CN100395254C - 药用甜叶菊糖苷的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种高纯度药用甜叶菊糖苷的制备方法，它包括Al2O3柱层析法纯化、浓缩和硅胶柱层析法纯化等过程。第一次层析以Al2O3为固定相，用第一次层析流动相洗脱，可去除葡萄糖、麦芽糖、蛋白质、色素等大分子的杂质，收集部分洗脱液后进行浓缩进行第二次层析。第二次层析以硅胶为固定相，用第二次层析流动相洗脱，可去除其他等杂质，收集部分洗脱液后进行浓缩进行经检测甜叶菊糖苷含量可达到95%-98%。采用本发明的方法生产的甜叶菊糖苷可达到了JECFA的要求，具有一定的理论意义和较高的实际应用价值。
Description
一、技术领域
本发明涉及的是一种提纯方法，具体地说是一种甜叶菊糖苷的提纯方法。
二、背景技术
目的意义：工业生产中甜味剂主要有三大类：
第一类是为化工合成产品：糖精、甜蜜素、阿斯巴甜等；
第二类是化学改性的天然植物性糖，如木糖醇、甘露糖醇；
第三类是天然植物性糖。天然植物性糖又包括有能量代谢(蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖等)，无能量代谢(甘草糖苷、甜叶菊糖苷等)。
随着人类生活水平的不断提高，人们更加倾向于使用安全性较高的天然产物：甘草糖苷和甜叶菊糖苷，因此在未来的生活中甘草糖苷和甜叶菊糖苷有较广阔的应用前景。
甜叶菊糖苷具有如下的特点：
1、甜叶菊糖苷甜度高，与糖苷浓度有关，大约为蔗糖的250～450倍，甜味接近于蔗糖，可代替糖精和部分蔗糖；甜叶菊糖苷主要有8种成分组成，其中Stevioside和Rebaudioside成分达到90％以上，而且Rebaudioside甜味最接近于蔗糖。
2、低热量，其热量大约为蔗糖的1/300，稳定性好，其在人体内不参与代谢。
3、无毒性的特点，大量的动物实验证明了甜叶菊糖苷无毒性，1970年开始，日本将从甜叶菊中叶片中提取甜叶菊糖苷作为了甜味剂在食品、保健品、药品等行业广泛应用。
4、还有报道甜叶菊糖苷对糖尿病、小儿龋齿、肥胖症、高血压、心脏病有一定防治功能和辅助疗效。
2004年8月，JECFA在第63次会议上认可了甜叶菊提取物使用的试行案。该试行案允许甜叶菊糖苷作为甜味剂使用，认为成人每天的安全摄取甜叶菊糖苷量为2mg/kg。该试行案的实施意味着：甜叶菊糖苷的应用将从部分地区走向世界。但是JECFA认为作为甜味剂的甜叶菊糖苷纯度必须在95％以上；目前在中国生产的甜叶菊糖苷纯度只有80％，还没有达到该试行案的要求。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种可以将甜叶菊糖苷的纯度达到95％以上，使甜叶菊糖苷的浓度可以达到药用标准的高纯度甜叶菊糖苷的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
1、Al2O3柱层析法纯化
(1)Al2O3的前处理：称取一定重量的Al2O3，经5％的HCl浸泡12h后，用蒸馏水洗至中性，湿法装柱，径高比为1∶10；
(2)上样：称取80℃下烘至恒重的纯度为80％甜叶菊糖苷粗干粉，粗干粉高度为Al2O3高度的1/5；
(3)洗脱和定性检测：用第一次柱层析的第一次流动相即丙酮∶石油醚＝1∶1进行洗脱，自然洗脱流速或液面高差为1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测，至无红色为止；改用用第一次柱层析的第二次流动相即100％乙醇进行洗脱，同时用自动部分收集器进行收集；对洗脱液进行硫酸显色定性检测，至无粉红色为止；
2.浓缩：收集第一次柱层析的第二次流动相洗脱液，进行浓缩；
3.硅胶柱层析法纯化
(1)装柱：称取一定重量的硅胶，用水浸泡后湿法装柱，径高比为1∶10；
(2)上样：将第2步的浓缩液体上样，上样量为硅胶柱高度的1/10；
(3)洗脱：用第二次柱层析的流动相即20％乙醇进行洗脱，自然洗脱流速或液面高差为1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测，从粉红色出现到无粉红色为止，收集该段洗脱液得到本发明的产品。
本发明的产品可以通过这样的方法来定性、定量检测：
(1)甜叶菊糖苷的定性检测法----硅胶薄层层析：用0.1mol/L的硼酸溶液调浆制硅胶板，展开体系：(正丁醇∶乙酸∶乙醚∶水＝9∶6∶3∶1)；显色剂：50％的硫酸。本方法能够将甜叶菊糖苷中的两种主要单体成分(St和RA)、麦芽糖、葡萄糖区分开。
(2)甜叶菊糖苷的定量检测有5种方法参考。
A.分光光度计可见光法。郝再彬申请的专利：快速测定甜叶菊糖苷含量的方法和专用试剂，专利申请号：200510010277.3；专利公开号：CN1731144A；2006年2月8日公示，见发明专利公报2006，22(06)：311；
B.流动注射化学发光法。杨丹，郝再彬(2005)，化学工程师04：23～25；
C.铁氰化钾-鲁米诺流动注射化学发光法。郝再彬申请的专利(正在申请中)；
D.高压液相色谱紫外检测法。坂牧成惠等(2004)。食品卫生志(日文)。45(2)：81～86；
E.毛细管电泳紫外检测法等方法。邵寒娟，胡涌刚(2001)。植物学通报，18(1)：113～117。
高纯度药用甜叶菊糖苷的定义：高纯度的含量为95％-98％；同时达到JECFA认可的甜叶菊提取物使用的试行案中纯度必须在95％以上的要求。[注：2004年8月世界卫生组织和联合国粮组织(WHO/FAO)所属的食品添加剂专家委员会(JECFA)在第63次会议上认可了甜叶菊提取物使用的试行案，纯度必须在95％以上的要求]。
药用：符合中华人民共和国药典的要求。
本发明所基于的原理为：吸附层析就是利用吸附剂这种吸附能力可受溶媒影响而发生改变的性质，在样品中的物质被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液冲洗，改变吸附剂的吸附能力，使被吸附的物质解吸，随洗脱液向前移动。经过反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的过程，物质即可沿洗脱液的前进方向移动，其移动速度取决于当时条件下吸附剂对该物质的吸附能力。若吸附剂对物质的吸附能力强，该物质向前移动的速度慢；反之，若吸附能力弱，其移动速度快。由于吸附剂对样品中个组分的吸附能力不同，所以在洗脱过程中个组分便会由于移动速度不同而逐渐的分离开来，这就是吸附层析的基本原理。
经本发明的方法可使甜叶菊糖苷的含量由80％提高到95％--98％，起到精细加工的目的，为我国生产的高纯度甜叶菊糖苷走向国际市场奠定了基础。这对于改变我国是甜叶菊糖苷生产大国，而不是生产强国的局面；对于中国的甜叶菊糖苷工业生产的未来，具有一定的理论意义和实际应用价值。
第一次层析以Al2O3为固定相，用第一次层析流动相洗脱，可去除葡萄糖、麦芽糖、蛋白质、色素等大分子的杂质，收集部分洗脱液后进行浓缩进行第二次层析。第二次层析以硅胶为固定相，用第二次层析流动相洗脱，可去除其他等杂质，收集部分洗脱液后进行浓缩进行经检测甜叶菊糖苷含量可达到95％--98％。
本发明的制备高纯度甜叶菊糖苷的方法，可使甜叶菊糖苷的含量达到98％，达到了JECFA的要求，具有一定的理论意义和较高的实际应用价值。
四、附图说明
图1是甜叶菊糖苷的结构式，其中R是H时为St、R是葡萄糖时为RA；
图2是几种糖的显色反应，其中：1.St；2.RA；3.麦芽糖；4.葡萄糖；
图3几种糖的薄层层析图，其中：1.St；2.RA；3.葡萄糖；4.麦芽糖。
五、具体实施方式
下面对本发明做更详细的描述：
1.材料：甜叶菊糖苷粗粉。
2.仪器设备：
BT124S万分之一电子天平；
玻璃层析柱(直径5.0cm×长80.0cm)；
玻璃试管；
SBSZ100数控计滴自动部分收集器；
UV-1600紫外可见分光光度计。
3.试剂：
(1)柱层析用的试剂：第一次柱层析：Al2O3、第一次流动相(丙酮∶石油醚＝1∶1)，第二次流动相(100％乙醇)；第二次柱层析：硅胶(100μm)、流动相(20％乙醇)。
(2)定性检测用的试剂：甜叶菊糖苷标准品(300倍蔗糖甜度的st和450倍蔗糖甜度的RA)、葡萄糖、麦芽糖，正丁醇、乙酸、乙醚、水、50％的硫酸。
4.Al2O3柱层析法纯化甜叶菊糖苷
(1)Al2O3的前处理：称取一定重量的Al2O3，经5％的HCl浸泡12h后，用蒸馏水洗至中性，湿法装柱，径高比为1∶10。
(2)上样：称取80℃下烘至恒重的纯度为80％甜叶菊糖苷样品(粗干粉)，粗干粉高度为Al2O3高度的1/5。
(3)洗脱和定性检测：用第一次柱层析的第一次流动相(丙酮∶石油醚＝1∶1)进行洗脱，自然洗脱流速或液面高差为1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测(图2)，至无红色为止。改用用第一次柱层析的第二次流动相(100％乙醇)进行洗脱，同时用自动部分收集器进行收集。对洗脱液进行硫酸显色定性检测(图2)，至无粉红色为止。
5.浓缩：收集第一次柱层析的第二次流动相(100％乙醇)洗脱液，进行浓缩。
6.硅胶柱层析法纯化甜叶菊糖苷
(1)装柱：称取一定重量的硅胶，用水浸泡后湿法装柱，径高比为1∶10。
(2)上样：将第5步的浓缩液体上样，上样量为硅胶柱高度的1/10。
(3)洗脱：用第二次柱层析的流动相(20％乙醇)进行洗脱，自然洗脱流速或液面高差为1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测(图2)，从粉红色出现到无粉红色为止。收集该段洗脱液。
7.定性、定量检测：
(1)硅胶薄层层析法定性检测甜叶菊糖苷：用0.1mol/L的硼酸溶液调浆制硅胶板，展开体系：(正丁醇∶乙酸∶乙醚∶水＝9∶6∶3∶1)；显色剂：50％的硫酸。本方法能够将甜叶菊糖苷中的两种主要单体成分(St和RA)、麦芽糖、葡萄糖区分开(图3)。
(2)分光光度法定量检测甜叶菊糖苷(参见郝再彬申请的专利：快速测定甜叶菊糖苷含量的方法和专用试剂，专利申请号：200510010277.3；专利公开号：CN1731144A；2006年2月8日公示，见发明专利公报2006，22(06)：311)
Claims (1)
1.一种药用甜叶菊糖苷的制备方法，其特征是：
1.1Al2O3柱层析法纯化
1.1.1Al2O3的前处理：称取一定重量的Al2O3，经5％的HCl浸泡12h后，用蒸馏水洗至中性，湿法装柱，径高比为1∶10；
1.1.2上样：称取80℃下烘至恒重的纯度为80％甜叶菊糖苷粗干粉，粗干粉高度为Al2O3高度的1/5；
1.1.3洗脱和定性检测：用第一次柱层析的第一次流动相即丙酮∶石油醚＝1∶1进行洗脱，自然洗脱流速或液面高差为1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测，至无红色为止；改用用第一次柱层析的第二次流动相即100％乙醇进行洗脱，同时用自动部分收集器进行收集；对洗脱液进行硫酸显色定性检测，至无粉红色为止；
1.2浓缩：收集第一次柱层析的第二次流动相洗脱液，进行浓缩；
1.3硅胶柱层析法纯化
1.3.1装柱：称取一定重量的硅胶，用水浸泡后湿法装柱，径高比为1∶10；
1.3.2上样：将第2步的浓缩液体上样，上样量为硅胶柱高度的1/10；
1.3.3洗脱：用第二次柱层析的流动相即20％乙醇进行洗脱，自然洗脱流速或液面高差为1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测，从粉红色出现到无粉红色为止，收集该段洗脱液得到产品。
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