CN102232988A - 具有抗肿瘤活性的金铁锁总皂苷及其制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苗族药物金铁锁抗肿瘤作用的新用途，同时公开了其抗肿瘤活性药用部位的制备方法及其制剂。制备方法主要经过乙醇提取，浓缩，正丁醇萃取、大孔吸附树脂纯化等步骤获得金铁锁总皂苷。以总皂苷为原料，制备成片剂、胶囊剂、注射剂等临床常用的药物制剂。药效学评价采用体内外结合的方法。体外试验显示，TSPT对胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤，6种肿瘤细胞具有较强的抑制作用，而对正常脾淋巴细胞抑制不明显；整体动物体内实验结果显示，该药对S180实体瘤抑制率高达72％，作用效价高，而对小鼠体重影响不大；与阳性药顺铂比，副作用较低。上述实验结果表明，该药抗癌效价强、副作用低，具备原始创新的优势。

Description

具有抗肿瘤活性的金铁锁总皂苷及其制剂

技术领域

本发明涉及一种金铁锁有效部位—总皂苷在抗肿瘤作用方面的应用及其制剂。 

背景技术

恶性肿瘤一直是严重威胁人类健康的重大疾病之一。抗肿瘤药物的药物毒性及不良反应也越来越受到重视。世界各国科研人员一直在为寻找具备一定选择性抗肿瘤的候选药物而不懈努力。寻求毒副作用小、抗肿瘤作用强，具有一定选择性抗肿瘤的药物是目前和将来的研究热点和重点。天然药物是理想的抗肿瘤候选药物筛选的一大宝库，如紫杉醇、喜树碱等一批具有较强抗肿瘤活性的天然药物被筛选出来，表现出了较好的临床疗效和应用前景。因此，鉴于我国自然草药资源丰富，民族、民间草药用药经验广泛的特点，从民族民间用药中筛选出毒副作用小、抗肿瘤作用强的药物及其有效部位，具有相当的优势。在从民族民间药物中筛选抗肿瘤活性的候选药物的过程中，首次发现了苗族药物金铁锁具有很强的抑制肿瘤细胞和实体瘤生长的作用，而对正常细胞和小鼠体重等方面的影响明显，这是一个令人兴奋的重要发现。 

金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu为石竹科单属种植物，别名独定子、蜈蚣七、对叶七、白马分鬃等，主要分布于贵州、云南、四川、西藏等中国西南地区，是苗族民间常用药物之一。其功效具有散淤定痛，止血，消痈排脓等作用。主治跌打损伤，风湿，胃痛，痈疽疮疖，创伤出血等。主要化学成分含有三萜、三萜皂苷、环肽以及内酰胺以及氨基酸和有机酸等，药理作用主要集中在镇痛、抗炎、免疫和抗类风湿等几个方面。 

在本发明之前，尚未见有金铁锁抗肿瘤作用及临床运用方面的报道。 

发明内容

本发明的目的之一是提供金铁锁具有抗肿瘤作用有效部位-总皂苷及制备方法； 

本发明的目的之二是提供金铁锁总皂苷药物制剂的制备方法； 

本发明的目的之三是提供金铁锁的抗肿瘤作用的新用途及实验数据； 

本发明通过以下技术方案来实现： 

本发明金铁锁总皂苷的制备方法取金铁锁药材粉碎后，经乙醇70℃-95℃回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收乙醇得浸膏。取浸膏以2倍量的水溶解后，以正丁 醇萃取3次，合并正丁醇层，减压蒸干溶剂后得金铁锁总皂苷粗提物；然后将金铁锁总皂苷粗提物用低碳醇溶解，过大孔吸附树脂柱，以梯度乙醇-水溶液为流动相进行洗脱，再用TLC方法监测流出产物，收集含金铁锁总皂苷的流出产物；合并洗脱液，减压浓缩去除溶剂，冷冻或喷雾干燥至粉，得金铁锁总皂苷。 

本发明的药物制剂含有1％-99％的金铁锁总皂苷和99％-1％的赋形剂，优选含有20％-80％的赋形剂，最好含有40％-60％的金铁锁总皂苷和60％-40％的赋形剂。按照药剂学制备工艺和方法，可以将本发明的金铁锁总皂苷制备成多种抗肿瘤药物的临床应用剂型，包括口服制剂和非肠道给药剂型。所指的口服机制包括片剂、胶囊剂、脂质体、滴丸、缓控释剂、微孔渗透、薄膜包衣、乳剂、颗粒剂、口崩片中的任何一种；非肠道给药剂型包括注射剂、粉针剂中的任何一种。 

本发明通过体外肿瘤细胞培养实验，初筛金铁锁总皂苷的抗肿瘤作用的药理学活性并评价其作用效价，然后通过整体动物实验进一步验证其抗肿瘤作用及强度。体外细胞实验筛选了金铁锁总皂苷对胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌共5种肿瘤细胞抑制作用及其效价，同时比较的研究其对正常脾淋巴细胞抑制作用情况，考察了金铁锁总皂苷其对肿瘤细胞株杀伤作用的选择性和敏感性，分析了其对肿瘤细胞的特异性抑制作用，以及对正常细胞生长有无明显影响。通过整体动物实验，分析了金铁锁总皂苷对S₁₈₀小鼠实体瘤生长的抑制作用以及对小鼠体重的影响。 

附图说明

图1是金铁锁总皂苷(TSPT)及各给药组小鼠S₁₈₀瘤体大小的比较图 

图中“生理盐水”是指生理盐水给药组；“TSPT大剂量”、“TSPT中剂量”、“TSPT小剂量”分别是指金铁锁总皂苷分别为10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg的给药剂量组；“顺铂”是指阳性对照药顺铂给药组。 

具体实施例如下： 

实施例1金铁锁总皂苷的制备方法 

优化后的提取条件是：取金铁锁药材3kg，以8倍量体积为95％的乙醇76℃条件下回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收乙醇至干，然后将金铁锁提取物用低碳醇溶解，过大孔吸附树脂柱，分别以10％，30％，50％，70％，90％乙醇-水溶液为流动相进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩去除溶剂，冷冻或喷雾干燥至粉，得金铁锁总皂苷151.3g。 

实施例2金铁锁总皂苷对体外5种肿瘤细胞的抑制作用 

细胞：乳腺癌细胞(MCF-7)、人结肠癌细胞C26、人肝癌细胞BEL-7401、人卵巢癌细胞(SKOV3)、人胃癌细胞(BGC-823)，上述5种肿瘤细胞均由中国医学科学院肿瘤医院提供。 

药品与试剂：金铁锁总皂苷，由北京中医药大学分子生药实验室提供，白色粉末，青霉素(Sigma，USA)、链霉素(Sigma，USA)；胰蛋白酶(Sigma，USA)、RPMI1640培养基(Gibco，Invitragen co.，USA)；胎牛血清(Gibco，Invitragen co.，USA)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma， USA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma，USA)。培养条件：温度37℃、湿度100％、含5％二氧化碳空气中培养。 

仪器：CO2培养箱(Thermo 311型)；超净工作台(苏州净化设备厂)；倒置荧光显微镜(BDS200型)；酶标自动分析仪(华东电子集团医疗装备有限公司)；台式离心机(Anke7DL-50B型)；高压灭菌锅(日本森展企业有限公司)；冰箱(Hisense 225U型)；电热恒温干燥箱(中兴202型) 

实验方法，MTT法：各种肿瘤细胞株按照常规方法培养传代，收集对数生长期的细胞，调节细胞悬液浓度；取96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液180μL(3000个/孔)，于37℃，5％CO₂培养箱中培养2h。金铁锁总皂苷溶解在生理盐水中，终浓度为4μg/mL、16μg/mL、64μg/mL、256μg/mL、512·μg/mL，各20μL/孔，每浓度8个复孔，正常对照组加入等量1640培养基，同时设顺铂阳性对照20μL，终浓度为312μg/mL，于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。弃去培养液，每孔加入200μL MTT溶液(原液5mg/mL)，继续培养4h。弃去MTT，每孔加入200μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 540nm处测量各孔的吸光值。计算抑制率和IC₅₀值。 

实验结果显示(见表1)，金铁锁皂苷1.6μg/mL对部分肿瘤细胞株如人胃癌细胞(BGC-823)、和乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖没有明显的抑制作用，但随着药物剂量的增加至6.4μg/mL、25.6μg/mL、52.1μg/mL时，对各肿瘤细胞株均呈现明显的生长抑制作用，并具有一定的浓度依赖关系，最高抑制率达71.4％(人胃癌细胞株BGC-823)和71.9％(人结肠癌细胞C26)。数据还显示，人结肠癌细胞C26对金铁锁总皂苷最为敏感，IC50值最小仅为9.02μg/mL，说明金铁锁总皂苷抗癌作用效价较强，作用强度接近临床常用化疗西药如顺铂等。 

表1  金铁锁总皂苷对5种肿瘤细胞的抑制率及IC₅₀值 

实施例3 金铁锁总皂苷对正常脾细胞的作用 

脾细胞免疫细胞培养 

6～8周龄昆明小鼠，颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3min，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5mL Hanks液的培养皿中；将脾脏放置不锈钢网(200目)上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液。培养液：10％小牛血清、青霉素100u/mL、链霉素100u/mL的RPMI 1640。培养条件：温度37℃、湿度100％、含5％二氧化碳空气中培养。 

细胞增殖检测 

取96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液100μL，浓度3×10⁵个/mL，37℃，5％CO₂培养箱中培养2h。终浓度为32μg/mL、6.4μg/mL、8.0μg/mL、12.8μg/mL、25.6g/mL，各10μL/孔，每浓度8个复孔，正常对照组只加入等量的溶媒(30％乙醇-NaCl溶液)，同时设ConA阳性对照组ConA 10μL，终浓度为5μg/mL，于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。取出细胞培养板，倒置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20μL MTT溶液(原液5mg/mL)，继续培养4h。弃去培养液，用PBS冲2-3遍(根据细胞贴壁情况确定是否冲洗)，每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 540nm处测量各孔的吸光值。增殖率＝(处理组OD值一对照组OD值)/对照组OD值×100％ 

实验结果显示(见表2)，金铁锁总皂苷在6.4μg/mL时开始出现对脾淋巴细胞的轻微抑制作用，但这种作用较小，当剂量高达51.2μg/mL时，其抑制率仅为2.1％，与相同剂量对肿瘤细胞的抑制率71.0％相比(参见表1)，金铁锁总皂苷对正常细胞的这种抑制作用显得微不足道。 

由实施例2和实施例3可知，金铁锁总皂苷对肿瘤细胞具有选择性细胞毒作用，而对正常细胞的细胞毒性相对较小。 

表2  金铁锁总皂苷对脾细胞的增殖抑制作用 

实施例4 金铁锁总皂苷抗对S180实体瘤的抑制作用 

实验动物：ICR小鼠，雄性，体重18-22g，7-9周龄，共100只，由北京维通利华实验中心提供。动物饲养及实验条件为无特殊病原菌级屏障系统，饲养于北京中医药大学实验动物中心。 

肿瘤细胞接种：取传代接种后9天的S180瘤株种鼠，无菌条件下取出瘤块，按1∶3稀释成匀浆，制备肿瘤细胞悬液(6×10⁷个/mL)，植入ICR小鼠左前肢腋部皮下(0.2mL/只)，接种后定期观察小鼠精神、饮食及排便等情况。 

实验分组及方法：当皮下移植瘤长到约5mm³左右，挑选肿瘤大小一致的小鼠称重，用随机数字表达法分为6组，每组12只，每天皮下给药一次，连续10天。 

金铁锁高、中及低剂量组分别按10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg给药，顺铂阳性对照组按4mg/kg剂量给药，模型组皮下注射生理盐水(0.1mL/10g)，正常组不给药，正常取食、饮水。停药次日处死全部小鼠，分离瘤块称重，计算抑瘤率。实验结果采用SPSS软件进行统计，实验数据以(平均数±标准差)表示，按照P小于0.05为统计学显著性差异的意义标准。 

实验结果表明，金铁锁三个剂量组均对荷S180小鼠实体瘤具有明显的抑制作用，高、中、低剂量组的抑瘤率分别为72.20％，62.26％和53.65％，与对照组相比差异有显著性(P＜0.01)((表3、图1))，其中高剂量组抑瘤率高达72.20％，接近西药对照药顺铂的效价；而对小鼠体重与生理盐水组相比，没有明显的小鼠体重减轻的副作用(P＞0.05)(表3)，各给药组小鼠体重正常增重，小鼠精神状态良好，食欲正常。而顺铂组在4mg/kg的给药剂量下，小鼠体重急剧减轻，表现为小鼠消瘦、食欲减弱，精神状态较差。 

表3  金铁锁总皂苷对荷S180小鼠的抑瘤作用 

表3  金铁锁总皂苷对荷S180小鼠的抑瘤作用 

注：TSPT代表金铁锁总皂苷；与生理盐水组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01 

实施例5 金铁锁总皂苷药物制剂的制备 

(1)片剂的制备 

TSPT总皂苷33g，药用淀粉217g，混合均匀，用适量的淀粉糊作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，压片，每片250mg，口服，每次1片，每日2次。 

(2)胶囊剂的制备 

TSPT总皂苷33g，药用淀粉217g，混合均匀，用适量的淀粉糊作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，填充胶囊，每粒250mg，口服，每次1粒，每日2次。 

(3)注射剂的制备 

注射剂：用注射用水3000mL溶解TSPT总皂苷33g，加入活性炭(105℃活化1h)30g，使其达到0.01％，加热煮沸20min，调PH值为5.5-6.5，加入氯化钠调为等渗溶液，趁热滤过，灌封，灭菌即得。每支3mL，肌肉注射，每次3mL，一日2次。 

(4)粉针剂的制备 

TSPT总皂苷33g冷冻干燥成细粉，或注射液每1000mL加入62.5g甘露醇和62.5g麦芽糖做支持剂，溶解后冷冻干燥，封装，灭菌即得。 

(5)脂质体的制备 

称取处方量TSPT总皂苷3.3g，大豆卵磷脂40g和胆固醇10g用氯仿和甲醇(2∶1)溶解，40℃恒温水浴中，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，加入适量浓度的甘露醇和葡萄糖的水溶液1000mL，轻摇，将类脂膜洗脱并水合成脂质体初悬液，置探头式超声至半透明胶体溶液，微孔滤膜滤过，滤液分装后冷冻干燥。 

(6)滴丸剂的制备 

取TSPT皂苷16.5g，加聚乙二醇400033g，加热熔化均匀后，在80℃状态下，以每分钟20滴的速度滴入液体石蜡冷凝剂(冷凝剂上部的温度控制在5～15℃)中，成形后，取出，去除冷凝剂，干燥，得本品1000丸。控制丸重在0.0495g/丸。 

(7)缓、控释制剂的制备 

1)骨架片：TSPT总皂苷66g，HPMC K100M 40g，乳糖120g，淀粉40g。混合均匀，用适量的5％PVP的95％乙醇溶液作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，压片，每片266mg，口服，每次1片，每日1次。 

2)微孔渗透泵、薄膜包衣：每片273mg，口服，每次1片，每日1次。 

片心：TSPT皂苷66g，乳糖140g，淀粉50g，氯化钠3g，滑石粉1g，用适量的5％PVP的95％乙醇溶液作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，压片，每片260mg； 

包衣液：醋酸纤维素用丙酮和异丙酮的混合溶液溶解，浓度为2％(g/100mL)，加入邻苯二甲酸二丁酯25％为增塑剂，加入PEG400为致孔剂，将片心包衣，衣膜增重5％。 

(8)乳剂的制备 

TSPT皂苷0.5g、二甲基亚砜14mL、三乙醇胺1.6g、甘油4.0g、蒸馏水54mL、羊毛脂2.0g、白凡士林10g、硬脂酸16g，混合均匀。 

(9)口腔黏附片的制备 

TSPT总皂苷33g，HPMC K4M 50g，HPMC K15M 25g，乳糖85g，硬脂酸镁1.5g，阿斯巴甜5.5g。混合均匀，分别粉碎过100目筛，采用粉末直接压片法压片，每片200mg，口服，每次1片，每日2次。 

(10)口崩片的制备 

主药33g，低取代羟丙基纤维素146.65g，微晶纤维素75g，阿斯巴甜8.1g，薄荷脑5.4g，乳糖35.5g，硬脂酸镁1.35g。口服，每次1片，每日2次。 

(11)颗粒剂的制备 

TSPT总皂苷33g，乳糖1167g，糊精2800g，混合均匀，用适量的95％乙醇作为粘合剂制粒，干燥，整粒机整粒，包装机包装，每袋4g，口服，每次1袋，每日2次。 

Claims (10)

1.苗药金铁锁抗肿瘤活性有效部位，其特征在于：其有效部位提取物为总皂苷，其基本母核结构为齐墩果烷型五环三萜类化合物，该提取物中金铁锁总皂苷含量在50％以上。

2.根据权利要求1所述的金铁锁总皂苷，其特征在于：所提取溶剂为乙醇、水及其不同的配比。

3.根据权利要求1所述的金铁锁总皂苷，所述提取方法为回流提取，提取温度为70-100℃，至少提取一次，每次时间为40分钟-1小时。

4.一种用于肿瘤治疗的药物制剂，其特征在于含有抗肿瘤作用的有效剂量的金铁锁总皂苷和一种或多种药学上可以接受的赋形剂，或可以与金铁锁总皂苷租方的其它药物。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于含有1％-99％的金铁锁总皂苷和99％-1％的药用赋形剂或其它可组方的药物。

6.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于所说的药物制剂是指非肠道给药或口服类制剂。

7.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、脂质体、滴丸、缓控释剂、微孔渗透泵、薄膜包衣、乳剂、颗粒剂、口崩片的任何一种；非肠道给药的剂型选自于注射剂、粉针剂当中的任何一种。

8.金铁锁总皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8的用途，其特征在于所说的抗肿瘤活性是指抑制肿瘤细胞的增殖和抑制实体瘤的生长。

10.根据权利要求9的用途，其特征在所说的肿瘤细胞包括5种：乳腺癌细胞(MCF-7)、人结肠癌细胞C26、人肝癌细胞BEL-7401、人卵巢癌细胞(SKOV3)、人胃癌细胞(BGC-823)；所说的实体瘤为S180的小鼠移植性肿瘤。

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