CN107045021B - 一种同时鉴别抗菌消炎片中金银花、黄芩和知母的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药品检测技术领域,特别涉及一种同时鉴别抗菌消炎片中金银花、黄芩和知母的检测方法。对待检物进行高效液相色谱仪检测得到色谱图，将得到的色谱图同标准色谱图进行比对。通过对抗菌消炎片中存在与金银花、黄芩和知母混合对照药材相应的11个色谱峰进行筛选，并对其中9个色谱峰进行了确认，实现了上述三味药材的准确定性鉴别；该方法环保、高效，重现性好，可用于抗菌消炎片的定性质量控制。

Description

一种同时鉴别抗菌消炎片中金银花、黄芩和知母的检测方法

技术领域

本发明涉及药品检测技术领域,特别涉及一种同时鉴别抗菌消炎片中金银花、黄芩和知母的检测方法。

背景技术

薄层色谱法是一种目前应用很广泛的定性鉴别方法，以2015年版《中国药典》一部所收载的复方中成药质量标准为例，若除去各品种通则项下所要求的常规检验项目，则薄层检验项目占标准中全部检验项目比例超过70％。很多标准中有多个薄层色谱鉴别项，如达立通颗粒、正天胶囊、洋参保肺丸、脂脉康胶囊、芪参胶囊、苏合香丸、通宣理肺片、滑膜炎片、调经活血胶囊和藿香正气水等标准中有6个薄层鉴别项，黄连上清胶囊、感冒清热咀嚼片和糖脉康片等标准中有7个，活血通脉片标准中有8个，而在2010年版及以前各版次《中国药典》所收载复方中成药标准中几乎没有超过5个薄层鉴别项的品种，照此发展趋势，2020年版个别品种标准中出现10个以上薄层鉴别项将不足为怪，标准将越来越繁杂，使得药品生产企业及药品检验部门的日常检验工作任务有增无减。

薄层色谱法之所以在中成药质量标准中应用很广泛，主要原因在于成本非常低，对实验室硬件条件要求不高，但其分离能力和检验效率都比较低，一个薄层鉴别项只能鉴别复方中成药中一味药材，试验中使用了大量有毒化学试剂，带来了很严重的环境污染问题，也极大危害了检验人员身体健康，所以有必要采用高效、简便、低毒和专属性更强的方法来代替薄层色谱法进行检验。

目前高效液相色谱仪已经成为药品实验室必备的仪器，高效液相色谱法具有很高的色谱分离能力，且试验中不需要使用三氯甲烷、甲苯等薄层色谱法常用的有毒化学试剂，检验过程大部分由仪器来完成等优点，已经在药品定量研究方面应用非常广泛，但定性研究方面应用较少。

抗菌消炎片是由金银花、黄芩、知母等七味药组成，现行质量标准收载于卫生部部颁标准第七册(WS₃-B-1339-93)，标准中未收载鉴别项，经查阅文献，对抗菌消炎片的鉴别研究除采用显微鉴别方法外，均采用薄层色谱法对处方中金银花、黄芩、知母等药味进行定性鉴别，未见有采用液相色谱法鉴别抗菌消炎片的报道。

发明内容

为了解决以上现有技术中薄层色谱法检测中药中存在的环境污染问题严重、分离能力和检验效率低的问题，本申请提供了一种检测友好、效率高的同时鉴别抗菌消炎片中金银花、黄芩和知母的检测方法。本研究在同一色谱条件下可以同时鉴别处方中上述三味药材的11个特征峰，大大优于传统的薄层鉴别法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种同时鉴别抗菌消炎片中金银花、黄芩和知母的检测方法，其特征在包括以下步骤：

(1)对待检物进行高效液相色谱仪检测得到色谱图，

(2)将步骤(1)得到的色谱图同标准色谱图进行比对。

所述的检测方法，优选标准色谱图中主色谱峰为黄芩苷，以此作为参照峰，其余10个色谱峰的相对保留时间分别为0.30、0.31、0.42、0.84、0.91、1.13、1.16、1.24、1.31和1.33。各色谱峰的相对保留时间误差应控制在±5％以内。

所述的检测方法，优选标准色谱图是金银花、黄芩和知母的对照药材混合后进行高效液相色谱仪检测后，对色谱图进行筛选后得到的。

所述的检测方法，优选色谱条件：色谱柱Agilent extend C18 5μm,4.6×250mm；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，0～5min，5％A，5～20min,5→9％A，20～64min，9→21％A，64～80min，21→30％A，80～95min，30→80％A，得到待检物的色谱图，波长317.5±2nm。

一般的薄层色谱法鉴别金银花、黄芩和知母三味药材，需要三个不同的薄层鉴别试验，费时费力。且还需要绿原酸、黄芩苷和芒果苷对照品方能对薄层色谱中主斑点进行定性确认，结果判定也只关注主斑点是否存在。而采用该文研究方法，不需要各种价格不菲的对照品，仅需要三种价格非常低廉的对照药材，就可以对上述药味进行非常准确的定性鉴别，该检验需要对11个特征色谱峰进行比对，且通过引入相对保留时间这一因素，可以确认其所含有的九种化学物质，远远优于薄层色谱法仅能分别对3个主斑点是否存在进行评判的方法。

试验过程中曾使用了中国食品药品检定研究院提供的多个批号的金银花、黄芩和知母对照药材，只需要进行等比例取样，在波长317.5nm±2nm下，均可保证混合对照药材溶液主色谱峰为黄芩苷，均呈现11个主要特征色谱峰。如果混合对照药材溶液不能呈现上述11个色谱峰，或各色谱峰的分离度小于1.5，则该方法不能用于检验，应更换色谱柱或对照药材，并重新进行试验。为保证检验结果的准确性，三种对照药材取样比例应控制在±10％以内，即(1±10％)：(1±10％)：(1±10％)。

为保证试验结果的准确性，供试品溶液中各色谱峰的相对保留时间应控制在±5％以内，超出该范围，则判为不合格。供试品溶液中任何色谱峰的缺失，则结果判为不合格，并应根据缺失色谱峰的药味归属，进一步判定具体由哪味药材引起，并可结合其他实验分析不合格的原因。

本发明的有益效果：

1、通过对抗菌消炎片中存在与金银花、黄芩和知母混合对照药材相应的11个色谱峰进行筛选，并对其中9个色谱峰进行了确认，实现了上述三味药材的准确定性鉴别；

2、该方法环保、高效，重现性好，可用于抗菌消炎片的定性质量控制。

附图说明

图1金银花对照药材溶液的HPLC色谱图，

图2黄芩对照药材溶液的HPLC色谱图，

图3知母对照药材溶液的HPLC色谱图，

图4混合对照药材溶液的HPLC色谱图,

图5供试品的溶液的HPLC色谱图，样4，批号1511002，合格，

图6金银花、黄芩和知母的阴性对照溶液的HPLC色谱图,

图7混合对照品的溶液HPLC色谱图,

图8供试品的溶液的HPLC色谱图，样1，批号20150510，不合格,

图9供试品的溶液的HPLC色谱图，样6，批号215001079，不合格，

其中附图中各峰1.新芒果苷；2.绿原酸；3.芒果苷；4.异绿原酸B；5.异绿原酸C；6.黄芩苷；7.未知；8.汉黄芩苷；9.黄芩素；10.汉黄芩素；11.未知。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1.仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2448DAD检测器；Sartorius CP225D电子天平；BK-600C超声波清洗仪(巴克超声设备有限公司)

绿原酸(批号110753-201415)、黄芩苷(批号110715-201117)、黄芩素(批号111595-201306)、新芒果苷(成都曼斯特生物科技有限公司，纯度大于98％)，

芒果苷(批号111607-200301)、汉黄芩苷批号071114(纯度≥98％，上海同田生物技术有限公司)、汉黄芩素(批号111514-200403)、金银花对照药材(批号121060-201107)、黄芩对照药材(批号120955-201309)、知母对照药材(批号121070-200503)均由中国食品药品检定研究院提供；异绿原酸B、异绿原酸C批号分别为ps100623-03、ps100623-01，纯度≥98％，均购自成都普思生物科技有限公司；抗菌消炎片均为市售样品；乙腈为色谱纯。

2.方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1供试品溶液的制备

取本品(糖衣片除去包衣)，研细，混匀，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2对照药材溶液的制备

取金银花对照药材、黄芩对照药材和知母对照药材各约0.20g，精密称定，照供试品溶液的制备方法，分别制得对照药材溶液。

2.1.3混合对照药材溶液的制备

取金银花对照药材、黄芩对照药材和知母对照药材各约0.10g，精密称定，照供试品溶液的制备方法，制得混合对照药材溶液。

2.1.4混合对照品溶液的制备

精密称取新芒果苷、绿原酸、芒果苷、异绿原酸B、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素上述九种对照品适量，加70％甲醇制成每ml各含50μg、0.1mg、60μg、50μg、40μg、0.2mg、45μg、50μg、和50μg的混合溶液。

2.1.5阴性对照溶液的制备

按处方比例及工艺制备了缺金银花、黄芩和知母三味药材的阴性样品，同供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。

2.2色谱条件与系统适用性试验

参考相关文献，采用如下色谱条件：色谱柱Agilent extend C18(5μm,4.6×250mm)；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，0～5min，5％A，5～20min,5→9％A，20～64min，9→21％A，64～80min，21→30％A，80～95min，30→80％A，DAD检测器。理论塔板数按绿原酸峰计算不得少于10 000。

2.3检测波长的选择

分别精密吸取上述对照药材溶液、混合对照药材溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，进行定性分析，图谱分别见图1～5。发现在波长317.5nm条件下，金银花对照药材溶液色谱中有3个主要特征峰，黄芩对照药材溶液色谱中有6个主要特征峰，知母对照药材溶液色谱中有2个主要特征峰，供试品溶液色谱与混合对照药材溶液色谱中也呈现上述相应的11个主要特征色谱峰，各色谱峰的分离度均大于1.5，说明在该波长条件下可以同时检测上述三味药材，故选择317.5nm作为检测波长。

2.4专属性试验

精密吸取阴性对照溶液10μl，注入液相色谱仪，进行分析，图谱见图6。在波长317.5nm下，在混合对照药材溶液和供试品溶液色谱中呈现的11个主要特征色谱峰在阴性对照溶液色谱相应的位置处没有干扰峰出现，说明本方法具有很高的专属性。

2.5色谱峰的确认

精密吸取混合对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，进行分析，图谱见图7。金银花对照药材溶液色谱中的3个主要特征峰为峰2(绿原酸)、峰4(异绿原酸B)和峰5(异绿原酸C)，黄芩对照药材溶液色谱中的6个主要特征峰为峰6(黄芩苷)、峰7(未知1)、峰8(汉黄芩苷)、峰9(黄芩素)、峰10(汉黄芩素)和峰11(未知2)，知母对照药材溶液色谱中的2个主要特征峰为峰1(新芒果苷)和峰3(芒果苷)。

2.6参照色谱峰的选择

混合对照药材溶液呈现11个主要的特征色谱峰，中间6号色谱峰为黄芩苷，在波长317.5nm下，黄芩苷色谱峰为主峰，其峰面积远远大于其他十个色谱峰，在保证金银花、黄芩和知母对照药材等比例取样的条件下，按照本研究供试品溶液制备方法，则该混合溶液的主色谱峰一定是黄芩苷，而且该色谱峰恰好在十一个色谱正中央，故可以利用该主色谱峰作为参照峰，来计算其他十个色谱峰的相对保留时间，这样计算所得相对保留时间偏差较小。其余10个色谱峰的相对保留时间分别为0.30、0.31、0.42、0.84、0.91、1.13、1.16、1.24、1.31和1.33。各色谱峰的相对保留时间应控制在±5％以内。

实施例2相对保留时间的精密度试验考察

精密吸取混合对照药材溶液10μl，连续进样6次，以所得混合对照药材溶液主色谱峰黄芩苷峰为参照峰，计算11个主要的特征色谱峰的相对保留时间。

表1 11个主要的特征色谱峰的相对保留时间的精密度试验考察结果

上述结果可知，11个色谱峰的相对保留时间的RSD均小于3％，提示本方法的精密度试验良好。

实施例3样品的测定

抗菌消炎片全国共有6家生产企业，本实验选取全部6家不同企业样品进行考察，批号分别为20150510、150504、150606、1511002、20151101和215001079。

表2 11个主要的特征色谱峰的相对保留时间的不同企业样品的考察结果

(“/”表示未检出该色谱峰)

上表结果可知，样1和样2中均未能检出峰1(知母-新芒果苷)、峰5(金银花-异绿原酸C)和峰11(黄芩-未知物)，图谱见图8(样1)，判为不合格。经进一步含量测定分析，发现样1和样2所含绿原酸、芒果苷和黄芩苷的含量均远远低于平均含量水平，提示该两批样品可能存在知母、金银花和黄芩三味药材少投料现象；样3、样4和样5均能检出上述11个特征峰，判定为合格，图谱见图5(样4)；样6中未能检出峰1(知母-新芒果苷)和峰3(知母-芒果苷)，图谱见图9(样6)，判为不合格，该批样品可能存在知母未投料现象。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种同时鉴别抗菌消炎片中金银花、黄芩和知母的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）对待检物进行高效液相色谱仪检测得到色谱图，

（2）将步骤（1）得到的色谱图同标准色谱图进行比对；

所述待检物的制备方法为：取待检物，糖衣片除去包衣，研细，混匀，取0 .5g，精密称定，置锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液作为待检物溶液；

所述的标准色谱图通过以下步骤得到：取金银花对照药材、黄芩对照药材和知母对照药材各0.20g，精密称定，照待检物溶液的制备方法，分别制得对照药材溶液，进行高效液相色谱仪检测得标准色谱图；

所述的色谱条件为：色谱柱Agilent extend C18 5µm, 4.6×250mm；以乙腈为流动相A，以0.5%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，0～5 min，5% A，5～20 min, 5→9% A，20～64min，9→21%A，64～80 min，21→30% A，80～95 min，30→80% A，得到待检物的色谱图，波长317.5±2nm。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于标准色谱图中主色谱峰为黄芩苷，以此作为参照峰，其余10个色谱峰的相对保留时间分别为0.30、0.31、0.42、0.84、0.91、1.13、1.16、1.24、1.31和1.33，误差在±5%以内。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于标准色谱图是金银花、黄芩和知母的对照药材混合后进行高效液相色谱仪检测后，对色谱图进行筛选后得到的。