CN109393540A - 一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法。所述预处理方法具体是取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:5‑1:30的比例加入浓度为0.2％～5％的NaOH溶液；将固液混合物在80℃～90℃的水浴锅中处理30min～120min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。经过处理后的烟杆进行酶解糖化的还原糖得率可达345.06mg/g，较未处理烟杆提高165.74％，葡萄糖和木糖是酶解液中的主要成分；在同样条件下预处理后，烟杆经同步酶解糖化发酵的乙醇得率可达106.64mg/g，较未处理烟杆提高138％，大大提高了生物转化得率。
Description
技术领域
本发明属于生物炼制技术，具体是一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法。
背景技术
烟草是世界上最重要的非食用经济作物之一，为各国广泛种植。烟叶是烟草工业的主要原料，在烟叶采收后，往往剩余大量烟杆。据估计，全球每年在烟草种植中产生的烟杆可达2.6亿吨以上。这些烟杆即不能作为农用燃料，焚烧后又污染大气，只能堆积在田间地头自然腐烂，严重污染环境。
近年来，环境友好的生物炼制技术逐渐成为木质纤维素类农林废弃物资源化利用的发展趋势。该过程通常利用纤维素酶和微生物将木屑、秸秆等废弃物转化为糖、乙醇、乳酸等生物基产品。糖和乙醇是于烟草加工过程中的两类重要辅料，通常应用于美拉德反应、香料提取等等方面。因此，如果利用生物炼制技术将烟杆转化为糖和乙醇，不仅有助于实现废弃物资源的高值化利用，又能为烟草企业提供廉价的辅料来源，这对提高烟草行业资源化循环利用水平无疑具有重要的意义。
然而，目前利用烟杆进行生物炼制的研究并不多见，其瓶颈在于木质纤维素结构对纤维素酶解的高抗性导致极低的生物转化效率。近年来，研究者们发现预处理技术可以有效降低木质纤维素转化抗性、提高转化效率。常用的预处理方法包括酸预处理、碱预处理、蒸汽爆破预处理、超压临界水预处理和高压湿氧化预处理等。通常不同原料所适用的预处理方式和条件并不相同，如农业秸秆废弃物更适用于酸、碱等化学预处理方式。因此，选择适当的预处理技术和处理条件将有望提高烟杆生物转化效率，实现烟杆的高效生物炼制。
发明内容
本发明根据现有技术的不足，提供一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，该方法可以增强烟杆转化为糖和乙醇的生物炼制效率，为实现高效的烟杆生物炼制过程奠定基础。
本发明提供的技术方案：所述一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:5-1:30的比例加入浓度为0.2％～5％的NaOH溶液；
(2)将步骤(1)中的固液混合物在80℃～90℃的水浴锅中处理30min～120min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。
本发明较优的技术方案：所述一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法的具体步骤如下：
(1)取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:10的比例加入浓度为2％的NaOH溶液；
(2)将步骤(1)中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)中在加入NaOH溶液之前，先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒5～30天后，将其在50～60℃的烘箱中烘烤1～3天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入1-10L反应器中。
本发明较优的技术方案：所述步骤(2)中的固液混合物在加热处理之前，先在40～75℃的条件恒温浸泡0.5～24小时。
本发明较优的技术方案：所述步骤(2)中的加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤，抽滤完成后再加入固定液混合物体积2～10倍的蒸馏水进行水洗，直至洗出液用pH试纸检测为pH＝7，然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣，在烘箱中于50～60℃条件下烘烤1～4天得到预处理后的烟杆原料。
本发明通过碱预处理大大提高了烟杆生物转化效率，经过处理后的烟杆可以作为烟杆生物炼制，且经过实验研究发现，采用本发明中方法对烟杆进行预处理之后，其酶解糖化的还原糖得率最高可达345.06mg/g，较未处理烟杆提高165.74％，葡萄糖和木糖是酶解液中的主要成分；在同样条件下预处理后，烟杆经同步酶解糖化发酵的乙醇得率最高可达106.64mg/g，较未处理烟杆提高138％，大大提高了烟杆的利用率，可以广泛使用与烟杆生物炼制中。
附图说明
图1是实验1中化学预处理对烟杆酶解糖化和乙醇转化的影响对比图；
图2是实验2中碱预处理温度对烟杆酶解糖化的影响对比图；
图3是实验3中碱预处理时间和氢氧化钠浓度对烟杆酶解糖化的影响对比；
图4是实验5中碱预处理时间和氢氧化钠浓度对烟杆乙醇转化的影响对比；
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进一步说明。
以下实施例和对比实验中的烟杆的糖化处理的具体如下：
烟杆的酶解糖化反应在250ml三角瓶中进行，其中包含100mL 50mM pH4.8的醋酸纳缓冲溶液、0.5g纤维素酶和2.5g的烟杆基质；将三角瓶置于50℃水浴锅内反应72h后，10000rpm离心5min，利用DNS法测定上清液中的还原糖浓度，酶解液用0.22μm过滤器过滤后，利用高效液相色谱仪测定酶解糖的组成，色谱柱：Sugar-pak-1钙型阳离子交换柱(美国Waters公司)，流动相：0.05g/L EDTA钙钠溶液,流速：0.5mL/min，柱温：80℃，示差折光检测器。
以下实施例和对比实验中的烟杆的乙醇转化的处理：采用同步酶解糖化发酵(Simultaneous Saccharification and Fermentation，SSF)将烟杆转化为乙醇。将5g酿酒酵母干粉制剂加入100mL 2％的葡萄糖溶液，在40℃活化30min，然后在32℃下活化1.5h至起泡备用；乙醇转化在250mL三角瓶中进行，其中包含100mL 50mM pH4.8的醋酸纳缓冲溶液、0.5g纤维素酶和2.5g的烟杆基质。向三角瓶中接种0.7mL已活化好的酵母溶液，置于40℃水浴锅内发酵48h后过滤。利用高效液相色谱仪测定滤液中的乙醇浓度，色谱柱：Sugar-pak-1钙型阳离子交换柱(美国Waters公司)，流动相：0.05g/L EDTA钙钠溶液，流速：0.5mL/min，柱温：80℃，示差折光检测器。
实施例1：一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)取新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒10天后，将其在50℃的烘箱中烘烤2天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入5L反应器中，按照固液比1:5的比例加入浓度为4％的NaOH溶液；
(2)将步骤(1)中的固液混合物在40～75℃的条件恒温浸泡3小时，然后加热至80℃预处理70min，加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤，抽滤完成后再加入固定液混合物体积2～10倍的蒸馏水进行水洗，直至洗出液用pH试纸检测为pH＝7，然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣，在烘箱中于50～60℃条件下烘烤1～4天得到预处理后的烟杆原料A。
实施例2：一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)取新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒20天后，将其在55℃的烘箱中烘烤2天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入10L反应器中，按照固液比1:10的比例加入浓度为2％的NaOH溶液；
(2)将步骤(1)中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料B。
实施例3：一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒30天后，将其在60℃的烘箱中烘烤1天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入8L反应器中，按照固液比1:20的比例加入浓度为0.5％的NaOH溶液；
(2)将步骤(1)中的固液混合物在40℃的条件恒温浸泡0.5小时，加热至90℃的水浴锅中处理60min，加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤，抽滤完成后再加入固定液混合物体积2～10倍的蒸馏水进行水洗，直至洗出液用pH试纸检测为pH＝7，然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣，在烘箱中于50～60℃条件下烘烤1～4天得到预处理后的烟杆原料C。
将实施例1至3中处理后得到的烟杆原料A、B、C与未处理的烟杆原料分别进行酶解糖化反应，并同步进行酶解糖化发酵，观察其酶解糖化的还原糖得率和同步酶解糖化发酵的乙醇得率，其具体结果如表1:
表1为三个实施例中处理后的烟杆原料与未处理的烟杆原料生物转化率的对比
| 还原糖得率(mg/g) | 乙醇转化率(mg/g) | |
| 烟杆原料A | 318.85 | 96.58 |
| 烟杆原料B | 324.90 | 102.80 |
| 烟杆原料C | 345.06 | 106.64 |
| 未处理的烟杆原料 | 129.85 | 44.81 |
通过表1中的数据可以看出，经过本申请中的预处理后的烟杆在进行生物转化时，其得率相比未处理的烟杆得率高出很多。
发明人针对本申请还做了以下对比实验。
对比实验1：化学预处理方法的比较
分别用1％NaOH与1％H2SO4试剂按1:10的固液比在90℃水浴锅中处理烟杆30min，水洗过滤至中性，所得的纤维质残渣于60℃烘干后，按照上述糖化处理和乙醇转化处理的步骤进行处理测定其糖和乙醇得率，具体如图1所示。
图1显示了经1％稀酸和稀碱溶液预处理30min后烟杆酶解的还原糖得率和同步酶解糖化发酵的乙醇得率。正如所预料的，未经预处理烟杆具有较高的木质素和半纤维素含量，因此对纤维素酶解具有很高的抗性，所以还原糖和乙醇得率都很低，分别为129.85mg/g和44.89mg/g。碱预处理后两者均显著提升，还原糖和乙醇得率分别提高115％和60.2％。然而，酸预处理仅增强了烟杆糖化，较未处理烟杆的还原糖得率提高23.43％，但乙醇得率反而有所下降。
与酸预处理相比，碱预处理对烟杆生物转化效率的提升更加显著。研究表明，酸预处理通过水解木质纤维素中的半纤维素，破坏木质纤维素的致密结构并增加其多孔性，从而增强酶转化效率；而碱处理主要是通过碱的去木质化作用去除部分木质素，并断裂木质素和半纤维素之间的连键，同时部分半纤维素与碱发生“剥皮反应”，溶解在碱液中，从而增强纤维素酶和纤维素底物的亲和力。酸处理对木质素没有很大的影响，但由于半纤维素的水解，往往导致处理后基质木质素含量显著上升。尽管半纤维素和木质素对木质纤维素的生物炼制都会产生阻碍作用，但对于烟杆而言，木质素对生物转化的影响可能较半纤维素更加显著，酸处理后木质素含量的上升反而对其转化有负面作用。因此，稀碱处理较酸处理更适合增强烟杆的生物转化。
对比实验2：碱预处理温度对烟杆糖化转化率的影响。
分别用1％NaOH试剂按1:10固液比于30、60、90、120、150℃处理烟杆60min后，水洗过滤至中性，纤维质残渣于60℃烘干后，按照上述糖化处理步骤进行处理测定其糖得率，具体如图2所示。其中100℃以上的预处理在压力蒸气灭菌锅中进行，100℃以下的预处理在水浴锅中进行。
如图2所示，碱反应温度的提升会增强预处理的效果，烟杆酶解的还原糖得率随着反应温度的增加而逐渐提升，当反应温度超过100℃时逐渐趋于稳定，由于反应温度超过100℃时需要高温高压的预处理设备，无疑增加了处理成本。
对比实验3：碱浓度和预处理时间对烟杆糖化转化率的影响。
分别用0.25、5、1、2％NaOH试剂按1:10固液比于90℃处理烟杆15、30、45、60、90min，水洗过滤至中性，纤维质残渣于60℃烘干，按照上述糖化处理和乙醇转化处理的步骤进行处理测定其糖和乙醇得率，具体如图3所示。
如图3所示，在相同的氢氧化钠浓度下，还原糖得率随着预处理时间的延长而逐渐增加，当预处理时间达到60min后，还原糖得率达到峰值，进一步延长预处理时间，得率并没有明显的变化，甚至有少许下降。氢氧化钠浓度对烟杆还原糖得率有显著的影响，预处理过程中的氢氧化钠浓度越高，预处理后烟杆酶解所得到的还原糖也越多。当氢氧化钠浓度为2％、预处理时间为60min时，烟杆酶解的还原糖得率最高，达到345.06mg/g，较未处理烟杆提高165.74％。
对比实验4：针对未处理烟杆和在最佳预处理条件下处理后烟杆的酶解液的组成，进行比较，具体如表2所示：
表2酶解液的糖组成分析
结果表明，葡萄糖在烟杆酶解液中的含量最高，主要来源于纤维素的水解。预处理显著提升了葡萄糖的含量，较未处理烟杆提高了463％。在未处理烟杆的酶解液中，两种来源于半纤维素的单糖——木糖和阿拉伯糖的含量相似。预处理后，烟杆酶解液中木糖含量显著上升，仅次于葡萄糖含量，但阿拉伯糖却没有检测到，这可能是预处理过程中阿拉伯糖与氢氧化钠发生反应，溶解在碱液中的结果。解液中的葡萄糖可以作为烟用糖加以利用，而木糖则可作为保润剂木糖醇的生产原料。此外，预处理烟杆的酶解液中还含有少量的纤维二糖，这可能是纤维素不完全酶解所导致的。在纤维素酶解过程中，纤维素先由纤维素内切酶和纤维素外切酶水解为纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶水解为葡萄糖，但葡萄糖对β-葡萄糖苷酶具有产物抑制作用，因此导致纤维二糖的部分累积。
对比实验5：碱预处理条件对烟杆乙醇转化的影响
传统的乙醇转化通常包括酶酶解糖化和乙醇发酵两个步骤，近年研究表明，同步酶解糖化发酵(SSF)可以解除糖化过程中的底物抑制，增强乙醇转化率，降低反应成本，较分步发酵更具有优势。因此，本申请利用SSF技术将烟杆转化为乙醇，并比较了预处理条件对烟杆乙醇得率的影响。同样考虑成本因素，选择不需要高压设备的90℃反应作为碱预处理的温度，其具体结果如图4所示。
图4显示了在不同碱预处理时间和氢氧化钠浓度下烟杆转化乙醇的得率。结果表明，氢氧化钠浓度越高，乙醇得率也越高。乙醇得率随着预处理时间的延长而逐渐增加，当预处理时间为60min时到达峰值，进一步延长处理时间，乙醇得率反而有所降低。烟杆经2％NaOH预处理60min后，乙醇得率最高，为106.64mg/g，较未处理烟杆提高138％。
同时针对乙醇得率最高时同步酶解发酵液的组成进行分析，其分析结果如表3所示：
表3乙醇发酵液的组成分析
表3中的结果表明，预处理后发酵液中的乙醇浓度较未处理烟杆提高272.32％，这将有利于减少乙醇蒸馏和纯化的成本。然而，乙醇浓度较其它生物炼制的研究(通常为5-7mg/mL)仍有一定差距。这可能与本研究所采用的葡萄酒酿酒酵母性能较低有关。发酵液中仍有部分葡萄糖残余，说明乙醇的转化并不完全。因此，采用高活性的酿酒酵母将有助于进一步提高乙醇转化。
此外，发酵液中含有大量的木糖，仅略低于经相同条件预处理烟杆酶解糖化后酶解液中的木糖含量。这表明酿酒酵母主要利用葡萄糖作为乙醇发酵的碳源。尽管目前有少量的基因工程菌可以利用木糖作为碳源发酵乙醇，但发酵成本过高且性能不稳定。因此，对于烟草行业而言，可以将发酵液中的木糖分离后做为烟用糖醇的原料。
本发明中的处理方法，可以大大提高烟杆生物转化率，其中酶解糖化的还原糖得率可达345.06mg/g，较未处理烟杆提高165.74％，同步酶解糖化发酵的乙醇得率可达106.64mg/g，较未处理烟杆提高138％。因此，本申请中的碱预处理技术对实现烟杆的高效生物炼制将具有重要意义。
Claims (5)
1.一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:5-1:30的比例加入浓度为0.2％～5％的NaOH溶液；
(2)将步骤(1)中的固液混合物在80℃～90℃的水浴锅中处理30min～120min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。
2.根据权利要求1所述的一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:10的比例加入浓度为2％的NaOH溶液；
(2)将步骤(1)中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于：所述步骤(1)中在加入NaOH溶液之前，先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒5～30天后，将其在50～60℃的烘箱中烘烤1～3天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入1-10L反应器中。
4.根据权利要求1或2所述的一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于：所述步骤(2)中的固液混合物在加热处理之前，先在40～75℃的条件恒温浸泡0.5～24小时。
5.根据权利要求1或2所述的一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于：所述步骤(2)中的加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤，抽滤完成后再加入固定液混合物体积2～10倍的蒸馏水进行水洗，直至洗出液用pH试纸检测为pH＝7，然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣，在烘箱中于50～60℃条件下烘烤1～4天得到预处理后的烟杆原料。
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2018
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