CN102258558B - 一种含肌醇的纳米级南瓜提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含肌醇的纳米级南瓜提取物及其制备方法和用途。该南瓜提取物含总肌醇3-5%，平均粒径为300-500nm；其制备方法包括用提取剂提取，再利用植酸酶将肌醇衍生物酶解释放出肌醇单体，经过离子交换树脂分离得到含有肌醇单体及其衍生物的南瓜肌醇提取物；并将提取物以高能球磨法制备成适宜粒径的纳米级南瓜提取物；经试验，此含肌醇的纳米级南瓜提取物具有较好的辅助降血糖作用，可用于糖尿病新药物及各种保健制剂的制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种含肌醇的纳米级南瓜提取物及其制备方法和用途。
背景技术
南瓜，学名Cucurbita moschata Duch，别名番瓜、饭菜瓜等，是葫芦科。南瓜不但具有非常高的营养价值，而且还具有极高的药用价值，其中最为人们所熟知的药用、保健功能是抗糖尿病。近年来，对南瓜功能性因子的研究及相应功能食品的开发越来越受到重视，据研究报道，南瓜中所含有的多糖、肌醇等成分是其抗糖尿病的主要有效物质。
肌醇是近年来发现的一类新的开发治疗糖尿病新的特异分子，是一种重要的、紧俏的医药添加剂和生化原料，具有类似于维生素B1和维生素H（生物素）的作用，是人类和动物维持正常生理功能不可缺少的低分子有机物，能促进糖和脂肪代谢，具有促进细胞生长和防止老化的医疗作用，可治疗各种维生素缺乏症，被广泛用于制造复合维生素制剂原料，能治疗肝硬化、脂肪肝、血管硬化、胆固醇过高、肥胖症、糖尿病等多种疾病。其最初在肌肉中发现，后来已在微生物、动物中广泛发现。几乎所有生物都含有游离态或结合态的肌醇。在植物和鸟类有核红血球中作为六磷酸肌醇是以六磷酸酯形式存在的。国内外对肌醇生产方法主要是菲汀法、溶剂法、化学合成法、微生物法等。目前肌醇的提取方法在玉米、米糠等作物中比较成熟，但在南瓜中提取肌醇的极少，范子建等报道用溶剂法提取南瓜肌醇，肌醇得率为0.566%；在Tao Xia和Qing Wang有关南瓜提取物中D-手性肌醇及其对糖尿病小鼠降糖作用的研究中，用甲醇提取肌醇得率约为1%。肌醇在南瓜中大多以六磷酸肌醇形式存在，简单用溶剂法提取往往只能得到肌醇的衍生物，且可能南瓜中其他多糖等大分子物质包裹住肌醇类物质，不易溶解出来，肌醇提取率较低，资源利用率差。
随着纳米技术的发展，纳米加工在中草药上的运用也逐步受到关注。郝存江的研究结果表明，中药产生的药理效应不能完全归功于该药特有的化学组成，还与药物的物理状态密切相关。南瓜提取物往往获得大分子功效分子，不易被人体吸收利用，目前对其纳米研究还未见有。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有肌醇这一活性成分的南瓜提取物，并利用一定的纳米加工工艺条件，将其制备成纳米级南瓜提取物。本发明另一目的是提供该南瓜提取物的制备方法和用途。
本发明所提供的含有肌醇的纳米级南瓜提取物是以南瓜为原料，经过提取、酶解、过柱、干燥、纳米加工而成。其肌醇含量为2-5%，平均粒径300-500nm；所含肌醇可以为肌醇单体，也可以为肌醇单体与其衍生物混合的总肌醇。理想的，该提取物含有4-5%以肌醇单体为主，辅以少量肌醇衍生物，平均粒径为350-450nm。
本发明所提供的上述提取物的制备方法：将南瓜用水或者醇溶液提取，提取液进行酶解并过柱，经干燥后进一步纳米加工所得。
具体的制备步骤为：
1）其中的提取方法及条件是在40-70℃温度下，用10-30倍重量的水或20-60%的乙醇水溶液为提取剂提取南瓜，提取液离心，取清液，浓缩后得到含有肌醇及其衍生物的提取液。
此外，本发明探讨了南瓜前处理方法可以是是带籽一起粉碎，干燥成南瓜粉作为原料提取，也可以粉碎后直接加提取剂提取。
2）上述提取完成后，提取液只是提取了南瓜中的可溶成分，而肌醇往往是以肌醇磷酸的形式存在或者与多糖类等包裹起来，并没有释放出肌醇单体，本发明尝试了诸多方法发现用植酸酶酶解能有效地释放出提取液中肌醇单体，因此本发明所利用的酶解的方法是将上述浓缩后的提取液溶解于pH4.2-6.2的乙酸缓冲液中，加入提取液0.05-2.0%的植酸酶，于40-65℃条件下酶解2-6h，得到酶解液。
3）为从上述酶解液中进一步纯化分离得到的肌醇，本发明还采用了柱层析方法，即将酶解液用NaOH溶液调节PH中性，经离子交换树脂分离精制后，浓缩干燥得到含肌醇3-5%南瓜提取物。
其中离子交换树脂分离精制是将酶解液以2ml/min的速度通过离子交换树脂柱，并用蒸馏水洗脱，收集洗脱液而得。本发明中采用的离子交换树脂是华东理工大学上海华振科技有限公司生产的HZ202凝胶型阴离子交换树脂。
4）之后对干燥所得的含肌醇的南瓜提取物进行纳米加工，该工艺方法是将提取物置于球磨器中，加入惰性气体作为助磨剂，在球料比为10：1-20:1，球磨转速20-45Hz，球磨2-6h后得到平均粒径为300-500nm的样品，即为纳米级南瓜提取物。
纳米级材料在理论上需要制备成100nm以下的物料颗粒，但在医药运用方面，100nm以下微粒其限度已经接近某些大分子的单分子水平，故很可能会破坏医药原有的有效成分及药效学性质。本发明人进行了诸多试验，最终确定了上述纳米加工工艺条件及提取物颗粒粒径大小，经动物实验显示，具有较好的辅助降血糖效果。
故根据本发明所提供的含肌醇的纳米级南瓜提取物的用途，可作为辅助降血糖药物原料，也可以做成相关保健品制剂。
具体实施方式
实施例1含肌醇的南瓜提取物的制备
1）称取南瓜1kg，经清洗，去除瓜柄、瓜蒂，切成薄片，置于粉碎机中粉碎成浆，经喷雾干燥得到南瓜粉；
2）将南瓜粉置于不锈钢桶中，加入20L蒸馏水，40℃下搅拌提取4h，离心，滤渣再加入10L蒸馏水提取一次，离心弃渣，合并两次滤液，减压浓缩至原体积的1/30；
3）加入pH4.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液2%的植酸酶，40℃下酶解2h，减压浓缩至1/5体积，并去除乙酸，调节pH至中性，得到酶解液；
4）上述酶解液通过HZ202型阴离子交换树脂进行柱层析，用4L去离子水清洗树脂，收集洗脱液，将洗脱液经减压浓缩，真空干燥得到含肌醇的南瓜提取物样品。
实施例2含肌醇的南瓜提取物的制备
采用实施例1的方案制备提取物，只是南瓜前处理中粉碎之后喷雾干燥改为不进行喷雾干燥，即用湿的南瓜粉碎物直接进行后续提取。
实施例3含肌醇的南瓜提取物的制备
采用实施例2的方案制备提取物，只是提取剂添加量由原来的第一次20L、第二次10L改为第一次7L、第二次3L。
实施例4含肌醇的南瓜提取物的制备
采用实施例2的方案制备提取物，只是提取剂添加量由原来的第一次20L、第二次10L改为第一次15L、第二次5L；并且提取剂由原来的蒸馏水改为60%乙醇溶液。
实施例5含肌醇的南瓜提取物的制备
采用实施例2的方案制备提取物，只是提取剂由原来的蒸馏水改为40%乙醇溶液；而提取温度由原来的40℃改为70℃。
实施例6含肌醇的南瓜提取物的制备
采用实施例2的方案制备提取物，只是酶解条件由原来的加入pH4.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液2%的植酸酶，40℃下酶解2h改为加入pH6.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液1%的植酸酶，40℃下酶解6h。
实施例7含肌醇的南瓜提取物的制备
采用实施例2的方案制备提取物，只是酶解条件由原来的加入pH4.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液2%的植酸酶，40℃下酶解2h改为加入pH6.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液0.05%的植酸酶，50℃下酶解2h。
实施例8含肌醇的南瓜提取物的制备
采用实施例2的方案制备提取物，只是酶解条件由原来的加入pH4.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液2%的植酸酶，40℃下酶解2h改为加入pH5.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液0.05%的植酸酶，60℃下酶解4h。
实施例9含肌醇的南瓜提取物的制备
采用实施例2的方案制备提取物，只是酶解条件由原来的加入pH4.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液2%的植酸酶，40℃下酶解2h改为加入pH5.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液1%的植酸酶，50℃下酶解6h。
实施例10含肌醇的南瓜提取物的制备
采用实施例2的方案制备提取物，只是提取剂由原来的蒸馏水改为20%乙醇溶液；而提取温度由原来的40℃改为60℃；酶解条件由原来的加入pH4.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液2%的植酸酶，40℃下酶解2h改为加入pH4.2的乙酸缓冲溶液及浓缩液1%的植酸酶，50℃下酶解4h。
实施例11上述几个实施例所得南瓜提取物中肌醇含量的测定
样品用60%（V:V）乙腈溶液溶解，以正十八烷为内标，经过硅烷化处理后，用毛细管柱和氢火焰离子化检测器（FID），以程序升温同时对样品中肌醇进行气相色谱测定。
色谱柱：DB-5MS石英毛细管色谱柱（30m×0.25mm,0.25μm）；
柱温：200℃（保持2min）～300℃（保持10min），升温速度：15℃/min；
载气（流量）：He（1.0mL/min），分流比：15:1，进样量：0.5μL。
分别吸取标准溶液和样品溶液于1.5ml安培瓶中，水浴加热N2吹干，依次加入30.0μL硅烷化试剂、30.0μL吡啶、50.0μL乙酸乙酯到上述安瓿瓶中，煤气灯火焰封口，120℃反应30min。冷却至室温后，各加入10.0μL内标，进行气相色谱测定，结果如下：
表1上述各实施例方法所得的南瓜提取物中肌醇测定结果
实施例12含肌醇的南瓜提取物纳米级加工
根据实施例10所制备的提取物样品置于球磨器中，加入氦气作为助磨剂，在球料比为10:1，球磨转速20Hz，球磨时间为3h，即得样品。
实施例13含肌醇的南瓜提取物纳米加工
根据实施例10所制备的提取物样品置于球磨器中，加入氦气作为助磨剂，在球料比为20:1，球磨转速45Hz，球磨时间为6h，即得样品。
实施例14含肌醇的南瓜提取物纳米加工
根据实施例10所制备的提取物样品置于球磨器中，加入氦气作为助磨剂，在球料比为15:1，球磨转速35Hz，球磨时间为4h，即得样品。
上述实施例12、13、14所得样品用Zetasizer3000HS激光粒度分析仪进行粒径测定，记录平均粒径，结果见表2：
表2上述各实施例方法所得的提取物粒径测定结果
实施例15本发明含肌醇的纳米级南瓜提取物的降血糖作用
雄性C57小鼠100只，6周龄，腹腔注射80mg/kg STZ(链脲佐菌素)。72h后，尾尖取血测空腹血糖，选取血糖值为11.1-20mmol/L的小鼠为高血糖模型实验组，并按血糖水平进行随机分为4组，每组10-12只，分别为模型对照组、实施例12样品组、实施例13样品组、实施例14样品组，各组分别灌胃上述试药，模型对照组灌胃双蒸水，每日一次，连续给药30天。
1）对C57糖尿病小鼠随机和空腹血糖的长期作用：给药后每7天测定各组小鼠随机和空腹血糖，随机血糖测定后，换笼禁食，禁食2h后给药，空腹血糖为小鼠禁食不禁水6h后测定。
表3对C57糖尿病小鼠随机血糖的长期作用（血糖值，mmol/L，n=10,）
表4对C57糖尿病小鼠空腹血糖的长期作用（血糖值，mmol/L，n=10，X±s）
注：*表明与模型对照组比较P＜0.05
从表3、表4可见，模型对照组小鼠随机血糖较稳定，灌胃实施例12所得样品的小鼠随机和血糖略有下降，但不明显，而实施例13组小鼠随机和空腹血糖都不是很稳定，在给药后血糖值在小范围内起伏，说明其对由STA诱导的糖尿病小鼠的随机和空腹血糖没有降低作用；而实施例14组小鼠血糖随着给药时间的延长，随机和空腹血糖呈现下降趋势，在给药22天时与模型组随机血糖对比具有显著性差异，而空腹血糖在给药8d后即显现了明显的差异，说明实施例14所得样品对STA诱导的糖尿病小鼠随机和空腹血糖具有较好的降低作用。
2）对C57糖尿病小鼠口服糖耐量的影响
给药30d后，灌胃葡萄糖1.5g/kg，于给糖前及给糖后15、30、60、120min尾尖取血，分离血清，测定血清葡萄糖含量。
表5对C57糖尿病小鼠口服糖耐量的影响（血糖值，mmol/L，n=10，）
注：*表明与模型对照组比较P＜0.05
由表5可见，实施例14所得样品与模型组对比能明显降低小鼠糖负荷后15min后的血糖值，有效地控制了小鼠血糖的升高；而实施例12组、实施例13小鼠口服糖耐量作用不明显。
根据上述对C57糖尿病小鼠随机、空腹血糖和口服糖耐量的影响试验证实，实施例14组所得样品的降糖效果好，说明提取物纳米加工以得到粒径在300-500nm大小为宜，该含肌醇的纳米级南瓜提取物可作为辅助降血糖的医药原料或制备成保健食品制剂。
Claims (4)
1.一种含肌醇的具有降血糖作用的纳米级南瓜提取物，其特征在于：该提取物含有2-5%肌醇作为活性成分，其粉末粒径平均300-500nm，该提取物的制备方法为：a.南瓜经前处理，加入10-30倍体积的水或乙醇溶液提取离心，清液经浓缩得浓缩液；b.浓缩液加入pH为4.2-6.2乙酸缓冲溶液，用植酸酶酶解释放出肌醇单体；c.酶解液调节pH至中性，经过阴离子交换树脂，得到含有肌醇的南瓜提取物；d.所得提取物经高能球磨法制备成纳米级；所述的步骤a中南瓜前处理是指将南瓜切片，干燥后粉碎或者直接切片后粉碎；所述的步骤b中植酸酶添加量为0.05-2.0%，于40-65℃条件下酶解2-6h；所述的步骤c中所指的阴离子交换树脂是HZ202型阴离子交换树脂；所述的步骤d中高能球磨法是指将提取的南瓜提取物置于球磨器中，加入惰性气体作为助磨剂，在球料比为10：1-20:1，球磨转速20-45Hz，球磨2-6h。
2.如权利要求1所述的含肌醇的具有降血糖作用的纳米级南瓜提取物，其特征在于：所含有的肌醇可以为肌醇单体，也可以为肌醇单体、肌醇衍生物混合的总肌醇。
3.制备权利要求1所述的含肌醇的具有降血糖作用的纳米级南瓜提取物的方法：a.南瓜经前处理，加入10-30倍体积的水或乙醇溶液提取离心，清液经浓缩得浓缩液；b.浓缩液加入pH为4.2-6.2乙酸缓冲溶液，用植酸酶酶解释放出肌醇单体；c.酶解液调节pH至中性，经过阴离子交换树脂，得到含有肌醇的南瓜提取物；d.所得提取物经高能球磨法制备成纳米级；所述的步骤a中南瓜前处理是指将南瓜切片，干燥后粉碎或者直接切片后粉碎；所述的步骤b中植酸酶添加量为0.05-2.0%，于40-65℃条件下酶解2-6h；所述的步骤c中所指的阴离子交换树脂是HZ202型阴离子交换树脂；所述的步骤d中高能球磨法是指将提取的南瓜提取物置于球磨器中，加入惰性气体作为助磨剂，在球料比为10：1-20:1，球磨转速20-45Hz，球磨2-6h。
4.如权利要求1所述的含肌醇的具有降血糖作用的纳米级南瓜提取物在制备辅助降血糖的医药原料或保健食品制剂中的用途。
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