CN112649534A - 一种无患子三萜类皂苷成分的指纹图谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无患子三萜类皂苷成分的指纹图谱检测方法，包括步骤：1)制备参照物溶液和含无患子皂苷的供试品溶液；2)基于步骤1)的各溶液，采用高效液相色谱法得到参照物溶液和含无患子皂苷的供试品溶液的指纹色谱图；3)基于步骤2)的指纹色谱图生成无患子三萜类皂苷成分的对照指纹图谱，选择成分较高且分离度较好的色谱峰为特征峰，并确定为共有峰；4)将待测无患子果皮、无患子皂苷提取物原料的指纹色谱图与步骤3)的对照指纹图谱进行比较，相似度不低于0.90则判定为符合规定，相似度小于0.90则判定为不符合规定。该方法操作简便、稳定性高、重现性好，能全面反映皂苷成分信息，适用于无患子果皮及无患子皂苷提取物原料的质量控制。

Description

一种无患子三萜类皂苷成分的指纹图谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种无患子三萜类皂苷成分的指纹图谱检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
无患子来源无患子科(Sapindaceae)，俗称“菩提树、皂果、肥皂树”等，拉丁学名Sapindus，意即“印度肥皂”。《本草纲目》记载，无患子果实可用于洗发洗面，因其果皮含有丰富的皂苷，其中大部分为三萜类皂苷，即无患子皂苷，总含量约为5.33％。无患子皂苷为天然的非离子型表面活性剂，临界胶束浓度和表面张力均较低，能显著降低水的表面张力，泡沫丰富，手感细腻，去污力强，能100％降解，长期使用不会对人体和环境有害，愈来愈广泛应用于日化行业中，特别是洗涤用品和化妆品中。目前国内市场上已有添加了无患子皂苷的化妆品、洗涤用品出售，例如迪奥、高斯、仙美无患等。
目前，文献报道的无患子皂苷检测方法有高效液相色谱法指纹图谱鉴别，比色法、高效液相色谱法、近红外法含量测定等，但现有的指纹图谱鉴别为无患子皂苷水解产物的指纹图谱，含量测定为无患子皂苷水解产物常春藤皂苷元的含量，由于皂苷元无表面活性，不能反映原料中表面活性成分无患子三萜皂苷成分分布及含量多少，因此现有方法不能准确有效地评价其质量。实验表明，采购的部分批次无患子皂苷提取物原料表面活性、起泡性与标签标示的无患子皂苷含量并不呈正相关，有的批次按现有方法检测其皂苷含量测定值很高，但其表面活性、起泡性很差，提示目前市场上无患子皂苷提取物原料质量良莠不齐，现有方法不能有效控制其质量。针对现有技术的不足，有必要建立无患子果皮及无患子皂苷提取物原料三萜类皂苷成分的指纹图谱方法，以更全面反映皂苷成分信息，更有效控制果皮及无患子皂苷提取物原料质量。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种无患子三萜类皂苷成分的指纹图谱检测方法，该方法包括以下步骤：
1)制备参照物溶液和含无患子皂苷的供试品溶液；
2)基于步骤1)中制备的各溶液，采用高效液相色谱法得到参照物溶液和含无患子皂苷的供试品溶液的指纹色谱图；
3)基于步骤2)中获得的指纹色谱图生成无患子三萜类皂苷成分的对照指纹图谱，选择其中主要成分较高且分离度较好的色谱峰作为特征峰，并确定为共有峰；
4)将待测无患子果皮、无患子皂苷提取物原料的指纹色谱图与步骤3)的对照指纹图谱进行比较，相似度不低于0.90则判定为符合规定，相似度小于0.90则判定为不符合规定。
进一步的，上述步骤1)中的含无患子皂苷的供试品溶液采用的是无患子果皮供试品溶液和无患子皂苷提取物原料供试品溶液。
进一步的，上述无患子果皮供试品溶液的制备包括以下步骤：取无患子果皮，干燥，粉碎成细粉，称取0.5-1.5g，加入6-70mL的甲醇、乙醇或水，超声提取15-45min，冷却定容至10-100mL量瓶，用滤膜过滤，取续滤液即得。
进一步的，上述无患子皂苷提取物原料供试品溶液的制备包括以下步骤：取无患子皂苷提取物原料0.05-0.2g，加入6-70mL的甲醇或乙醇，超声提取5-15min，冷却定容至10-100mL量瓶，用滤膜过滤，取续滤液即得。
进一步的，上述参照物溶液的制备包括以下步骤：精密称取RarasaponinIII对照品适量，加甲醇或乙醇制成每1mL含150-200μg的溶液，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，即得。
进一步的，上述步骤2)中高效液相色谱法测定时的色谱条件与系统适用性试验参数包括：选用的色谱柱为AgilentEclipseplusC18或WelchXtimateC18或WelchUltimateC18色谱柱，或其它等效十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱型为4.6mm×250mm，5μm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱程序为：0～15min，25～40％A；15～35min，40～43％A；35～45min，43～50％A；45～50min,100％A；50～55min,25％A；流速0.9-1.1mL·min-1，柱温25-40℃；蒸发光散射检测器：漂移管温度95-115℃，载气流速2.5-3.5mL·min-1，进样量10μL；理论板数按参照峰RarasaponinIII计算不低于5000。
进一步的，上述步骤2)中测定的无患子果皮供试品溶液的批次数量不少于11批次，测定的无患子皂苷提取物原料供试品溶液的批次数量不少于11批次。
进一步的，上述步骤3)中确定的共有峰至少有9个。
进一步的，以参照物相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积控制在以下限度范围内：
Figure BDA0002872580520000021
Figure BDA0002872580520000031
进一步的，上述步骤4)中的相似度判断是通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行实施。
本发明的有益效果如下：
1、首次建立了高效液相色谱-蒸发光散射检测无患子果皮及无患子皂苷提取物原料的主要表面活性物质三萜皂苷成分指纹图谱方法，并优化该检测方法，使其能检出更全面的目标峰，且目标峰不受基线干扰影响，响应值和灵敏度高，峰之间分离度好，能较好地呈现无患子三萜皂苷类成分整体图谱峰特征，准确反应无患子皂苷的真实成分分布，适用于无患子果皮及无患子皂苷提取物原料的真伪鉴别和产品质量控制。
2、运行时间相对较短，小于50min。
附图说明
图1为实施例1无患子果皮三萜类皂苷成分HPLC-ELSD指纹图谱；
图2为实施例1无患子皂苷提取物原料的三萜类皂苷成分HPLC-ELSD指纹图谱；
图3为实施例1无患子果皮三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱；
图4为实施例1无患子皂苷提取物原料三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱；
图5为实施例2无患子果皮三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱；
图6为实施例2无患子皂苷提取物原料三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱；
图7为实施例3无患子果皮三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱；
图8为实施例3无患子皂苷提取物原料三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例中的实验条件如下：
仪器和色谱条件：
仪器：Ultimate3000赛默飞高效液相色谱仪(AlltechELSD6000蒸发光散射检测器，U3000四元低压梯度泵，CM7.2色谱工作站)
流动相A：乙腈
流动相B：一级水
流速：0.9-1.1mL·min-1
柱温：25-40℃
检测器参数：漂移管温度95-115℃，载气气流2.5-3.5L·min-1。
溶液的制备
参照物溶液的制备：精密称取RarasaponinIII对照品适量，加甲醇或乙醇制成每1mL含200μg的溶液，摇匀，用0.45μm有机滤膜过滤，即得；
供试品溶液的制备：取无患子果皮，干燥，粉碎成细粉，称取0.5-1.5g，加入6-70mL体积的甲醇、乙醇或水，超声提取15-45min；取无患子皂苷提取物原料0.05-0.2g，加入6-70mL体积的甲醇或乙醇超声提取5-15min，冷却定容至10-100mL量瓶，用0.45μm滤膜过滤，取续滤液即得。
无患子果皮或取无患子皂苷提取物原料来源见表1和2。
表1：无患子果皮收集情况表
编号 名称 收集地 产地/生产厂家
S1 无患子果皮 湖南攸州 湖南株洲攸县
S2 无患子果皮 山西运城 山西
S3 无患子果皮 安徽 安徽
S4 无患子果皮 安徽亳州 安徽
S5 无患子果皮 浙江台州 浙江
S6 无患子果皮 湖南攸州 湖南株洲攸县
S7 无患子果皮 山东济南 山东
S8 无患子果皮 安徽 安徽
S9 无患子果皮 广西玉林 广西
S10 无患子果皮 河北安国 河北
S11 无患子果皮 湖南攸州 湖南株洲攸县
表2无患子皂苷提取物原料收集情况表
Figure BDA0002872580520000051
实施例1
无患子果皮及无患子皂苷提取物原料HPLC-ELSD对照指纹图谱的建立
1、方法结果
1.1、参照物溶液制备：精密称取自制对照品10mg，置50mL容量瓶中，用甲醇30mL超声溶解，放冷，定容，摇匀，制成每1mL含200μg的溶液，用0.45μm微孔有机滤膜过滤，取续滤液，HPLC备用。
1.2、供试品溶液的制备：取无患子果皮，干燥，粉碎成细粉，称取1g，加30mL甲醇，超声提取10-30min，放冷，定容至50mL，用0.45μm微孔有机滤膜过滤，取续滤液，HPLC备用。取无患子皂苷提取物原料0.1g，加入30mL的甲醇，超声提取10min，冷却定容至50mL量瓶，用滤膜过滤，取续滤液即得。
1.3、色谱条件：色谱柱AgilentEclipseplusC18，4.6mm×250mm，5μm，柱温25℃；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度105℃，载气流速3.0mL·min-1；1.0mL·min-1，按下表进行梯度洗脱：
表3梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0-15min 25→40％ 75→60％
15-35min 40→43％ 60→57％
35-45min 43→50％ 57→50％
45-50min 100％ 0
1.4、指纹图谱的建立：测定11批无患子果皮、11批无患子皂苷提取物原料HPLC-ELSD指纹图谱(参见附图1和2)，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的无患子果皮和无患子皂苷提取物原料HPLC-ELSD对照指纹图谱(参见附图3和4)，其中以RarasaponinIII对照品为参照物S峰，计算得出11批无患子果皮和11批无患子皂苷提取物原料共有峰的相对保留时间、相对峰面积见表4。
Figure BDA0002872580520000061
2、方法学考察
精密度试验
取编号为S1来源的无患子果皮样品，按照1.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以6号峰为参照峰，计算出1～9号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2％(如表5与表6所示)，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。
表5指纹图谱精密度考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872580520000071
表6指纹图谱精密度考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872580520000072
稳定性试验
取编号为S1来源的无患子果皮样品，按照1.2项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，24h进样，以6号峰为参照峰，计算出1～9号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2％(如表7与表8所示)，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24小时内稳定。
表7指纹图谱稳定性考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872580520000081
表8指纹图谱稳定性考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872580520000082
重现性试验
取编号为S1来源的无患子果皮样品，分别精密称取6份，按照1.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，以6号峰为参照峰，计算出1～9号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2％(如表9与表10所示)，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。
表9指纹图谱重现性考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0002872580520000091
表10指纹图谱重现性考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0002872580520000092
3无患子指纹图谱共有峰成分确认
质谱条件：ESI离子源，正负离子模式，毛细管电压3500V，雾化室电压40psi，干燥气流速10L·min-1，加热毛细管温度350℃，源内裂解电压175V，传输电压65V，质量数扫描范围m/z100～1000，碰撞能量为20～25V。
本实验用对照品比对，结合HPLC-MS-MS质谱图中化合物的质荷比及相关参考文献对主要共有峰进行了指认。在实验条件下，供试品中的皂苷类成分对质谱负离子检测有较好的响应，MS结果见表11。
表11无患子主要共有峰的HPLC-MS-MS分析
Figure BDA0002872580520000101
实施例2
一种无患子果皮及无患子皂苷提取物原料的指纹图谱检测方法
1、方法结果
1.1、参照物溶液制备：同实施例1。
1.2、供试品溶液的制备：同实施例1。
1.3、色谱条件：WelchXtimateC18，4.6mm×250mm，5μm，柱温30℃；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度105℃，载气流速3.0mL·min-1；进样量10μl。以乙腈为流动相A，以水为流动相B；流速1.0mL·min-1，按实施例1表3梯度洗脱。
1.4、指纹图谱的测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。供试品指纹图谱中应呈现与参照峰保留时间一致的色谱峰，并应出现9个共有峰(见实施例1)，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与实施例1的对照指纹图谱比较，相似度不低于0.90。无患子果皮三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱见图5；无患子皂苷提取物原料三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱见图6。
实施例3
一种无患子果皮及无患子皂苷提取物原料的指纹图谱检测方法
1、方法结果
1.1、参照物溶液制备：同实施例1。
1.2、供试品溶液的制备：同实施例1。
1.3、色谱条件：WelchUltimateC18，4.6mm×250mm，5μm，柱温30℃；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度105℃，载气流速3.0mL·min-1；进样量10μL。以乙腈为流动相A，以水为流动相B；流速1.0mL·min-1，按实施例1表3梯度洗脱。
1.4、指纹图谱的测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。供试品指纹图谱中应呈现与参照峰保留时间一致的色谱峰，并应出现9个共有峰(见实施例1)，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与实施例1的对照指纹图谱比较，相似度不低于0.90。无患子果皮三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱见图7；无患子皂苷提取物原料三萜类皂苷成分HPLC-ELSD对照指纹图谱见图8。
实施例4
一种无患子果皮及无患子皂苷提取物原料的指纹图谱检测方法
1、方法结果
1.1、参照物溶液制备：同实施例1。
1.2、供试品溶液的制备：同实施例1。
1.3、色谱条件：WelchUltimateC18，4.6mm×250mm，5μm，柱温30℃；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度115℃，载气流速3.5mL·min-1；进样量10μL。以乙腈为流动相A，以水为流动相B；流速1.1mL·min-1，按实施例1表3梯度洗脱。
1.4、指纹图谱的测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。供试品指纹图谱中应呈现与参照峰保留时间一致的色谱峰，并应出现9个共有峰(见实施例1)，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与实施例1的对照指纹图谱比较，相似度不低于0.90。
实施例5
一种无患子果皮及无患子皂苷提取物原料的指纹图谱检测方法
1、方法结果
1.1、参照物溶液制备：同实施例1。
1.2、供试品溶液的制备：同实施例1。
1.3、色谱条件：WelchUltimateC18，4.6mm×250mm，5μm，柱温30℃；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度95℃，载气流速2.5mL·min-1；进样量10μL。以乙腈为流动相A，以水为流动相B；流速0.9mL·min-1，按实施例1表3梯度洗脱。
1.4、指纹图谱的测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。供试品指纹图谱中应呈现与参照峰保留时间一致的色谱峰，并应出现9个共有峰(见实施例1)，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与实施例1的对照指纹图谱比较，相似度不低于0.90。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖与该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种无患子三萜类皂苷成分的指纹图谱检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)制备参照物溶液和含无患子皂苷的供试品溶液；
2)基于步骤1)中制备的各溶液，采用高效液相色谱法得到参照物溶液和含无患子皂苷的供试品溶液的指纹色谱图；
3)基于步骤2)中获得的指纹色谱图生成无患子三萜类皂苷成分的对照指纹图谱，选择其中主要成分较高且分离度较好的色谱峰作为特征峰，并确定为共有峰；
4)将待测无患子果皮、无患子皂苷提取物原料的指纹色谱图与步骤3)的对照指纹图谱进行比较，相似度不低于0.90则判定为符合规定，相似度小于0.90则判定为不符合规定。
2.根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤1)中的含无患子皂苷的供试品溶液采用的是无患子果皮供试品溶液和无患子皂苷提取物原料供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述无患子果皮供试品溶液的制备包括以下步骤：取无患子果皮，干燥，粉碎成细粉，称取0.5-1.5g，加入6-70mL的甲醇、乙醇或水，超声提取15-45min，冷却定容至10-100mL量瓶，用滤膜过滤，取续滤液即得。
4.根据权利要求2所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述无患子皂苷提取物原料供试品溶液的制备包括以下步骤：取无患子皂苷提取物原料0.05-0.2g，加入6-70mL的甲醇或乙醇，超声提取5-15min，冷却定容至10-100mL量瓶，用滤膜过滤，取续滤液即得。
5.根据权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述参照物溶液的制备包括以下步骤：精密称取Rarasaponin III对照品适量，加甲醇或乙醇制成每1mL含150-200μg的溶液，摇匀，用滤膜过滤，即得。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤2)中高效液相色谱法测定时的色谱条件与系统适用性试验参数包括：选用的色谱柱为AgilentEclipse plus C18或Welch Xtimate C18或Welch Ultimate C18色谱柱，或其它等效十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱型为4.6mm×250mm，5μm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱程序为：0～15min，25～40％A；15～35min，40～43％A；35～45min，43～50％A；45～50min,100％A；流速0.9-1.1mL·min-1，柱温25-40℃；蒸发光散射检测器：漂移管温度95-115℃，载气流速2.5-3.5mL·min-1，进样量10μL；理论板数按参照峰Rarasaponin III计算不低于5000。
7.根据权利要求2-4中任一项所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤2)中测定的无患子果皮供试品溶液的批次数量不少于11批次，测定的无患子皂苷提取物原料供试品溶液的批次数量不少于11批次。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤3)中确定的共有峰至少有9个。
9.根据权利要求8所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，以参照物相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积控制在以下限度范围：
Figure FDA0002872580510000021
10.根据权利要求1-5中任一项所述的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述步骤4)中的相似度判断是通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行实施。
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