连具有显著的抗菌、抗病毒、抗炎及增强免疫力的作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物，将双黄连的三种中药以一种新的配比制成药物，可以有效抑制肿瘤的扩散。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物，包括从金银花中提取得到的绿原酸、从黄芩中提取得到的黄芩苷，以及从连翘中提取得到的连翘酯苷A；其中，黄芩苷：绿原酸：连翘酯苷A的摩尔比为30-50：500-600：115-190。
作为一种优选方案，黄芩苷：绿原酸：连翘酯苷A的摩尔比为50:580:160。
作为一种优选方案，所述新双黄连配方药物为冻干闪释片制剂。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的新双黄连配方药物经过实验验证，其可以有效抑制CT26结肠癌细胞的增殖和迁移，因此可以有效抑制CT26结肠癌细胞肝、肺转移，具有较好的抗肿瘤效果；
2、本发明所提供的新双黄连配方药物采用冻干闪释片制剂，能在口腔中快速崩解，药物释放快，服用方便，更能让病人接受。
附图说明
图1为本发明实施例2中CCK-8法检测细胞增殖抑制率的结果示意图；
图2为本发明实施例2中伤口愈合实验检测CT26细胞的迁移行为的观察结果对比示意图；
图3为本发明实施例2中伤口愈合实验检测CT26细胞的迁移行为的数据对比示意图；
图4为本发明实施例2中得到的Transwell迁移实验下对照组对CT26细胞迁移的抑制作用实验结果示意图；
图5为本发明实施例2中得到的Transwell迁移实验下新双黄连配方药物对CT26细胞迁移的抑制作用实验结果示意图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1
本实施例提供一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物，包括从金银花中提取得到的绿原酸、从黄芩中提取得到的黄芩苷，以及从连翘中提取得到的连翘酯苷A。
在本实施例中，所述新双黄连配方药物采用冻干闪释片制剂。
所述冻干闪释片制备方法如下：
按比例称取从金银花中提取得到的绿原酸、从黄芩中提取得到的黄芩苷，以及从连翘中提取得到的连翘酯苷A，按照一定的顺序溶解并混匀之后，调节pH使黄芩苷全部溶解，并定容，将得到的液体进行高剪切，使其分布更加均匀，然后在磁力搅拌的辅助下进行真空脱气，脱气完成后用移液枪将其转移至铝塑泡罩内；置-60℃冰箱预冻1h，放入冻干机按照设定的冻干曲线进行冷冻干燥。冻干完成后进行包装得到最终的冻干闪释片。
实施例2
本实施例旨在通过实验验证实施例1所提供的一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物的有效性。按照常规方法得到从金银花中提取得到的绿原酸、从黄芩中提取得到的黄芩苷，以及从连翘中提取得到的连翘酯苷A，根据计算以及实验后得出新双黄连配方药物，将单体按照配比配置成溶液进行后续的抗肿瘤实验。
一、提取
从金银花中提取有效成分绿原酸的提取方法为大孔树脂纯化绿原酸类化合物：称取已预处理的D101树脂适量，湿法装于玻璃层析柱中备用。量取金银花粗提物适量，用盐酸调pH值至3，1BV/h上样通过D101树脂柱，待树脂吸附饱和后，先用去离子水冲洗大孔树脂柱，直至流出液颜色为无色，然后以pH为3的酸水、不同浓度的乙醇为洗脱剂进行洗脱，分别收集洗脱液。高效液相色谱法分析鉴定各洗脱液中的成分，最后确定绿原酸的洗脱部位在乙醇浓度为10％处。将收集的洗脱液旋转蒸发浓缩后，放水浴锅上挥尽乙醇，置于-60℃冰箱冷冻，将其冷冻干燥成粉，即得绿原酸类化合物，保存于-20℃冰箱。
从连翘中提取有效成分连翘酯苷的提取方法为大孔树脂纯化连翘酯苷类化合物：连翘浸膏适量，旋转蒸发回收乙醇至无醇味，加入适量水分散，调整至适当粘度。根据连翘浸膏的量，量取适量完全膨胀好的D101型大孔树脂装柱。由95％乙醇→纯水梯度洗脱，洗脱完成后上样。上样后，先用纯水洗脱，弃去水洗脱部位。再用30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，旋转浓缩除去乙醇以及大部分的水，真空干燥，得连翘酯苷类化合物。
从黄芩中提取有效成分黄芩苷的提取方法为碱提取酸沉淀法纯化黄芩苷类化合物：用2mol/L盐酸溶液调节pH值至1.0ˉ2.0，在80℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀加8倍量水，搅拌，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，加入等量乙醇，搅拌使沉淀溶解，滤过，滤液用2mol/L盐酸溶液调节pH值至2.0，在60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗至pH值4.0，加10倍量水，搅拌，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，每1000ml溶液中加入5g活性炭，充分搅拌，在50℃保温30分钟，加入等量乙醇，搅拌均匀，滤过，滤液用2mol/L盐酸溶液调节pH值至2.0，在60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用少量乙醇洗涤，于60℃以下干燥，备用。
二、组分配比的取得：
1.CCK-8法检测双黄连各组分(黄芩苷/绿原酸/连翘酯苷A)对CT26细胞增殖的影响：
接种细胞，培养24h后将双黄连各组分分别按照浓度梯度给药，黄芩苷(0ˉ200ˉ500μM)/绿原酸(0ˉ700ˉ1000μM)/连翘酯苷A(0ˉ200ˉ350μM)，药物作用24h后吸出药液，用CCK-8试剂盒检测，计算给药黄芩苷、绿原酸、连翘酯苷A下的细胞增殖抑制率，并计算IC50值。
2.均匀设计法优化双黄连的最佳配比实验
根据双黄连各组分IC50结果，在黄芩苷(30ˉ38ˉ50μM)/绿原酸(500ˉ560ˉ600μM)/连翘酯苷A(115ˉ160ˉ190μM)范围内取几个浓度，根据均匀设计表设计成不同配方进行考察，CCK-8法检测细胞增殖抑制率。
配方1：黄芩苷30μM，绿原酸520μM，连翘酯苷A145μM；
配方2：黄芩苷34μM，绿原酸560μM，连翘酯苷A190μM；
配方3：黄芩苷38μM，绿原酸600μM，连翘酯苷A130μM；
配方4：黄芩苷42μM，绿原酸500μM，连翘酯苷A175μM；
配方5：黄芩苷46μM，绿原酸540μM，连翘酯苷A115μM；
配方6：黄芩苷50μM，绿原酸580μM，连翘酯苷A160μM。
结果显示：新双黄连各配方对CT26的增殖抑制率由高至低依次为配方6、配方2、配方4、配方3、配方1和配方5，即配方6对CT26的抑制效果最好，如图1所示。
3.伤口愈合实验检测CT26细胞的迁移行为
接种细胞，用1ml枪头垂直于培养板底部划痕，给予上述配方1-6处理，并于0h、24h观察并拍照。
结果表明，配方1-6均能显著抑制CT26细胞的迁移行为。其中抑制效果最好的为配方6，如图2-3和表1-2所示。
表1
Figure BDA0002317971410000081
表2
0h 24h 差值
配方6-0h 28.7 15.7 13
配方2-0h 28.4 15 13.4
配方3-0h 30.2 16.8 13.4
配方4-0h 20.8 7.3 13.5
配方5-0h 19.8 5.9 13.9
配方1-0h 18.5 2.4 16.1
正常-0h 25.6 0 25.6
以上实验结果表明，配方1-6均能抑制肿瘤增殖、迁移，其中配方6抑制肿瘤增殖、迁移效果最好，该配方6的各成分比例为：黄芩苷50μM，绿原酸580μM，连翘酯苷A160μM。
二、新双黄连配方药物的有效性
本部分以配方6为基础，通过实验验证新双黄连配方药物的有效性。
1.Transwell迁移实验验证新双黄连配方药物对CT26结肠癌细胞迁移行为的抑制作用
实验方法：Transwell上室接种CT26，下室加入含血清培养基(对照组)和新双黄连配方药物(RSHL组)，迁移24h，固定上室并染色，倒置显微镜观察，计数小室外侧TranswellPC膜上的细胞，检测新双黄连配方药物对CT26细胞迁移行为的抑制作用。结果如图4-5所示。图4为对照组的实验结果示意图，图5为RSHL组的实验结果示意图。
2.CT26结肠癌荷瘤小鼠模型的制备及新双黄连配方药物的抑瘤作用观察
BALB/c小鼠随机分为肿瘤模型组(Model)、新双黄连配方药物组(RSHL)、奥沙利铂组(L-OHP)，每组12只，雌雄各半。除空白对照组外，其余各组小鼠麻醉后，经右前肢背部皮下注入CT26细胞0.2mL(1×106个/只)，空白对照组小鼠皮下注射等剂量溶剂(0.01M PBS)。RSHL组给予每只小鼠3mg/kg(0.1mL·10g-1/d)、L-OHP组给予每只小鼠5mg·kg-1(0.1mL·10g-1)，隔日给药1次。Model组给予同等剂量的生理盐水，均为腹腔注射给药。
各组小鼠自移植肿瘤细胞第2天开始腹腔注射给药，连续给药21天。自移植肿瘤第6天，用游标卡尺测量荷瘤小鼠皮下肿瘤的长度和宽度、计算皮下肿瘤体积。取材时剥离皮下肿瘤，称重、拍照并计算抑瘤率。实验结果如表3、表4所示。
表3各组小鼠肿瘤体积
Figure BDA0002317971410000101
注：与模型组组比较，**P＜0.01
皮下瘤块体积测量结果表明，与肿瘤模型组比较，奥沙利铂及双黄连组小鼠皮下肿瘤体积增长缓慢，组间差异显著，有统计学意义(**P＜0.01)，如表3。取材后，肿瘤计重结果表明，与Model组比较，L-OHP组及RSHL组小鼠皮下肿瘤的重量显著降低，组间比较差异显著，有统计学意义(**P＜0.01)，如表4。
表4各组小鼠肿瘤重量及抑瘤率(n＝12,
Figure BDA0002317971410000102
)
Figure BDA0002317971410000103
注：与模型组组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物，其特征在于，包括从金银花中提取得到的绿原酸、从黄芩中提取得到的黄芩苷，以及从连翘中提取得到的连翘酯苷A；其中，黄芩苷：绿原酸：连翘酯苷A的摩尔比为30-50：500-600：115-190。
2.根据权利要求1所述的用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物，其特征在于，黄芩苷：绿原酸：连翘酯苷A的摩尔比为50:580:160。
3.根据权利要求1所述的用于抑制肿瘤增殖、迁移的新双黄连配方药物，其特征在于，所述新双黄连配方药物为冻干闪释片制剂。
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