CN115611711B - 厚朴药渣的资源化综合利用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药技术,具体涉及一种厚朴药渣的资源化综合利用方法。所述方法包括1)将厚朴药渣在碱性条件下进行预处理,得预处理液和预处理后的药渣;2)用MOF材料MIL‑101(Cr)吸附回收所述预处理液中的厚朴酚及和厚朴酚。本发明以厚朴药渣为原料实现了厚朴酚、和厚朴酚和β‑amyrin的联产。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术,具体涉及一种厚朴药渣的资源化综合利用方法。
背景技术
厚朴的年产量约30万吨,经水或乙醇提取后产生大量的厚朴药渣。传统厚朴药渣的处理方式主要是堆放、填埋或燃烧,造成资源浪费。厚朴药渣富含木质纤维素,可以有效地利用其生产高附加值的化合物。张等人使用藿香正气水药渣通过同步糖化发酵生产乙醇,Nguyen等人评估了姜黄药渣生茶乳酸和乙醇的可行性。Wang等人测试了六种药渣经稀酸预处理后产生琥珀酸的能力。Wang等人报道了将氢氧化钠(NaOH)用于预处理苦参药渣的可行性。
厚朴药材中的两个活性成分厚朴酚及和厚朴酚在厚朴药渣中有大量残留,可以回收再利用。目前未见相关报道。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中的技术问题之一,或者至少提供一种商业选择。
本发明公开一种厚朴药渣的资源化综合利用方法,包括以下步骤:
1)预处理:将厚朴药渣在碱性条件下进行预处理,得预处理液和预处理后的药渣;
2)吸附回收:用MIL-101(Cr)吸附回收所述预处理液中的厚朴酚及和厚朴酚。
本发明所述厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹叶厚朴Magnolia offinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮。
若无特殊说明,本发明所述厚朴药渣(MOR)是指厚朴药材通过水提取或乙醇提取后所得药渣。
在一些实施例,本发明所述厚朴药渣为水提制备厚朴配方颗粒后晾干的药渣。
在一些实施例,所述厚朴药渣中厚朴酚的含量为1.65-1.75g/100g,例如1.72g/100g;以及和厚朴酚的含量为0.5-0.6g/100g,例如0.56g/100g。
在一些实施例,使用碱溶液对厚朴药渣进行预处理,所述碱选自氢氧化钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠;优选为氢氧化钠。研究发现,使用碱溶液尤其是氢氧化钠溶液对厚朴药渣进行预处理,可以最大限度地将厚朴酚及和厚朴酚释放出来,从而有利于后续回收利用。
在一些实施例,所述碱溶液为0.5%-1.5%氢氧化钠溶液。
在一些实施例,所述预处理时,以g/mL计,厚朴药渣与碱溶液的固液比为1:(18-22),例如1:20。这样更有利于厚朴酚及和厚朴酚的释放。
在一些实施例,所述厚朴药渣为50-60目,例如40目。这样更有利于厚朴酚及和厚朴酚的释放。
在一些实施例,所述预处理的温度为70-90℃,例如80℃。这样更有利于厚朴酚及和厚朴酚的释放。
在一些实施例,所述预处理的时间为50-80min,例如60min。
在一些实施例,所述预处理在水浴的条件下进行。
在一些实施例,预处理后可采用常规方法例如离心或过滤得到得预处理液和预处理后的药渣。
在一些实施例,所述预处理具体包括:以g/mL计,将40目厚朴药渣与1%氢氧化钠溶液按固液比1:20混合,在80℃水浴中预处理60min;离心或过滤得到得预处理液和预处理后的药渣。
在一些实施例经预处理后,厚朴药渣中约90-92%的厚朴酚以及约95-97%的和厚朴酚可释放到预处理液中。
在一些实施例,为进一步提高厚朴酚及和厚朴酚的得率,可将预处理后的药渣用水洗涤,将洗涤液与预处理液混合,用于后续回收步骤。
在一些实施例,将预处理后的药渣干燥,用于后续步骤。
金属有机框架(MOF)是一类新的高度有序的多孔晶体材料,具有无限框架结构,可以从多功能有机配体和金属中心组装。本发明研究发现,MIL-101(Cr)能够最大限度地从预处理液中吸附回收厚朴酚及和厚朴酚。
在一些实施例,所述吸附回收时调整所述预处理液的pH为9-11,优选为9-9.5,更优选为9。研究发现,在预处理液的pH为9时MIL-101(Cr)对厚朴酚及和厚朴酚的吸附量最大。
在一些实施例,所述吸附回收的时间为6-8h。
在一些实施例,所述吸附回收时,MIL-101(Cr)用量为40-60mg,例如40 mg、50 mg或60 mg。
若无特殊说明,本文中,MIL-101(Cr)用量是指100mL厚朴酚浓度为100mg/L的预处理液中MIL-101(Cr)的添加量(以mg计)。
在一些实施例,还包括对使用后的MIL-101(Cr)进行清洗再生(例如使用甲醇清洗)的步骤。虽然随着使用MIL-101(Cr)循环次数的增加,其吸附量逐渐减少,但经过两次再生后,其吸附量仍可达到较高的水平。
与化学提取厚朴酚等其他方法相比,MIL-101(Cr)吸附不仅避免了大量试剂的消耗,而且节省了时间,减少了人工消耗。
在一些实施例,所述厚朴药渣的资源化综合利用方法还包括将预处理后的药渣通过纤维素酶酶解,得到还原糖;然后用酿酒酵母Y2-C2-4工程菌株对所述还原糖进行发酵以制备β-Amyrin(β-香树脂醇)的步骤。通过酿酒酵母Y2-C2-4工程菌株的发酵,利用还原糖生产高附加值的β-amyrin。
在一些实施例,纤维素酶酶解时,纤维素酶添加量为10-90 FPU/g DW,可选为30-60 FPU/g DW,优选为30 FPU/g DW。
本文中若无特殊说明,DW是指预处理后的药渣重量(干物质)。
在一些实施例,所述还原糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。
在一些实施例,所述酿酒酵母Y2-C2-4工程菌株由中国中医科学院中药研究所提供,该菌株已在文献(孙梦楚等,产β香树脂醇酿酒酵母细胞构建及高密度发酵,中国中药杂志,2019年,第44卷第7期,第1341-1349页)公开。
在一些实施例,所述厚朴药渣的资源化综合利用方法包括:
1)预处理:将厚朴药渣粉碎过40目筛,厚朴药渣与1%氢氧化钠溶液按固液比1:20混合,在80℃水浴中预处理60min;离心或过滤得到得预处理液和预处理后的药渣;
2)吸附回收:用MIL-101(Cr)吸附回收所述预处理液中的厚朴酚及和厚朴酚;所述吸附回收时调整所述预处理液的pH为9;所述吸附回收的时间为6-8h;吸附回收时,MIL-101(Cr)用量为40-60mg;
3)将预处理后的药渣通过纤维素酶酶解,得到还原糖;然后用酿酒酵母Y2-C2-4工程菌株对所述还原糖进行发酵,制备β-Amyrin;纤维素酶添加量为30-60 FPU/g DW。
本发明以厚朴药渣为原料实现了厚朴酚、和厚朴酚和β-amyrin的联产。MIL-101(Cr)吸附回收与厚朴药渣糖化发酵过程联合生产高附加值化学品,为中药资源利用提供了新的思路。本发明实施例中,1000公斤的厚朴药渣可实现170,700元的价值。本发明方法在厚朴药渣价值提升方面具有巨大的潜力。
附图说明
图1为厚朴药渣资源化综合利用的工艺路线图。
图2为模拟体系溶液的pH,吸附时间,吸附剂用量及使用次数对MIL-101(Cr)吸附厚朴酚的影响。
图3为不同酶用量对还原糖浓度和酶解率的影响。
图4为摇瓶发酵和发酵罐发酵的结果。
图5为100g厚朴药渣经资源化综合利用的产量及产值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
1.实验仪器与试剂
1.1实验仪器
ME204T/02型1/1万电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);
XSR105/A型1/10万电子分析天平(Mettler-ToledogmbH(Switzerland));
KQ-600E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);
1260型系列高效液相色谱仪-配置DAD检测器(美国Agilent公司);
赛默飞Vanquish高效液相色谱仪-配置CAD检测器(美国Thermo公司);
X-pert3 Powder XRD(荷兰PANalytical公司);
场发射扫描电镜(德国Merlin公司);
ASAP2020高速比表面孔径测定仪(美国Micrometer公司);
7.5L发酵罐(瑞士Infors公司);
2550型UV检测器(Shimadzu公司);
7890型GC-配置7000C型QQQ-MS(美国安捷伦);
1.2试剂
厚朴药渣来源于华润三九公司;纤维素酶Cellic® CTec3(诺维信公司,中国);厚朴酚(99.2%)及和厚朴酚(99.75%)(成都普思生物科技有限公司,四川);葡萄糖 (≥99.5%), 木糖 (≥99.5%), 阿拉伯糖 (≥99.5%),和三乙胺 (≥99.5%)均来自于麦克林公司(上海);角鲨烯和β-Amyrin来自于美国sigma公司。
2.厚朴药渣的资源化综合利用路线
本发明设计并测试了一种从厚朴药渣(MOR)中生产三种有价值产品的新工艺,如图1所示。在此过程中,实现了MOR中所有成分的综合再利用,以MOR为原料实现厚朴酚、和厚朴酚和β-amyrin的联产。首先,通过碱预处理破坏MOR的复杂结构,将厚朴酚、和厚朴酚等小分子化学物质释放到预处理溶液中,再由合成的MOF材料MIL-101(Cr)吸附预处理液中的厚朴酚及和厚朴酚。而其大分子组分,如纤维素和半纤维素,被酶水解成还原糖。最后,通过酿酒酵母Y2-C2-4工程菌株(参见上文)的发酵,利用还原糖生产高附加值的β-amyrin。本研究首次报道了MOF材料吸附与MOR糖化发酵过程联合生产高附加值化学品,为中药渣资源利用提供了新的思路。
3.厚朴药渣的预处理及组成成分分析
3.1预处理
预处理前,将厚朴药渣置于80℃烘箱中干燥至恒重,粉碎过40目筛。按固液比(以g/mL计)1:20加入厚朴药渣和1% NaOH溶液或1% HCl溶液混合,碱预处理在80℃水浴中反应60 min,酸预处理在高压灭菌锅中120℃反应60 min。反应结束后,以8000 r/min离心10min分离固体部分和液体部分。固体部分用水洗后于45℃烘箱中干燥至恒重,预处理液与洗涤液混合用于分离厚朴酚及和厚朴酚。
3.2组成成分分析
预处理前后药渣的厚朴酚及和厚朴酚采用《中华人民共和国药典》2020版中厚朴药材含量测定方法进行测定。结果如表1所示。MOR中厚朴酚及和厚朴酚的总含量高达2.28g/100g,而厚朴药材中厚朴酚及和厚朴酚的总含量高达2.41g/100g,说明MOR中有95%的厚朴酚和和厚朴酚残留在MOR中,可回收使用。稀酸预处理的MOR中厚朴酚及和厚朴酚的总含量为1.95g/100g,稀碱预处理后的MOR中厚朴酚及和厚朴酚的总含量仅为0.15g/100g。经测定预处理后溶液中厚朴酚和和厚朴酚的总含量后,这种现象是非常合理的。稀酸预处理溶液中厚朴酚及和厚朴酚的总含量为0.33g/100g,占未处理MOR的14.47%(表1),而碱预处理中厚朴酚及和厚朴酚的溶解量较大,分别为1.58g/100g和0.54g/100g,其在碱预处理溶液中的总量占未处理MOR的92.98%。这些数据充分说明,在稀碱性预处理过程中,MOR中的厚朴酚和和厚朴酚大部分释放到液体中,而在稀酸预处理后,厚朴酚及和厚朴酚仍保留在MOR固体中。在本研究中可将碱预处理液中的厚朴酚及和厚朴酚回收利用。
此外,分析了预处理前后MOR木质纤维素组成成分的变化。预处理前后厚朴药渣的木质纤维素成分采用美国可再生能源实验室(NREL)标准分析方法进行测定,结果如表2所示。MOR原料纤维素含量为28.21%,半纤维素含量为16.96%,木质素含量为24.13%。同时考察了稀酸(1% HCl)和稀碱(1% NaOH)两种预处理方法对MOR的化学成分的影响。稀酸和稀碱预处理后MOR中纤维素含量分别增加至39.9%和43.1%(表2)。稀酸预处理MOR中半纤维素含量下降至7.7%,稀碱预处理MOR为17%,与未预处理的MOR相似(表2)。对于木质素含量,1% HCl预处理MOR木质素含量较高,为31.7%,1% NaOH预处理MOR木质素含量较低,为19.9%。1% HCl和1% NaOH预处理的固体回收率分别为57.87%和61.07%,说明两种预处理方法都破坏了MOR的生物量结构(表2)。1% HCl预处理的纤维素和半纤维素回收率分别为66.10%和26.69%。相比之下,1% NaOH预处理对纤维素和半纤维素的回收率均高于1% HCl预处理,分别为93.35%和79.78%(表2)。1% HCl预处理对木质素的去除率为24.00%,远低于1% NaOH预处理(49.41%;表2)。
这些结果表明,稀酸预处理主要通过去除MOR中半纤维素来提高纤维素对纤维素酶的可及性。而1% NaOH预处理主要通过去除木质素和最大限度保留纤维素来提高酶解效果。此外,厚朴酚和和厚朴酚在稀碱预处理过程中大量释放到液体中,易于回收,而在稀酸预处理过程中,厚朴酚和和厚朴酚则保留在预处理后的MOR固体中。这些数据充分支持1%NaOH预处理比稀酸预处理更适合于分解MOR。
表1 预处理前后厚朴药渣厚朴酚及和厚朴酚含量
a1%HCl预处理后药渣中厚朴酚及和厚朴酚的总量/原药渣中厚朴酚及和厚朴酚的总量;
b1%NaOH预处理后药渣中厚朴酚及和厚朴酚的总量/原药渣中厚朴酚及和厚朴酚的总量;
c1%HCl预处理后溶液中厚朴酚及和厚朴酚的总量/原药渣中厚朴酚及和厚朴酚的总量;
d1%NaOH预处理后溶液中厚朴酚及和厚朴酚的总量/药渣中厚朴酚及和厚朴酚的总量。
4.MOFs材料的合成及吸附厚朴酚及和厚朴酚过程
4.1MOFs材料的合成
MIL-101(Cr):将800 mg九水硝酸镉和332 mg对苯二甲酸置于10 mL 0.05 mol/L乙酸钠溶液中混合,置于磁力搅拌器搅拌30 min,混合均匀后置于200℃烘箱中反应12 h,反应结束后冷却至室温,用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和热乙醇洗涤数次,最后将样品于60℃烘箱中烘干,使用前将样品于120℃烘箱中活化4 h。
MIL-100(Fe):将2.5 mmol九水合硝酸铁溶于12 ml水中,再加入1.68 mmol均苯三酸混匀后,转移到聚四氟乙烯反应釜内并加入89 μL的HF和68 μL 的HNO3作为晶体调节剂。将反应釜程序升温到150℃后保持24 h,降温后分别用无水乙醇、50% 乙醇水溶液对其进行洗涤、离心和真空干燥,最后得到浅橙色固体粉末即为MIL-100(Fe)。
MIL-53(Al):称取2.55g Al(NO3)3·9H2O和1.66g对苯二甲酸溶解在70 ml DMF溶剂中,利用磁力搅拌器搅拌1 h加快反应物溶解过程到溶液呈现澄清状态,随后将溶液倒入高温高压反应釜内,在190℃的恒温鼓风干燥箱中反应72 h。反应结束后取出高温高压反应釜并让其自然冷却达到室温状态。过滤使白色沉淀分离出来,用DMF溶液洗涤白色沉淀三次。将白色沉淀放入温度设定为80℃恒温干燥箱中干燥12 h,干燥后的样品为孔道中留有客体分子的MIL-53(Al)。
4.2 MOFs的表征
比表面积及孔径采用高速比表面孔径测定仪测定样品在77 K下的N2吸附-解吸等温线,采用Brunauer–Emmett–Teller(BET)模型计算孔径和比表面积,结果如表3所示。
4.3MIL-101(Cr)吸附和重复使用性能
在表1中,MOR中大量的厚朴酚和和厚朴酚在碱预处理过程中释放到碱预处理液中。为了通过MOFs材料分离这些有价值的化学物质,发明人制备了一个模拟系统来探索MOFs材料的最佳吸附条件。与其他化学物质不同,当pH值为>9时,厚朴酚在水中的溶解度最大。当pH<9时,液中厚朴酚浓度大幅下降,且几乎全部沉淀在中性液中。因此,MIL-101(Cr)吸附厚朴酚的模拟体系探究的pH条件为9~12,结果如图2的a所示。
随着pH从9增加到12,三种MOFs材料对厚朴酚的吸附量均逐渐减小。其中MIL-101(Cr)吸附量在pH 9时为255.64 mg/g,相较于其它两种吸附量最大,并且是pH 9.5时该材料吸附量的2.3倍。三种材料在pH为12时对厚朴酚均无吸附作用,吸附量急剧下降,这是因为MIL系列材料的结构在pH为>10时逐渐崩解,在pH为12时被完全破坏。
在图2的b中MIL-101(Cr)吸附6小时后吸附达到平衡,吸附量保持稳定。另外两种材料的吸附平衡时间分别为9小时和10小时,相较于MIL-101(Cr)平衡时间较长,可能是由于这两种材料的孔径较小。
本研究考察了吸附剂用量对溶液中厚朴酚回收率的影响(图2的c)。本研究中,吸附剂用量是指100 mL浓度为100 mg/L的厚朴酚溶液中吸附剂的添加量(以mg计)。结果表明,随着MOFs材料添加量的增加,厚朴酚的吸附率增加。当MIL-101(Cr)用量为5、10、20、40、50和60 mg时,厚朴酚的吸附率分别为9.50%、14.82%、45.31%、80.08%、97.65%和98.03%。而MIL-100(Fe)和MIL-53(Al)在60 mg时的吸附率分别为78.35%和65.22%,其吸附量相对于MIL-101(Cr)均较低。模拟溶液中加入50 mg MIL-101(Cr)时,厚朴酚回收率为97.65%,仅比添加60 mg时降低0.38%,说明对于100 mL浓度为100 mg/L的厚朴酚溶液50 mg的吸附剂用量为最佳用量。结果表明,MIL-101(Cr)对厚朴酚的吸附效果相较于另外两种MOFs材料最好,并且其对厚朴酚的最佳吸附条件为pH 9,吸附剂用量为50 mg,吸附时间为6 h,并且在此条件下MIL-101对厚朴酚的吸附量为255.64 mg/g。
用甲醇清洗使用后的MIL-101(Cr)后,也评估了MIL-101(Cr)的可重用性。虽然随着循环次数的增加,吸附量逐渐减少,但经过两次再生后,吸附量仍可达到141.97±5.14mg/g(图2的d)。
用合成的MIL-101吸附1% NaOH预处理后MOR溶液中的厚朴酚及和厚朴酚。先将溶液pH调至9,加入50 mg MIL-101吸附12 h。MIL-101(Cr)在真实体系(碱预处理液)中对厚朴酚和和厚朴酚的回收率分别为76.02±1.38%和62.59±5.07%,可解吸、纯化、重复使用。回收率低于模拟溶液,这可能是由于液体溶液中吸附了其他化学物质造成的,与之前的研究相比,这并不是个例。结果表明,吸附法能有效回收废液中的厚朴酚。此外,与化学提取厚朴酚等其他方法相比,MIL-101(Cr)吸附不仅避免了大量试剂的消耗,而且节省了时间,减少了人工消耗。
表2 预处理前后厚朴药渣的组成
表3 MIL-101(Cr)在77K时N2吸附等温线计算的孔隙参数
5.酶解过程
5.1酶解实验
酶解在50 mL Erlenmeyer烧瓶中进行,烧瓶中含有1.5g MOR(包括酸预处理、碱预处理和未处理后的MOR)和15 mL柠檬酸缓冲液(50 mM, pH 4.8)。酶解过程在50℃恒温培养箱摇床中进行72 h。为了探究酶的用量,测试了10、20、30、50和90 FPU/g DW的酶载量。
5.2还原糖浓度测定
所有还原糖均采用带有电气溶胶检测器的高效液相色谱进行定量分析。采用Waters X-Bridge Amide(3.5 μm, 4.6 × 250 mm)色谱柱,柱温为35℃,流动相为0.2%三乙胺的水溶液和乙腈的混合物,比例为1:3,流量为0.5 mL/min。
5.3酶解产还原糖结果
首先用未处理的MOR来评估糖的产量,只生产了16.2g/L的还原糖,包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。为了增加还原糖的含量,采用稀酸预处理和稀碱预处理后解聚MOR。1% NaOH预处理MOR产生的还原糖浓度达到32.13g/L,比1% HCl预处理的19.39g/L高65%。
酶用量对还原糖浓度和酶解率的影响如图3所示。当纤维素酶添加量从10 FPU/gDW增加到90 FPU/g DW时,还原糖总浓度从15.98±0.34增加到39.20±0.20g/L(图3的a)。酶解率由33.34±0.71%增加到81.81±0.68%(图3的b)。木糖和阿拉伯糖的浓度分别为1.76~ 2.54和0.65 ~ 1.14g/L。而葡萄糖浓度则在13.05 ~ 36.01g/L之间。当纤维素酶投加量为30 FPU/g DW时,酶解率达到71.01%,得到34.63g/L可发酵糖,仅比90 FPU/g DW时降低11.61%。当酶加量设置为30 FPU/g DW时,酶解率与45和60 FPU/g DW无显著差异,说明30FPU/g DW是MOR酶解的最佳酶用量(图3的b)。注:DW是指预处理后的药渣重量(干物质)。
6.发酵生产β-Amyrin
6.1发酵实验
对于摇瓶发酵,将提前构建好的菌株接种到SD培养基中并培养24 h。培养后的菌株接种到20 mLSD培养基中使OD600值为0.05,再培养12~20 h。在250 mL的烧瓶中进行分批发酵,瓶中加入50 mL YPD培养基,其中包括酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,加入含葡萄糖20g/L的酶解液在30°C和200 rpm下发酵10天。
在7.5 L发酵罐中进行补料分批发酵,种子培养的准备方法与烧瓶发酵相似。将菌株接种量维持在5% (v/v),用NaOH将pH调整为5.0后,在30℃下开始发酵。在初始批次阶段将溶解氧调整到30%,并通过搅拌速度(300-1000 rpm)、空气流量(3-20 L/min)和进料速率(0-100%)的组合逐步补料。在对数阶段,通过在发酵过程中自动添加含200g/L葡萄糖的酶解液,使发酵罐内葡萄糖浓度保持在0.5~1g/L左右。72h后,加入乙醇作为碳源生产β-Amyrin,使溶解氧级联至30%。
6.2测定方法
用岛津UV-2550分光光度计测定所有菌株在600 nm处的光密度(OD600)。角鲨烯和β-amyrin采用Agilent Technologies 7890气相色谱联用7000C三四极质谱(AgilentTechnologies)分析。取2微升样品,注入温度300℃,无喷口注入。为了分离样品,两个HP-5ms色谱柱(15 m × 0.25 mm,即× 0.25 μm膜厚)通过一个净化的终极连接件连接。氦载气保持恒定流量。第一列流速为1.1 mL/min,第二列流速为1.3 mL/min。列温度程序如下:1分钟在80°C,紧随其后的是加热列310°C在20°C /分钟和维护310°C 17.5分钟,多反应监测模式被用于收集数据。
6.3发酵结果
本研究采用酿酒酵母Y2-C2-4工程菌株(参见上文)进行发酵。采用可发酵糖浓度为20g/L的MOR酶解液进行分批发酵。在图4的a中,菌株逐渐生长,发酵结束时OD600达到22.9。在整个发酵过程中,角鲨烯的产量逐渐积累并迅速转化为β-amyrin,在40h,48h后产生的β-amyrin迅速增加,直到发酵96 后β-amyrin积累较为缓慢。β-amyrin在全部葡萄糖和部分木糖、阿拉伯糖被消耗的情况下达到34.39 mg/L。
用同样的酿酒酵母Y2-C2-4工程菌株进行发酵罐大量补料分批发酵,以获得更高的β-amyrin产量(图4的b)。正如预期的那样,由于发酵罐的有利条件,菌株的生长速度比在烧瓶中更快,发酵结束时OD600达到190。β-amyrin产量随菌株生长而增加,发酵后开始逐渐积累,β-amyrin的产量呈线性增长,最终在220 h达到最大值,达到382 mg/L。在144 h的补料发酵过程中,该菌株还产生了52 mg/L的β-amyrin的前体化合物角鲨烯。由于菌株生长较快,角鲨烯在60 ~ 144 h开始积累,144 h后进一步消耗,表明其有效转化为β-Amyrin。在补料分批发酵过程中,葡萄糖、木糖和阿拉伯糖消耗的还原糖分别为260克、20克和9克。此外,在使用MOR水解物发酵过程中没有观察到生长抑制,说明预处理产生的抑制因子可以忽略。这些数据完全支持MOR酶解液可用于这些工程菌株的发酵,其生产价值远远高于以往大宗化学品的植物源性化学品。
7产物增值计算
对1%NaOH预处理后的MOR的产值进行了评估,结果如图5所示。对于100g MOR,通过MIL-101(Cr)吸附可回收大于800 mg的厚朴酚及100 mg的和厚朴酚,酶解后可产生22.36g的还原糖,批量发酵后可得到764 mg β-amyrin。目前这些化合物的价格分别为:厚朴酚~2000元/公斤,和厚朴酚~ 1500元/公斤,β-amyrin ~ 20000元/公斤。因此,1000公斤的MOR可实现170,700元的价值,说明本研究开发的工艺在MOR价值提升方面具有巨大的潜力。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)预处理:将厚朴药渣在碱性条件下进行预处理,得预处理液和预处理后的药渣;
2)吸附回收:用MIL-101(Cr)吸附回收所述预处理液中的厚朴酚及和厚朴酚。
2.根据权利要求1所述厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,所述厚朴药渣中厚朴酚的含量为1.65-1.75g/100g;以及和厚朴酚的含量为0.5-0.6g/100g。
3.根据权利要求1或2所述厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,使用碱溶液对厚朴药渣进行预处理,所述碱选自氢氧化钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠。
4.根据权利要求3所述厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,所述碱溶液为0.5%-1.5%氢氧化钠溶液;和/或,
以g/mL计,厚朴药渣与所述碱溶液的固液比为1:(18-22);和/或,
所述厚朴药渣为50-60目。
5.根据权利要求1、2、4任一项所述厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,所述吸附回收时调整所述预处理液的pH为9-11。
6.根据权利要求5所述厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,所述吸附回收时调整所述预处理液的pH为9。
7.根据权利要求1、2、4、6任一项所述厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,所述吸附回收时,MIL-101(Cr)用量为40-60mg;所述MIL-101(Cr)用量是指100mL厚朴酚浓度为100mg/L的预处理液中MIL-101(Cr)的添加量。
8.根据权利要求1、2、4、6任一项所述厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,所述厚朴药渣的资源化综合利用方法还包括将预处理后的药渣通过纤维素酶酶解,得到还原糖;然后用酿酒酵母Y2-C2-4工程菌株对所述还原糖进行发酵以制备β-香树脂醇的步骤。
9.根据权利要求8所述厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,所述纤维素酶酶解时,纤维素酶添加量为10-90 FPU/g DW。
10.根据权利要求1或2所述厚朴药渣的资源化综合利用方法,其特征在于,包括:
1)预处理:将厚朴药渣粉碎过40目筛,再与1%氢氧化钠溶液按固液比1:20混合,在80℃水浴中预处理60min;离心或过滤得到得预处理液和预处理后的药渣;
2)吸附回收:用MIL-101(Cr)吸附回收所述预处理液中的厚朴酚及和厚朴酚;所述吸附回收时调整所述预处理液的pH为9;所述吸附回收的时间为6-8h;吸附回收时,MIL-101(Cr)用量为40-60mg;所述MIL-101(Cr)用量是指100mL厚朴酚浓度为100mg/L的预处理液中MIL-101(Cr)的添加量;
3)将预处理后的药渣通过纤维素酶酶解,得到还原糖;然后用酿酒酵母Y2-C2-4工程菌株对所述还原糖进行发酵,制备β-香树脂醇;纤维素酶添加量为30-60 FPU/g DW。
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