CN102585198B

CN102585198B - 一种不含异山梨醇酐聚氧乙烯脂肪酸酯的聚山梨酯

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Publication number: CN102585198B
Application number: CN201110440652.3A
Authority: CN
Inventors: 涂家生; 吴建梅
Original assignee: NANJING FANTAI CHEMICAL PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: NANJING FANTAI CHEMICAL PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2031-12-26
Also published as: CN102585198A

Abstract

本发明一种不含异山梨醇酐聚氧乙烯脂肪酸酯的聚山梨酯，该聚山梨酯可采用不含异山梨醇酐的山梨醇及山梨坦为原料经合成得到，也可通过色谱纯化得到，其中优选以山梨醇为母核结构的聚山梨酯类，不含或极少含有以异山梨醇酐为母核结构的组分，实验证明：本发明的溶血性和直接刺激肥大细胞脱颗粒释放组胺能力得到明显改善，具有更高的安全性且其功能性并未降低。

Description

一种不含异山梨醇酐聚氧乙烯脂肪酸酯的聚山梨酯

技术领域：

本发明涉及一种聚合物的制备，特别是一种不含异山梨醇酐聚氧乙烯脂肪酸酯的聚山梨酯，该聚山梨酯以山梨醇或山梨坦作为母核与环氧乙烷醚化，再与脂肪酸进行酯化得到。

背景技术：

目前，大量疏水性药物的溶解度低影响了其成药性。聚山梨酯类表面活性剂如聚山梨酯20、40、60、80是常用的增溶剂，然而，过敏性、溶血性成为影响其应用的障碍。如抗癌药物中包括紫杉醇、多西他赛、顺铂和阿霉素等均为难溶性药物，在水中的溶解度很低，因此在临床使用上有很大的局限性。

以聚山梨酯80为例。聚山梨酯80(俗称吐温80，Tween80)，化学名为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯，分子量约为1309，是一种亲水型的非离子表面活性剂。由于结构中具有较长的碳链结构，对亲脂性药物有较好的助溶作用，吐温80可以用作填充剂、乳化剂和稳定剂等。特别是对难溶性药物具有良好的增溶作用，被广泛用于化学药物、生物制品和中药制剂的注射剂，在制药工业中具有重要的价值，各国药典对其均有收载。

近年来，国内外常见由于聚山梨酯80引起不良反应的报道，使得聚山梨酯80质量及安全性的研究受到广泛关注。美国药典对其最新定义如下：“聚山梨酯80是由一摩尔山梨醇及其脱水物与约二十摩尔环氧乙烷结合，再与油酸酯化所形成的聚合物。”其典型结构如下图所示。根据这一定义，聚山梨酯80并非单一结构的纯净物质，而可能是由多种结构组成的混合物。

现阶段的研究大多将聚山梨酯80所出现的安全性问题(包括过敏性、溶血性)归咎于原料的纯度和杂质的残留。原料的纯度主要指油酸纯度，目前只有欧洲药典中对聚山梨酯80生产中所用油酸的纯度提出了明确的要求；残留杂质的控制主要包括环氧乙烷、二氧六环、氯乙醇、乙二醇、二甘醇等物质。但实验表明，即使是高质量聚山梨酯80(油酸含量高于97.7％且无上述残留杂质)，依然具有一定程度的过敏性和溶血性(CHENGO，GAOP，TUJS.Relationofpolysorbate80qualitytothesensitization[J].JournalofChinaPharmaceuticalUniversity，2010，41(03)：244-247.)。因此说明，单纯针对油酸纯度及杂质残留量的控制，并不能完全解决聚山梨酯80所存在的安全性问题。

聚山梨酯80的生产工艺一般为三步：1.山梨醇的脱水；2.油酸的酯化；3.环氧乙烷的醚化聚合。分析聚山梨酯80合成工艺发现：排除油酸纯度和环氧乙烷聚合步骤引入的杂质，其第一步山梨醇脱水反应本身就存在多种产物：可能形成一脱水或二脱水产物，此外在后续过程中也有可能含有山梨醇，如下图所示。

基于上述不同结构的产物，聚山梨酯80合成工艺中的第一步是后面产物种类繁杂的基础，在此基础得到了结构差异和酯化程度不等的聚山梨酯80组分。因此设想：将聚山梨酯80合成第一步中所得到的产物根据结构差异分为三类：第一类是基于山梨醇(sorbitol)为母核结构的聚山梨酯80成分；第二类是基于一失水山梨醇酐(sorbitan)为母核结构的聚山梨酯80成分；第三类则是基于二失水异山梨醇酐(1，4:3，6-isosorbide)为母核结构的聚山梨酯80成分。

发明内容：

本发明目的之一在于提供一种不含异山梨醇酐为母核结构的聚山梨酯，这样可以改善聚山梨酯的安全性，降低其溶血性和致敏性，同时并不影响其作为药用辅料的功能性。

本发明目的之二在于提供一种简单易行，安全有效的新型药用辅料——山梨醇或山梨坦聚氧乙烯脂肪酸酯的制备方法。

本发明目的之三在于提供一种成本低廉，操作简单的不含或极少含有异山梨醇酐为母核结构的聚山梨酯的制备方法。

本发明提供一种不含异山梨醇酐聚氧乙烯脂肪酸酯的聚山梨酯，其结构通式如下

式中R＝月桂酸时为聚山梨酯20

R＝棕榈酸时为聚山梨酯40

R＝硬脂酸时为聚山梨酯60

R＝油酸时为聚山梨酯80

其中环氧乙烷醚化程度不局限于20，优选为20。脂肪酸酯化程度不局限于单酯。

本发明为包括但不局限于山梨醇为母核结构的一种山梨醇聚氧乙烯脂肪酸酯聚合物。

本发明中应不含或极少含有异山梨醇酐为母核结构的组分，即结构通式如下的组分：

式中R＝月桂酸时为聚山梨酯20、

R＝棕榈酸时为聚山梨酯40、

R＝硬脂酸时为聚山梨酯60、

R＝油酸时为聚山梨酯80

其中环氧乙烷醚化程度不局限于20，脂肪酸酯化程度不局限于单酯。

本发明的聚山梨酯的制备方法包括以下方法：

(1)以山梨醇为原料，不经脱水步骤或每摩尔山梨醇脱去0.5-1摩尔水，直接与油酸进行酯化，所得产物再与环氧乙烷进行醚化。得到山梨醇聚氧乙烯脂肪酸酯。

(2)以色谱法进行分离纯化。如：离子交换树脂，大孔吸附树脂，硅胶等但不局限于此。对现有聚山梨酯产品进行分离纯化，得到不含或极少含有异山梨醇酐为母核结构组分的聚山梨酯。

本发明的聚山梨酯，既可以采用山梨醇原料直接合成，也可以采用现有聚山梨酯通过色谱法分离纯化后得到。

本发明的聚山梨酯可以作为助溶剂药用辅料在制备药物中应用。如在制备抗癌药物制剂中的应用，包括紫杉醇、多西他赛、顺铂和阿霉素等难溶性药物，其制备成乳剂，溶液剂等剂型中加入本发明的聚山梨酯可以解决溶解性问题。

本发明提供的聚山梨酯，其优点在于：在合成工艺中，可以省略山梨醇脱水步骤，既可以降低合成制备的成本，也可以避免在脱水中形成异山梨醇酐。

我们发现，该聚山梨酯具有极低的溶血性和致敏性，使聚山梨酯具有更高的安全性，适合于注射用。但在保证其安全性的同时，本发明并不影响其作为药用辅料的功能性，如增溶性。

以下通过试验数据进一步说明本发明：

1、山梨醇聚氧乙烯油酸酯与异山梨醇酐聚氧乙烯油酸酯的致敏性比较

取浓度2×10⁵/mL的RBL-2H3细胞悬液接种于96孔板，200μL/孔，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养。

待细胞单层长满底部后，弃去培养基，改良Tyrode液(NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，glucose5.6mmol/L，CaCl₂1.8mmol/L，MgCl₂1mmol/L，HEPES20mmol/L，BSA1mg/mL，pH7.4)洗2遍，加入各种受试液：①阴性对照组加入改良Tyrode液；②阳性对照组加入2mg/mLCompound48/80溶液；③裂解组加改良Tyrode液；④试验组加入各组受试液(0.3％、1％，溶解于改良Tyrode液)，200μL/孔，每组平行3孔；

37℃孵育1h后，置于冰上10min终止反应。在裂解组相应的复孔中加入40μL1.2％TritonX-100，冰上裂解min，以获得细胞裂解液(代表β-氨基己糖苷酶总量)；

4℃、1500r/min离心5min。分别取50μL细胞上清或60μL细胞裂解液，转移至一新的96孔板，在各组细胞上清液及调零孔(50μL改良Tyrode液)中加入10μL1.2％TritonX-100补齐体积至60μL。各孔加入60μL底物(5mmol/Lp-Nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopy-ranoside+0.1mmol/mL柠檬酸钠缓冲液pH4.5)；

37℃孵育1h后，每孔加入150μL终止液(100mmol/LNaCO₃、100mmol/LNaHCO₃缓冲液pH10.7)终止反应，于酶标仪405nm处测定各孔反应液吸光度(A)值；

计算β-氨基己糖苷酶释放率：

β-氨基己糖苷酶释放率(％)＝(上清样品酶活力A值-空白A值)/(裂解组总酶活力A值-空白A值)×100％。结果见图3。图中纵坐标吸光度表示供试品β-氨基己糖苷酶的释放率，可以反映其促组胺释放能力的强弱。由该结果可知：异山梨醇酐聚氧乙烯油酸酯(POI)具有极强的促组胺释放能力，而本发明山梨醇聚氧乙烯油酸酯(POS)的促组胺释放能力显著降低。由此证明：本发明在除去异山梨醇酐聚氧乙烯油酸酯后，可以显著降低聚山梨酯80的致敏性。

2、山梨醇聚氧乙烯油酸酯与异山梨醇酐聚氧乙烯油酸酯的溶血性比较

(1)2％血细胞混悬液的配制

健康家兔取血适量，玻璃棒搅拌使成脱纤血液，加入10倍量生理盐水，1500r/min离心15分钟，弃去上清液。反复洗涤2～3次至上清液不显红色。用生理盐水配制成2％的血细胞混悬液，4℃保存备用。

(2)聚山梨酯80溶液的配制

精密称取聚山梨酯80样品1.25g，置25mL量瓶，加生理盐水超声溶解，生理盐水定容。

(3)紫外分光光度法测定聚山梨酯80的溶血率

照表1配制聚山梨酯80各浓度溶液的血细胞混悬液，

表1

分别设置生理盐水空白阴性对照组(第8组)和纯水阳性对照组(第9组)。37℃恒温箱中温孵3小时后将各管溶液1500r/min离心15分钟，取上清液于分光光度计540nm出检测。按下式计算溶血率，结果见图4。由此结果可知：本发明山梨醇聚氧乙烯油酸酯(POS)与异山梨醇酐聚氧乙烯油酸酯(POI)相比，其溶血性更低。在20mg/mL的最高实验浓度条件下，其溶血率仅为16.35％；而异山梨醇酐聚氧乙烯油酸酯在2mg/ml的最低实验浓度条件下，溶血率高达94.34％。由此证明：本发明在除去异山梨醇酐聚氧乙烯油酸酯后，可以显著降低聚山梨酯80的溶血性。

Hemolysisrate(％)＝(ODt-Odnc)/(Odpc-Odnc)×100％

其中：Odt为各样品试管吸光度

Odnc为阴性对照管吸光度

Odpc为阳性对照管吸光度

3、山梨醇聚氧乙烯油酸酯的临界胶束浓度(CMC)考察

精密称取1.300g本发明产品，置50mL量瓶，加超纯水使完全溶解并定容。移取1mL至100mL量瓶，超纯水定容，得吐温80储备液。

精密称取0.020g芘，置50mL量瓶，丙酮溶解并定容，移取0.8mL至50mL量瓶，丙酮定容，得芘-丙酮溶液。

移取0.2mL芘-丙酮溶液至12个西林瓶中，避光条件下，N₂气流挥干。分别移取吐温80储备液0.04、0.05、0.1、0.15、0.25、0.425、0.6、0.75、1、2、4、10mL至10mL量瓶中，超纯水定容后，移至上述已挥干的西林瓶中，避光过夜保存。结果见图5。通过对此图中“S”型曲线第一个拐点附近做切线，求切线交点可得本发明的临界胶束浓度(CMC)。经计算得其CMC约为0.462×10^-5mol/L。与现有市售聚山梨酯80的所测结果无显著差异，证明本发明的增溶性未受成分改变的影响。

荧光检测条件如下：

SpectrumType：EX

ScanRange：300.0nm-360.0nm

EMWavelength：390nm

Slitwidth：EX：3.0nm；EM：3.0nm

4、山梨醇聚氧乙烯油酸酯的载药能力考察

移取4mL多西他赛乙腈溶液(5mg/mL)和4mL本发明产品乙腈溶液(50mg/mL)置圆底烧瓶，与50℃下旋转蒸发除去乙腈，持续20min。得多西他赛-吐温溶液，取所得样品溶液及供试品原品适量，测定其¹H-NMR谱，溶剂为D₂O，频率为300MHz。若药物与辅料在1∶10质量比的溶液中未能对模型药物进行增溶，则核磁谱中应出现药物的特征峰，载药胶束结果见图6；模型药物多西他赛检测结果见图7；本发明产品检测结果见图2。由核磁检测结果可见：本发明具有与普通聚山梨酯80相当的载药能力，在图6中未明显见多西他赛的特征峰。说明药物已经载入胶束中。由该结果进一步证明本发明对原有聚山梨酯80成分的优化并未对其功能性(以增溶能力为主)有所影响。

附图说明：

图1为本发明中所得以山梨醇为母核结构的聚山梨酯80的MALDI-TOF-MS图谱。

图2为本发明中所得以山梨醇为母核结构的聚山梨酯80利用AVANCE300MHz核磁共振仪测定的¹H-NMR图谱。

图3为本发明中所得以山梨醇为母核结构的聚山梨酯80(POS)与以异山梨醇酐为母核结构的聚山梨酯80(POI)直接刺激肥大细胞脱颗粒能力的比较图。

表1为考察本发明溶血性时，配制不同浓度供试品溶液的配制方法。

图4为本发明中所得以山梨醇为母核结构的聚山梨酯80(POS)与以异山梨醇酐为母核结构的聚山梨酯80(POI)的溶血性比较图。

图5为本发明中所得以山梨醇为母核结构的聚山梨酯80的临界胶束浓度(CMC)的测定结果图。

图6为本发明中所得以山梨醇为母核结构的聚山梨酯80的载药能力考察结果图。

图7为模型药物多西他赛的利用AVANCE300MHz核磁共振仪测定的¹H-NMR图谱。

具体实施方式：

下面结合实施例，对本发明的高质量聚山梨酯类的制备并以山梨醇聚氧乙烯油酸酯聚合物(聚山梨酯80)为例对其表征和相关性质进行详细说明：

实施例1

山梨醇和/或山梨坦聚氧乙烯脂肪酸酯的制备

准确称取山梨醇原料(20g，0.11mol)，在约0.47MPa压力和少量H₂SO₄(约1g，0.01mol)催化下，在50℃与月桂酸(27g，0.132mol)反应，得到山梨醇月桂酸酯约30.73g(得率约为76.32％)。在少量NaOCH₃(1.3g，0.02mol)存在下，130-140℃与环氧乙烷(96.8g，2.2mol)反应。得到山梨醇聚氧乙烯月桂酸酯(聚山梨酯20)约68.13g(得率约为53.43％)。

准确称取山梨醇原料(20g，0.11mol)，在约0.47MPa压力和少量H₂SO₄(约1g，0.01mol)催化下，在50℃与棕榈酸(33.8g，0.132mol)反应，得到山梨醇棕榈酸酯约34.32g(得率约为74.28％)。在少量NaOCH₃(1.3g，0.02mol)存在下，130-140℃与环氧乙烷(96.8g，2.2mol)反应。得到山梨醇聚氧乙烯棕榈酸酯(聚山梨酯40)约66.02g(得率约为50.35％)。

准确称取山梨醇原料(20g，0.11mol)，在约0.47MPa压力和少量H₂SO₄(约1g，0.01mol)催化下，在50℃与硬脂酸(37.49g，0.132mol)反应，得到山梨醇硬脂酸酯约34.79g(得率约为70.59％)。在少量NaOCH₃(1.3g，0.02mol)存在下，130-140℃与环氧乙烷(96.8g，2.2mol)反应。得到山梨醇聚氧乙烯硬脂酸酯(聚山梨酯60)约69.32g(得率约为52.68％)。

准确称取山梨醇原料(20g，0.11mol)，在约0.47MPa压力和少量H₂SO₄(约1g，0.01mol)催化下，在50℃与油酸(37.22g，0.132mol)反应，得到山梨醇油酸酯约38.00g(得率约为77.45％)。在少量NaOCH₃(1.3g，0.02mol)存在下，130-140℃与环氧乙烷(96.8g，2.2mol)反应。得到山梨醇聚氧乙烯油酸酯(聚山梨酯80)约74.64g(得率约为55.37％)。

现有聚山梨酯通过色谱法分离纯化后得到，方法如下：

以现有市售吐温80为原料。采用正相硅胶为色谱柱填料，以乙酸乙酯∶丙酮∶水＝53∶36∶11(m/m/m)作为流动相。控制流速为0.5mL/min。准确称取吐温80原料(2.6，0.002mol)，称取硅胶104g(约40倍于上样量)。装柱并沉降过夜。采用干法上样，后以乙酸乙酯∶丙酮∶水的混合液为流动相，20mL收集一馏分。依法处理后可得到本发明。

实施例2

以山梨醇聚氧乙烯油酸酯(聚山梨酯80)为例对本发明聚合物的表征

MALDI-TOF-MS分析取本发明聚山梨酯80样品30μL溶于200μL甲醇并加入一定量氯化钠溶液，配制成待测溶液，选用α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)为基质，基质用混合溶剂乙氰∶水∶三氟乙酸(50∶50∶0.1％)配制成饱和溶液，取1μL样品溶液和1μL基质溶液混合均匀，点样，待自然干燥后送入离子源进行质谱分析，结果见图1。

¹H-NMR分析取本发明聚山梨酯80适量，测定其¹H-NMR谱，溶剂为D₂O，频率为300MHz，结果见图2。

Claims

1.一种聚山梨酯的制备方法，所述聚山梨酯其结构通式如下

式中R＝月桂酸时为聚山梨酯20

R＝棕榈酸时为聚山梨酯40

R＝硬脂酸时为聚山梨酯60

R＝油酸时为聚山梨酯80

所述聚山梨酯，以山梨醇聚氧乙烯脂肪酸酯为主要成分，其中不含或几乎不含以异山梨醇酐为母核的组分

式中R＝月桂酸时为聚山梨酯20

R＝棕榈酸时为聚山梨酯40

R＝硬脂酸时为聚山梨酯60

R＝油酸时为聚山梨酯80

其中环氧乙烷醚化程度不局限于20，脂肪酸酯化程度不局限于单酯，

其特征在于，所述方法步骤如下：称取山梨醇原料，在H₂SO₄催化下，与月桂酸反应，得到山梨醇月桂酸酯，在NaOCH₃存在下，130—140℃与环氧乙烷反应，得到山梨醇聚氧乙烯月桂酸酯；

或

称取山梨醇原料，在H₂SO₄催化下，与棕榈酸反应，得到山梨醇棕榈酸酯，在NaOCH₃存在下，130—140℃与环氧乙烷反应，得到山梨醇聚氧乙烯棕榈酸酯；

或

称取山梨醇原料，在H₂SO₄催化下，与硬脂酸反应，得到山梨醇硬脂酸酯，在NaOCH₃存在下，130—140℃与环氧乙烷反应，得到山梨醇聚氧乙烯硬脂酸酯；

或

称取山梨醇原料，在H₂SO₄催化下，与油酸反应，得到山梨醇油酸酯，在NaOCH₃存在下，130—140℃与环氧乙烷反应，得到山梨醇聚氧乙烯油酸酯。