CN112274550A - 超声酶解复合法提取山茱萸果肉中的降血糖成分及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了超声酶解复合法提取山茱萸果肉中的降血糖成分及应用，属于中药有效成分提取技术领域。包括以下步骤：(1)将去核后的山茱萸果肉干燥粉碎，得山茱萸粉末；(2)将所述山茱萸粉末与酶和柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液混合后，超声提取20～30min；所述超声提取的功率为140W，所述超声提取的温度为40℃；(3)灭酶后离心，上清液为所述山茱萸果肉中降血糖成分。本发明所述方法将超声提取和酶解提取合并，同时进行酶解提取和超声提取，缩短了提取周期并减少了提取成本，在最大程度上提高了山茱萸的利用价值及药用价值，以对α‑葡萄糖苷酶的抑制率为指标，提取得到的降血糖成分，对α‑葡萄糖苷酶的抑制率最高可达到83.4％。

Description

超声酶解复合法提取山茱萸果肉中的降血糖成分及应用
技术领域
本发明属于中药有效成分提取技术领域，具体涉及超声酶解复合法提取山茱萸果肉中的降血糖成分及应用。
背景技术
山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)为山茱萸科山茱萸属多年生木本植物，以干燥成熟果肉入药，主要产自我国陕西、河南、浙江、山西、安徽等省，在朝鲜、日本也有分布。山茱萸作为中药材使用始载于《神农本草经》，根据中医学的基本理论，山茱萸补益肝肾，涩精固脱。用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴。山茱萸被广泛应用于传统经典名方中，如六味地黄丸、杞菊地黄丸、知柏地黄丸等。山茱萸中的多种活性成分具有降血糖、免疫抑制、抗炎等作用，其中马钱苷、莫诺苷、熊果酸和甲基莫诺苷可保护胰腺β细胞免受高葡萄糖诱导的过度氧化应激和凋亡的影响，并可增加胰岛素释放。
目前关于山茱萸有效成分的提取方法中，常用的有水提法、超声法、碱液提取法和微波法，但基本都存在提取率低，有效成分提取不完全等问题。酶法提取具有高效性和专一性，因其可直接针对细胞壁作用，通过降解细胞壁中纤维素、果胶等成分，使细胞内容物迅速溶出，进入提取溶剂中，提高提取效率，缩短提取时间，加之反应条件温和，不易破坏药效成分，最大限度破碎细胞结构，达到增加其活性成分的目的。同样的，酶解提取具有成本高，提取时间长等问题。因此需要开发一种快速有效提取山茱萸有效成分，并能提高抑制α-葡萄糖苷酶能力的提取方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种超声酶解复合法提取山茱萸果肉中的降血糖成分及应用，利用超声酶解复合法，以超声合并酶解的方法，快速提取且还能提高山茱萸提取物抑制α-葡萄糖苷酶的能力，进而对II型糖尿病进行控制与治疗。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种提取山茱萸果肉中降血糖成分的方法，包括以下步骤：
(1)将去核后的山茱萸果肉干燥、粉碎，得山茱萸粉末；
(2)将所述山茱萸粉末与酶和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合后，超声提取20～30min；所述超声提取的功率为140W，所述超声提取的温度为40℃；
(3)灭酶后离心，上清液即为所述山茱萸果肉中降血糖成分。
优选的，步骤(1)所述干燥为在60℃下干燥6h，所述粉末为粉碎后过120目筛。
优选的，步骤(2)所述酶包括果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，所述果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的质量比为(2～4)∶1∶1。
优选的，所述酶的质量为所述山茱萸粉末质量的0.4～0.6％。
优选的，步骤(2)所述混合时，山茱萸粉末与缓冲液的比例为1g∶25mL。
优选的，步骤(2)所述超声时体系内的pH值为4.5～5.5。
优选的，步骤(3)所述灭酶为在沸水中灭酶10min。
优选的，步骤(3)所述离心的转速为3000rpm，所述离心的时间为10min。
本发明还提供了所述方法制备得到的山茱萸果肉中降血糖成分在制备抗糖尿病的保健品中的应用。
本发明还提供了所述方法制备得到的山茱萸果肉中降血糖成分在制备抗糖尿病的药物中的应用。
本发明提供了一种提取山茱萸果肉中降血糖成分的方法，包括以下步骤：(1)将去核后的山茱萸果肉干燥、粉碎，得山茱萸粉末；(2)将所述山茱萸粉末与酶和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合后，超声提取20～30min；所述超声提取的功率为140W，所述超声提取的温度为40℃；(3)灭酶后离心，上清液即为所述山茱萸果肉中降血糖成分。本发明所述方法将超声提取和酶解提取合并，同时进行酶解提取和超声提取，较单一的提取方式，缩短了提取周期，并减少了提取成本，适合大规模生产，并在最大程度上提高了山茱萸的利用价值及药用价值，具有广阔的市场应用前景。在本发明实施例中，以对α-葡萄糖苷酶的抑制率为指标，利用本发明所述方法，提取得到的降血糖成分，对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高可达到83.4％。
附图说明
图1为PNP标品HPLC色谱图；
图2为PNP标准工作曲线，其中Y＝217.6X+0.8534，R2＝0.9998；
图3为山茱萸果肉粉末粒径对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响；
图4为酶的种类和用量对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响；
图5为酶的混合关系对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响；
图6为酶解温度对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响；
图7为酶解pH对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响；
图8为不同超声波功率作用下的复合酶酶活；
图9为超声酶解时间对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种提取山茱萸果肉中降血糖成分的方法，包括以下步骤：
(1)将去核后的山茱萸果肉干燥、粉碎，得山茱萸粉末；
(2)将所述山茱萸粉末与酶和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合后，超声提取20～30min；所述超声提取的功率为140W，所述超声提取的温度为40℃；
(3)灭酶后离心，上清液即为所述山茱萸果肉中降血糖成分。
在本发明所述方法中，将去核后的山茱萸果肉干燥粉碎，得山茱萸粉末。本发明所述山茱萸果肉优选来源于成熟的山茱萸果实，将其去核后，得到山茱萸果肉。本发明将所述山茱萸果肉干燥粉碎，所述干燥的温度优选为60℃，所述干燥的时间优选为6h。本发明所述粉碎优选为在所述粉碎后过120目筛，收集筛下的粉末。
得山茱萸粉末后，本发明将所述山茱萸粉末与酶和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合后，超声提取20～30min；所述超声提取的功率为140W，所述超声提取的温度为40℃。本发明在所述混合时，优选将山茱萸粉末和酶混合，然后再溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。本发明所述酶的质量优选为所述山茱萸粉末质量的0.4～0.6％，所述酶优选为复合酶，包括果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，所述果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的质量比优选为(2～4)∶1∶1，更优选为3∶1∶1。本发明所述山茱萸粉末和酶的混合物与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的质量体积比优选为1g∶25mL。本发明所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值优选为5.0。本发明在所述超声提取时，体系内的pH值优选为4.5～5.5。
本发明在灭酶后离心，上清液即为所述山茱萸果肉中降血糖成分。本发明所述灭酶优选为在沸水中灭酶10min。本发明所述离心的转速优选为3000rpm，所述离心的时间优选为10min。
本发明还提供了所述方法制备得到的山茱萸果肉中降血糖成分在制备抗糖尿病的保健品中的应用。
本发明还提供了所述方法制备得到的山茱萸果肉中降血糖成分在制备抗糖尿病的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的超声酶解复合法提取山茱萸果肉中的降血糖成分及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎后过4号(65目)标准药筛。向1.0g山茱萸粉末中分别加入0.4％的1∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉(以山茱萸粉末干重计)，溶于25mL，pH值5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于40℃温度中进行60min，水浴超声(功率为140W)，沸水灭酶10min，离心10min(3000r/min)、过滤得上清液，进行α-葡萄糖苷酶抑制率测定。每组实验均设置3组平行实验。
实施例2
与实施例1相比，除经粉碎机粉碎后过5号(80目)标准药筛外，其他与实施例1相同。
实施例3
与实施例1相比，除经粉碎机粉碎后过6号(100目)标准药筛外，其他与实施例1相同。
实施例4
与实施例1相比，除经粉碎机粉碎后过7号(120目)标准药筛外，其他与实施例1相同。
实施例5
与实施例1相比，除经粉碎机粉碎后过8号(150目)标准药筛外，其他与实施例1相同。
实施例6
与实施例1相比，除经粉碎机粉碎后过9号(200目)标准药筛外，其他与实施例1相同。
实施例7
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎后过7号(120目)标准药筛。在5个100mL锥形瓶内分别加入1.0g山茱萸果肉粉末和0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1.0％的果胶酶粉(以山茱萸粉末干重计)，溶于25mL，pH值5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于40℃温度中进行60min，水浴超声(功率为140W)，沸水灭酶10min，离心10min(3000r/min)、过滤得上清液，进行α-葡萄糖苷酶抑制率测定。每组实验均设置3组平行实验。
实施例8
与实施例7相比，除所用酶粉为纤维素酶外，其他与实施例7相同。
实施例9
与实施例7相比，除所用酶粉为半纤维素酶外，其他与实施例7相同。
实施例10
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎后过7号(120目)标准药筛。向1.0g山茱萸果肉粉末中分别加入0.5％的4∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉(以山茱萸粉末干重计)，溶于25mL，pH值5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于40℃温度中进行60min，水浴超声(功率为140W)，沸水灭酶10min，离心10min(3000r/min)、过滤得上清液，进行α-葡萄糖苷酶抑制率测定。每组实验均设置3组平行实验。
实施例11
与实施例10相比，除所用酶粉3∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉外，其他与实施例7相同。
实施例12
与实施例10相比，除所用酶粉2∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉外，其他与实施例7相同。
实施例13
与实施例10相比，除所用酶粉1∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉外，其他与实施例7相同。
实施例14
与实施例10相比，除所用酶粉1∶4∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉外，其他与实施例7相同。
实施例15
与实施例10相比，除所用酶粉1∶3∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉外，其他与实施例7相同。
实施例16
与实施例10相比，除所用酶粉1∶2∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉外，其他与实施例7相同。
实施例17
与实施例10相比，除所用酶粉1∶1∶4的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉外，其他与实施例7相同。
实施例18
与实施例10相比，除所用酶粉1∶1∶3的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉外，其他与实施例7相同。
实施例19
与实施例10相比，除所用酶粉1∶1∶2的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉外，其他与实施例7相同。
实施例20
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎后过7号(120目)标准药筛。向1.0g山茱萸粉末中分别加入0.4％的3∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉(以山茱萸粉末干重计)，溶于25mL，pH值5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于20℃温度中进行60min，水浴超声(功率为140W)，沸水灭酶10min，离心10min(3000r/min)、过滤得上清液，进行α-葡萄糖苷酶抑制率测定。每组实验均设置3组平行实验。
实施例21
与实施例20相比，除超声酶解反应温度为30℃外，其他与实施例20相同。
实施例22
与实施例20相比，除超声酶解反应温度为40℃外，其他与实施例20相同。
实施例23
与实施例20相比，除超声酶解反应温度为50℃外，其他与实施例20相同。
实施例24
与实施例20相比，除超声酶解反应温度为60℃外，其他与实施例20相同。
实施例25
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎后过7号(120目)标准药筛。向1.0g山茱萸果肉粉末中分别加入0.4％的3∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉(以山茱萸粉末干重计)，溶于25mL，pH值5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于40℃温度中进行60min，水浴超声(功率为140W)，沸水灭酶10min，离心10min(3000r/min)、过滤得上清液，进行α-葡萄糖苷酶抑制率测定。每组实验均设置3组平行实验。
实施例26
与实施例25相比，除超声酶解反应用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH值为4.0外，其他与实施例25相同。
实施例27
与实施例25相比，除超声酶解反应用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH值为4.5外，其他与实施例25相同。
实施例28
与实施例25相比，除超声酶解反应用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH值为5.5外，其他与实施例25相同。
实施例29
与实施例25相比，除超声酶解反应用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH值为6外，其他与实施例25相同。
实施例30
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎后过7号(120目)标准药筛。向1.0g山茱萸果肉粉末中分别加入0.4％的3∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉(以山茱萸粉末干重计)，溶于25mL，pH值5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于40℃温度中进行反应10min，水浴超声(功率为140W)，沸水灭酶10min，离心10min(3000r/min)、过滤得上清液，进行α-葡萄糖苷酶抑制率测定。每组实验均设置3组平行实验。
实施例31
与实施例30相比，除超声酶解反应时间为20min外，其他与实施例30相同。
实施例32
与实施例30相比，除超声酶解反应时间为30min外，其他与实施例30相同。
实施例33
与实施例30相比，除超声酶解反应时间为60min外，其他与实施例30相同。
实施例34
与实施例30相比，除超声酶解反应时间为90min外，其他与实施例30相同。
实施例35
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎后过7号(120目)标准药筛。向1.0g山茱萸果肉粉末中分别加入0.4％的3∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶的混合酶粉(以山茱萸粉末干重计)，溶于25mL，pH值5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于40℃温度中进行反应间10min，水浴超声(功率为160W)，沸水灭酶10min，离心10min(3000r/min)、过滤得上清液，进行α-葡萄糖苷酶抑制率测定。每组实验均设置3组平行实验。
实施例36
与实施例35相比，除超声功率为为120W外，其他与实施例35相同。
实施例37
与实施例35相比，除超声功率为0W外，其他与实施例35相同。
对比例1单一复合酶解提取法(EE)
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎过6号(120目)筛。准确称取1.0g山茱萸果肉粉末，分别加入药材重量0.4％的复合酶(3∶1∶1的果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶)，溶于25mL pH＝5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于45℃条件下酶解30min后用沸水灭酶10min，离心(3000r/min，10min)、过滤得上清液后检测其α-葡萄糖苷酶的抑制率。
对比例2超声波辅助提取法(UE)
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎过6号(120目)筛。准确称取1.0g山茱萸果肉粉末，与25mLpH＝5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在烧瓶中混合，于45℃进行超声波水浴提取30min后离心(3000r/min，10min)，过滤得上清液，检测其对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
对比例3超声波优先法(SF)
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎过6号(120目)筛。准确称取1.0g山茱萸果肉粉末，与25mL pH＝5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混合在圆底烧瓶中，然后把将混合体系在45℃条件下进行水浴超声波提取30min后分别加入药材重量0.4％的复合酶，于45℃条件下酶解30min后用沸水灭酶10min，离心(3000r/min，10min)，过滤得上清液，检测其对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
对比例4酶解优先法(EF)
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎过6号(120目)筛。准确称取1.0g山茱萸果实粉末，分别加入药材重量1.0％的复合酶，溶于25mLpH＝5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于45℃条件下酶解30min后用沸水灭酶10min，随后将混合体系于45℃条件下进行水浴超声波提取30min，离心(3000r/min，10min)，过滤得上清液，检测其对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
对比例5传统提取法(TE)
成熟的山茱萸果实去核后，在60℃鼓风干燥箱中干燥6h，经粉碎机粉碎过四号筛。准确称取1.0g山茱萸果肉粉末，与25mL pH＝5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混合，然后把混合体系在45℃条件下进行水浴，提取60min后离心10min(3000r/min)、过滤得上清液，检测其对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
对实施例1～37以及对比例1～4中，检测α-葡萄糖苷酶的抑制率方法均相同，具体如下：
1、色谱条件
根据文献(孙彦敏,彭亮,李知敏.高效液相色谱法测定灰兜巴对α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].天然产物研究与开发,2014,26(10):1673-1676.)建立的色谱条件进行酶解底物PNP的含量测定，填充剂是十八烷基硅烷键合的硅胶；流动相A是含0.1％甲酸的水溶液，流动相B是乙腈，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为314nm；柱温为25℃；流速为1.0mL/min；进样量为20μL。
表1梯度洗脱条件
Figure BDA0002138336480000101
Figure BDA0002138336480000111
2、PNP标准曲线的制备
精密称取PNP标准品0.0209g，用磷酸盐缓冲液充分溶解后于25mL的容量瓶中定容，得到1mmol/L的PNP储备液，之后再将储备液依次稀释成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.0025mmol/L的6个不同的浓度的PNP标准溶液待用。
依据上述色谱条件对上述配制好的PNP标准溶液进行测定，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线。
其中，PNP标品HPLC色谱图如图1所示，绘制的标准曲线如图2所示，其回归方程为Y＝217.6X+0.8534，R2＝0.9998，说明PNP在0.0025～0.1000mmol/L浓度范围内的线性关系比较好。
3、HPLC方法学考察
精密度试验：重复6次，每次分别取0.01mmol/L配制好的PNP溶液20μL进样，记下PNP峰面积，并计算RSD值；结果显示PNP峰面积的RSD值为0.93％，表明该HPLC仪器的精密度良好；
重现性试验：按上述色谱条件，重复6次测样，记下PNP峰面积，并计算RSD值；经计算得到的6组PNP峰面积的RSD值为0.75％，表明此操作的可重复性较好；
稳定性试验：取相同浓度的PNP溶液，分别于0、2、4、8、12、24、48h进样，进行测定，并记下色谱峰峰面积，并计算RSD值；在连续的48个小时内，得到7组不同时间测得的PNP峰面积，通过计算得到这7组峰面积的RSD值为0.65％，说明在该检测条件下PNP稳定性较好；
回收率试验：不加供试药品，用PNP标准溶液作为阴性对照，按140％、120％、100％、80％、60％的不同水平分别添加对照品，进样，记下PNP峰面积，并计算回收率；测得的回收率分别为98.24％、99.67％、98.01％、100.36％、100.93％，表明标准曲线可信度较高。
4、α-葡萄糖苷酶的抑制率的检测
以pNPG为底物，通过高效液相法检测产物PNP的变化，确定α-葡萄糖苷酶的活性。实验在1.5mL离心管中进行，分别加入10μL 0.067mol/L，pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液、30μL0.1U/mLα-葡萄糖苷酶及山茱萸果肉提取物30μL，振荡混匀，37℃孵育20min，加入40μL4.0mmol/L PNPG开启反应，振荡混匀，37℃反应30min后，加入80μL 0.2mol/LNa2CO3使酶反应终止，之后再加200μL超纯水稀释并混匀，通过0.45μm滤膜后，按上述色谱条件进样检测。把PNP峰面积记为A1。另取一支新离心管，用溶解样品的试剂作为空白对照，重复上述实验步骤，将得到的PNP峰面积记为A2。根据下面的计算公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率：
α-葡萄糖苷酶抑制率＝(A2-A1)/A2×100％。
对利用上述方法得到的对α-葡萄糖苷酶抑制率进行统计发现：
A、山茱萸粉末的粒径对于抑制率的影响
结果如图3所示：伴随粉碎度的增加，α-葡萄糖苷酶抑制率也随之增高。这是因为山茱萸的破碎程度越大，其细胞的分散程度也就越大，与酶的接触面积也随之增大，但破碎程度超过120目后，抑制率的增长又变得缓慢，所以山茱萸果肉粉碎度以120目为最佳条件。
B、酶的种类及酶用量对于抑制率的影响
结果如图4所示：随着酶添加量不断增加，其α-葡萄糖苷酶抑制率均是先逐渐上升后趋于平稳的趋势。其中，果胶酶的提取效果显示在0.2％～0.4％浓度范围内时，随着其添加量的增加，α-葡萄糖苷酶抑制率有明显提升，0.4％处抑制率最高，为43.76％，添加量在0.4％～1.0％处，α-葡萄糖苷酶抑制率先下降后趋于稳定，说明随着酶添加量的不断增加，抑制效果也逐渐趋于稳定。纤维素酶和半纤维素酶相比较，在酶的添加量为0.2％～0.6％范围时，纤维素酶的效果优与半纤维素酶，而在酶的添加量在0.6％～1.0％范围内两者都有平稳趋势，纤维素酶在添加量为0.6％时，α-葡萄糖苷酶抑制率为30.23％，半纤维素浓度为27.60％。说明果胶酶酶解的效果作用明显优胜于纤维素酶，纤维素酶优胜于半纤维素酶。
C、酶的比例关系对于抑制率的影响
结果如图5所示：当复合酶中果胶酶占比增加时，α-葡萄糖苷酶抑制率也随之增加，当复合酶比例为3∶1∶1，提取物的α-葡萄糖苷酶抑制率最大为75.12％，分析原因可能是由于果胶酶将细胞中的果胶酶解使得细胞中α-葡萄糖苷酶抑制成分大量溶出，但当酶添加量继续增大至复合酶比例为4∶1∶1时，会包裹住山茱萸颗粒，阻碍其进一步与酶反应，释放出活性物质。而纤维素酶和半纤维素酶对于活性成分的溶出影响要小于果胶酶所发挥的作用，当把三种酶以3∶1∶1的比例混合对山茱萸果肉进行酶解，能够最大程度将α-GI成分溶出。
D、酶解温度和pH对于抑制率的影响
结果如图6和图7所示，其中图6为酶解温度对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响，随着提取温度的提升，山茱萸提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率在20～40℃范围内显著升高，在40℃时抑制率最大为84.51％，表明此时山茱萸中抑制α-葡萄糖苷酶的活性成分的溶出达到最高值；继续升高温度，α-葡萄糖苷酶的抑制率略有降低；
图7为酶解pH对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响，随着pH的升高，抑制率呈抛物线状，但抑制率在pH为4.5～5.5的范围内变化不大。
E、超声酶解时间和功率对于抑制率的影响
结果如图8和图9所示，其中图8为不同超声波功率作用下的复合酶酶活，当超声波功率控制在0～140W之间，复合酶的活力能随着功率的加大而增加。其原因可能在于部分酶本身就与其他物质结合并以络合物的形式存在，而超声波的作用是能加速结合物的分解，从而使酶的活性部位得以充分暴露。当超声波产生的声场作用于酶溶液时，能够通过空化的作用以及机械震荡从而使酶分子的构型产生改变，进而使得酶的关键催化活性部位发生改变，影响酶反应的催化活力。此外，超声波发挥的协同作用还能增加其产物的释放速度。但是，超声波功率达到一定值或太高反而导致了复合酶的活力大小的降低。从复合酶活力随时间的变化趋势可以得出结论，复合酶水解反应是高效快速的反应过程。随着反应时间的延长，其酶活力逐渐降低，因此维持合适功率的超声波有助于保持酶的活力值，因此140W为最优超声功率；
图9为超声酶解时间对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响，经复合酶处理的山茱萸提取物在前20min对α-葡萄糖苷酶的抑制率均呈逐步上升的趋势，这说明开始阶段由于有效成分大多分布山茱萸粉末颗粒较表层的位置，且含量最高，因而有效成分向溶剂中扩散的阻力较小，因此提取效率较高，但在30min后抑制率趋于平缓且略有下降，证明可能在酶解30min时刚好将包裹α-葡萄糖苷酶的抑制性成分组织酶解完全使活性成分释放出来，从而提取率达到最高；随着提取过程的深入，山茱萸粉末颗粒中所含有的有效成分含量逐渐降低，并且溶剂扩散的阻力也不断增大，提取效率开始降低，并且由于长时间的加热还可能使已经释放出来的活性成分结构发生改变从而失去α-葡萄糖苷酶抑制活性。
F、不同提取方法对应的α-葡萄糖苷酶活性的抑制率
对实施例32(SUE)及对比例1～5的α-葡萄糖苷酶活性的抑制率进行统计，结果如表2所示：
表2不同提取方法对应的α-葡萄糖苷酶活性的抑制率
Figure BDA0002138336480000141
由表2可知，采用SUE法得到了最好的α-葡萄糖苷酶抑制率效果，与其他提取方法相比都存在显著性差异，而且单独使用超声波提取法相比较于传统的提取方法，其提取效率也明显增加。三种酶提法(EE、UF和EF)比TE和UE法得到的α-葡萄糖苷酶抑制率明显提高，因为细胞壁内大量存在半纤维素、淀粉、果胶等，通过相应的酶处理之后，破坏了细胞壁，促进活性成分的释放，从而使提取物的α-葡萄糖苷酶抑制率明显增强；但是EE、UF和EF提取法所得的抑制率并不存在显著性差异，当酶解作用和超声波作用不同时进行时，酶解作用的效果要比超声波作用的效果更加强烈，所以使得超声波的作用并没有展现出来。而当超声波与酶解同时进行时，超声波的传质作用加速了酶在反应进程中的运动，从而有着更优的抑制效果。
本发明提供了一种提取山茱萸果肉中降血糖成分的方法，将超声提取和酶解提取合并，同时进行酶解提取和超声提取，较单一的提取方式，缩短了提取周期并减少了提取成本，适合大规模生产，并在最大程度上提高了山茱萸的利用价值及药用价值，具有广阔的市场应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种提取山茱萸果肉中降血糖成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将去核后的山茱萸果肉干燥粉碎，得山茱萸粉末；
(2)将所述山茱萸粉末与酶和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合后，超声提取20～30min；所述超声提取的功率为140W，所述超声提取的温度为40℃；
(3)灭酶后离心，上清液为所述山茱萸果肉中降血糖成分。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述干燥为在60℃下干燥6h，所述粉碎为粉碎后过120目筛。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述酶包括果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，所述果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的质量比为(2～4)∶1∶1。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述酶的质量为所述山茱萸粉末质量的0.4～0.6％。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述混合时，山茱萸粉末与缓冲液的比例为1g∶25mL。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述超声时体系内的pH值为4.5～5.5。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述灭酶为在沸水中灭酶10min。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述离心的转速为3000rpm，所述离心的时间为10min。
9.利用权利要求1～8任一项所述方法制备得到的山茱萸果肉中降血糖成分在制备抗糖尿病的保健品中的应用。
10.利用权利要求1～8任一项所述方法制备得到的山茱萸果肉中降血糖成分在制备抗糖尿病的药物中的应用。
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