CN104764822A - 一种无患子皂甙的hplc检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无患子皂甙的检测方法，所述的检测方法为高效液相色谱，其流动相为乙腈和水的混合物，采用梯度洗脱，乙腈的起始浓度为10-30vol.％，最终浓度为50-80vol.％。本发明的方法填补国内外无患子检测方法专利的空白，并优化该检测方法，使目标峰的理论踏板数大大提高，且基线平稳，出峰时间适宜，试剂用量小，峰之间分离度好，能较好地呈现无患子皂甙的谱图峰特点，让HPLC检测无患子皂甙真正达到了高效、准确的目的；并运行时间相对较短，为60min；出峰早，10分钟左右即出现第一个皂甙吸收峰。

Description

一种无患子皂甙的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及一种植物天然皂甙集合的检测，尤其涉及一种无患子皂甙的高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测方法。

背景技术

无患子(Sapindus mukorossi)为无患子属无患子科落叶乔木，在世界范围内，约有13个种类分布，主要产于亚洲、美洲和大洋洲；中国无患子属共有4种，主要分布于长江流域以南地区。无患子果皮中含有多种生物活性物质，在抗菌、抗肿瘤、抗肝炎、抗胃溃疡、杀精、杀螺等方面均有大量研究报道，此外，由于无患子果皮中丰富的倍半萜和三萜皂苷含量，赋予其优秀的表面活性性能，让其在开发为各日化用品方面具有巨大潜力而一度成为研究的热点。此外，其较强的抗菌、消炎、抗肿瘤、抗生育、促进微量元素及药物吸收等能力，亦赋予了其在日化用品开发之外的潜在研究价值。

目前无患子皂甙的检测方法主要集中在用分光光度法测定，比色法如：五氯化锑、香草醛硫酸比色或香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法测定。此外还有通过RP-HPLC法测定常春藤皂苷元(Hederagenin)或齐墩果酸(Oleanolic acid)的方法来间接测定；以巴拿马树皮提取物Quillaja Saponin(QS)为标准来测定无患子皂苷的含量。但以上方法过于粗略而不能准确反应无患子皂苷的真实成分分布和真实含量。

此外，报道有使用LC-MS法、电喷雾离子化ESI-MS、大气压电离子化质谱APCI-MS，对无患子皂甙进行检测，虽然此类方法可以直接地对无患子总皂苷中各种皂苷成分进行分离鉴定和分子量测定，但检测仪器昂贵，操作过程复杂，普遍推广使用难度大。

印度国家药物研究中心CDRI用HPTLC和LC-MS对无患子皂苷指纹图谱进行过研究，并用C18柱对无患子皂苷B(Sapindoside B)的HPLC检测方法进行研究，该方法的预处理过程十分复杂，梯度洗脱基线漂移严重，色谱分离效果较差，样品测定结果的重现性、准确性等差。发明人按该方法而HPLC谱图中一直未得到目标峰。

因此，本领域迫切需要提供一种运行时间适当，基线稳定，分离度良好，重现性好，准确度高的无患子皂甙的HPLC检测方法，以为无患子的充分开发利用以及加快其商品化进程提供一种优秀，实效的工具。

发明内容

本发明旨在提供一种无患子皂甙的高效液相检测方法。

在本发明中，上述目的是通过如下方案实现的：

一种无患子皂甙的检测方法，包括将待检测的无患子皂甙通过高效液相色谱分离，其流动相为两种以上极性溶剂的混合溶剂，采用梯度洗脱。

作为优选，其中所述极性溶剂选自乙腈、乙醇、甲醇或水。

进一步的，其流动相为乙腈和水的混合物，采用梯度洗脱，乙腈的起始浓度为10-30vol.％，最终浓度为50-80vol.％。

发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的试验，摸索得到了一种无患子皂甙的HPLC检测方法。发明人发现了有效分离、检测无患子皂甙的乙腈和水的体积比，进一步地，发明人还发现在一定的时间内使乙腈和水的体积比逐步变化(即采用一定的浓度梯度洗脱方式)，可以得到更佳的分离、检测效果。

作为优选，在本发明中，浓度梯度优选为如下五个阶段：

1)洗脱剂中乙腈在0-20分钟从10-30vol.％递增到20-40vol.％；

2)洗脱剂中的乙腈在20-35分钟，从20-40vol.％递增至40-60vol.％；

3)洗脱剂中的乙腈从35-45分钟，保持在40-60vol.％；

4)洗脱剂中的乙腈浓度在45-55分钟，从40-60vol.％递增到70-100vol.％；

5)洗脱剂中的乙腈在55-60分钟，从70-100vol.％递减到50-80vol.％。

进一步的，在本发明中，浓度梯度优选为如下五个阶段：

(1)所述流动相中乙腈在0-20分钟从23vol.％递增到30vol.％；

(2)流动相中的乙腈在20-35分钟，从30vol.％递增至55vol.％；

(3)流动相中的乙腈从35-45分钟，保持在55vol.％；

(4)流动相中的乙腈浓度在45-55分钟，从55vol.％递增到80vol.％；

(5)流动相中的乙腈在55-60分钟，从80vol.％递减到50vol.％。

在本发明中，所述HPLC使用反相C18色谱柱，柱温保持在30-40℃，UV检测器检测波长为200-210nm。

在另一优选例中，无患子皂甙样品的进样浓度为1-3mg/ml。

在另一优选例中，步骤(1)前还包括步骤：

将无患子原料果皮粉碎，以80wt％乙醇按照(6:5:4)的量提取，合并提取液，旋干，真空干燥，研磨。称取一定量原料粉末，加纯化水超声溶解，定容于10ml容量瓶中，使其成终浓度3-8mg/ml的无患子原料溶液，用0.45um水系有机滤膜过滤，HPLC备用。

据此，本发明提供了一种运行时间相对较短、基线稳定、分离度良好的检测无患子皂苷的HPLC方法。

本发明的主要优点在于：

1、填补国内外无患子检测方法专利的空白，并优化该检测方法，使目标峰的理论塔板数大大提高，且基线平稳，出峰时间适宜，试剂用量小，峰之间分离度好，能较好地呈现无患子皂甙的谱图峰特点，让HPLC检测无患子皂甙真正达到了高效、准确的目的；

2、运行时间相对较短，为60min；出峰早，10分钟左右即出现第一个皂甙吸收峰。

附图说明

图1是无患子主要皂甙sapindosideB的结构图。

图2-9为实施案例1-8的无患子样品以UV作为检测器的HPLC检测图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的最佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明实施例中的实验条件如下：

仪器和色谱条件：

仪器：Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪(Shimadzu SPD-20A型号检测器、二元泵)

色谱柱：Wondasil C₁₈for herb medicine

流动相A：去离子水(UP)

流动相B：乙腈

中流速：1.0ml/min

柱温：40℃

检测波长：选用200nm-210nm作为检测波长。

溶液的制备

对照品溶液：常春藤皂苷元(Hederagenin)用甲醇超声溶解，用0.45um一次性针孔过滤后，HPLC备用。

样品溶液：精密称取一定量事先制备好的干燥的无患子原料粉末，加纯化水超声溶解，定容于10ml容量瓶中，使其成终浓度3-8mg/ml的无患子原料溶液，用0.45um水系有机滤膜过滤，作为样品溶液，HPLC备用。

实施例1

起始流动相A：流动相B＝75：25，随后，流动相B连续性递增从25％逐渐升到50％洗脱25分钟，随后在接下来的35分钟内，流动相B继续连续性递增，从50％逐渐升至55％，平衡。此方法下，7分钟后开始出现第一组峰，分离度较好，35分钟以后峰分离不明显，如，RT＝39.123min处峰,分离度为1.432，理论塔板数为2564.687。见附图2。

实施例2

起始流动相A：流动相B＝75:25等度洗脱25分钟，随后流动相B连续性递增从25％逐渐升到50％，洗脱35分钟，平衡。此方法下，各阶段峰型分离度较差，RT＝30.732处出现严重拖尾，而RT＝39.065处峰，分离度为0.506，理论塔板数为21077.566。见附图3。

实施例3

起始流动相A：流动相B＝75:25，等度洗脱25分钟，随后流动相B连续性递增从25％逐渐升到50％洗脱35分钟，流动相B保持50％洗脱10分钟，平衡。总耗时为70分钟。此方法下峰分离度较差，出峰时间有延后，现象，如RT＝64.132min处才出现的第三个大峰，分离度为0.685，理论塔板数为55628.145。见附图4。

实施案例4

起始流动相A：流动相B＝75:25等度洗脱25分钟，随后流动相B连续性递增从25％逐渐升到50％洗脱25分钟，流动相B保持50％洗脱10分钟，随后，流动相B从50％逐渐递增至75％，洗脱10分钟，最后10分钟，流动相B再从75％回到50％，平衡。总耗时80分钟。此方法耗时较长，分离度不好，出峰时间后延，如RT＝56.36min峰分离度为0.54，理论塔板数为60358.895。但此法较之上述三条案例，在第三个大峰之后，又多分离出了第四组峰组，出峰的整体数目增多了。见附图5。

实施案例5

起始流动相A：流动相B＝80:20，随后流动相B连续性递增从20％逐渐升至30％，洗脱30分钟，随后流动相B从30％逐渐递增至50％，洗脱20分钟，流动相B保持50％洗脱10分钟，随后从50％逐渐升至75％保持十分钟，而后流动相B从75％逐渐回到50％，洗脱10分钟，平衡。总耗时80分钟。此方法在20分钟左右才开始出现第一组峰，出峰时间延后，耗时较长，第三组大峰RT＝56.315min，分离度为0.525，理论塔板数为63743.988。见附图6。

实施案例6

起始流动相A：流动相B＝77:23，随后流动相B连续性增加从23％升至30，洗脱20分钟，随后从30％连续性升至55％，洗脱20分钟，流动相B保持55％洗脱10分钟，随后，流动相B从55％连续性升至75％洗脱5分钟，流动相B保持75％洗脱5min，随后从75％回到50％洗脱10分钟，最后流动相B保持50％，洗脱10分钟，平衡。此法总耗时80分钟，第一组峰首次出峰时间提前到12分钟左右，四个组分分离明显，如，第三大组RT＝43.198min，其分离度为0.363，理论塔板数为63550.0。但此法耗时较长。见附图7。

实施案例7

起始流动相A：流动相B＝77:23，随后流动相B从23％逐渐升至30％，洗脱20分钟，随后流动相B从30％再逐渐升至55％，洗脱15分钟，流动相B保持55％的比例洗脱10分钟，随后再从55％逐渐升至80％，洗脱10分钟，最后5分钟，流动相B从80％逐渐回到50％，平衡。此法总耗时60分钟。第一组峰出峰时间为12分钟左右，整体耗时较短，分离度好，基线平稳，如第三组大峰RT＝39.732，分离度为0.452，理论塔板数为94012.016，为所有上述实施案例中最高。见附图8。

实施案例8

流动相中酸的影响

将流动相A中加入一定量TFAA，使流动相A成为0.05％TFAA-H₂O或0.1％TFAA-H₂O溶液，采用实施案例7中流动相比例条件，进行实验。

可见此法可在一定程度上改善峰型，但此法容易让检测器于大峰之后出现溢出“OVER”状态。影响检测。见附图9。

综上8组实施案例可以看出，梯度洗脱中，流动相的比例，该比例下的保持时间，以及流动相中是否加酸，均对无患子皂甙样品峰型，最早出峰时间，峰分离度以及基线的稳定性等具有较大的影响，故综合上述8组实施案例中，实施案例7出峰时间早，耗时短，基线稳定，峰分离度好，为本发明的优选案例。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖与该权利要求范围之中。

Claims (9)

1.一种无患子皂甙的检测方法，包括将待检测的无患子皂甙通过高效液相色谱分离，其流动相为两种以上极性溶剂的混合溶剂，采用梯度洗脱。

2.如权利要求1所述的检测方法，其中所述极性溶剂选自乙腈、乙醇、甲醇或水。

3.如权利要求1或2所述的检测方法，所述混合溶剂为乙腈和水。

4.如权利要求3的检测方法，所述梯度洗脱的洗脱剂中，乙腈浓度从起始的10-30vol.％增加到50-80vol.％。

5.如权利要求3或4所述的检测方法，所述梯度洗脱为：

1)洗脱剂中乙腈在0-20分钟从10-30vol.％递增到20-40vol.％；

2)洗脱剂中的乙腈在20-35分钟，从20-40vol.％递增至40-60vol.％；

3)洗脱剂中的乙腈从35-45分钟，保持在40-60vol.％；

4)洗脱剂中的乙腈浓度在45-55分钟，从40-60vol.％递增到70-100vol.％；

5)洗脱剂中的乙腈在55-60分钟，从70-100vol.％递减到50-80vol.％。

6.如权利要求5所述的检测方法，所述梯度洗脱为：

(1)所述流动相中乙腈在0-20分钟从23vol.％递增到30vol.％；

(2)流动相中的乙腈在20-35分钟，从30vol.％递增至55vol.％；

(3)流动相中的乙腈从35-45分钟，保持在55vol.％；

(4)流动相中的乙腈浓度在45-55分钟，从55vol.％递增到80vol.％；

(5)流动相中的乙腈在55-60分钟，从80vol.％递减到50vol.％。

7.如权利要求1-6任一项所述的检测方法，其中所述HPLC使用反相C18色谱柱，柱温保持在30-40℃，UV检测器检测波长为200-210nm。

8.如权利要求1-7任一项所述的检测方法，其中所述无患子皂甙样品的进样浓度为1-3mg/ml。

9.如权利要求1-8任一项所述的检测方法，其中待检测的无患子皂甙通过如下方法制备：

1)将无患子原料果皮粉碎，以80wt％乙醇按照(6:5:4)的量提取三次，合并提取液，旋干，真空干燥，研磨；

2)称取一定量原料粉末，加纯化水超声溶解，定容于10ml容量瓶中，使其成终浓度3-8mg/ml的无患子原料溶液，用0.45um水系有机滤膜过滤。