CN108061774A - 一种同时测定三七中19种有机氯类农药残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三七中19种有机氯农药残留量的检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备：取药材粉末，加入石油醚浸泡，抽滤，残渣用石油醚分次洗涤，转移至圆底烧瓶中，于25‑45℃下水浴旋转蒸发至近干，以正己烷复溶，加入浓硫酸，充分震摇，反应完全后，离心，取上清液备用；(2)混合对照品溶液的制备：取19种农药标准品置容量瓶中加正己烷稀释至刻度，得各对照品储备液，分别称取对照品储备液置容量瓶中，用正己烷稀释至刻度即得混合对照品溶液；(3)测定法：取供试品溶液，混合对照品溶液注入气相色谱仪中测定。

Description

一种同时测定三七中19种有机氯类农药残留量的方法

技术领域：

本发明涉及一种中药中农药残留物质的检测方法，特别涉及一种同时测定三七中19种有机氯类农药残留量的方法。

背景技术：

农药的使用给人类生活带来了巨大贡献，同时农药的滥用，也给人类机体造成一定的伤害。目前随着中药材规范化种植的不断深入开展，药材的农药残留问题越来越引起世界各国学者的重视。有机氯农药曾广泛用于中药栽培，但由于其半衰期长、降解缓慢、化学性质稳定的特点，我国于20世纪80年代已禁止使用，但至今仍能从水、土壤及植物体内检测到残留成分。植物在生长过程中若富集了环境中残留的有机氯农药，并通过食物链关系转移至人体中，由于其脂溶性大，毒性易积蓄，这将严重影响人的用药安全。

三七(Notoginseng Radix et Rhizoma)为五加科植物三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)的干燥根和根茎，具有散瘀止血、消肿定痛的功效。明代著名的药学家李时珍称其为“金不换”。清朝药学著作《本草纲目拾遗》记载：“三七补血第一”，三七现广泛应用于冠心病、心绞痛等疾病的治疗。由于三七一般约3年收获，且入药部位为根和根茎，因此易富集土壤、空气及水域中的农药。鉴于三七的生长习性与采收特点，对三七进行有机氯类农药残留的控制显得尤为必要。

中药材前处理方法有磺化法、固相萃取法等。周家明等采用不同三七饮片中六六六、滴滴涕农药残留量的分析，采用样品丙酮超声提取、分液漏斗萃取，石油醚洗涤，硫酸钠脱水，取石油醚层毛浓缩后硫酸溶解后用毛细管气相色谱法测定六六六、滴滴涕含量。(周家明等，不同三七饮片中六六六、滴滴涕农药残留量的分析，现在中药研究与实践2007,21(1)，10-13)。张曙明等对黄芪、三七和西洋参中15种有机氯农药残留量测定分析，样品采用水浸泡、丙酮、氯化钠和二氯甲烷(或石油醚)混合溶剂超声提取，无水硫酸钠脱水，Florisil硅土柱层析净化后，石油醚溶解即得，采用毛细管气相色谱法-电子捕获检测器分析测定。(张曙明等，黄芪、三七和西洋参中多种有机氯弄呀残留量分析，中国中药杂志，2000年7月，25(7)402-405)。药典法测定有机氯残留，采用了样品加水浸泡，丙酮超声处理，氯化钠、二氯甲烷超声处理，有机相置于装有无水硫酸钠的锥形瓶中，放置4h，取上清液减压浓缩加石油醚溶解，硫酸振摇，取上清液浓缩稀释即可。上述方法样品制备比较繁琐检测时间长，使用毒性试剂比较多如二氯甲烷等，柱层析需要填充层析柱并处理，对检测人员要求高这些都不适于日常的生产检验。

发明内容：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于日常检验的三七有机氯农残检测方法。本发明的三七中19种有机氯农残的检测方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取药材粉末，加入石油醚浸泡，抽滤，残渣用石油醚分次洗涤，转移至圆底烧瓶中，于25-45℃下水浴旋转蒸发至近干，以正己烷复溶，加入浓硫酸，充分震摇，反应完全后，离心，取上清液备用；

(2)混合对照品溶液的制备：取α-六六六、六氯苯、五氯苯甲醚、β-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、γ-六六六、环氧七氯B、氧化氯丹、环氧七氯A、α-硫丹、p,p’-滴滴伊、除草醚、p,p’-滴滴滴、o,p’-滴滴涕、硫丹硫酸酯、p,p’-滴滴涕、甲氧滴滴涕和灭蚁灵标准品置容量瓶中加正己烷稀释至刻度，得各对照品储备液，分别称取对照品储备液置容量瓶中，用正己烷稀释至刻度即得混合对照品溶液；

(3)测定法：取供试品溶液，混合对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算19种有机氯农残含量。

其中，气相色谱条件如下：

气相色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；载气：氮气，流速0.5-0.7mL/min，进样口温度为225-235℃，检测器温度290-310℃，进样量1.0-2.0μL，升温程序：初始温度100℃，以10℃/min的速度升温至215℃，保持3min，以8℃/min的速度升温至225℃，保持35min，运行时间为50.75min。

优选的，气相色谱条件如下：

气相色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；载气：氮气，流速0.6mL/min，进样口温度为230℃，检测器温度300℃，进样量1.5μL，升温程序：初始温度100℃，以10℃/min的速度升温至215℃，保持3min，以8℃/min的速度升温至225℃，保持35min，运行时间为50.75min。

本发明所述的气相色谱柱包括但不限于DB-1701和HP-5毛细管柱，优选DB-1701毛细管柱。

优选的，步骤(1)供试品溶液的制备方法如下：

取药材粉末1-2份，精密称定，置50mL聚丙烯塑料离心管中，加入20-40倍粉末重量的石油醚浸泡≥1h，抽滤，残渣用10-20倍粉末重量石油醚分次洗涤，转移至圆底烧瓶中，于25-45℃下水浴旋转蒸发至近干。以正己烷复溶，转移至离心管中，加入0.1-0.2mL浓硫酸，充分震摇大于1min，反应完全后，以3000-12000r/min的速度离心2-10min，取上清液，进GC待测。

更优选的，步骤(1)供试品溶液的制备方法如下：

取药材粉末1份，精密称定，置50mL聚丙烯塑料离心管中，加入30倍药材重量的石油醚浸泡1h，抽滤，残渣用15倍药材重量的石油醚分次洗涤，转移至100mL圆底烧瓶中，于40℃下水浴旋转蒸发至近干。以2mL正己烷复溶，转移至离心管中，加入0.1mL浓硫酸，充分震摇1min，反应完全后，以3000r/min的速度离心5min，取上清液，进GC待测。

优选的，步骤(2)混合对照品溶液的制备方法如下：

精密量取α-六六六等19种农药对照品各1mL，置各自10mL量瓶中，加正己烷稀释至刻度，得对照品储备液。分别精密量取对照品储备液各200μL置同一10mL量瓶中，正己烷稀释至刻度，得质量浓度为2μg/mL的19种有机氯农药混合对照储备液。

本发明的方法是经过筛选得到的，筛选过程如下：

1、色谱柱的选择

本文比较DB-1701和HP-5毛细管柱对19种有机氯农药的分离效果。结果表明，HP-5分离环氧七氯A与环氧七氯B、除草醚与p,p’-滴滴涕的效果较差，而DB-1701可实现19种有机氯农药有效分离，且峰形良好。19种有机氯农药混合标准溶液色谱图见图1-A，空白基质色谱图见图1-B，空白正己烷色谱图见图1-C。各峰保留时间及对应农药见表2。

2不同提取方式的选取

本文考察了超声1h，浸泡1h和浸泡过夜三种不同的提取方式。超声1h提取回收率结果一般在65.8～94.6％之间，未达到要求；而浸泡1h和浸泡过夜的回收率结果相差不大，均在82.1～120.0％之间，考虑到要节省时间，故选择静置1h。

3磺化法也探讨了不同浓硫酸用量的净化效果

分别向提取液中加入0.05、0.1、0.2和0.4mL的浓硫酸。浓硫酸加入量为0.05mL时，三七基质对有机氯农药测定有干扰；浓硫酸加入量为0.2和0.4mL时，回收率普遍低于浓硫酸加入量为0.1mL时的回收率。故浓硫酸用量选择0.1mL。不同浓硫酸加入量回收率结果见表1。

表1不同浓硫酸加入量对回收率的影响

方法学验证

1.1仪器、试剂及材料

GC-6890N型气相色谱(美国Agilent公司)，CF16RN型高速微量离心机(日本HITACHI公司)；R-215型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；XS105型电子分析天平(瑞士MettlerToledo公司)。

三七药材(云南)，石油醚(60-90℃)、正己烷均为色谱纯(德国Merck公司)；浓硫酸(天津威晨化学试剂科贸有限公司，分析纯)；α-六六六、六氯苯、五氯苯甲醚、β-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、γ-六六六、环氧七氯B、氧化氯丹、环氧七氯A、α-硫丹、p,p’-滴滴伊、除草醚、p,p’-滴滴滴、o,p’-滴滴涕、硫丹硫酸酯、p,p’-滴滴涕、甲氧滴滴涕和灭蚁灵农药标准品购自农业部环境质量监督检验测试中心和德国Dr.Ehrenstorfer公司(浓度均为1000μg/mL)，纯度大于95％。

1.2样品制备

取药材粉末1g，精密称定，置50mL聚丙烯塑料离心管中，加入30mL石油醚浸泡1h，抽滤，残渣用15mL石油醚分次洗涤，转移至100mL圆底烧瓶中，于40℃下水浴旋转蒸发至近干。以2mL正己烷复溶，转移至离心管中，加入0.1mL浓硫酸，充分震摇1min，反应完全后，以3000r/min的速度离心5min，取上清液，进GC待测。

1.3对照品溶液的制备

精密量取α-六六六等19种农药对照品各1mL，置各自10mL量瓶中，加正己烷稀释至刻度，得对照品储备液。分别精密量取对照品储备液各200μL置同一10mL量瓶中，正己烷稀释至刻度，得质量浓度为2μg/mL的19种有机氯农药混合对照储备液。

1.4气相色谱条件

DB-1701气相色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm；美国Agilent公司)；载气：氮气(纯度≥99.999％)，流速0.6mL/min，进样口温度为230℃，检测器温度300℃，进样量1.0μL，升温程序：初始温度100℃，以10℃/min的速度升温至215℃，保持3min，以8℃/min的速度升温至225℃，保持35min，运行时间为50.75min。

4.1仪器精密度

取浓度为50ng/mL的混合标准溶液连续进样6次，计算各峰面积的相对标准偏差(RSD，n＝6)均小于5％，表明仪器精密度良好。

4.2线性

以2μg/mL的19种有机氯农药混合标准溶液配制成质量浓度分别为1、2、5、10、20，50、100和200ng/mL的标准曲线溶液，分别精密吸取1μL，注入气相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果见表2。如表所示，质量浓度在1～200ng/mL范围内，各组分线性关系良好，相关系数(r)均大于0.99。

表2线性结果表

4.3回收率和重复性

本发明采用标准加入法，向空白样品中加入混合标准溶液，制备加标水平分别为0.05、0.10和0.20mg/kg的样品各3份，按上述优化后的方法提取、净化样品，进行GC分析，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD，n＝9)。各农药的平均回收率均在72.1％～92.5％之间，RSD在3.3％～14.9％之间。结果见表2。平行制备6份加标水平为0.10mg/kg的样品，进行GC分析，计算回收率和相对标准偏差(RSD，n＝6)，各农药的平均回收率均在71.1％～111.7％之间，RSD在4.9％～13.1％之间，重复性良好。

4.4定量限

定量限是指试样中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应符合准确度和精密度要求。本发明通过加标试验，向三七空白基质中添加加标水平分别为0.005mg/kg，0.010mg/kg，0.020mg/kg的农药混合标准溶液，每个加标水平平行制备6份，所得的溶液进行GC分析，计算回收率和相对标准偏差(RSD，n＝6)，回收率在70％～120％之间，RSD在20％以内即为该物质的定量限。结果见表3。

表3回收率和定量限结果表

表格中19中农药的中文名称分别为：α-六六六、六氯苯、五氯苯甲醚、β-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、γ-六六六、环氧七氯B、氧化氯丹、环氧七氯A、α-硫丹、p,p’-滴滴伊、除草醚、p,p’-滴滴滴、o,p’-滴滴涕、硫丹硫酸酯、p,p’-滴滴涕、甲氧滴滴涕和灭蚁灵。

本发明的有益效果

1、本发明采用硫酸磺化法结合气相色谱(GC)建立了三七中19种有机氯农药同时检测的分析方法。外标法定量对30批三七药材进行测定。本方法准确可靠，灵敏度高，适用于三七中19种有机氯农药残留的同时测定。本发明的方法与药典中方法相比，操作简单省事，避免使用了毒性较大的二氯甲烷，且同时测定了19种有机氯农残，而回收率能够同时得到满足，样品的处理方法净化的较为完全，基质本身不干扰测定。也避免使用层析柱的使用，对实验人员要求技能不高，操作人员的实用性更好。

2、本发明的供试品溶液制备中避免了水溶液的带入，减少了后期浓缩过程和气相测定中水分的影响。同时也省略了脱水剂无水硫酸钠的使用，无水硫酸钠在磺化法中加入量直接影响到回收率，本发明减少影响回收率的诸多因素，采用正丁醇溶解最后进入气相避免了石油醚或丙酮对仪器的干扰，这些都措施保证了结果准确性。

3、同时本发明的供试品制备，减少水的浸泡和无水硫酸钠吸水过程，使操作更简便，同时避免有毒试剂的大量使用，还采用一些低毒价优的试剂，平时一次的检验成本是3元钱，检验一次所需时间1.5-2h，做到节能降耗，更适应产业化的日常检验。

附图说明：

图1 19种有机氯农药混合标准溶液(A)、空白基质(B)和空白正己烷(C)气相色谱图

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、

一种同时测定三七中19种有机氯类农药残留量的方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：

取药材粉末1份，精密称定，置50mL聚丙烯塑料离心管中，加入30倍药材重量的石油醚浸泡1h，抽滤，残渣用15倍药材重量的石油醚分次洗涤，转移至100mL圆底烧瓶中，于40℃下水浴旋转蒸发至近干。以2mL正己烷复溶，转移至离心管中，加入0.1mL浓硫酸，充分震摇1min，反应完全后，以3000r/min的速度离心5min，取上清液，进GC待测。

(2)混合对照品溶液的制备：

精密量取α-六六六等19种农药对照品各1mL，置各自10mL量瓶中，加正己烷稀释至刻度，得对照品储备液。分别精密量取对照品储备液各200μL置同一10mL量瓶中，正己烷稀释至刻度，得质量浓度为2μg/mL的19种有机氯农药混合对照储备液。

(3)测定法：取供试品溶液，混合对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算19种有机氯农残含量。

其中，气相色谱条件如下：

气相色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；载气：氮气，流速0.6mL/min，进样口温度为230℃，检测器温度300℃，进样量1.5μL，升温程序：初始温度100℃，以10℃/min的速度升温至215℃，保持3min，以8℃/min的速度升温至225℃，保持35min，运行时间为50.75min。

本发明所述的气相色谱柱为DB-1701毛细管柱。

实施例2、

按照实施例1的方法，对产地为云南的30批三七药材进行测定。检测结果见表4。其中，五氯硝基苯最大残留量为0.32mg/kg，超出了2015版中国药典规定的限度，其余农药残留均未见超标。

表4检测结果表

Tab.4 Test results

(注：“-”表示未检出，“+”表示检出，“++”表示超标)。

Claims (8)

1.一种同时测定三七中19种有机氯农残的方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取药材粉末，加入石油醚浸泡，抽滤，残渣用石油醚分次洗涤，转移至圆底烧瓶中，于25-45℃下水浴旋转蒸发至近干，以正己烷复溶，加入浓硫酸，充分震摇，反应完全后，离心，取上清液备用；

(2)混合对照品溶液的制备：取α-六六六、六氯苯、五氯苯甲醚、β-六六六、δ-六六六、五氯硝基苯、γ-六六六、环氧七氯B、氧化氯丹、环氧七氯A、α-硫丹、p,p’-滴滴伊、除草醚、p,p’-滴滴滴、o,p’-滴滴涕、硫丹硫酸酯、p,p’-滴滴涕、甲氧滴滴涕和灭蚁灵标准品置容量瓶中加正己烷稀释至刻度，得各对照品储备液，分别称取对照品储备液置容量瓶中，用正己烷稀释至刻度即得混合对照品溶液；

(3)测定法：取供试品溶液，混合对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算19种有机氯农残含量；

其中，气相色谱条件如下：

气相色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；载气：氮气，流速0.5-0.7mL/min，进样口温度为225-235℃，检测器温度290-310℃，进样量1.0-2.0μL，升温程序：初始温度100℃，以10℃/min的速度升温至215℃，保持3min，以8℃/min的速度升温至225℃，保持35min，运行时间为50.75min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中气相色谱条件如下：

气相色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；载气：氮气，流速0.6mL/min，进样口温度为230℃，检测器温度300℃，进样量1.5μL，升温程序：初始温度100℃，以10℃/min的速度升温至215℃，保持3min，以8℃/min的速度升温至225℃，保持35min，运行时间为50.75min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中色谱柱为DB-1701或HP-5毛细管柱。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中色谱柱为DB-1701。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤(1)供试品溶液的制备方法如下：

取药材粉末1-2份，精密称定，置50mL聚丙烯塑料离心管中，加入20-40倍粉末重量的石油醚浸泡≥1h，抽滤，残渣用10-20倍粉末重量石油醚分次洗涤，转移至圆底烧瓶中，于25-45℃下水浴旋转蒸发至近干。以正己烷复溶，转移至离心管中，加入0.1-0.2mL浓硫酸，充分震摇大于1min，反应完全后，以3000-12000r/min的速度离心2-10min，取上清液，进GC待测。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤(1)供试品溶液的制备方法如下：

取药材粉末1份，精密称定，置50mL聚丙烯塑料离心管中，加入30倍药材重量的石油醚浸泡1h，抽滤，残渣用15倍药材重量的石油醚分次洗涤，转移至100mL圆底烧瓶中，于40℃下水浴旋转蒸发至近干。以2mL正己烷复溶，转移至离心管中，加入0.1mL浓硫酸，充分震摇1min，反应完全后，以3000r/min的速度离心5min，取上清液，进GC待测。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤(2)混合对照品溶液的制备方法如下：

精密量取α-六六六等19种农药对照品各1mL，置各自10mL量瓶中，加正己烷稀释至刻度，得对照品储备液。分别精密量取对照品储备液各200μL置同一10mL量瓶中，正己烷稀释至刻度，得质量浓度为2μg/mL的19种有机氯农药混合对照储备液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：

取药材粉末1份，精密称定，置50mL聚丙烯塑料离心管中，加入30倍药材重量的石油醚浸泡1h，抽滤，残渣用15倍药材重量的石油醚分次洗涤，转移至100mL圆底烧瓶中，于40℃下水浴旋转蒸发至近干，以2mL正己烷复溶，转移至离心管中，加入0.1mL浓硫酸，充分震摇1min，反应完全后，以3000r/min的速度离心5min，取上清液，进GC待测，

(2)混合对照品溶液的制备：

精密量取α-六六六等19种农药对照品各1mL，置各自10mL量瓶中，加正己烷稀释至刻度，得对照品储备液，分别精密量取对照品储备液各200μL置同一10mL量瓶中，正己烷稀释至刻度，得质量浓度为2μg/mL的19种有机氯农药混合对照储备液，

(3)测定法：取供试品溶液，混合对照品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算19种有机氯农残含量，

其中，气相色谱条件如下：

气相色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)；载气：氮气，流速0.6mL/min，进样口温度为230℃，检测器温度300℃，进样量1.5μL，升温程序：初始温度100℃，以10℃/min的速度升温至215℃，保持3min，以8℃/min的速度升温至225℃，保持35min，运行时间为50.75min，所述的气相色谱柱为DB-1701毛细管柱。