CN103933122B - 一种厚朴总酚提取物的吸附分离制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种厚朴中两个同分异构体成分——和厚朴酚与厚朴酚的提取工艺，步骤包括吸附液的制备、大孔吸附树脂吸附、吸附后平衡、厚朴总酚的解吸和解吸液后处理。本发明克服了吸附分离法制备厚朴总酚提取物时共存生物碱的干扰，提出了有机溶剂中酸碱隔离提取的吸附液制备方法，建立了生物碱预分离与高纯度厚朴总酚吸附树脂提取的连续工艺，经“吸附－洗脱”一个工艺流程即可得到纯度高于70%的厚朴总酚提取物。吸附树脂法提取工艺操作简便，树脂可重复使用，适于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于天然植物中单体活性成分的提取纯化技术领域。特别是厚朴中两个同分异构体成分——和厚朴酚与厚朴酚的提取工艺。
背景技术
厚朴为常用中药，始载于《神农本草经》，列为中品，其后历代本草与《中国药典》均有记载。《中国药典》2010年版一部规定，厚朴为木兰科木兰属植物厚朴Magnoliaofficinalis Rehd.et Wils.或凹叶厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Wils. Var.bilobaRehd. et Wils. 的干燥干皮、根皮及枝皮。现代药理试验证明厚朴具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗炎、保护心脑血管、抗溃疡以及抗凝血等作用。
厚朴中的主要活性成分为厚朴酚与和厚朴酚，结构如图1所示。厚朴酚与和厚朴酚为同分异构体，难溶于水，可溶于稀的氢氧化钠溶液，易溶于有机溶剂。与此同时，厚朴中还含有生物碱成分[中草大辞典:下册[M]，军事医学出版社，2007，P1628-1630]，已分离得到的生物碱为9种异喹啉结构的生物碱[王洪燕,周先礼,黄帅,申向黎.凹叶厚朴中生物碱成分的研究[J].华西药学杂志.2007,22(1)]，结构如图2所示。
厚朴中的生物碱与厚朴酚在空间构型上相互匹配，易由强的疏水性的π-π相互作用结合在一起，成为一对结合体，这种疏水的π-π相互作用在极性溶剂中表现的更为明显。生物碱是植物中普遍存在的另一种活性成分，厚朴中生物碱常用于消炎灭菌、胸腹胀满、肠梗塞、痰饮喘满的症。厚朴总酚提取物中，由于生物碱的存在不仅使厚朴总酚提取物的纯度明显降低，同时也给后续的药理药效研究带来了不确定的影响。
厚朴酚与和厚朴酚传统的提取方法有热水浸提法和乙醇浸提法，但其杂质含量高，后续分离工艺复杂。现代提取技术有超声提取法、热浸渍提取法、碱提酸沉法、聚酰胺分离提取法、高速逆流色谱法、超临界二氧化碳萃取法等。超声提取法提取速度快，时间短，但其噪音大，且提取物纯度不高；热浸渍提取法提取后续步骤繁琐，萃取、重结晶等步骤有机溶剂用量大，提取物损失严重；高速逆流色谱法分离制备厚朴酚与和厚朴酚，纯度可满足要求，但制备量小，不宜用于工业化扩大生产；而超临界萃取法设备复杂，前期设备投入较大，这都限制了超临界萃取法的大规模工业化应用。溶剂萃取法的工艺繁琐、操作步骤多、溶剂的损失也较大。而且上述方法都面临着提取所得的厚朴总酚中含有生物碱类成分的问题，而残留的生物碱类成分与厚朴酚的结合作用，使得厚朴酚与和厚朴酚的同时提取很难实现。
近年来，大孔吸附树脂法因其工艺操作简单、环境友好、吸附树脂可重复使用、分离成本较低等优点，在天然植物有效成分的分离纯化中发挥了越来越重要的作用，吸附分离提取工艺也成为广泛应用的工业化生产和制备天然产物的成熟方法，在厚朴的有效成分提取中，也有吸附树脂分离的报道，但是到目前为止，所报道的方法中，制备的厚朴总酚提取物纯度较低，如赵春颖等用大孔树脂DM-301将中药厚朴中的厚朴酚含量由7.56%提高到15.26%[赵春颖,毛晓霞,张梓倩.大孔吸附树脂分离纯化厚朴酚的方法研究[J].承德医学院学报,2009,26(4):358-360]，叶卉等通过调节吸附液的乙醇浓度，降低了厚朴中部分杂质在树脂上的吸附作用随流出液流出，从而制备了纯度为46.0%的厚朴总酚提取物，但与此同时存在于厚朴中的生物碱类物质也由于乙醇浓度的提高而进入吸附液，随吸附——解吸过程进入最终产物，造成了厚朴总酚中生物碱类成分难以分离的问题，这必然制约了厚朴酚进一步的药理研究和药用开发[叶卉,冉晓辉,俞凯.厚朴提取物工艺研究[J].医药导报.2008,27(8):974-975]。
这是由于传统吸附液的制备方法通过乙醇的溶解能力将厚朴总酚提取至乙醇溶液中，然后蒸发部分乙醇以将厚朴酚与和厚朴酚转移至低浓度的乙醇水溶液中，当乙醇降至适宜浓度时，才可上柱吸附。在这个过程中，乙醇提取厚朴总酚的同时易溶于乙醇的生物碱也被提取出来。随着乙醇的减少，水的不加，溶液的极性逐渐增加，生物碱与厚朴酚之间的相互作用逐渐增强，通过强的π-π相互作用成为一对结合体共同保留在吸附液中，随着树脂对厚朴酚的“吸附—解吸”这一连续过程使得生物碱类成分进入最终的提取产物中。
发明内容
本发明为了解决这一制约高纯度厚朴总酚提取物制备中的关键问题，提出了有机溶剂中酸碱隔离提取的吸附液制备方法，建立了生物碱预分离与高纯度厚朴总酚提取的连续工艺，即在酸性乙醇溶液中将厚朴原药材加热回流，提取生物碱与厚朴总酚，此时生物碱以盐的状态存在，厚朴总酚以分子状态存在，同时在有机溶剂中生物碱与厚朴总酚的π-π相互作用被有效的破坏， 避免了两者以结合体的状态存在，在接下来的蒸发溶剂过程中，不断补加酸性水溶液，以保持生物碱始终溶解于溶液中，酚类成分因不溶于酸性水溶液而以沉淀的方式析出。经离心后将沉淀复溶于碱性水溶液中，即得到不含生物碱的吸附溶液。经树脂吸附、解吸后，即可得到纯度高于70%(w%)的厚朴总酚提取物，经检测生物碱显色剂甲醛——浓硫酸（Marquis试剂）检测，提取物中成分对该试剂呈负反应，证明提取物中不含生物碱。
本发明克服了吸附分离法制备厚朴总酚提取物时共存生物碱的干扰，提出了有机溶剂中酸碱隔离提取的吸附液制备方法，建立了生物碱预分离与高纯度厚朴总酚吸附树脂提取的连续工艺，经“吸附－洗脱”一个工艺流程即可得到纯度高于70%的厚朴总酚提取物。吸附树脂法提取工艺操作简便，树脂可重复使用，适于大规模工业化生产。
具体工艺步骤如下：
1.吸附液的制备：厚朴粉碎，用5%-7%（v%）的盐酸乙醇溶液，作为提取液，在55℃-70℃下提取厚朴酚与和厚朴酚，药材质量（g）与提取液体积（mL）比为1:3~1:5,，w/v，回流2-3h，抽滤，相同操作条件下提取两次，合并滤液、减压蒸馏回收乙醇后，补加pH=1-3的水，保持厚朴药材的质量（g）与溶液体积（mL）之比为1:5-1:6，离心，收集析出物。将析出固体溶于pH=11-13的30%（v%）乙醇水溶液中，厚朴药材质量（g）与溶液体积（mL）比为1:5-1:7，离心除去少量不溶物，得到上层清液，即为吸附液，吸附溶液将用于下一步的树脂纯化。
2.大孔吸附树脂吸附：所用树脂是商品化大孔吸附树脂（牌号AB-8、HPD-722、D101、CAD-40、CAD-45）。树脂装入交换柱中，吸附柱的长径比为1:5-1:20。将2-3倍床体积（BV）的上述吸附液通过装有大孔吸附树脂的树脂柱进行吸附，吸附流速为0.5-2.0BV / h；
3. 吸附后平衡：用2-3BV的去离子水将树脂清洗干净，再用2-3BV的60%（v%）乙醇水溶液继续清洗树脂柱，流速均为0.5-2.0BV / h；
4. 厚朴总酚的解吸：用3-5BV的 80%（v%）乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为0.5-2.0 BV / h，收集解吸液；
5. 解吸液后处理：将上述解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物，也可采用其他方式进行造粉或者造粒等处理。经HPLC测定，提取物中厚朴总酚纯度为70%-73%（w%），且通过Marquis试剂）检测，该提取物中不含生物碱。
本发明的优点和积极效果：
本发明克服了吸附分离法制备高纯度厚朴总酚提取物时共存生物碱的干扰，提出了有机溶剂中酸碱隔离提取吸附液的制备方法，建立了生物碱预分离与高纯度厚朴总酚吸附树脂提取的连续工艺，经“吸附－洗脱”一个工艺流程即可得到纯度为70%-73%（w%）、不含生物碱的厚朴总酚提取物。本发明工艺简单，树脂可重复使用，生产成本低，适于大规模工业化生产。
附图说明
图1 厚朴酚与和厚朴酚的分子结构式。
图2厚朴中几种生物碱的分子结构示意图。
具体实施方式
实施例1：
用商品化AB-8大孔吸附树脂提取高纯度厚朴总酚的工艺方法，步骤如下：
1）称取中药厚朴23g，粉碎，用5%（v%）的盐酸乙醇溶液90mL在60℃下提取，回流2h，抽滤，提取两次，合并滤液减压蒸馏回收乙醇，同时补加pH=2的水, 离心，收集析出物。将析出固体溶于pH=12.5的30%乙醇水溶液140mL中，离心除去少量不溶物，得到吸附液。
2）将60mL（2BV）的上述吸附液通过装有AB-8大孔吸附树脂的树脂柱（柱内径8 mm，柱长250 mm，装有30 mL湿树脂），吸附速度为1.0 BV/h；
3）吸附完成后，用90 mL（3BV）的去离子水将树脂清洗干净，用90mL（3BV）60%（v%）乙醇水溶液将树脂上吸附能力较弱的杂质洗脱下来速度为1.0BV / h；
4）用90mL（3BV）80%（v%）乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为1.0 BV / h，收集解吸液；
5）将上述解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物0.1955g。
经HPLC分析测定，提取物中厚朴总酚含量为70.1%（w%）， 且通过Marquis试剂检测，该提取物中不含生物碱。
实施例2：
用商品化D101大孔吸附树脂提取高纯度厚朴总酚的工艺方法，步骤如下：
1）称取中药厚朴25g，粉碎，用4%（v%）的盐酸乙醇溶液90mL在55℃下提取，回流2h，抽滤，提取两次，合并滤液减压蒸馏回收乙醇，同时补加pH=2.5的水, 离心，收集析出物。将析出固体溶于pH=11.5的30%乙醇水溶液145mL中，离心除去少量不溶物，得到吸附液。
2）将90mL（3BV）的上述吸附液通过装有D101大孔吸附树脂的树脂柱（柱内径8mm，柱长250mm，装有30 mL湿树脂），吸附速度为0.5 BV/h；
3）吸附完成后，用90 mL（3BV）的去离子水将树脂清洗干净，用90mL（3BV）60%（v%）乙醇水溶液将树脂上吸附能力较弱的杂质洗脱下来速度为0.5BV / h；
4）用120mL（4BV）80%（v%）乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为0.5BV / h，收集解吸液；
5）将上述解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物0.3124g。
经HPLC分析测定，提取物中厚朴总酚含量为71.3%（w%），且通过Marquis试剂检测，该提取物中不含生物碱。
实施例3：
用商品化CAD-40大孔吸附树脂提取高纯度厚朴总酚的工艺方法，步骤如下：
1）称取中药厚朴26g，粉碎，用6%（v%）的盐酸乙醇溶液85mL在62℃下提取，回流2.5h，抽滤，提取两次，合并滤液减压蒸馏回收乙醇，同时补加pH=2的水, 离心，收集析出物。将析出固体溶于pH=12的30%乙醇水溶液140mL中，离心除去不溶物，得到吸附液。
2）将90mL（3BV）的上述吸附液通过装有CAD-40大孔吸附树脂的树脂柱（柱内径8mm，柱长250 mm，装有30 mL湿树脂），吸附速度为1 BV/h；
3）吸附完成后，用60 mL（2BV）的去离子水将树脂清洗干净，用90mL（3BV）60%（v%）乙醇水溶液将树脂上吸附能力较弱的杂质洗脱下来速度为1BV / h；
4）用120mL（4BV）80%（v%）乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为1BV / h，收集解吸液；
5）将上述解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物0.3391g。
经HPLC分析测定，提取物中厚朴总酚含量为71.7%（w%），且通过Marquis试剂）检测，该提取物中不含生物碱。
实施例4：
用商品化AB-8大孔吸附树脂提取高纯度厚朴总酚的工艺方法，步骤如下：
1）称取中药厚朴48g，粉碎，用5%（v%）的盐酸乙醇溶液185mL在65℃下提取厚朴酚与和厚朴酚，回流2.5h，提取两次，抽滤，合并滤液减压蒸馏回收乙醇，同时补加pH=2的水,离心，收集析出物。将析出固体溶于pH=13的30%（v%）乙醇水溶液240mL中，离心除去少量不溶物，得到吸附液。
2）将120mL（2BV）的上述吸附液通过装有AB-8大孔吸附树脂的树脂柱（柱内径1.2mm，柱长200 mm，装有60 mL湿树脂），吸附速度为1.5 BV/h；
3）吸附完成后，用180 mL（3BV）的去离子水将树脂清洗干净，用180mL（3BV）体积百分比为60%（v%）乙醇水溶液将树脂上吸附能力较弱的杂质洗脱下来速度为1.5BV / h；
4）用240mL（4BV）体积百分比浓度为80%乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为1.5 BV/ h，收集解吸液；
5）将上述解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物0.3934g。
经HPLC分析测定，提取物中厚朴总酚含量为72.3%，且通过Marquis试剂）检测，该提取物中不含生物碱。
实施例5：
用商品化HPD-722大孔吸附树脂提取高纯度厚朴总酚的工艺方法，步骤如下：
1）称取中药厚朴48g，粉碎，用5%（v%）的盐酸乙醇溶液180mL在65℃下提取，回流2.5h，抽滤，提取两次，合并滤液减压蒸馏回收乙醇，同时补加pH=2的水, 离心，收集析出物。将析出固体溶于pH=13的30%乙醇水溶液240mL中，离心除去少量不溶物，得到上层清液，即为吸附液。
2）将120mL（2BV）的上述吸附液通过装有HPD-722大孔吸附树脂的树脂柱（柱内径12 mm，柱长200 mm，装有60 mL湿树脂），吸附速度为1.5 BV/h；
3）吸附完成后，用120 mL（2BV）的去离子水将树脂清洗干净，用120mL（2BV）60%（v%）乙醇水溶液将树脂上吸附能力较弱的杂质洗脱下来速度为1.5BV / h；
4）用240mL（4BV）80%（v%）乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为1.5BV / h，收集解吸液；
5）将上述解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物0.3824g。
经HPLC分析测定，提取物中厚朴总酚含量为70.0%（w%），且通过Marquis试剂）检测，该提取物中不含生物碱。
实施例6：
用商品化CAD-45大孔吸附树脂提取高纯度厚朴总酚的工艺方法，步骤如下：
1）称取中药厚朴52g，粉碎，用5%（v%）的盐酸乙醇溶液180mL在65℃下提取，回流2.5h，抽滤，提取两次，合并滤液减压蒸馏回收乙醇，同时补加pH=2的水, 离心，收集析出物。将析出固体溶于pH=13的30%乙醇水溶液240mL中，离心除去少量不溶物，得到上层清液，即为吸附液。
2）将180mL（3BV）的上述吸附液通过装有CAD-45大孔吸附树脂的树脂柱（柱内径12mm，柱长200 mm，装有60 mL湿树脂），吸附速度为1.5 BV/h；
3）吸附完成后，用120 mL（2BV）的去离子水将树脂清洗干净，用180mL（3BV）60%（v%）乙醇水溶液将树脂上吸附能力较弱的杂质洗脱下来速度为1.5BV / h；
4）用240mL（4BV）80%（v%）乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为1.5BV / h，收集解吸液；
5）将上述解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物0.6048g。
经HPLC分析测定，提取物中厚朴总酚含量为71.6%（w%），且通过Marquis试剂）检测，该提取物中不含生物碱。
实施例7：
用商品化D101大孔吸附树脂提取高纯度厚朴总酚的工艺方法，步骤如下：
1）称取中药厚朴107g，粉碎，用6%（v%）的盐酸乙醇溶液350mL在65℃下提取，回流2.5h，抽滤，提取两次，合并滤液减压蒸馏回收乙醇，同时补加pH=2的水, 离心，收集析出物。将析出固体溶于pH=12.5的30%乙醇水溶液240mL中，离心除去少量不溶物，得到吸附液。
2）将200mL（2BV）的上述吸附液通过装有D101大孔吸附树脂的树脂柱（柱内径15mm，柱长300 mm，装有100 mL湿树脂），吸附速度为1.5 BV/h；
3）吸附完成后，用300mL（3BV）的去离子水将树脂清洗干净，用300mL（3BV）60%（v%）乙醇水溶液将树脂上吸附能力较弱的杂质洗脱下来速度为1.5BV / h；
4）用240mL（4BV）80%（v%）乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为1.5BV / h，收集解吸液；
5）将上述解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物0.9596g。
经HPLC分析测定，提取物中厚朴总酚含量为72.8%（w%），且通过Marquis试剂）检测，该提取物中不含生物碱。
实施例8：
用商品化AB-8大孔吸附树脂提取高纯度厚朴总酚的工艺方法，步骤如下：
1）称取中药厚朴101g，粉碎，用5%（v%）的盐酸乙醇溶液320mL在70℃下提取厚朴酚与和厚朴酚，回流2h，提取两次，抽滤，合并滤液减压蒸馏回收乙醇，同时补加pH=1的水, 离心，收集析出物。将析出固体溶于pH=11.5的30%（v%）乙醇水溶液240mL中，离心除去少量不溶物，得到吸附液。
2）将200mL（2BV）的上述吸附液通过装有AB-8大孔吸附树脂的树脂柱（柱内径15mm，柱长300 mm，装有100 mL湿树脂），吸附速度为2.0 BV/h；
3）吸附完成后，用300 mL（3BV）的去离子水将树脂清洗干净，用300mL（3BV）体积百分比为60%乙醇水溶液将树脂上吸附能力较弱的杂质洗脱下来速度为2.0BV / h；
4）用300mL（3BV）体积百分比浓度为80%乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为2.0 BV/ h，收集解吸液；
5）将上述解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物0.9668g。
经HPLC分析测定，提取物中厚朴总酚含量为72.9%（w%），且通过Marquis试剂）检测，该提取物中不含生物碱。
Claims (2)
1.一种厚朴总酚提取物的吸附分离制备方法，其特征是，步骤包括吸附液的制备、大孔吸附树脂吸附、吸附后平衡、厚朴总酚的解吸和解吸液后处理，其中吸附液的制备方法为有机溶剂中酸碱隔离提取吸附液的制备方法；
所述的有机溶剂中酸碱隔离提取吸附液的制备方法的步骤为：将厚朴粉碎，用体积分数为5％-8％的盐酸乙醇溶液，作为提取液，在55℃-70℃下提取厚朴酚与和厚朴酚，药材质量与提取液体积比为1:3～1:5，g/mL，回流2-3h，抽滤，相同操作条件下提取两次，合并滤液、减压蒸馏回收乙醇后，补加pH＝1-3的水，保持厚朴药材的质量与溶液体积之比为1:5-1:6，g/mL，离心，收集析出物，将析出固体溶于pH＝11-13的体积分数为30％的乙醇水溶液中，厚朴药材质量与溶液体积比为1:5-1:7，g/mL，离心除去少量不溶物，得到上层清液，即为吸附液；
所述的大孔吸附树脂牌号为AB-8、HPD-722、D101、CAD-40、CAD-45。
2.根据权利要求1所述的厚朴总酚提取物的吸附分离制备方法，其特征是，所述的大孔吸附树脂吸附步骤为：将2-4倍床体积的吸附液通过装有大孔吸附树脂的树脂柱进行吸附，吸附流速为0.5-2.0BV/h，吸附柱的长径比为1:5-1:20；所述的吸附后平衡的步骤为：2-3BV的去离子水将树脂清洗干净，再用2-4BV的体积分数为60％的乙醇水溶液继续清洗树脂柱，流速均为0.5-2.0BV/h；所述的厚朴总酚的解吸步骤为：用3-5BV的体积分数为80％的乙醇水溶液作解吸剂，解吸速度为0.5-2.0BV/h，收集解吸液；所述的解吸液后处理步骤为：解吸液经减压蒸馏并回收乙醇，然后经浓缩、真空干燥，得到棕色厚朴总酚提取物。
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