CN107085065A - 一种同时测定牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定中药中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮含量的方法，所述方法包括：1)分别取牛蒡苷、甘草酸铵和胡薄荷酮标准品及含有牛蒡子、甘草、荆芥穗(或荆芥)中药材的供试品溶于甲醇水溶液中，分别制成标准溶液及供试品溶液；2)分别取等体积的标准溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，然后测定标准品溶液和供试品溶液的峰面积并进行计算，即得供试品中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮的含量。本发明为含有牛蒡子、甘草和荆芥穗(或荆芥)的中药、及其提取物或制剂中的牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮的含量测定提供了一种快速、准确的方法。

Description

一种同时测定牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮含量的方法

技术领域

本发明涉及一种同时测定中药提取物及其制剂中牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮含量的方法，属于中药技术领域。

背景技术

咽炎，在中医中属“喉痹”范畴。现代医学认为咽炎是由溶血性链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌等病原体感染引起的咽部粘膜的急性炎症。中医认为多因热邪毒侵袭咽喉，内伤于肺，相博不去，致咽喉肿痛；或邪热壅盛，由肺卫传里，热邪循经灼伤咽喉而成喉痹。临床主要表现为咽部红肿、疼痛、干痒不适及异物感，常伴发热。本病是以咽喉疼痛，咽部红肿或有颗粒突起，喉核肿胀不明显，全身有风热症状主要临床表现的咽部急性炎症。西医治疗多以抗生素为主，但多有毒副作用，而且易产生耐药性，而中医中药治疗，具有疗效好，副作用小的特点。

传统中医认为：急性咽炎(急喉痹)分为风寒外侵、风热袭肺、肺卫热盛三型。临床则多见风热袭肺、肺卫热盛两型。风热袭肺型表现为咽痛，口微渴，发热，微恶寒，咽部轻度充血、水肿，舌边尖红，苔薄白，脉浮数。治宜疏风清热，解毒利咽。肺卫热盛型表现为咽痛较剧，口渴多饮，咳嗽、痰粘稠，发热，大便偏于干，小便短赤，咽部充血较甚，舌质红，苔薄黄，脉数有力。治宜泄热解毒，利咽消肿。

消毒散载于宋代《小儿药证直诀》，原方为“牛蒡子二两、甘草半两、荆芥穗一分。”主治：“疮疹未出，或已出未能匀遍。及治大人、小儿上膈壅热，咽喉肿痛，胸膈不利”；其制法及用法为“上同为粗末，每服三钱，水一盏半，煎至一盏，温服，不拘时。”历代主要医书中均有该方剂记载，如明代《活幼心方》等。

荆芥穗含挥发油1.69％，其中主要成分均为胡薄荷酮(pule-gone)，薄荷酮(menthone)，异薄荷酮(isomenthone)和异胡薄荷酮(isopulegone)，薄荷醇(menthol)，辣薄荷酮(piperitone)，辣薄荷烯酮(piperitenone)，葎草烯(humulene)，丁香烯(caryophyllene)，β-蒎烯(β-pinene)等。而这些成分很容易挥发，传统工艺中，通过加热，很容易导致该类成分的损失。甘草中含有甘草甜素(glycyrrhizin，即甘草酸glycyrrhinicacid,C₄₂H₆₂O₁₆)6～14％，为甘草的甜味成分，是一种三萜皂甙。甘草酸水解产生一分子甘草次酸(glycyrrhetic acid即glycyrrhetinic acid,C₃₀H₄₆O₄)及二分子葡萄糖醛酸(glycuronic acid,C₆H₁₀O₇)。并含少量甘草黄甙(即甘草甙liquiritin,C₂₁H₂₂O₉,为一种黄烷醇flavanone的甙，其甙元名甘草素liquiritigenin,,C₁₅H₁₂O₄和甘草苦甙glycyamarin)、异甘草黄甙(iso-liquiritin,,C₂₁H₂₄O₉)、二羟基甘草次酸(dihydroxyglycyrrhetic acid即grabric acid,C₃₀H₄₆O₅)、甘草西定(licoricidin,,C₂₅H₃₂O₅,即3’，6-二异戊烯－2’，4’，5-三羟基异黄烷)、甘草醇(glycyrol,C₂₁H₁₈O₆)、5-0-甲基甘草醇(5-0-methyl glycerol,C₂₂H₂₀O₆)、异甘草醇(iso-glycyrol,C₂₁H₁₈O₆)等。牛蒡子中含牛蒡甙(arctiin)，水解生成牛蒡甙元(arctigenin)及葡萄糖(glucose)。又含罗汉松脂酚(matairesinol)，络石甙元(trachelogenin)，倍半木质素(sesquiligenan)及脂肪油，其中脂肪酸成分有：花生酸(arachic acid)，硬脂酸(steraic acid)，棕榈酸(palmitic acid)和亚油酸(linoleicacid)等。

《中国药典》(2015版)中，分别有牛蒡子中牛蒡苷、甘草中甘草酸、荆芥(穗)中胡薄荷酮的含量测定方法，但尚未见有同时测定牛蒡苷、甘草酸及胡薄荷酮含量的方法，为了更好地开发利用“消毒散”这一经典古方，本发明对其质量控制进行了深入研究，并建立了同时测定牛蒡苷、甘草酸及胡薄荷酮含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够快速、准确地同时测定“消毒散”提取物及制剂中牛蒡苷、甘草酸及胡薄荷酮含量的方法，具体地提供一种用高效液相色谱法测定“消毒散”提取物及制剂中牛蒡苷、甘草酸及胡薄荷酮含量的方法。

本发明所述方法包括：

1)分别取牛蒡苷、甘草酸铵和胡薄荷酮标准品及含有牛蒡子、甘草、荆芥穗(或荆芥)中药材的供试品溶于甲醇水溶液中，分别制成标准溶液及供试品溶液；

2)分别取等体积的标准溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，然后测定标准品溶液和供试品溶液的峰面积并进行计算，即得供试品中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮的含量。

其中，所述高效液相色谱仪的固定相为碳十八烷基键合硅胶；流动相为甲醇-乙腈-水溶液。

本发明方法中，作为优选的实施方案，所述碳十八烷基键合硅胶的粒径为≤5μm，进一步优选为5μm，4μm，3.5μm。

本发明所述流动相为甲醇-乙腈-水溶液，优选为10％～15％甲醇及10％～90％的乙腈的水溶液梯度洗脱。

所述梯度溶液以体积百分比计，如下表所示：

本发明所述的一种同时测定牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮含量的方法，可以用于任何包含牛蒡子、甘草、荆芥(穗)三味药材的中药复方，及其提取物，及其各种药物剂型，如片剂、胶囊、口服液、注射剂、颗粒剂等成药中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮含量的同时测定。

作为优选的实施方案，所述小儿咽宁口服液中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮的含量测定方法，包括：

1)供试品溶液的制备：精密量取小儿咽宁口服液3ml，置25ml容量瓶中，加入70％甲醇水溶液至刻度，摇匀，滤过，即得。

2)对照品溶液的制备：分别取牛蒡苷、甘草酸铵、胡薄荷酮对照品适量，加70％甲醇水溶液溶解，制成每1ml分别含含0.5mg、0.1mg、0.2mg的对照品溶液。

3)含量测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，测定对照品溶液及供试品溶液的峰面积，按外标法计算样品中牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的含量。

其中，固定相为250×4.6mm,5μm的碳十八烷基键合硅胶柱，流动相如下表所示梯度洗脱。

检测波长分别为：280nm(牛蒡苷)、237nm(甘草酸)、252nm(胡薄荷酮)，理论塔板数按牛蒡苷峰计算不低于3000。

附图说明

图1是牛蒡苷、甘草酸铵、胡薄荷酮标准品HPLC色谱图。图中1.牛蒡苷；2.甘草酸铵；3.胡薄荷酮。

图2是小儿咽宁口服液样品HPLC色谱图。图中1.牛蒡苷；2.甘草酸；3.胡薄荷酮。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明再做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明仅限于以下实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1 小儿咽宁口服液(深圳海王医药科技研究院有限公司制备，批号：20160401)中牛蒡苷、甘草酸、和胡薄荷酮的含量测定

1)色谱条件及系统适应性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250×4.6mm,5μm)；以流动相为甲醇-乙腈-磷酸水溶液为流动相，如下表所示梯度洗脱。

检测波长分别为：280nm(牛蒡苷)、237nm(甘草酸)、252nm(胡薄荷酮)，理论塔板数按牛蒡苷峰计算不低于3000。

2)供试品溶液的制备：精密量取小儿咽宁口服液3ml，置25ml容量瓶中，加入70％甲醇水溶液至刻度，摇匀，滤过，即得。

3)对照品溶液的制备：分别取牛蒡苷、甘草酸铵、胡薄荷酮对照品适量，加70％甲醇水溶液溶解，制成每1ml分别含含0.5mg、0.1mg、0.2mg的对照品溶液。

4)含量测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，测定对照品溶液及供试品溶液的峰面积，按外标法计算样品中牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的含量分别为：9.21mg/ml、0.76mg/ml、0.24mg/ml。

实施例2 小儿咽宁口服液(深圳海王医药科技研究院有限公司制备，批号：20160401)中牛蒡苷、甘草酸、和胡薄荷酮的含量测定方法学验证

1)专属性 在优选的色谱条件下，小儿咽宁口服液中牛蒡苷、甘草酸、和胡薄荷酮各色谱峰分离良好，无干扰，表明该方法具有较好的专属性。见图1.

2)线性 精密配成不同浓度的牛蒡苷、甘草酸铵、胡薄荷酮对照品溶液。准确吸取上述对照品溶液20μL，按上述确定的色谱条件进行测定，以每个对照品的进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到3个成分的线性回归方程及线性范围，见下表。

3个成分的线性回归方程及线性范围

3)精密度

日内精密度(n＝5) 准确吸取同一供试品溶液20μl，连续进样5次，测定牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的峰面积，计算相对标准偏差分别为0.15％、1.22％、0.37％。

日间精密度(n＝15) 准确吸取同一供试品溶液20μl，连续测定三天，每天测定5次，测定牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的峰面积，计算相对标准偏差分别为0.63％、1.29％、1.18％。

4)重复性

取同一样品(批号：20160401)6份，按“供试品溶液制备”项下操作，在上述色谱条件下进行测定，测定牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的峰面积，计算相对标准偏差分别为1.84％、1.59％、0.63％。

5)加样回收率

取已知牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮含量的小儿咽宁口服液(深圳海王医药科技研究院有限公司制备，批号：20160401)1.5ml，精密量取6份，置25ml容量瓶中，每份加入等量的牛蒡苷、甘草酸铵、胡薄荷酮对照品，加入70％甲醇水溶液至刻度，摇匀，滤过，按“含量测定”项下方法操作，测定各色谱峰面积，计算加样回收率分别为：101.19％、100.95％、100.29％，相对标准偏差分别为：1.02％、1.14％、1.54％。

6)稳定性

准确吸取同一供试品溶液20μl，于0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、48h进行测定，以牛蒡苷、甘草酸、胡薄荷酮的峰面积进行考察，计算相对标准偏差1.71％、0.85％、0.93％，表明样品在48h内稳定性良好。

Claims (9)

1.一种牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮的含量同时测定方法，所述方法包括：

1)分别取牛蒡苷、甘草酸铵和胡薄荷酮标准品及含有牛蒡子、甘草、荆芥穗或荆芥中药材的供试品溶于甲醇水溶液中，分别制成标准溶液及供试品溶液；

2)分别取等体积的标准溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，然后测定标准品溶液和供试品溶液的峰面积并进行计算，即得供试品中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮的含量；

其中，所述高效液相色谱仪的固定相为碳十八烷基键合硅胶，所述碳十八烷基键合硅胶的粒径为≤5μm；流动相为甲醇-乙腈-酸水溶液，所述甲醇-乙腈-酸水溶液为：以体积百分比计，5％～15％甲醇-10％～90％乙腈的梯度溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碳十八烷基键合硅胶的粒径为5μm或4μm或3.5μm。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的碳十八烷基键合硅胶的粒径为5μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酸水为磷酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸之一种，酸的体积浓度为0.01％～0.5％。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的酸水为体积浓度0.05％磷酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度溶液为：以体积百分比计，如下表所示：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述梯度溶液为：以体积百分比计，如下表所示：

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲醇水溶液为以体积计60％～80％的甲醇水溶液。

9.采用权利要求1测定小儿咽宁口服液中牛蒡苷、甘草酸和胡薄荷酮的含量方法，所述方法包括：

1)供试品溶液的制备：精密量取小儿咽宁口服液3ml，置25ml容量瓶中，加入70％甲醇水溶液至刻度，摇匀，滤过，即得；

2)对照品溶液的制备：分别取牛蒡苷、甘草酸铵、胡薄荷酮对照品适量，加70％甲醇水溶液溶解，制成每1ml分别含含0.5mg、0.1mg、0.2mg的对照品溶液；

3)含量测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，测定对照品溶液及供试品溶液的峰面积，按外标法计算样品中牛蒡苷、甘草酸铵、胡薄荷酮的含量；

其中，固定相为250×4.6mm,5μm的碳十八烷基键合硅胶柱，流动相为权利要求6所示梯度洗脱，检测波长分别为：280nm(牛蒡苷)、237nm(甘草酸)、252nm(胡薄荷酮)，理论塔板数按牛蒡苷峰计算不低于3000。