CN110082446B - 一种姜黄质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种姜黄质量检测方法，它包括如下操作步骤：1)内标溶液的制备；2)供试品溶液的制备：挥发油供试品溶液和芳香水供试品溶液；3)分别将挥发油和芳香水供试品溶液注入气相色谱‑质谱联用仪；4)用内标法计算挥发油成分和芳香水中挥发性成分相对含量。本发明的姜黄质量检测方法，能检测姜黄挥发油中32种挥发性成分，芳香水中62种挥发性成分，能反应出姜黄挥发油的整体面貌，结果可靠，为姜黄挥发油的质量控制提供了新方法，同时可用于区分来自不同产地的姜黄药材质量，具有广泛应用前景。

Description

一种姜黄质量检测方法

技术领域

本发明具体涉及一种姜黄质量检测方法。

背景技术

姜黄是姜科多年生草本植物姜黄的根茎，主要产自于福建、四川、广西、云南等地。具有特异的香气，味苦涩，辛温，行通经止痛、行气、破风活血之功效，现代临床医学研究得出，姜黄具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗原虫、降低血糖血脂等多种药理作用。挥发油是姜黄的主要有效成分，主要含有姜黄酮、芳姜黄酮、姜黄新酮、β-倍半水芹烯、α-姜黄烯等特征成分，且其药理活性显著。

《中国药典》仅对姜黄挥发油总量进行了控制，如“照挥发油测定法(附录X D)测定。本品含挥发油不得少于7.0％(ml/g)”，此种控制方法不利于不同产地姜黄质量的对比和区分。

目前也没有关于不同产地姜黄质量区分方法的研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明一种姜黄质量检测方法，它包括如下操作步骤：

1)内标溶液的制备：取正二十二烷，加乙醚溶解，混匀得标准品溶液；

2)供试品溶液的制备：

a)取姜黄药材，加水浸泡，提取，提取液静置分层，分离油相和水相；

b)取步骤a)油相，加无水乙醚稀释50～75倍，再加无水硫酸钠脱水，过滤，滤液加入步骤1)内标液和乙醚，摇匀，作为挥发油供试品溶液；

c)取步骤a)水相，加乙醚萃取，取乙醚层溶液，加无水硫酸钠脱水，过滤，滤液加入步骤1)内标液和乙醚，摇匀，作为芳香水供试品溶液；

3)分别将挥发油和芳香水供试品溶液注入气相色谱-质谱联用仪；色谱条件如下：

色谱柱：HP-5毛细管；程序升温：初始温度50℃，保持3min，以5℃·min^-1的速率升温至140℃，以10℃min^-1的速率升温至280℃，保持2min；

质谱条件：离子源：EI离子源；扫描质量范围m/z 33～1000amu。

进一步地，步骤1)所述正二十二烷与乙醚的质量体积比为(10-12)mg：10ml。

进一步地，步骤a所述姜黄药材与水的质量体积比为1g:8mL；所述浸泡30min；所述提取为水蒸汽蒸馏法提取，提取时间为7.5-8h。

进一步地，步骤b所述油相与无水乙醚体积比为2：100；所述滤液与内标液和乙醚体积比为5：2：8。

进一步地，步骤c所述水相与乙醚的体积比为1：(3-5)，优选1：3；所述提取为振摇提取；所述滤液与内标液和乙醚体积比为5：2：8。

进一步地，步骤3)所述HP-5毛细管色谱柱规格为30m×0.25mm，0.1μm，弱极性；所述色谱条件中进样口温度250℃，进样量1.5μL，载气为氦气，柱温130℃，分流比20:1。

进一步地，步骤3)所述质谱条件中离子源温度230℃，接口温度250℃，四极杆温度150℃，溶剂延迟3min。

进一步地，所述供试品溶液中挥发性成分相对含量用内标法计算。

更进一步地，所述挥发性成分中的特征性成分相对含量，与挥发油总量用PCA法分析，得到的两个主成分对姜黄药材进行产地和/或质量区分。

更进一步地，所述特征性成分为芳姜黄酮、姜黄新酮、A-姜黄烯、β-倍半水芹烯、吉马酮和(+)-α-柏木萜烯。

用本发明方法检测来自四川宜宾、四川乐山、四川屏山、云南红河、云南文山、云南河口、云南曲靖、云南洱源、云南瑞丽、陕西汉中、福建泉州和浙江温州12批次样品，可区分出云南产区质量最好，四川产区质量最差，其余地方质量居中。

本发明的姜黄质量检测方法，能检测姜黄挥发油中32种挥发性成分，芳香水中62种挥发性成分，能反应出姜黄挥发油的整体面貌，结果可靠，为姜黄挥发油的质量控制提供了新方法，同时可用于区分不同产地的姜黄药材，及其来自不同产地的姜黄药材质量，具有广泛应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1姜黄挥发油样品GC-MS总离子流图(450min收集所得)

图2姜黄芳香水样品GC-MS总离子流图(450min收集所得)

图3实验方案流程图

图4姜黄挥发性成分GC-MS总离子流图(30min收集所得挥发油)

图5挥发性成分总体特征图谱

图6主要特征成分含量-时间曲线图

图7不同分布成分含量-时间曲线图

图8水中特有成分对芳香水中主要成分溶出的影响散点矩阵图

图9不同产地姜黄挥发油总含量

图10不同产地姜黄PCA分析结果

具体实施方式

实施例1本发明姜黄质量检测

1)内标溶液的制备：精密称取11.77mg正二十二烷置于10mL棕色容量瓶中加入乙醚定容，振摇均匀，得到浓度为1.177mg/mL的正二十二烷标准品溶液，4℃保存备用。

2)供试品溶液制备：

a、取姜黄200g，置于三口圆底烧瓶，加8倍量水，浸泡30min，电热套煮沸提取，打开挥发油收集装置下端活塞，连续收集冷凝液，共收集450min。冷凝液静置至室温，待油水分层后，分离挥发油部分和芳香水部分，备用。

b、挥发油供试品溶液的制备：取挥发油20μL，加入1mL无水乙醚，另加适量无水硫酸钠脱水，过滤，准确量取0.5mL至2mL棕色样品瓶中，再加入200μL二十二烷标准品溶液，加乙醚至1.5mL，摇匀，密封，4℃保存备用。

c、芳香水供试品溶液的制备：取芳香水溶液1mL，加3mL乙醚振摇提取，分取乙醚层溶液，加入无水硫酸钠适量脱水，过滤，准确量取0.5mL至样品瓶，另加入200μL二十二烷标准品溶液，加乙醚至1.5mL，摇匀，密封。4℃保存备用。

3)分别将挥发油和芳香水供试品溶液注入气相色谱-质谱联用仪，得总离子流(图1～图2)；色谱条件如下：

HP-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.1μm，弱极性)，进样口温度250℃，进样量1.5μL，载气为氦气，柱温130℃，分流比20:1，程序升温为初始温度50℃，保持3min，以5℃·min^-1的速率升温至140℃，以10℃min^-1的速率升温至280℃，保持2min。EI离子源，离子源温度230℃，接口温度250℃，四极杆温度150℃，扫描质量范围m/z 33～1000amu，溶剂延迟3min。

4)用内标法计算挥发油和芳香水中挥发性成分相对含量，其中特征性成分：芳姜黄酮、姜黄新酮、A-姜黄烯、β-倍半水芹烯、吉马酮和(+)-α-柏木萜烯相对含量，与挥发油总量用PCA法分析，得到的两个累计方差贡献率大于92％主成分，用于对姜黄药材进行产地和/或质量区分。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

1.1仪器与设备

100-1000μL移液器，Dragonlab公司；10-100μL移液枪，Sartorius公司；GC-MS，Agilent technologies公司；微孔滤膜，衫羽(天津)科技有限公司；粉碎机，浙江屹立工资有限公司；分析天平，天行者；BT25S型1/10万天平，sartorius公司。

1.2试验药材及对照品

姜黄(陕西省兴盛德药业有限公司，生产批号20170901)，经陕西中医药大学颜永刚教授鉴定为姜科多年生草本植物姜黄(Curcumalonga L.)的根茎；正二十二烷(上海源叶生物有限公司，生产批号A11N8L47966)。乙醚、无水硫酸钠均为分析纯；实验用水为纯净水。

2实验方法及过程

采用水蒸气蒸馏法提取姜黄，每30分钟收集一次提取液。分离提取液的挥发油部分和芳香水部分。GC-MS分析不同部分的挥发性成分，提取特征成分并进行特征分析，对其提取时间-含量进行模型拟合，探索姜黄挥发油提取动力学规律。本文采用的研究方案路线如下(流程图见图3)：

2.1水蒸气蒸馏法提取姜黄挥发油

取姜黄200g，置于三口圆底烧瓶，加8倍量水，浸泡30min，电热套煮沸提取，打开挥发油收集装置下端活塞，连续收集冷凝液，每30min更换一次收集器，记录该段时间下冷凝液体积，并及时补充等量沸水至三口圆底烧瓶中，共收集450min。冷凝液静置至室温，待油水分层后，分离挥发油部分和芳香水部分，分别按提取时间编号挥发油1-15、芳香水1-15，备用。

2.2溶液的制备

2.2.1内标溶液的制备

内标溶液的制备：精密称取11.77mg正二十二烷置于10mL棕色容量瓶中加入乙醚定容，振摇均匀，得到浓度为1.177mg/mL的正二十二烷标准品溶液，4℃保存备用。

2.2.2供试品溶液的制备

挥发油供试品溶液的制备：取2.1项下制备的挥发油20μL，加入1mL无水乙醚，另加适量无水硫酸钠脱水，过滤至2mL棕色样品瓶中，再加入200μL二十二烷标准品溶液，加乙醚至1.5mL，摇匀，密封，分别编号1-15，4℃保存备用。

芳香水供试品溶液的制备：取2.1项下芳香水溶液1mL，加3mL乙醚振摇提取，分取乙醚层溶液，加入无水硫酸钠适量脱水，过滤，准确量取0.5mL至样品瓶，另加入200μL二十二烷标准品溶液，加乙醚至1.5mL，摇匀，密封。分别编号1-15，4℃保存备用。

2.3姜黄挥发油的GC-MS分析

2.3.1GC-MS的测定条件

HP-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.1μm，弱极性)，进样口温度250℃，进样量1.5μL，载气为氦气，柱温130℃，分流比20:1，程序升温为初始温度50℃，保持3min，以5℃·min^-1的速率升温至140℃，以10℃min^-1的速率升温至280℃，保持2min。EI离子源，离子源温度230℃，接口温度250℃，四极杆温度150℃，扫描质量范围m/z33～1000amu，溶剂延迟3min。

3实验结果

3.1 GC-MS总离子流图谱

挥发性成分经GC-MS分析所得总离子流图见图4。表明该色谱条件下，各成分可得到基本分离，满足后续研究定性及相对定量的要求。

3.2化合物信息

调用NIST 14.L数据库，解析总离子流图，整理芳香水、挥发油在不同时间点下的分析结果，共得到姜黄芳香性成分71个，见表1。

表1水蒸气蒸馏法提取姜黄挥发性成分化合物信息

3.3提取特征分析

3.3.1主要特征性成分的确定

通过内标法计算各成分在不同时间段的相对含量。绘制姜黄挥发油提取过程的特征图谱，从提取时间聚类结果可知，芳香水溶液挥发性成分大部分在前13个时间点(即提取时间6.5小时)溶出，挥发油部分挥发性成分大部分在7-13个时间段溶出(即提取时间3.5-6.5小时溶出)。从挥发性成分聚类结果看，特征成分可分为9类：①芳姜黄酮，(CAS号：532-65-0)；②姜黄新酮(又名curlone，CAS号：87440-60-6)；③Tumerone(CAS号：180315-67-7)；④A-姜黄烯(CAS号：644-30-4)；⑤β-倍半水芹烯(CAS号：20307-83-9)；⑥吉马酮(CAS号：6902-91-6)；⑦(+)-α-柏木萜烯(CAS号：50894-66-1)；⑧2,6-二叔丁基对甲酚(CAS号：128-37-0)；⑨其他类成分。前8类成分含量占总含量的86.33％，可作为特征成分反映提取动力学规律，见图5。进一步分析可知，间异丙基甲苯、正二十四烷、Succinic acid,2-fluorophenyl 1-phenylpropyl ester、2-epi-.alpha.-Funebrene、Benzene,(1,1-dimethyldecyl)-、Tetratriacontane等9种成分特异性地分布于挥发油中，记为油中特有成分(only in oil)；桉叶油醇、N-乙基间甲苯胺、(E)-β-金合欢烯、3'-甲基苯乙酮、反式角鲨烯、1,3-二甲基-4-乙基苯等39种成分特异性32地分布于芳香水中，记为水中特有成分(only in water)；尚有23种成分在挥发油、芳香水中均有分布，记为油水共有成分(inboth oil and water)。

.3.2特征成分提取行为

绘制特征成分含量-提取时间关系图，从图6可看出，芳姜黄酮(CAS:532-65-0)、姜黄新酮(CAS:87440-60-6)、Tumerone(CAS:180315-67-7)、β-倍半水芹烯(CAS:20302-83-9)以及A-姜黄烯(CAS:644-30-4)为水部分主要芳香类成分，油中主要挥发性成分为芳姜黄酮。

从提取初始到结束，特征成分在高温作用下主要溶解或分散于水中，而在油中含量远远少于在水中含量分布，见图7a、7b所示，可能是由于某些水中特有成分的“乳化”作用所致，结合图7c可以看出，提取时间至100-400分钟时，芳香水中挥发性成分的含量持续升高，而且远远大于油中挥发性成分的含量。比较特殊的是水中特有成分(S)-β-甜没药烯(棕黄色成分)与芳香水中特征成分芳姜黄酮的增长趋势基本相同。

综上所述，水中特有成分(S)-β-甜没药烯可能发挥了“乳化剂”的作用，增加了特征成分在水中的分布，但具体诱发“乳化”的机制有待后续更深入的研究。

3.3.3水中特有成分对芳香水中特征成分提取行为的影响

由图8可知，随着水中特有成分的增加，芳香水中主要特征成分芳姜黄酮的含量显著升高，且二者呈线性关系；水中特有成分对姜黄酮、姜黄新酮则呈现先升高后降低的作用趋势，可能与二者随着提取时间的增加，含量逐渐降低有关。

线性回归方程表明，水中特有成分与芳姜黄酮的线性关系如下：

M芳姜黄酮＝2.69×M水中特有成分+8.81(R2＝0.7653，P<0.05)。

4实用性

《中国药典》仅对姜黄挥发油总量进行了控制，如“照挥发油测定法(附录X D)测定。本品含挥发油不得少于7.0％(ml/g)”，此种控制方法不利于不同产地姜黄质量的对比和区分，经本实验提取的主要特征成分可便捷地区分不同姜黄的产地，是本研究的重要实用价值体现。

本实验采集了不同产地的姜黄药材12批次，分别来自四川宜宾、四川乐山、四川屏山、云南红河、云南文山、云南河口、云南曲靖、云南洱源、云南瑞丽、陕西汉中、福建泉州和浙江温州，分别测定不同批次姜黄挥发油总量以及芳姜黄酮、姜黄新酮、A-姜黄烯、β-倍半水芹烯、吉马酮和(+)-α-柏木萜烯的含量。如图9所示，各批次产地姜黄挥发油总量无显著性差异，仅仅依靠挥发油总量无法评价不同产地的药材质量。将所有测定指标进行PCA主成分分析，可得到影响产地分布的两个主成分，累计方差贡献率可达92.69％。

PC1＝0.97挥发油总含量-0.14芳姜黄酮+0.15姜黄新酮+0.08A.姜黄烯

0.09+β.倍半水芹烯(挥发油含量正相关，方差贡献率54.94％)；

PC2＝0.64A.姜黄烯-0.06挥发油总含量+0.54芳姜黄酮+0.53姜黄新酮

+0.04β.倍半水芹烯+0.02吉马酮-0.09柏木萜烯(姜黄烯、芳姜黄酮、姜黄新酮含量正相关，方差贡献率37.75％)。

如图10所示：实验所得主成分可成功的区分来自不同产地的姜黄药材质量。其中云南产区质量最好，四川产区质量最差，其余地方质量居中。

综上：本发明的姜黄质量检测方法，不仅能检测姜黄挥发油中32种挥发性成分，芳香水中62种挥发性成分，还可用于区分姜黄药材的产地和质量，具有广泛应用前景。

Claims (6)

1.一种姜黄质量检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

1）内标溶液的制备：取正二十二烷，加乙醚溶解，混匀得标准品溶液；

2）供试品溶液的制备：

a) 取姜黄药材，加水浸泡，提取，提取液静置分层，分离油相和水相；

b) 取步骤a)油相，加无水乙醚稀释50~75倍，再加无水硫酸钠脱水，过滤，滤液加入步骤1）内标液和乙醚，摇匀，作为挥发油供试品溶液；

c) 取步骤a)水相，加乙醚萃取，取乙醚层溶液，加无水硫酸钠脱水，过滤，滤液加入步骤1）内标液和乙醚，摇匀，作为芳香水供试品溶液；

3）分别将挥发油和芳香水供试品溶液注入气相色谱-质谱联用仪；色谱条件如下：

色谱柱：HP-5 毛细管，30 m×0.25 mm，0.1μm，弱极性；程序升温：初始温度50 ℃，保持3 min，以 5 ℃•min^-1的速率升温至140 ℃，以 10℃ min^-1的速率升温至280 ℃，保持2min；进样口温度 250 ℃，进样量 1.5 μL，载气为氦气，柱温 130 ℃，分流比 20:1；

质谱条件：离子源：EI 离子源；扫描质量范围 m/z 33~1000 amu；离子源温度 230℃，接口温度250℃，四极杆温度 150℃，溶剂延迟3 min；

所述供试品溶液中挥发性成分相对含量用内标法计算；

所述挥发性成分中的特征性成分为芳姜黄酮、姜黄新酮、A-姜黄烯、β-倍半水芹烯、吉马酮和 (+)-α-柏木萜烯。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1）所述正二十二烷与乙醚的质量体积比为10-12 mg：10 ml。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a所述姜黄药材与水的质量体积比为1g:8mL；所述浸泡30min；所述提取为水蒸汽蒸馏法提取，提取时间为7.5-8h。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b所述油相与无水乙醚体积比为2：100；所述滤液与内标液和乙醚体积比为5：2：8。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c所述水相与乙醚的体积比为1：（3-5）；所述萃取为振摇萃取；所述滤液与内标液和乙醚体积比为5：2：8。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述挥发性成分中的特征性成分相对含量，与挥发油总量用PCA法分析，得到的两个主成分对姜黄药材进行产地和/或质量区分。

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