CN101264110A - 菱角多糖及其提取方法及其药物用途 - Google Patents

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CN101264110A CNA2008100506677A CN200810050667A CN101264110A CN 101264110 A CN101264110 A CN 101264110A CN A2008100506677 A CNA2008100506677 A CN A2008100506677A CN 200810050667 A CN200810050667 A CN 200810050667A CN 101264110 A CN101264110 A CN 101264110A
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Abstract

本发明涉及一种菱角多糖及其提取方法及其药物用途，属于中药领域。菱角多糖，其特征在于它是由下列制备方法得到的：包括制备粗多糖和粗多糖纯化，将粗多糖溶解，配成5％的糖液，氯仿-正丁醇溶液体积比为1∶0.2，按粗多糖溶液与氯仿-正丁醇溶液，体积比为(2－5)∶1，加入一具塞容器中，振荡30min，离心15min，吸取上层水相保留，弃掉氯仿相与蛋白沉淀，按上述方法重复除蛋白3次，干燥；采用活性炭法脱色。菱角多糖具有抗肿瘤作用。药效学实验表明，菱角多糖对Hela、U251细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用。

Description

菱角多糖及其提取方法及其药物用途
技术领域
本发明属于中药领域。
背景技术
菱角(Water caltrop)被中华人民共和国药典(2005年版一部)及中药大辞典所收载，为菱科植物菱的果实，具有清热、解渴、健脾、益气明目之功效。前期的实验表明菱角的水提物具有良好的抗肿瘤活性，对于菱角多糖部分的活性尚未见文献报道。
恶性肿瘤已经成为人类生命的三大杀手之一，医学界在寻求和使用抗癌药物的同时，发现许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，但植物药的遗传毒性不太明显，表明中草药在抗癌抗突变方面有其独特的优势和广阔的应用前景。近些年来单味中药及中药复方防治肿瘤作用的研究已取得一定成绩。
发明内容
本发明提供一种菱角多糖及其提取方法及其药物用途。本发明菱角多糖是由下列制备方法得到的：
一、称取菱角皮置于提取器内，以8～10倍体积的蒸馏水浸泡8～10天，加热煮沸3～4小时，过滤后再以3～5倍体积的水重复提取1～2次，合并深色提取液，过滤，浓缩至相对密度1.15-1.20(50℃)；
二、加入2～3倍量95％乙醇沉淀，并不断搅拌，过滤，将沉淀加水充分溶解，3000rpm离心15min，去除不溶性杂质；
三、用2～3倍量95％乙醇沉淀，4℃，静置15-20小时，3000rpm离心15min；沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇脱水，再用乙醚脱去乙醇后，置于盛有P2O5及NaOH的真空干燥器内真空干燥，得粗多糖；
四、粗多糖纯化
a、将粗多糖溶解，配成5％的糖液，氯仿-正丁醇溶液体积比为1∶0.2，按粗多糖溶液与氯仿-正丁醇溶液，体积比为(2-5)∶1，加入一具塞容器中，振荡30min，离心15min，吸取上层水相保留，弃掉氯仿相与蛋白沉淀，按上述方法重复除蛋白3次，干燥；
b、除色素，采用活性炭法脱色，将多糖配成5％的糖液，加3％的活性炭，70℃水浴中加热2小时，冷却，抽滤除去活性炭。
本发明菱角多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供菱角多糖及其制备方法，菱角多糖具有抗肿瘤作用。药效学实验表明，菱角多糖对Hela、U251细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用。本发明药物用法用量，口服剂量以生药量计算0.5克-3克/次，一日三次。
附图说明
图1是24h后对照组Hela细胞。
图2是多糖处理24h后Hela细胞。
图3是24h后对照组U251细胞。
图4是多糖处理24h后Hela细胞。
图5菱角多糖对U251细胞的生长抑制曲线。
图6菱角多糖对Hela细胞的生长抑制曲线。
具体实施方式
下面通过具体药效学实验例来进一步证明其抗肿瘤作用。
1.MTT法测定多糖对肿瘤细胞增殖的抑制作用
取对数生长期的人宫颈癌细胞Hela，人神经胶质瘤细胞U251接种于96孔板中，每孔100μL，密度为8×104·mL-1，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，待细胞贴壁后加入不同浓度的多糖，使其终浓度分别为：1000、500、250、125、62.5、31.25，15.625、7.8125μg·mL-1，每个剂量设3个平行孔，对照孔以等体积的IMDM代之。将培养板置37℃、5％CO2的培养箱中继续培养24h后，加入MTT，每孔20μL，继续培养4h后，吸出培养液，加入DMSO 150μL，震荡10min后置酶标仪上于570nm波长测各孔吸光度值，各重复孔的吸光度值取平均值，计算菱角多糖各组分对Hela，U251细胞的抑制率。
抑制率计算公式为：
Figure A20081005066700051
2.结果与分析
2.2菱角多糖对Hela和U251细胞的体外抑瘤作用
2.2.1细胞形态的变化倒置显微镜下观察对照组和各实验组细胞形态变化，发现随着菱角多糖浓度的增加Hela和U251细胞的增殖受到明显抑制。
主要表现在：随着药物浓度的增加细胞数目逐渐减少，细胞的体积变小、变形，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。Hela细胞24h对照组细胞与加药细胞形态变化见图1、图2；U251细胞24小时对照组与加药细胞形态变化见图3、图4。
2.2.2菱角多糖对U251细胞和Hela细胞24小时生长抑制率
采用MTT法检测了菱角多糖对U251细胞和Hela细胞24小时生长抑制率，结果见表1，表2，图5和图6。实验表明，菱角多糖作用24h对所实验肿瘤细胞Hela和U251细胞具有较强的抑制增殖作用，最高抑制率均达70％以上，并且呈现良好的量效关系。
表1  菱角多糖对U251细胞24小时生长抑制率(x±s)
*P＜0.05
表2  菱角多糖对Hela细胞24小时生长抑制率(x±s)
Figure A20081005066700062
*P＜0.05，**P＜0.01
目前普遍认为恶性肿瘤化学治疗药物引起肿瘤退缩的机理，在于促进肿瘤细胞死亡和阻止其增殖，而细胞死亡既可以通过坏死(necrosis)又可通过凋亡(apoptosis)的形式进行。与坏死不同，凋亡的细胞维持完整的细胞膜结构和功能，细胞解体后形成凋亡小体，不引起周围组织炎症反应[。体外实验MTT结果表明，菱角多糖具有抑制Hela和U251细胞增殖的作用，并且呈现良好的量效关系，作用24小时的最高抑制率均在70％以上。菱角多糖对Hela细胞作用24h半数抑制率IC50为48.18μg·mL-1，对U251细胞作用24h半数抑制率IC50为41.97μg·mL-1。在倒置显微镜下观察菱角多糖对Hela和U251细胞的作用，随着菱角多糖浓度的增加细胞数目逐渐减少，药物诱导后的肿瘤细胞胞浆内颗粒增多、增粗，细胞膜边缘变粗糙。
总之，菱角多糖对Hela、U251细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用。
实施例1：
一、称取菱角皮置于提取器内，以8倍体积的蒸馏水浸泡8天，加热煮沸3小时，过滤后再以3倍体积的水重复提取2次，合并深色提取液，过滤，浓缩至相对密度1.15-1.20(50℃)；
二、加入3倍量95％乙醇沉淀，并不断搅拌，过滤，将沉淀加水充分溶解，3000rpm离心15min，去除不溶性杂质；
三、用3倍量95％乙醇沉淀，4℃，静置15小时，3000rpm离心15min；沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇脱水，再用乙醚脱去乙醇后，置于盛有P2O5及NaOH的真空干燥器内真空干燥，得粗多糖；
四、粗多糖纯化
a、将粗多糖溶解，配成5％的糖液，氯仿-正丁醇溶液体积比为1∶0.2，按粗多糖溶液与氯仿-正丁醇溶液，体积比为2∶1，加入一具塞容器中，振荡30min，离心15min，吸取上层水相保留，弃掉氯仿相与蛋白沉淀，按上述方法重复除蛋白3次，干燥；
b、除色素，采用活性炭法脱色，将多糖配成5％的糖液，加3％的活性炭，70℃水浴中加热2小时，冷却，抽滤除去活性炭。
实施例2
一、称取菱角皮置于提取器内，以9倍体积的蒸馏水浸泡9天，加热煮沸3.5小时，过滤后再以4倍体积的水重复提取2次，合并深色提取液，过滤，浓缩至相对密度1.15-1.20(50℃)；
二、加入2倍量95％乙醇沉淀，并不断搅拌，过滤，将沉淀加水充分溶解，3000rpm离心15min，去除不溶性杂质；
三、用2倍量95％乙醇沉淀，4℃，静置18小时，3000rpm离心15min；沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇脱水，再用乙醚脱去乙醇后，置于盛有P2O5及NaOH的真空干燥器内真空干燥，得粗多糖；
四、粗多糖纯化
a、将粗多糖溶解，配成5％的糖液，氯仿-正丁醇溶液体积比为1∶0.2，按粗多糖溶液与氯仿-正丁醇溶液，体积比为3∶1，加入一具塞容器中，振荡30min，离心15min，吸取上层水相保留，弃掉氯仿相与蛋白沉淀，按上述方法重复除蛋白3次，干燥；
b、除色素，采用活性炭法脱色，将多糖配成5％的糖液，加3％的活性炭，70℃水浴中加热2小时，冷却，抽滤除去活性炭。
实施例3
一、称取菱角皮置于提取器内，以10倍体积的蒸馏水浸泡10天，加热煮沸4小时，过滤后再以5倍体积的水重复提取1次，合并深色提取液，过滤，浓缩至相对密度1.15-1.20(50℃)；
二、加入2.5倍量95％乙醇沉淀，并不断搅拌，过滤，将沉淀加水充分溶解，3000rpm离心15min，去除不溶性杂质；
三、用2.5倍量95％乙醇沉淀，4℃，静置20小时，3000rpm离心15min；沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇脱水，再用乙醚脱去乙醇后，置于盛有P2O5及NaOH的真空干燥器内真空干燥，得粗多糖；
四、粗多糖纯化
a、将粗多糖溶解，配成5％的糖液，氯仿-正丁醇溶液体积比为1∶0.2，按粗多糖溶液与氯仿-正丁醇溶液，体积比为5∶1，加入一具塞容器中，振荡30min，离心15min，吸取上层水相保留，弃掉氯仿相与蛋白沉淀，按上述方法重复除蛋白3次，干燥；
b、除色素，采用活性炭法脱色，将多糖配成5％的糖液，加3％的活性炭，70℃水浴中加热2小时，冷却，抽滤除去活性炭。
实施例4本发明片剂的制备
取实施例1制得的菱角多糖500克，加入制备片剂的常规辅料500克，混匀，制成1000片。
实施例5本发明胶囊剂的制备
取实施例1制得的菱角多糖500克，加入淀粉500克，混匀，用乙醇制粒，干燥，装胶囊，制成1000粒。

Claims (5)

1、一种菱角多糖，其特征在于它是由下列制备方法得到的：
一、称取菱角皮置于提取器内，以8～10倍体积的蒸馏水浸泡8～10天，加热煮沸3～4小时，过滤后再以3～5倍体积的水重复提取1～2次，合并深色提取液，过滤，浓缩至相对密度1.15-1.20(50℃)；
二、加入2～3倍量95％乙醇沉淀，并不断搅拌，过滤，将沉淀加水充分溶解，3000rpm离心15min，去除不溶性杂质；
三、用2～3倍量95％乙醇沉淀，4℃，静置15-20小时，3000rpm离心15min；沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇脱水，再用乙醚脱去乙醇后，置于盛有P2O5及NaOH的真空干燥器内真空干燥，得粗多糖；
四、粗多糖纯化
a、将粗多糖溶解，配成5％的糖液，氯仿-正丁醇溶液体积比为1∶0.2，按粗多糖溶液与氯仿-正丁醇溶液，体积比为(2-5)∶1，加入一具塞容器中，振荡30min，离心15min，吸取上层水相保留，弃掉氯仿相与蛋白沉淀，按上述方法重复除蛋白3次，干燥；
b、除色素，采用活性炭法脱色，将多糖配成5％的糖液，加3％的活性炭，70℃水浴中加热2小时，冷却，抽滤除去活性炭。
2、如权利要求1所述的菱角多糖的制备方法。
3、如权利要求1所述的菱角多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
4、如权利要求3所述的菱角多糖在制备抗人宫颈癌药物中的应用。
5、如权利要求3所述的菱角多糖在制备抑制人神经胶质瘤细胞增殖的药物中的应用。
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