CN109371068A - 一种利用烟杆作为生物炼制原料制备乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种利用烟杆生物炼制生产乙醇的方法。所述预处理方法具体是取去烟叶后的新鲜烟杆,晾晒烘干后切碎后,加入浓度为0.2%~5%的NaOH溶液,并置于80℃~90℃的水浴锅中处理30min~120min,水洗过滤至中性,收集处理后的纤维质残渣烘干得到预处理后的烟杆原料,然后加入其重量10~30%的纤维素酶和pH为4.8、浓度为50mmol/L的醋酸纳缓冲溶液混合,并接种活化好的酵母溶液置于40℃~50℃的恒温水浴中发酵48h~72h后过滤,收集滤液即得到乙醇溶液。本发明中的方法酶解糖化发酵的乙醇得率可达106.64mg/g,较未处理烟杆提高138%。大大提高了烟杆的利用率。
Description
技术领域
本发明属于生物炼制技术,具体是一种利用烟杆作为生物炼制原料制备乙醇的方法。
背景技术
烟草是世界上最重要的非食用经济作物之一,为各国广泛种植。烟叶是烟草工业的主要原料,在烟叶采收后,往往剩余大量烟杆。据估计,全球每年在烟草种植中产生的烟杆可达2.6亿吨以上。这些烟杆即不能作为农用燃料,焚烧后又污染大气,只能堆积在田间地头自然腐烂,严重污染环境。
近年来,环境友好的生物炼制技术逐渐成为木质纤维素类农林废弃物资源化利用的发展趋势。该过程通常利用纤维素酶和微生物将木屑、秸秆等废弃物转化为糖、乙醇、乳酸等生物基产品。乙醇是于烟草加工过程中的比较重要辅料,通常应用于美拉德反应、香料提取等等方面。因此,如果利用生物炼制技术将烟杆转化为乙醇,不仅有助于实现废弃物资源的高值化利用,又能为烟草企业提供廉价的辅料来源,这对提高烟草行业资源化循环利用水平无疑具有重要的意义。
然而,目前利用烟杆进行生物炼制的研究并不多见,其瓶颈在于木质纤维素结构对纤维素酶解的高抗性导致极低的生物转化效率。近年来,研究者们发现预处理技术可以有效降低木质纤维素转化抗性、提高转化效率。常用的预处理方法包括酸预处理、碱预处理、蒸汽爆破预处理、超压临界水预处理和高压湿氧化预处理等。通常不同原料所适用的预处理方式和条件并不相同,如农业秸秆废弃物更适用于酸、碱等化学预处理方式。因此,选择适当的预处理技术和处理条件将有望提高烟杆生物转化效率,实现烟杆的高效生物炼制。
发明内容
本发明根据现有技术的不足,提供一种利用烟杆作为生物炼制原料制备乙醇的方法,该方法通过对烟杆进行特殊的预处理,使其能够实现高效的生物炼制,利用废弃的烟杆作为生物炼制的原料,生产用于烟草加工中的乙醇原料,大大提高了烟杆的利用率,节约了生产成本。
本发明提供的技术方案:所述一种利用烟杆作为生物炼制原料制备乙醇的方法,其特征在于具体步骤如下:
(1)原料的预处理
a.取去烟叶后的新鲜烟杆,晾晒烘干后切碎后,按照固液比1:5-1:30的比例加入浓度为0.2%~5%的NaOH溶液;
b.将步骤a中的固液混合物在80℃~90℃的水浴锅中处理30min~120min,并进行水洗过滤至中性,收集处理后的纤维质残渣于50~60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料;
(2)将5g~20g酿酒酵母干粉制剂加入重量比为20~50倍的质量百分比浓度为2%~5%的葡萄糖溶液中,在40℃~50℃活化0.5h~1.5h,然后在30℃~35℃下活化1h~2h至起泡备用;
(3)取步骤(1)中经过预处理后的烟杆原料,加入其重量10~30%的纤维素酶,并加入pH为4.8、浓度为50mmol/L的醋酸纳缓冲溶液混合均匀;其中烟杆原料与醋酸纳缓冲溶液的质量比为1:20~1:50;
(4)向混合溶液中接种溶液重量的7%~15%的步骤(2)中已活化好的酵母溶液,并置于40℃~50℃的恒温水浴中发酵48h~72h后过滤,收集滤液即得到乙醇溶液。
本发明较优的技术方案:所述烟草原料的预处理具体步骤如下:
a取去烟叶后的新鲜烟杆,晾晒烘干后切碎后,按照固液比1:10的比例加入浓度为2%的NaOH溶液;
b将步骤a中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min,并进行水洗过滤至中性,收集处理后的纤维质残渣于50~60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。
本发明较优的技术方案:所述烟草原料的预处理的步骤a中在加入NaOH溶液之前,先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质,于室外自然晾晒5~30天后,将其在50~60℃的烘箱中烘烤1~3天,随后将其取出冷却至室温,并用粉碎机将其切碎至0.5~5cm长度的小段后放入1-10L反应器中。
本发明较优的技术方案:所述烟草原料的预处理的步骤b中的固液混合物在加热处理之前,先在40~75℃的条件恒温浸泡0.5~24小时。
本发明较优的技术方案:所述烟草原料的预处理的步骤b中的加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤,抽滤完成后再加入固定液混合物体积2~10倍的蒸馏水进行水洗,直至洗出液用pH试纸检测为pH=7,然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣,在烘箱中于50~60℃条件下烘烤1~4天得到预处理后的烟杆原料。
本发明较优的技术方案:所述烟草原料的预处理具体步骤如下:
a取去烟叶后的新鲜烟杆,晾晒烘干后切碎后,按照固液比1:10的比例加入浓度为2%的NaOH溶液;
b将步骤a中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min,并进行水洗过滤至中性,收集处理后的纤维质残渣于50~60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。
本发明较优的技术方案:所述烟草原料的预处理的步骤a中在加入NaOH溶液之前,先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质,于室外自然晾晒5~30天后,将其在50~60℃的烘箱中烘烤1~3天,随后将其取出冷却至室温,并用粉碎机将其切碎至0.5~5cm长度的小段后放入1-10L反应器中。
本发明较优的技术方案:所述烟草原料的预处理的步骤b中的固液混合物在加热处理之前,先在40~75℃的条件恒温浸泡0.5~24小时。
本发明较优的技术方案:所述烟草原料的预处理的步骤b中的加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤,抽滤完成后再加入固定液混合物体积2~10倍的蒸馏水进行水洗,直至洗出液用pH试纸检测为pH=7,然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣,在烘箱中于50~60℃条件下烘烤1~4天得到预处理后的烟杆原料。
本发明通过对烟杆进行碱预处理,使烟杆能够作为生物炼制的原料制备还原糖,其制备的还原糖可以作为烟草加工和烟用原料提取中,提高了废弃烟杆的利用率,节约了烟草生产的成本;且本发明中的生产方法,其乙醇得率能够提高60.2%。
附图说明
图1是对比实验3中化学预处理对烟杆酶解糖化和乙醇转化的影响对比图;
图2是对比试验5中碱预处理时间和氢氧化钠浓度对烟杆乙醇转化的影响对比。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进一步说明。
实施例1所述的一种利用烟杆生物炼制生产还原糖的方法,其特征在于具体步骤如下:
(1)烟杆原料的预处理:
a.取新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质,于室外自然晾晒10天后,将其在50℃的烘箱中烘烤2天,随后将其取出冷却至室温,并用粉碎机将其切碎至0.5~5cm长度的小段后放入5L反应器中,按照固液比1:5的比例加入浓度为4%的NaOH溶液;
b.将步骤(1)中的固液混合物在40~75℃的条件恒温浸泡3小时,然后加热至80℃预处理70min,加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤,抽滤完成后再加入固定液混合物体积2~10倍的蒸馏水进行水洗,直至洗出液用pH试纸检测为pH=7,然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣,在烘箱中于50~60℃条件下烘烤1~4天得到预处理后的烟杆原料A;
(2)将15g酿酒酵母干粉制剂加入150mL质量百分比浓度为5%的葡萄糖溶液中,在50℃活化0.5h,然后在30℃下活化2h至起泡备用;
(3)取预处理得到烟杆原料A置于容器中,并加入其重量30倍的浓度50mM pH4.8的醋酸纳缓冲溶液和烟杆原料重量30%的纤维素酶搅拌均匀;
(4)向混合溶液中接种溶液重量的10%的步骤(2)中已活化好的酵母溶液,并置于50℃的恒温水浴中发酵48h后过滤,收集滤液即得到乙醇溶液。
实施例2:一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法,其特征在于具体步骤如下:
(1)烟杆原料的预处理:
a.取新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质,于室外自然晾晒20天后,将其在55℃的烘箱中烘烤2天,随后将其取出冷却至室温,并用粉碎机将其切碎至0.5~5cm长度的小段后放入10L反应器中,按照固液比1:10的比例加入浓度为2%的NaOH溶液;
b.将步骤(1)中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min,并进行水洗过滤至中性,收集处理后的纤维质残渣于50~60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料B。
(2)将10g酿酒酵母干粉制剂加入120mL质量百分比浓度为3%的葡萄糖溶液中,在45℃活化1h,然后在35℃下活化1h至起泡备用;
(3)取步骤(1)中处理的烟杆原料B置于250ml三角瓶中,并加入其重量15倍的浓度50mM、pH4.8的醋酸纳缓冲溶液和其重量15%的纤维素酶搅拌均匀;
(4)向混合溶液中接种溶液重量的7%的步骤(2)中已活化好的酵母溶液,并置于45℃的恒温水浴中发酵72h后过滤,收集滤液即得到乙醇溶液。
实施例3:一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法,其特征在于具体步骤如下:
(1)烟杆原料的预处理:
a.先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质,于室外自然晾晒30天后,将其在60℃的烘箱中烘烤1天,随后将其取出冷却至室温,并用粉碎机将其切碎至0.5~5cm长度的小段后放入8L反应器中,按照固液比1:20的比例加入浓度为0.5%的NaOH溶液;
b.将步骤(1)中的固液混合物在40℃的条件恒温浸泡0.5小时,加热至90℃的水浴锅中处理60min,加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤,抽滤完成后再加入固定液混合物体积2~10倍的蒸馏水进行水洗,直至洗出液用pH试纸检测为pH=7,然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣,在烘箱中于50~60℃条件下烘烤1~4天得到预处理后的烟杆原料C。
(2)取5g酿酒酵母干粉制剂加入100mL质量浓度2%的葡萄糖溶液,在40℃活化30min,然后在32℃下活化1.5h至起泡备用;
(3)取2.5g预处理得到烟杆原料C置于250ml三角瓶中,并加入100mL浓度50mMpH4.8的醋酸纳缓冲溶液和0.5g纤维素酶搅拌均匀;
(4)向步骤(3)的三角瓶中接种溶液重量的15%的已活化好的酵母溶液,置于40℃水浴锅内发酵48h后过滤,收集滤液即得到所述乙醇溶液。
利用高效液相色谱仪测定滤液中的乙醇浓度,色谱柱:Sugar-pak-1钙型阳离子交换柱(美国Waters公司),流动相:0.05g/L EDTA钙钠溶液,流速:0.5mL/min,柱温:80℃,示差折光检测器。并与未处理的烟杆酶解糖化发酵后的乙醇浓度进行对比,具体如表1所示:
表1为三个实施例中处理后的烟杆原料与未处理的烟杆原料乙醇得率的对比
乙醇转化率(mg/g) | |
烟杆原料A | 96.58 |
烟杆原料B | 102.80 |
烟杆原料C | 106.64 |
未处理的烟杆原料 | 44.81 |
通过表1中的数据可以看出,本申请中的方法对烟杆进行处理后其乙醇得率相比未处理的烟杆得率高出很多。
对比试验1:申请人针对烟杆与其它纤维原料的纤维素、半纤维素、木质素和灰分含量进行研究对比。
(1)原料。烟杆采自湖北恩施,采收时间为2009年6月;稻草秸秆、玉米秸秆和木屑由华中科技大学生命科学与技术学院环境资源微生物研究所提供。
(2)试剂。氢氧化钠、硫酸、酒石酸钾钠、重结晶酚、3,5-二硝基水杨酸、硫酸、十六烷基三甲基溴化铵、乙二胺四乙酸二钠、四硼酸钠、磷酸氢二钠、十二烷基硫酸钠、乙二醇乙醚、亚硫酸氢纳、醋酸和醋酸钠(AR,国药集团化学试剂有限公司)。
(3)标样。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖、乙醇、EDTA钙钠(纯度均大于99%,Sigma公司)。
(4)菌株和酶。纤维素酶(Sigma公司),总纤维素酶活力为100FPU/g;葡萄酒高活性干酵母(宜昌安琪酵母股份有限公司)。
(5)仪器。金燕HH-S28S数显恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂);TG-332A微量分析天平(上海天平仪器厂);UV2000紫外-可见光分光光度计(尤尼柯仪器有限公司);小型台式控温摇床(北京迪索仪器有限公司);HN101-2型电热鼓风干燥箱(南通沪南科学仪器有限公司);SRJX-2-9型马福炉(湖北英山国营无线电元件厂);YX-450A型压力蒸气灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司);Agilent 1200型高效液相色谱仪,配备G1362A型示差折光检测器(美国Agilent公司)。
(6)具体实验方法:分别将烟杆、稻草秸秆、玉米秸秆和木屑晒干、粉碎后,取20—40目,得到平均直径为0.3mm的固体粉末,置于60℃烘箱内72h干燥备用;然后对各个原料的木质纤维素组分的化学分析,其中烟杆、稻草秸秆、玉米秸秆和木屑的纤维素、半纤维素、木质素和灰分含量按照美国分析化学家协会(AOAC)标准方法测定;烟杆半纤维素的糖组成按照美国可再生能源实验室标准方法测定,其测定结果如表2所示:
表2烟杆和几种常见农林废弃物化学组成的比较
表2显示了烟杆的化学组成,并与玉米杆、稻草杆和木屑等几种常用于生物炼制的农林废弃物原料进行比较。结果表明,与农业秸秆相比,烟杆的纤维素含量较高,达到40%左右,仅略低于木屑中的纤维素含量;而烟杆中的木质素含量则与秸秆相似,远低于木屑中的木质素含量。烟杆的半纤维素含量也与秸秆相似,均在20%左右。此外,烟杆中灰分含量较高,这与秸秆类似。半纤维素是由戊糖和己糖构成的低分子量聚合物,通过高效液相分析发现,烟杆半纤维素的主要成分为木糖,另含有少量的阿拉伯糖。纤维素的是由β-1,4糖苷键所连接而成的葡聚糖大分子,是纤维素酶解和乙醇转化的反应底物,纤维素含量越高,则所获得的转化产物越多。在木质纤维素大分子中,木质素和半纤维素通常与纤维素交联在一起,构成致密的结构,阻碍了纤维素酶对纤维素底物的吸附,从而影响生物转化的效率。通常,木质素含量低的原料生物转化越容易。与其它用于生物炼制的农林废弃物相比,烟杆具有类似秸秆的低木质素含量,但又具有类似木屑的高纤维素含量,因此是一种较有潜力的生物炼制原料。
本申请的发明人针对化学预处理的条件对烟杆糖化处理的还原糖得率的影响进行了研究,并做了以下具体的对比试验
对比实验2:化学预处理方法的比较
分别用1%NaOH与1%H2SO4试剂按1:10的固液比在90℃水浴锅中处理烟杆30min,水洗过滤至中性,所得的纤维质残渣于60℃烘干后,按照实施例3中的方法制备乙醇,并利用高效液相色谱仪测定滤液中的乙醇浓度,色谱柱:Sugar-pak-1钙型阳离子交换柱(美国Waters公司),流动相:0.05g/L EDTA钙钠溶液,流速:0.5mL/min,柱温:80℃,示差折光检测器。并与未处理的烟杆酶解糖化发酵后的乙醇浓度进行对比,其测定结果如图1所示。
图1显示了经1%稀酸和稀碱溶液预处理30min后烟杆酶解糖化发酵的乙醇得率。正如所预料的,未经预处理烟杆具有较高的木质素和半纤维素含量,因此对纤维素酶解具有很高的抗性,所以乙醇得率都很低,为44.89mg/g。碱预处理后两者均显著提升,乙醇得率分别提高60.2%。然而,酸预处理后乙醇得率反而有所下降。
与酸预处理相比,碱预处理对烟杆生物转化效率的提升更加显著。研究表明,酸预处理通过水解木质纤维素中的半纤维素,破坏木质纤维素的致密结构并增加其多孔性,从而增强酶转化效率;而碱处理主要是通过碱的去木质化作用去除部分木质素,并断裂木质素和半纤维素之间的连键,同时部分半纤维素与碱发生“剥皮反应”,溶解在碱液中,从而增强纤维素酶和纤维素底物的亲和力。酸处理对木质素没有很大的影响,但由于半纤维素的水解,往往导致处理后基质木质素含量显著上升。尽管半纤维素和木质素对木质纤维素的生物炼制都会产生阻碍作用,但对于烟杆而言,木质素对生物转化的影响可能较半纤维素更加显著,酸处理后木质素含量的上升反而对其转化有负面作用。因此,稀碱处理较酸处理更适合增强烟杆的生物转化。
对比实验3:碱预处理条件对烟杆乙醇转化的影响。
分别用0.25、5、1、2%NaOH试剂按1:10固液比于90℃处理烟杆15、30、45、60、90min,水洗过滤至中性,纤维质残渣于60℃烘干,按照实施例3中的方法制备乙醇,并利用高效液相色谱仪测定滤液中的乙醇浓度,色谱柱:Sugar-pak-1钙型阳离子交换柱(美国Waters公司),流动相:0.05g/L EDTA钙钠溶液,流速:0.5mL/min,柱温:80℃,示差折光检测器。并与未处理的烟杆酶解糖化发酵后的乙醇浓度进行对比,其测定结果如图2所示。
传统的乙醇转化通常包括酶酶解糖化和乙醇发酵两个步骤,近年研究表明,同步酶解糖化发酵(SSF)可以解除糖化过程中的底物抑制,增强乙醇转化率,降低反应成本,较分步发酵更具有优势。因此,本申请利用SSF技术将烟杆转化为乙醇,并比较了预处理条件对烟杆乙醇得率的影响。由于100℃以上的预处理在压力蒸气灭菌锅中进行,而通过温度试验,烟杆酶解的乙醇得率随着反应温度的增加而逐渐提升,当反应温度超过100℃时逐渐趋于稳定,考虑成本因素,选择不需要高压设备的90℃反应作为碱预处理的温度,其具体结果如图2所示。
图2显示了在不同碱预处理时间和氢氧化钠浓度下烟杆转化乙醇的得率。结果表明,氢氧化钠浓度越高,乙醇得率也越高。乙醇得率随着预处理时间的延长而逐渐增加,当预处理时间为60min时到达峰值,进一步延长处理时间,乙醇得率反而有所降低。烟杆经2%NaOH预处理60min后,乙醇得率最高,为106.64mg/g,较未处理烟杆提高138%。
同时针对乙醇得率最高时同步酶解发酵液的组成进行分析,其分析结果如表3所示:
表3乙醇发酵液的组成分析
表3中的结果表明,预处理后发酵液中的乙醇浓度较未处理烟杆提高272.32%,这将有利于减少乙醇蒸馏和纯化的成本。然而,乙醇浓度较其它生物炼制的研究(通常为5-7mg/mL)仍有一定差距[7]。这可能与本研究所采用的葡萄酒酿酒酵母性能较低有关。发酵液中仍有部分葡萄糖残余,说明乙醇的转化并不完全。因此,采用高活性的酿酒酵母将有助于进一步提高乙醇转化。
此外,发酵液中含有大量的木糖,仅略低于经相同条件预处理烟杆酶解糖化后酶解液中的木糖含量。这表明酿酒酵母主要利用葡萄糖作为乙醇发酵的碳源。尽管目前有少量的基因工程菌可以利用木糖作为碳源发酵乙醇,但发酵成本过高且性能不稳定。因此,对于烟草行业而言,可以将发酵液中的木糖分离后做为烟用糖醇的原料。
本发明中的方法,可以大大提高烟杆的乙醇得率,酶解糖化发酵的乙醇得率可达106.64mg/g,较未处理烟杆提高138%,大大提高了废弃烟杆的利用率。
Claims (5)
1.一种利用烟杆作为生物炼制原料制备乙醇的方法,其特征在于具体步骤如下:
(1)原料的预处理
a.取去烟叶后的新鲜烟杆,晾晒烘干后切碎后,按照固液比1:5-1:30的比例加入浓度为0.2%~5%的NaOH溶液;
b.将步骤a中的固液混合物在80℃~90℃的水浴锅中处理30min~120min,并进行水洗过滤至中性,收集处理后的纤维质残渣于50~60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料;
(2)将5g~20g酿酒酵母干粉制剂加入重量比为20~50倍的质量百分比浓度为2%~5%的葡萄糖溶液中,在40℃~50℃活化0.5h~1.5h,然后在30℃~35℃下活化1h~2h至起泡备用;
(3)取步骤(1)中经过预处理后的烟杆原料,加入其重量10~30%的纤维素酶,并加入pH为4.8、浓度为50mmol/L的醋酸纳缓冲溶液混合均匀;其中烟杆原料与醋酸纳缓冲溶液的质量比为1:20~1:50;
(4)向混合溶液中接种溶液重量的7%~15%的步骤(2)中已活化好的酵母溶液,并置于40℃~50℃的恒温水浴中发酵48h~72h后过滤,收集滤液即得到乙醇溶液。
2.根据权利要求1所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备乙醇的方法,其特征在于所述烟草原料的预处理具体步骤如下:
a取去烟叶后的新鲜烟杆,晾晒烘干后切碎后,按照固液比1:10的比例加入浓度为2%的NaOH溶液;
b将步骤a中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min,并进行水洗过滤至中性,收集处理后的纤维质残渣于50~60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备乙醇的方法,其特征在于:所述烟草原料的预处理的步骤a中在加入NaOH溶液之前,先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质,于室外自然晾晒5~30天后,将其在50~60℃的烘箱中烘烤1~3天,随后将其取出冷却至室温,并用粉碎机将其切碎至0.5~5cm长度的小段后放入1-10L反应器中。
4.根据权利要求1或2所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备乙醇的方法,其特征在于:所述烟草原料的预处理的步骤b中的固液混合物在加热处理之前,先在40~75℃的条件恒温浸泡0.5~24小时。
5.根据权利要求1或2所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备乙醇的方法,其特征在于:所述烟草原料的预处理的步骤b中的加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤,抽滤完成后再加入固定液混合物体积2~10倍的蒸馏水进行水洗,直至洗出液用pH试纸检测为pH=7,然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣,在烘箱中于50~60℃条件下烘烤1~4天得到预处理后的烟杆原料。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190222 |
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