CN110407897A - 俄色果中枸杞酸的提取方法和检测方法 - Google Patents

俄色果中枸杞酸的提取方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种俄色果提取物，俄色果中枸杞酸的制备方法和检测方法。实验结果证明，本发明成功从俄色果中分离出了枸杞酸，其在俄色果中属于首次发现，因此，枸杞酸可用于俄色果的鉴别和质量控制；还可为俄色果的药效作用的挖掘奠定基础。

Description

俄色果中枸杞酸的提取方法和检测方法
技术领域
本发明涉及俄色果中枸杞酸的提取方法和检测方法。
背景技术
“俄色”又名“瓦多”(藏语)，来源于蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes及花叶海棠Malus tiansitoria(Batal.)Schneid，其果实具有“健胃、降血压，治肝病、腹泻、眼病、月经不调”等作用，为甘孜州藏区民间常用药，具有悠久的药用和食用历史。现代研究表明俄色果含有丰富的维生素C、维生素B2；果糖、葡萄糖、二糖、多糖等；豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等多种脂肪酸及蛋白质等营养成分，但对其理化成分未见较为明确、系统的研究报道。
枸杞酸，英文名：2-O-β-D-Glucopyranosyl-L-ascorbic Acid(AA-2βG)，是一种抗坏血酸的衍生物，易溶于水。枸杞酸在2004年，由日本学者Toyoda-Ono等从宁夏枸杞和北方枸杞的干果中分离纯化得到，是真正意义上源于天然的、稳定的抗坏血酸衍生物，具有与维生素C相当的生物活性，有抗氧化/抗衰老、抗肿瘤发生活性、抗癌细胞的细胞毒性和抗增殖作用、免疫促进、抑制黑素细胞生长，降低细胞黑素合成等作用，在体内具有较高的稳定性，较长的时效和半衰期，因此枸杞酸比较适合作为Vc前体应用于医药、化妆品和食品等领域，其药用价值和商业价值较高。
目前未见俄色果中含有枸杞酸的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种俄色果提取物，俄色果中枸杞酸的制备方法和检测方法。
本发明首先提供了一种俄色果提取物，所述提取物中枸杞酸的含量为80％以上。
进一步地，所述俄色果是指蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malus toringoides及花叶海棠Malus tiansitoria的果实。
进一步地，所述提取物是由下述方法制备得到：
(1)取俄色果，粉碎，水提后，浓缩过滤即得制备液；
(2)取步骤(1)中的制备液，用高效液相色谱制备，采用C18色谱柱，检测波长为235nm，依次以甲醇：0.1％磷酸水＝4:96v/v为洗脱剂，流速0.5～1.0ml/min，进行洗脱，取13-20min的流分即得提取物。
进一步地，步骤(1)中，水提时，所述俄色果与水的质量比为1:10；所述提取为超声提取，提取次数为2次，每次提取时间为1小时。
本发明还提供了一种从俄色果中制备枸杞酸的方法，包括以下步骤：
(1)取俄色果，粉碎，水提后，浓缩过滤即得制备液；
(2)取步骤(1)中的制备液，用高效液相色谱制备，采用C18色谱柱，检测波长为235nm，依次以甲醇：0.1％磷酸水＝4:96v/v为洗脱剂进行洗脱，得样品段；
(3)取步骤(2)所得样品段，再次用高效液相色谱制备精分，得合格段，干燥后即得枸杞酸；
色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸溶液；
洗脱程序：0～15min，1％A；15～25min，1％A→10％A；25～30min，10％A→5％A；30～40min，5％A；40～50min，5％A→1％A；
检测波长：235nm。
进一步地，步骤(1)中，水提时，所述俄色果与水的质量比为1:10；所述提取为超声提取，提取次数为2次，每次提取时间为1小时。
进一步地，步骤(2)中，所述样品段为13-20min的流分，其中枸杞酸含量达到80％以上。
进一步地，步骤(3)中，所述合格段为15-22min的流分，其中枸杞酸含量达到98％以上。
进一步地，步骤(3)中，所述色谱条件中流速为0.5～1.0ml/min。
本发明还提供了一种检测俄色果中枸杞酸含量的HPLC方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取俄色果粉末，水提，过滤即得；
(2)对照品溶液制备：取枸杞酸，加水配制成对照品溶液；
(3)分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中检测；
(4)根据检测结果计算得到俄色果中枸杞酸的含量。
进一步地，色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
和/或，流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液；或流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液；
和/或，洗脱程序：乙腈：0.1％磷酸水＝5:95v/v等度洗脱，时间为35min或甲醇：0.1％磷酸水梯度洗脱，0～15min，1％A；15～25min，1％A→10％A；25～30min，10％A→5％A；30～35min，5％A→1％A；
和/或，检测波长：235nm；
优选地，步骤(1)中，所述提取为超声提取；步骤(3)中，所述色谱条件中流速为0.5～1.0ml/min。
本发明还提供了一种俄色果的质量检测方法或者鉴别方法，所述检测方法包括任选的用于检测枸杞酸的检测方法。
进一步地，所述检测方法包括如下步骤：
1)称取俄色果粉末，水提过滤即得提取液；
2)检测上述提取液中枸杞酸的含量。
进一步地，步骤2)中，所述枸杞酸的含量为0.45％～2.50％时。
进一步地，步骤2)中，所述检测方法包括薄层色谱鉴别法、高效液相色谱鉴别法、气相色谱鉴别法、纸色谱鉴别法、电化学分析法、分光光度法或色谱法。
进一步地，所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
和/或，流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液；或流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液；
和/或，洗脱程序：乙腈：0.1％磷酸水＝5:95v/v等度洗脱，时间为35min；或甲醇：0.1％磷酸梯度洗脱，0～15min，1％A；15～25min，1％A→10％A；25～30min，10％A→5％A；30～35min，5％A→1％A；
和/或，检测波长：235nm。
和/或，流速：0.5～1.0ml/min。
本发明首次在俄色果中发现有枸杞酸的存在，枸杞酸可作为俄色果的指标性成分，用于俄色果的鉴别和质量控制，可为俄色果的药效作用的挖掘奠定基础。本发明还从俄色果中分离纯化得到了高纯度的枸杞酸，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1中制备液的HPLC检测图谱。
图2为实施例1中白色固体的HPLC检测图谱。
图3为实施例1中目标峰的DAD图谱。
图4为实施例1中白色固体的[M-H]-质谱图。
图5为实施例1中白色固体的[M+Na]+质谱图。
图6为实施例1中白色固体的核磁氢谱。
图7为实施例1中白色固体的核磁碳谱。
图8为实施例1中白色固体的HSQC谱。
图9为实施例1中白色固体的HMBC谱。
图10为实施例1中白色固体的COSY谱。
图11为实施例2中枸杞酸对照品标准曲线。
图12为实施例2中枸杞酸对照品HPLC图谱(等度)。
图13为实施例2中俄色果中枸杞酸的HPLC图谱(等度)。
图14为实施例2中枸杞酸对照品HPLC图谱(梯度)。
图15为实施例2中俄色果中枸杞酸的HPLC图谱(梯度)。
具体实施方式
实施例1俄色果提取物的制备
取700g俄色果粉末(过4号筛)，用十倍量的纯水超声提取二次，每次1小时，合并提取液约15L，提取液静置后取上清液50℃浓缩至2L，浓缩液用200-300目硅胶过滤，然后再用0.45μm的微膜过滤作为制备液，
取上述制备液，用高效液相色谱制备，采用C18色谱柱，检测波长为235nm，依次以甲醇：0.1％磷酸水＝4:96v/v为洗脱剂，流速0.5～1.0ml/min,进行洗脱，取13-20min的流分，得俄色果提取物，纯度大于80％，HPLC检测图谱见图1，保留时间为14.727的峰为目标峰。
实施例2、俄色果中枸杞酸的制备方法
将实施例1得到的俄色果提取物作为样品段；
取上述样品段，再次用制备高效液相色谱(色谱柱：ultimate XB-ODS,4.6*250mm,5μm；流动相：A-甲醇B-0.1％磷酸溶液；检测波长：UV-235nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；梯度洗脱程序见下表1)精分，取15-22min的流分得合格段，50℃浓缩拉干，得白色固体粉末，纯度大于98％，HPLC检测图谱见图2。
表1、梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～15 1 99
15～25 1→10 99→90
25～30 10→5 90→95
30～40 5 95
40～50 5→1 95→99
目标峰的DAD扫描图见图3，质谱鉴定见图4、图5，核磁鉴定见图6、图7、图8、图9、图10。
从图3可知，目标峰化合物在235.5nm处为最大吸收，此结果为后续HPLC色谱条件波长的选择提供参考依据。
从图4可知，[M-H]-＝337，从图5可知，[M+Na]+＝361，所以目标物的分子量为338。
1H-NMR(400MHz，MeOD-d4)显示该化合物共有10个氢信号，其中有一个氢信号δH4.82(1H，J＝7.5Hz,d)是葡萄糖端基氢信号,δH 3.69，δH 3.87，δH 3.38-3.41是糖上其它的氢信号，δH 4.92(1H，J＝1.6Hz,d)，δH 3.96(1H，J＝7.0Hz,td)，δH 3.69(2H,m)是维生素C上的氢信号。
13C-NMR(100MHz，D2O)中，该化合物共有12个碳信号，其中
102.2,76.2,75.4,72.8,69.2,60.4为葡萄糖上的碳信号，117.9,163.8位双键上的碳，172.5为羧基碳。61.9,68.9，76.4是连接有羟基的碳信号。
HMBC图谱中4.81与117.9相关，4.92与163.8，172.5,117.9,61.5,102.2相关确定了化合物的连接方式。综合上述信息和文献数据对比鉴定目标峰为枸杞酸。
表2、目标物碳氢归属
实施例3、俄色果提取物及俄色果中枸杞酸的HPLC含量测定
1、药物
采集了17批俄色果实，均采自四川省甘孜州炉霍县，经成都中医药大学李敏教授鉴定为蔷薇科植物变叶海棠Malus toringoides(Rehd.)Hughes和花叶海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid.的干燥成熟果实。
按实施例1制备5批俄色果提取物。
2、试剂试药
纯水；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；磷酸(分析纯)；枸杞酸对照品(购自成都普思生物科技股份有限公司)。
3、实验仪器
KH-500V型超声波清洗器；Agilent technologies 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；SQP电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。
3、检测方法
1)对照品制备
精密称取枸杞酸对照品25.00mg置于25mL容量瓶中，加流动相溶解，并稀释至刻度，配成1.0mg/mL的枸杞酸对照品贮备液。
2)供试品制备
提取物 取适量俄色果提取物粉末，精密称定0.05g，用100ml水溶解。即得。
俄色果 精密称取俄色果粉末(过4号筛)0.5g于50ml具塞锥形瓶中，精密加入纯水25mL，超声处理45min，静置冷却至室温，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
3)色谱条件
条件1色谱柱：Insertsil ODS-3(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A-乙腈 B-0.1％磷酸水；乙腈(A)：0.1％磷酸水(B)＝5:95，检测波长：235nm；进样量10μL；流速：0.5mL/min；等度洗脱。
条件2色谱柱：Insertsil ODS-3(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A-甲醇 B-0.1％磷酸水；检测波长：235nm；进样量10μL；流速：0.5mL/min；梯度洗脱，洗脱梯度见下表3：
表3、梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～15 1 99
15～25 1→10 99→90
25～30 10→5 90→95
30～35 5→1 95→99
4)方法学考察
线性关系考察 分别精密量取1.0mg/mL的枸杞酸对照品贮备液0.31ml,0.63ml,1.2mL,2.5mL,5.0mL和7.5mL置于10mL容量瓶中。用流动相定容，分别制成0.031mg/mL，0.063mg/mL，0.12mg/mL,0.25mg/mL,0.50mg/mL和0.75mg/mL的枸杞酸对照品溶液。各吸取10μL进样，按3)项色谱条件进行色谱分析，检测结果如表4所示。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线(见图11)并进行线性回归，得到枸杞酸的线性方程Y＝11992x+26.335，R2＝0.9999。表明枸杞酸在质量浓度0.031mg/mL～0.75mg/mL范围内线性良好。
表4枸杞酸浓度与峰面积对应关系
精密度考察 对同一份对照品溶液，按3)项色谱条件，连续六次测定枸杞酸峰面积，结果见表5。
表5精密度考察
重复性考察 精密称定同一供试样品细粉6份，每份0.5g，按2)项制备供试品溶液，按3)项色谱条件，测得6份样品的峰面积，结果见表6。
表6重复性考察
稳定性考察 对同一供试品溶液，照3)项下色谱条件，在第0、2、4、6、12、24h内测定样品峰面积，结果见表7。
表7稳定性试验
加样回收率考察 精密称定已知枸杞酸含量的俄色果细粉6份，每份0.25g，精密称定；分别精密加入一定量的枸杞酸对照品，按2)项制备供试品溶液，按3)项色谱条件，测定样品峰面积，并计算回收率，结果见表8。
表8加样回收率试验
方法学考察结果表明，此方法的精密度、重复性、稳定性、回收率RSD值均符合要求，说明此俄色果中枸杞酸含量测定方法稳定、可靠。
5)含量测定
1)俄色果提取物
按2)项制备俄色果提取物溶液，按3)项色谱条件，对俄色果提取物进行枸杞酸含量检测，含量测定结果见表9。
表9俄色果提取物中枸杞酸的含量测定
结果表明，俄色果粗提物中枸杞酸含量在83.28％～89.15％之间。
2)俄色果
按2)项下制备供试品溶液，按3)项下的色谱条件，对俄色果进行枸杞酸含量检测，结果见图12～15、表10。
表10俄色果中枸杞酸的检测结果
上述结果表明，俄色果正品中均含有枸杞酸，可以用于与伪品的鉴别，以控制俄色果的质量。
综上，本发明成功从俄色果中分离出了枸杞酸，其在俄色果中属于首次发现，因此，枸杞酸可用于俄色果的鉴别和质量控制；还可为俄色果的药效作用的挖掘奠定基础。

Claims (17)

1.一种俄色果提取物，其特征在于：所述提取物中枸杞酸的含量为80％以上。
2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：所述俄色果是指蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malus toringoides及花叶海棠Malus tiansitoria的果实。
3.根据权利要求1或2所述的提取物，其特征在于：所述提取物是由下述方法制备得到：
(1)取俄色果，粉碎，水提后，浓缩过滤即得制备液；
(2)取步骤(1)中的制备液，用高效液相色谱制备，采用C18色谱柱，检测波长为235nm，依次以甲醇：0.1％磷酸水＝4:96v/v为洗脱剂进行洗脱，取13-20min的流分即得提取物。
4.根据权利要求3所述的提取物，其特征在于：步骤(1)中，水提时，所述俄色果与水的质量比为1:10；所述提取为超声提取，提取次数为2次，每次提取时间为1小时。
5.根据权利要求3所述的提取物，其特征在于：步骤(2)中，洗脱速度为：0.5～1.0ml/min。
6.一种从俄色果中制备枸杞酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)取俄色果，粉碎，水提后，浓缩过滤即得制备液；
2)取步骤(1)中的制备液，用高效液相色谱制备，采用C18色谱柱，检测波长为235nm，依次以甲醇：0.1％磷酸水＝4:96v/v为洗脱剂进行洗脱，得样品段；
3)取步骤2)所得样品段，用高效液相色谱精分，得合格段，干燥后即得枸杞酸；
色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸溶液；
洗脱程序：0～15min，1％A；15～25min，1％A→10％A；25～30min，10％A→5％A；30～40min，5％A；40～50min，5％A→1％A；
检测波长：235nm。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤1)中，水提时，所述俄色果与水的质量比为1:10；所述提取为超声提取，提取次数为2次，每次提取时间为1小时。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述样品段为13-20min的流分，其中枸杞酸含量达到80％以上。
9.根据权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述合格段为15-22min的流分，其中枸杞酸含量达到98％以上。
10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述色谱条件中流速为0.5～1.0ml/min。
11.一种检测俄色果中枸杞酸含量的HPLC方法，其特征在于：包括以下步骤：
(a)供试品溶液制备：取俄色果粉末，水提，过滤即得；
(b)对照品溶液制备：取枸杞酸，加水配制成对照品溶液；
(c)分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中检测；
(d)根据检测结果计算得到俄色果中枸杞酸的含量。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
和/或，流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液；或流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液；
和/或，洗脱程序：乙腈：0.1％磷酸水＝5:95v/v等度洗脱，时间为35min或甲醇：0.1％磷酸水梯度洗脱，0～15min，1％A；15～25min，1％A→10％A；25～30min，10％A→5％A；30～35min，5％A→1％A；
和/或，检测波长：235nm；
优选地，步骤(a)中，所述提取为超声提取；步骤(c)中，所述色谱条件中流速为0.5～1.0ml/min。
13.一种俄色果的质量检测方法或者鉴别方法，其特征在于：所述检测方法包括任选的用于检测枸杞酸的检测方法。
14.根据权利要求13所述的检测方法或者鉴别方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：
1)称取俄色果粉末，水提过滤即得提取液；
2)检测上述提取液中枸杞酸的含量。
15.根据权利要求14所述的检测方法或者鉴别方法，其特征在于：步骤2)中，所述枸杞酸的含量为0.45％～2.50％。
16.根据权利要求15所述的检测方法或者鉴别方法，其特征在于：步骤2)中，所述检测方法包括薄层色谱鉴别法、高效液相色谱鉴别法、气相色谱鉴别法、纸色谱鉴别法、电化学分析法、分光光度法或色谱法。
17.根据权利要求16所述的检测方法或者鉴别方法，其特征在于：所述高效液相色谱法的色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
和/或，流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液；或流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液；
和/或，洗脱程序：乙腈：0.1％磷酸水＝5:95v/v等度洗脱，时间为35min；或甲醇：0.1％磷酸水梯度洗脱，0～15min，1％A；15～25min，1％A→10％A；25～30min，10％A→5％A；30～35min，5％A→1％A；
和/或，检测波长：235nm；
和/或，流速：0.5～1.0ml/min。
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