CN101648935A - 一种从紫花地丁提取芹菜素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从紫花地丁中提取芹菜素的方法，大大地提高芹菜素得率和纯度。提出了一整套从紫花地丁分离提取得到高纯度的芹菜素，采用醇提超声处理，离心，浓缩，萃取，大孔吸附树脂LSA－10与层析柱硅胶吸附层析，连续分离，浓缩，丙酮结晶，得到芹菜素纯品。整个分离过程中对环境条件要求不高，分离时间较短，纯度高。分离材料易得便宜，分离操作过程简单，易控制，采用结晶和重结晶，纯化效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种紫花地丁等药用植物的综合利用，更具体地说本发明提供了从紫花地丁中提取芹菜素的方法，大大地提高芹菜素得率和纯度，因此本发明属于从紫花地丁等药用植物提取生物制品的领域。
背景技术
芹菜素是天然存在的一种黄酮类化合物，有“植物雌激素”之称，具有较强的生物学活性。芹菜素以植物黄色素的形式存在于多种植物中，纯品外观为黄色粉末，无嗅无味。是天然抗氧化剂。化学名为5，7，4′-三羟基黄酮，分子式及分子量为C15H10O5和270.25，熔点347.5℃，几乎不溶于水，微溶于热酒精，溶于稀KOH溶液。
研究表明，芹菜素具有神经保护、抗氧化、自由基清除剂、抗肿瘤、抗炎、碳水化合物代谢促进因子、免疫调节剂等作用，并且与其它黄酮类物质(槲皮素、山奈黄酮)相比具有低毒、无诱变性等特点。它可以通过抑制肿瘤细胞生长、侵袭、转移和新生血管形成等多种途径发挥抗肿瘤作用。因此，芹菜素有望成为治疗肿瘤的一种新的药物，同时也增强了人们从天然植物中制备抗肿瘤化学药物的信心。在国外其肿瘤的化学预防作用及其机制已得到较为深入的研究，而近年来芹菜素的其他药理药效作用也得到日益广泛的关注和研究。目前，国内对芹菜素抗炎症、降血压、抗动脉硬化和血栓症、抗焦虑、抗菌、抗病毒以及抗氧化作用等多方面的生物学活性研究较多。由此可见芹菜素具有广阔的应用前景。
目前，芹菜素也可以采用半合成的方式获得，但是合成的芹菜素经药理实验发现效果不佳，这可能是芹菜素有四种类型，合成只能是其中的一种类型而已，所以市场上采用半合成的芹菜素很少见。
因此，芹菜素和芹菜甙一般是从芹菜中提取，例如，传统的芹菜素制备工艺为：①芹菜甙(Apiin)，用酸煮沸、水解；②以芹菜素7-O-葡萄糖甙(Apigenin 7-O-glucoside)，用苦杏仁酶进行水解或以15％H2SO4水解(The Merk Index.13rd，2001年.P123)。
由于芹菜中芹菜素和芹菜甙的含量低，因而提取率低，成本高，难以满足日益增长的市场需求，目前不宜工业化生产。因此，从芹菜的替代物中寻找合适的提取方法，成为迫在眉睫的需求。
中国专利号为CN1284492提出了用石崖茶中提取芹菜素和芹菜甙混合物，虽然石崖茶中芹菜素含量高，但是其药理活性不高，这可能与不同植物中芹菜素类型不同有关。
紫花地丁(Viola Philippica Cav.ssp.muda w.Beck.)，又名光萼堇菜、地丁菜、独行虎、紫地丁、二月兰、山茄子，为堇菜科堇菜属植物，多年生莲座状草本，高7～14厘米，无地上茎，地下茎很短，主根较粗，全株被短白毛。《本草正义》誉其为痈肿疔毒通用之药。目前，紫花地丁作为中草药被广泛应用，而对其所含有效成分的开发利用很少。紫花地丁中含有机酸、黄酮及甙类、酚性成分、糖类、氨基酸、多肽及蛋白质、皂甙、植物甾醇、鞣质等多种有效成分，其中有效成分芹菜素具有多种药理学作用。民间广泛用于痈疽疮毒、毒蛇咬伤、狗咬伤、丹毒、蜂窝组织炎、黄疸、尿路感染，说明它们具有较好的抗菌、消炎、解毒作用。借鉴民间经验和现代研究，堇菜属植物可用于治疗风热咳嗽、肺痨、哮喘及鼻炎、角膜炎、咽炎、乳腺炎、风湿病、疔痈疮疖、丹毒、蜂窝组织炎、毒蛇咬伤、黄疸、尿路感染等。
由于紫花地丁本身作为一种中草药，从以前研究文献报道其药理活性很高，与芹菜的药理活性相当，其资源丰富、采收方便，利用其进行芹菜素等生物活性成分的提取、纯化具有很好的开发前景。因此，本发明的目的是提供一种以天然的紫花地丁植物为原料，研发一种成本低，药理活性高，适于工业化生产的芹菜素的方法。
发明内容
本发明采用的技术方案包括：干燥过后的紫花地丁经用甲醇溶液提取、过滤、减压浓缩，然后用树脂吸附、乙醇洗脱、将洗脱液浓缩，结晶制得芹菜素纯品。
因此，本发明提供一种从紫花地丁提取芹菜素的方法，步骤包括：
1)粉碎紫花地丁，加入甲醇或乙醇进行超声处理，离心，保留上清液；
2)再用甲醇或乙醇抽提一次沉淀物，合并两次上清液并进行浓缩；
3)加入石油醚进行萃取后，再加入乙酸乙酯进行萃取并进行浓缩，得浓缩液；
4)用大孔吸附树脂LSA-10、硅胶层析柱依次进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中LSA-10层析柱的洗脱液为甲醇或乙醇溶液，硅胶层析柱的洗脱液为氯仿-甲醇溶液，并且在硅胶层析柱进行2次上柱洗脱；
5)在干燥物中加入丙酮加热并使之充分溶解，趁热过滤；
6)将滤液低温过夜结晶，得到黄色晶体，抽滤，得到芹菜素初品，重结晶得到纯品。
在一个实施方案中，步骤1中为70％的甲醇或乙醇，优选在50℃下进行超声波处理。
在另一个实施方案中，将步骤2得到的两次上清液浓缩50倍后，在步骤3中加入1.5倍体积的石油醚进行萃取，其中优选萃取3-5次。其中，在一个具体实施方案中，步骤3中石油醚或乙酸乙酯的萃取过程可以互换。
在另一个实施方案中，其中步骤4中，LSA-10层析柱的洗脱液为30-80％的甲醇或乙醇溶液；第1次硅胶层析柱的洗脱液为体积比(25∶10)的氯仿-甲醇，第2次硅胶层析柱的洗脱液为体积比(25∶25)的氯仿-甲醇。
还在另一个实施方案中，步骤5中优选在56℃下加热回流2h，并乘热过滤。
在一个具体实施方案中，步骤6的结晶温度是4℃直至室温。
技术效果：
1、整个分离过程中对环境条件要求不高，分离时间短，纯度高。
2、本纯化过程中采用的分离材料是大孔吸附树脂LSA-10和硅胶，其分离操作过程简单，易得便宜，易控制。
3、采用结晶和重结晶进行纯化，工艺简单，易于操作，纯化效率高。
4、本方法涉及的所有工业制剂均可回收利用，既节约了成本，又避免了环境污染。
附图说明
图1：从紫花地丁中提取的芹菜素的纯度HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
图2：从石崖茶中提取的芹菜素的纯度HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
具体实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1：
称取紫花地丁粉末500kg，加入70％的甲醇4000L在50℃下超声处理10min，提取30min后离心10min(3000r/min)，沉淀物再用70％的甲醇1000L提取一次，合并两次上清液。将上清液进行浓缩，浓缩至约100L，向浓缩液中加入石油醚40L进行萃取，取下层，对浓缩液连续萃取四次后，合并四次下层萃取液共160L，再用乙酸乙酯40L对含有石油醚的溶液进行萃取，对含有石油醚的溶液连续萃取四次后，合并四次上层乙酸乙酯部分共160L，对萃取液进行浓缩，得乙酸乙酯浓缩液，在通风柜中于60℃下烘干。用40℃的50％乙醇10L完全溶解乙酸乙酯萃取烘干物，上大孔吸附树脂LSA-10柱，用70％乙醇洗脱得到洗脱物。将洗脱物进行浓缩得浓缩液，上硅胶柱，用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25∶10)100L洗脱杂质，再用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25∶25)200L洗脱得到洗脱物，并减压浓缩至干，加入丙酮1L在56℃下加热回流2h，趁热过滤，滤液放置冰箱中过夜，析出黄色晶体，抽滤，得到初步纯化的芹菜素共106g，重结晶一次，得96g。所得芹菜素样品进行纯度，其检测仪器为LC-9A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，色谱柱为KromasiL C18柱(250X4.6mm i.d，5μm)，流动相为1.92％乙酸、38.46％甲醇、19.23乙腈、1.92％磷酸的水溶液，检测波长：350nm；柱温30℃；流速：0.6mL/min；上样量为5μL。检测所得到芹菜素的纯度为95.80％，结果如表1和图1所示。
其中，图1可知，从紫花地丁中提取的芹菜素，其HPLC具有两个明显的特征峰值1893、2484，表明从紫花地丁提取的芹菜素纯度高，区分度好。
对照实施例：
称取石崖茶粉末500kg，按照实施例1的方法提取并检测芹菜素，其纯度为94.70％，结果如表1和图2所示。
由图2可知，其HPLC特征峰值也很明显1812、2476，表明从石崖茶提取的芹菜素纯度高。但是将图1与图2比较，图2少了两个峰，也就是说在石崖茶中只有两种类型的芹菜素，而另外两种芹菜素在石崖茶可能没有，这可能是造成从石崖茶中提取出的芹菜素药理活性不高的根本原因。因为余杰在石崖茶抗氧化、抑菌作用和毒理试验的研究结果表明：石崖茶类黄酮(芹菜素)只具有较强的抗氧化作用。从芹菜和紫花地丁提取的芹菜素是具有降压、安神、降血脂、保护血管和增强免疫力等功能(TsiD，Tan BK.Effects of celery extract and3-N-bu-tylphthalide on lipid level in genetically hypercho-lesterolaemic(RICO)rats.Clin Exp Pharmacol Physiol，1996，23(3)：214～217.)。
实施例2：
称取紫花地丁粉末1000kg，加入70％的甲醇8000L在50℃下超声处理10min，提取30min后离心10min(3000r/min)，沉淀物再用70％的甲醇2000L提取一次，合并两次上清液。将上清液进行浓缩，浓缩至约200L，向浓缩液中加入石油醚80L进行萃取，取下层，对浓缩液连续萃取四次后，合并四次下层萃取液共320L，再用乙酸乙酯80L对含有石油醚的溶液进行萃取，对含有石油醚的溶液连续萃取四次后，合并四次上层乙酸乙酯部分共320L，对萃取液进行浓缩，得乙酸乙酯浓缩液，在通风柜中于60℃下烘干。用40℃的50％乙醇20L完全溶解乙酸乙酯萃取烘干物，上大孔吸附树脂LSA-10柱，用70％乙醇洗脱得到洗脱物。将洗脱物进行浓缩得浓缩液，上硅胶柱，用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25∶10)200L洗脱杂质，再用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25∶25)400L洗脱得到洗脱物，并减压浓缩至干，加入丙酮1L在56℃下加热回流2h，趁热过滤，滤液放置冰箱中过夜，析出黄色晶体，抽滤，得到初步纯化的芹菜素共205g，重结晶一次，得195g。按照实施例1的方法进行纯度检测，得到芹菜素的纯度为96.20％，结果如表1所示。
实施例3：
称取紫花地丁粉末300kg，加入70％的乙醇2000L在50℃下超声处理10min，提取30min后离心10min(3000r/min)，沉淀物再用70％的乙醇1000L提取一次，合并两次上清液。将上清液进行浓缩，浓缩至约50L，向浓缩液中加入石油醚30L进行萃取，取下层，对浓缩液连续萃取四次后，合并四次下层萃取液共120L，再用乙酸乙酯30L对含有石油醚的溶液进行萃取，对含有石油醚的溶液连续萃取四次后，合并四次上层乙酸乙酯部分共120L，对萃取液进行浓缩，得乙酸乙酯浓缩液，在通风柜中于60℃下烘干。用40℃的50％乙醇10L完全溶解乙酸乙酯萃取烘干物，上大孔吸附树脂LSA-10柱，用70％乙醇洗脱得到洗脱物。将洗脱物进行浓缩得浓缩液，上硅胶柱，用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25∶10)80L洗脱杂质，再用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25∶25)160L洗脱得到洗脱物，并减压浓缩至干，加入丙酮1L在56℃下加热回流2h，趁热过滤，滤液放置冰箱中过夜，析出黄色晶体，抽滤，得到初步纯化的芹菜素共90.5g，重结晶一次，得80g。按照实施例1的方法进行纯度检测，得到芹菜素的纯度为96.45％，结果如表1所示。
实施例4：
称取紫花地丁粉末1500kg，加入70％的甲醇10000L在50℃下超声处理10min，提取30min后离心10min(3000r/min)，沉淀物再用70％的甲醇5000L提取一次，合并两次上清液。将上清液进行浓缩，浓缩至约200L，向浓缩液中加入石油醚100L进行萃取，取下层，对浓缩液连续萃取四次后，合并四次下层萃取液共400L，再用乙酸乙酯100L对含有石油醚的溶液进行萃取，对含有石油醚的溶液连续萃取四次后，合并四次上层乙酸乙酯部分共400L，对萃取液进行浓缩，得乙酸乙酯浓缩液，在通风柜中于60℃下烘干。用40℃的50％乙醇40L完全溶解乙酸乙酯萃取烘干物，上大孔吸附树脂LSA-10柱，用70％乙醇洗脱得到洗脱物。将洗脱物进行浓缩得浓缩液，上硅胶柱，用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25∶10)400L洗脱杂质，再用含有氯仿和甲醇的混合液(氯仿与甲醇的体积比为25∶25)800L洗脱得到洗脱物，并减压浓缩至干，加入丙酮5L在56℃下加热回流2h，趁热过滤，滤液放置冰箱中过夜，析出黄色晶体，抽滤，得到初步纯化的芹菜素共338g，重结晶一次，得314g。按照实施例1的方法进行纯度检测，得到芹菜素的纯度为98.65％，结果如表1所示。
表1
| 实施例 | 原料(kg) | 第一次结晶(g) | 第二次结晶(g) | 纯度(％) |
| 1 | 500 | 106 | 96 | 95.80 |
| 对照实施例 | 500(石崖茶) | 152 | 134 | 94.70 |
| 2 | 1000 | 205 | 195 | 96.20 |
| 3 | 300 | 90.5 | 80 | 96.45 |
| 4 | 1500 | 338 | 314 | 98.65 |
Claims (7)
1一种从紫花地丁提取芹菜素的方法，步骤包括：
1)粉碎紫花地丁，加入甲醇或乙醇进行超声处理，离心，保留上清液；
2)再用甲醇或乙醇抽提一次沉淀物，合并两次上清液并进行浓缩；
3)加入石油醚进行萃取后，再加入乙酸乙酯进行萃取并进行浓缩，得浓缩液；
4)用大孔吸附树脂LSA-10、硅胶层析柱依次进行吸附分离，并将洗脱物减压浓缩干燥，其中LSA-10层析柱的洗脱液为甲醇或乙醇溶液，硅胶层析柱的洗脱液为氯仿-甲醇溶液，并且在硅胶层析柱进行2次上柱洗脱；
5)在干燥物中加入丙酮加热并使之充分溶解，趁热过滤；
6)将滤液低温过夜结晶，得到黄色晶体，抽滤，得到芹菜素初品，重结晶得到纯品。
2权利要求1的方法，其中步骤1中为70％的甲醇或乙醇，优选在50℃下进行超声波处理。
3权利要求1或2的方法，其中将步骤2得到的两次上清液浓缩50-80倍后，在步骤3中加入1.5-3倍体积的石油醚进行萃取，其中优选萃取3-5次。
4权利要求3的方法，其中步骤3中石油醚或乙酸乙酯的萃取过程可以互换。
5权利要求1-4任一项的方法，其中在步骤4中，LSA-10层析柱的洗脱液为30-80％的甲醇或乙醇溶液；第1次硅胶层析柱的洗脱液为体积比(25∶10)的氯仿-甲醇，第2次硅胶层析柱的洗脱液为体积比(25∶25)的氯仿-甲醇。
6权利要求1-5任一项的方法，其中步骤5中优选在56℃下加热回流2h，并乘热过滤。
7权利要求1-6任一项的方法，其中步骤6的结晶温度是4℃直至室温。
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| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110706 Termination date: 20110902 |