CN105878449A

CN105878449A - 俄色果及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途

Info

Publication number: CN105878449A
Application number: CN201610379950.9A
Authority: CN
Inventors: 李敏; 周海玉; 曾俊
Original assignee: 李敏
Current assignee: SICHUAN ZHIJIACHENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2016-03-23
Filing date: 2016-05-30
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2036-05-30
Also published as: CN105878449B

Abstract

本发明公开了俄色果及提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。本发明还提供了新的俄色果的提取物。本发明俄色果及提取物用于保肝药效明确，可控，为临床提供了一种新的选择。

Description

俄色果及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途

技术领域

本发明涉及俄色果及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。属药物领域。

背景技术

“俄色叶”(藏语)是甘孜州藏族自治州藏族民间的一味习用药材，来源于蔷薇科植物变叶海棠Malus toringoides(Rehd.)Hughes.和花叶海棠Malus tiansitoria(Batal.)Schneid.的干燥叶，通常也简称“俄色”，现有大量研究也是针对俄色叶作的研究。

俄色果来源为上述同种植物的干燥成熟果实，在藏区的食用历史悠久，但对俄色果的现代研究却很少。

发明内容

本发明的技术方案是提供了俄色果或及提取物的新用途。

本发明提供了俄色果及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。

其中，所述的俄色果来源于蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malus toringoides(Rehd.)Hughes.和花叶海棠Malus transitoria(Batal.)Schneid.的干燥成熟果实。

优选地，所述的俄色果的提取物为水提取物。优选地，所述俄色果的水提取物是由下述方法制备：取俄色果，用水加热回流提取，即可。进一步优选地，所述俄色果的水提取物是由下述方法制备：俄色果实粉末(过三号筛)，20倍体积水，加热回流提取3次，每次2h，合并滤液，即可。

优选地，所述的俄色果的提取物为乙酸乙酯提取物。优选地，所述俄色果的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备：取俄色果，用95％乙醇回流提取；乙醇部位浸膏加水分散，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取溶剂，除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物。进一步优选地，所述俄色果的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备：取俄色果，粉碎，提取3次，分别加20倍95％的乙醇加热回流提取，过滤，收集续滤液，减压回收，得乙醇部位浸膏；将乙醇部位浸膏以水溶解，然后加入两倍石油醚(60～90)萃取至石油醚无色，再加入2倍乙酸乙酯反复萃取，直至乙酸乙酯溶液无色，合并乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂后得乙酸乙酯提取物。

其中，所述保肝的药物或保健食品是治疗和/或预防化学性肝损伤和/或物理性肝损伤的药物或保健食品。其中，所述化学性肝损伤是化学毒物、酒精、药物引起的肝损伤。其中，所述肝损伤是CCl₄、酒精、氨基半乳糖等引起的肝损伤。其中，所述肝损伤是急性酒精性肝损伤。

其中，所述保肝的药物或保健食品是治疗和/或预防急性肝损伤和/或慢性肝损伤的药物或保健食品。其中，所述肝损伤是硫代乙酰胺、对刀豆蛋白A、乙酰氨基酚、脂多糖、四环素、α-萘异硫氰酸酯等引起的肝损伤。

本发明还提供了一种俄色果提取物，它是俄色果的乙酸乙酯提取物，由下述方法制备：取俄色果，用95％乙醇回流提取；乙醇部位浸膏加水分散，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取溶剂，除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物。

优选地，所述俄色果的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备：取俄色果，粉碎，提取3次，分别加20倍95％的乙醇加热回流提取，过滤，收集续滤液，减压回收，得乙醇部位浸膏；将乙醇部位浸膏以水溶解，然后加入两倍石油醚(60～90)萃取至石油醚无色，再加入2倍乙酸乙酯反复萃取，直至乙酸乙酯溶液无色，合并乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂后得乙酸乙酯提取物。

本发明还提供了一种俄色果提取物，它是俄色果的水提取物，由下述方法制备：取俄色果，用水加热回流提取，即可。

优选地，所述俄色果的水提取物是由下述方法制备：俄色果实粉末(过三号筛)，20倍体积水，加热回流提取3次，每次2h，合并滤液，即可。

本发明俄色果或及提取物具有良好的保肝作用，对酒精性肝损伤和CCl₄导致酒精性肝损伤的预防和治疗作用明确，为临床提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠小鼠肝组织病理学的影响(HE，×100)。A.正常对照组 B.模型组 C.联苯双酯组 D.俄色果低剂量组E.俄色果中剂量组 F.俄色果高剂量组；

图2各组细胞形态观察(×200)

A.正常对照组 B.模型组 C.联苯双酯组 D.俄色果低剂量组E.俄色果中剂量组F.俄色果高剂量组；

具体实施方式

实验例1 藏药“俄色果”对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用及其机制

1 材料与仪器

1.1 实验动物 SPF级雄性昆明小鼠，体质量18～22g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物质量合格证号：SCXK(川)2013-24。

1.2 药物与试剂俄色果由四川省炉霍县雪域俄色有限公司提供，经成都中医药大学中药鉴定学李敏教授鉴定为蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malus toringoides(Rehd.)Hughes.和花叶海棠Malus transitoria(Batal.)Schneid.的干燥成熟果实；联苯双酯滴丸为浙江万邦药业股份有限公司产品，批号：A02140302；丙氨酸氨基转移酶(ALT)测试盒、门冬氨酸氨基转移酶(AST)测试盒、甘油三酯(TG)试剂盒、低密度脂蛋白(LDL-C)测试盒均为南京建成工程研究所提供，批号分别为20150420、20150420、20150521、20150417；丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)Elisa测试盒均由为Abcam公司产品，批号分别为Rm0739XL、Rm1377XL、Rm0149XL；其余为分析纯。

1.3主要仪器多功能酶标仪(美国，Thermo赛默飞世尔仪器有限公司，型号：Mk3)；电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司，型号：DZKW-4)；冷冻离心机(美国，BEICKMANCOULTER公司，型号：X-22R)；电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：SQP)；数码三目摄像显微镜(厦门，麦克奥迪实业集团有限公司，型号：BA400Digital)。

2 方法

2.1 本发明俄色果提取物的制备取俄色果实粉末(过三号筛)，20倍体积水，加热回流提取3次，每次2h，合并滤液，浓缩成含生药0.5g/mL的药液。临用前稀释成不同浓度。

2.2 动物分组、造模及给药取小鼠60只，适应性喂养4d后，按体质量随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，联苯双酯阳性对照组(150mg/kg)及本发明俄色果提取物低、中、高剂量组分别灌胃俄色果提取物0.6、1.2、2.4g/kg(生药量)。各组小鼠灌胃体积为20mL/kg，正常对照组和模型组灌胃等体积生理盐水，连续30d，灌胃后自由饮食。实验至第31天，给予受试样品结束时将模型组及各给药组一次性灌胃12mL/kg的50％体积分数的乙醇溶液，正常对照组给予蒸馏水。

2.3 指标检测末次灌胃后，禁食不禁水16h。去除死亡小鼠，按原先给药顺序各组取8只小鼠摘眼球采血，分离血清，备测；颈椎脱臼处死小鼠，取肝、脾、肾脏并称质量，计算各脏器指数；观察肝组织的病理形态学变化；准确称取肝脏相同部位约0.2g，以1∶9(m/V)的生理盐水制成肝组织匀浆，分别测定肝组织中MDA含量和SOD、GSH-Px活性。另所有小鼠均取左叶肝组织，用4％多聚甲醛固定液固定，制备切片，HE染色，对肝组织切片进行病理学检查。取备血清适量测定其ALT、AST酶活性，TG和LDL-C含量。

2.4 统计学处理实验数据均以表示，采用SPSS19.0统计软件分析，组间均数比较采用单因数方差进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠一般情况及死亡率的影响

灌胃50％的乙醇染毒后，小鼠多先表现为兴奋状态，继而行走不稳，四肢瘫软，后重者嗜睡、醉倒、呼吸急促、抽搐。12h后，模型组小鼠普遍状态不好，精神萎靡不振，毛色干枯无光泽，活动减少。由表1可知，除正常对照组和本发明俄色果提取物中剂量组外，每组皆有小鼠死亡。与模型组相比，阳性对照组、俄色果各剂量组小鼠对酒精所致急性肝损伤死亡时间有所延长，死亡数有所减少，精神状态和毛色、光泽有着显著改善。其中俄色果提取物1.2g/kg组在延长死亡时间和减少死亡数量上都优于联苯双酯组，其次死亡率：本发明俄色果提取物中剂量组＜联苯双酯组≈本发明俄色果提取物低剂量组＜本发明俄色果提取物高剂量组＜模型组。

表1 俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠一般情况及死亡率的影响(n＝13)

3.2 俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏、肾脏和脾脏指数的影响

本发明俄色果提取物各剂量组对小鼠肝指数影响无统计学意义。由表2可知，与正常对照组比较，模型组肝、肾指数明显升高；与模型组比较，联苯双酯组显著下降(P＜0.5)，俄色果各剂量组有不同程度下降，但无显著性。与模型组比较，联苯双酯组、俄色果各剂量组脾脏指数无统计学意义。

表2 俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏、肾脏和脾脏指数的影响(g/100g，n＝8)

注：组与正常对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01

3.3 俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠肝功能和血脂水平的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT、TG显著升高(P＜0.01)，AST也呈升高趋势(P＜0.05)，LDL-C显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组血清ALT、TG、LDL-C均明显下降(P＜0.05)，AST有不同程度下降，结果见表3。

表3 俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠肝功能和血脂水平的影响(n＝8)

3.4 俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠MDA含量显著升高(P＜0.01)，SOD、GSH-Px显著下降(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组均能显著降低小鼠肝组织中MDA含量(P＜0.01)；能不同程度增强SOD活性(P＜0.05)；对GSH-Px活性变化无统计学意义，但大部分值都高于模型组值。结果见表4。

表4俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影响(n＝8)

3.5 俄色果对急性酒精性肝损伤小鼠小鼠肝组织病理学的影响

正常对照组小鼠肝脏组织外观红褐色，质软富弹性；模型小鼠肝脏质地弹性较弱，色泽相对灰暗，体积增大，其余各给药组外观较模型好。从肝组织切片的病理学检查可知，正常对照组肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，胞质均匀，未见增生及假小叶形成，小叶中央静脉未见淤血，肝细胞未见变性及坏死，未见各类细胞浸润；模型组小鼠大部分肝小叶结构基本完整，肝细胞出现水肿、肝细胞局灶状坏死主要分布在肝小叶周边(按血液灌流方向主要分布于3区)，偶见脂肪变性，肝窦间及汇管区周围可见炎细胞浸润。联苯双酯组及俄色果提取物各剂量组肝细胞结构恢复正常，少部分肝细胞可见水肿及少许炎细胞浸润。病理图片见图1。

4 讨论

在人们生活水平的不断提高下，酒精的滥用和依赖在当今社会公共卫生问题中日益凸显。与酒精相关的疾病急剧增加。乙醇在肝脏内经乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶氧化代谢成乙酸。机体正常情况下相对完善的抗氧化系统包括SOD、GSH、维生素类等抗氧化系统，可对机体产生保护作用。过量酒精的摄入会使肝脏受到不同程度的损伤。机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧酸循环产生障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢。且大量的自由基将会导致肝细胞脂质过氧化反应，引起肝细胞的损伤。从而导致清除自由基的酶消耗增加，肝代谢紊乱以及脂肪在肝细胞内沉积，导致肝细胞损伤及坏死。

实验结果显示，乙醇诱导小鼠急性肝损伤模型组小鼠较正常组血清ALT、TG、HDL-C明显升高，AST有一定的上升趋势，模型组较正常对照组小鼠肝组织中的MDA含量升高，SOD、GSH-Px显著降低，而俄色果各给药组均能明显降低血清中ALT、TG、LDL-C及AST；能明显降低肝组织中MDA，不同程度增加SOD、GSH-Px活性，表明俄色果能增强乙醇所致的小鼠肝活性氧和脂质过氧化产物的清除能力，从而保护肝脏。病理切片观察到模型组小鼠部分细胞水肿变性、炎性细胞和坏死，说明酒精对小鼠肝功能、脂质代谢和肝细胞有损害作用，俄色果各给药组能减少病理组织切片中细胞的水肿、炎性细胞的产生。实验结果表明俄色对酒精性急性肝损伤有一定的保护作用，但俄色果提取物0.6g/kg，1.24g/kg，2.4g/kg三者的药效作用强度未呈现出一定的剂量依赖关系。其防治作用机制可能是通过调节肝功能、改善肝脏脂质蓄积以及增强抗氧化能力来完成的。

实验结果说明，本发明俄色果及其水提取物可以有效护肝，预防和治疗酒精性肝损伤。

实验例2 “俄色果”对CCl4诱导的HL7702细胞损伤的保护作用研究

本部分通过观察俄色果对体外CCl4诱导的人源性正常肝HL7702细胞损伤的影响，以联苯双酯为阳性对照，拟通过测定体外培养HL7702细胞培养上清液中ALT、AST、LDH的水平和细胞中MDA、SOD、GSH的水平，观察药物对CCl4诱导损伤的HL7702细胞的影响。并进一步认识俄色果对不同肝损伤的保护作用，同时探究其保肝作用机理。

1实验材料

1.1供试材料

实验材料由四川省炉霍县雪域俄色有限公司提供，经成都中医药大学中药鉴定学李敏教授鉴定为蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.和花叶海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid.的干燥成熟果实。联苯双酯(DDB)滴丸由浙江万邦药业股份有限公司生产，批号：A02140302。

1.2细胞株

人肝细胞HL-7702：购于上海复祥生物科技有限公司

1.3主要试剂

CCl₄：成都市科龙化工试剂厂

MTT：美国Sigma公司，以磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)配成5mg/mL的储备液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存，每月新鲜配制

RPMI 1640培养基：购自HyClone公司，批号：NAG1432。配成含10％胎牛血清(含青霉素钠、硫酸链霉素各10000u.L-1)的完全培养基

双抗(青霉素(10，000IU)和链霉素(10，000μg/mL)：美国Hyclone公司。

胎牛血清(FBS)：购自兰州民海生物科技有限公司，批号：20121213

胰蛋白酶(Trypsin)：购自美国GIBCO公司，批号：SH40003.1

二甲基亚砜(DMSO)：购自Sigma公司

谷丙转氨酶(ALT/GPT)试剂盒(赖氏法)，批号：20150820

谷草转氨酶(AST/GOP)试剂盒(赖氏法)，批号：20150819

乳酸脱氢酶(LDH)测试盒，批号：20150818

超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(WST法)，批号：20150820

微量还原型谷胱甘肽(GSH)测试盒，批号：20150825

总蛋白试剂盒(考马斯亮蓝法)，批号：20150320

试剂盒均购置于南京建成生物工程研究所

1.4主要仪器

SANYO型CO2培养箱

酶标仪：Mk3多功能酶标仪，赛默飞世尔仪器有限公司生产

SHHW21-600电子恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司

电子天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司

OLYMPUS-CK40倒置显微镜

D-37520Ostercde离心机

脱色摇床：江苏南达生物技术开发公司

干燥箱：上海福玛实验设备有限公司

超纯水仪：Millipore公司生产

手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，型号：SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂生产

1.5溶液的配制

CCl₄溶液的配制 CCl₄原液2.41mL与DMSO 2.59mL，配成5mol.L-1的CCl₄母液，分装，避光，常温保存。试验前一天，以不含血清的RPMI1640培养液配成浓度为5、10、15mmol.L^-1的CCl₄溶液。

2实验设计

2.1供试样品的制备和浓度设定

取俄色果干燥粉末100g，提取3次，分别加20倍95％的乙醇加热回流提取，过滤，收集续滤液，减压回收，得乙醇部位浸膏。将乙醇部位浸膏以水溶解，然后加入两倍石油醚(60～90)萃取至石油醚无色，再加入2倍乙酸乙酯反复萃取，直至乙酸乙酯溶液无色，合并乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂，得部位浸膏，减压浓缩，干燥得到俄色果提取物。联苯双酯直接配成应用液。

准确称取各样品，用RPMI1640培养液溶解，配成不同浓度的应用液。反复除菌过滤，分装至无菌小瓶密封保存至4℃冰箱备用。

表5组别及浓度

组别	药物浓度(μg/ml)
		正常对照组(Control)	－
模型组(Model)	－
		联苯双酯组(DDB)	5
俄色果低剂量(G-L)	1
		俄色果中剂量(G-M)	10
俄色果高剂量(G-H)	100

2.2 HL7702细胞培养、传代、冻存、复苏

2.2.1细胞的培养

采用25cm²的细胞培养瓶对HL7702细胞进行培养，置于5％CO₂，37℃细胞培养箱中，以含10％的灭火FBS RPME1640培养基进行常规培养。倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，依据其生长状态，每1～2天换入新鲜培养液一次，于无菌操作台中进行实验操作。

2.2.2细胞的传代

当通过倒置显微镜观察到HL7702细胞长满或接近长满瓶底时，在无菌超净工作台中，弃去旧培养液，PBS润洗1～2次后，加入0.25％胰酶1～2mL对细胞进行消化，约2～3分钟后，轻晃培养瓶，使细胞充分消化，当显微镜下观察到细胞变圆，间隙变大，细胞完全脱壁后，立即加入预温的完全培养基对消化进行终止。吹打细胞悬液以使细胞单个散在，按1传2或1传3的比例，转移部分悬液至新的培养瓶中，吸入3～4mL新鲜完全培养基,放入细胞培养箱中传代培养，约2～3天传代一次。

2.2.3细胞的冻存

取处于对数生长期的HL7702细胞(前一天换入新鲜培养基)，弃去细胞培养基，按2.2.2.2.2中的消化方法进行消化，1000rpm/min离心5min，弃去上清液，加入细胞冻存液(DMSO：完全培养基＝1：9)，吹打细胞悬液使其混匀，并将悬液转移至细胞冻存管中，然后梯度降温，4℃2h，-20℃2h，最后-70℃过夜放入液氮罐中保存。

2.2.4细胞的复苏

迅速从液氮罐中取出HL7702细胞冻存管，放入37℃恒温水浴锅内融化成悬液，然后在无菌超净工作台中进行操作，将细胞悬液转移至离心管中，放入10倍培养基，混匀后1000rpm/min离心5min，弃去上清液，重复操作一次，加入培养基4～5mL，吸至培养瓶中，细胞培养箱内培养。

2.3CCl₄诱导HL7702细胞损伤模型的建立

通过正交试验设计，选取两因素三水平确定细胞损伤模型。A-CCl₄损伤时间(h)；B-CCl₄浓度(mmol/L)。依据L₉(3⁴)正交表展开试验。在96孔培养板中加入1×10⁵个/mL细胞悬液，毎孔100μL。待细胞贴壁完全后，吸去旧培养液，试验孔分别加入相应的含CCl₄mmol/L无血清培养基100μL，每组4孔，正常对照孔加入含0.1％DMSO的无血清培养液100μL。培养箱中孵育相应的时间后，毎孔加入5mg/mL MTT 20μL，培养4h，吸弃上清液，毎孔加入150μLDMSO，摇床上振摇10min。酶标仪490nm波长处测定各孔OD值，按下列公式计算肝细胞的存活率：

存活率(％)＝实验组A_490nm/正常对照组A_490nm*100％，以确定CCl₄对肝细胞的损伤条件。

表6正交实验因素和水平

		因素
			水平	A	B
1	2	5
			2	4	10
3	6	15

2.4MTT法的基本原理

MTT(四甲基偶氮唑溴盐)为一种黄色染料，通过接受氢离子参与到活细胞线粒体的呼吸链中。MTT的四氮唑在细胞色素和琥珀酸脱氢酶的作用下开裂，生成的结晶为甲臜(formazan)，呈兰紫色。甲臜的生成量与存活细胞数量成正相关，而死细胞不能还原MTT，不呈现兰紫色。甲臜结晶溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，因此，在酶标仪490nm处测定溶液的OD值，OD值与所产生的甲臜结晶量成正比，从而对药物的细胞增殖作用进行评价。

2.5俄色果对正常HL7702细胞增殖的影响

采用MTT法观察供试样品单独应用时对HL7702细胞活性的影响。取对数生长期细胞，加培养基混匀，以1×10⁵/ml密度接种于96孔板，每孔100μL。待细胞完全贴壁后，实验孔加入各组药物100μL，每组设3个重复孔，并设正常对照组(加入含0.1％DMSO的无血清培养液100μL)。培养箱中孵育24h后，毎孔加5mg/mL MTT 20μL，培养4h，吸弃上清液，毎孔加入150μL DMSO，摇床上振摇10min。在酶标仪490nm波长处测定各孔OD值。

2.6俄色果对CCl₄损伤HL7702细胞上清液ALT、AST、LDH水平的影响

取对数生长期细胞，加培养基混匀，以1×10⁶/ml密度接种于24孔板，每孔300μL，培养12h，待细胞完全贴壁后，实验孔加入不同浓度药物200μL，每组设6个重复孔，并设正常对照组。培养箱中孵育24h后，吸弃上清液，毎孔加入10mmol/L的CCl₄溶液100uL，孵育6h后，取培养上清液，按试剂盒说明书测定ALT、AST、LDH值。

2.7俄色果对CCl₄损伤HL7702细胞MDA、SOD、GSH水平的影响

取对数生长期细胞，加培养基混匀，以1×10⁶/ml密度接种于24孔板，每孔300μL，培养12h，待细胞完全贴壁后，各实验孔加入各组药物200μL，每组设6个重复孔，并设正常对照组。培养箱中孵育24h后，吸弃上清液，毎孔加入10mmol/L的CCl₄ 100ul孵育6h后，收集细胞，用PBS稀释到一定浓度，超声破粹处理后，按试剂盒说明书测定MDA、SOD、GSH各指标值。

2.8俄色果对HL7702细胞形态学的影响

细胞分组(各组细胞数基本相同)：正常对照组，加入等容积培养液；CCl₄模型组，常规培养24h后，加入10mmol·L-1的CCl₄溶液培养6h。其余各药物保护组加入相应浓度的药物预处理24h后，再加入10mmol·L-1的CCl₄溶液培养6h，于37℃、5％CO2培养箱中培养。经预处理后，更换为含CCl₄的无血清培养液，继续培养6h。倒置显微镜下观察、记录，并对各组细胞形态学变化进行拍照。

2.9统计学处理

采用SPSS19.0软件进行分析，实验结果以“平均值±标准差”表示，组间采用单因素方差分析，采用LSD法进行两两比较。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

3实验结果

3.1CCl₄诱导的HL7702细胞损伤模型的建立

按L₉(3⁴)正交表进行实验，计算细胞存活率，不同浓度CCl₄作用不同时间后HL7702细胞存活率见表7。方差结果见表8。结果显示：CCl₄浓度对HL7702细胞活力影响较大，作用时间次之。实验选用细胞存活率在60％左右的组合：A3B2，因此本实验以10mmol.L^-1CCl₄损伤HL7702细胞6h为最佳损伤模型。

表7不同浓度CCl₄作用不同时间后HL7702细胞存活率(n＝3)

表8方差分析表

3.2俄色果对正常HL7702细胞活性的影响

表9各给药组对HL7702细胞增殖作用的影响(n＝3)

组别	药物浓度(μg/ml)	平均OD值
			Control	－	0.514
G-L	1	0.528
			G-M	10	0.539
G-H	100	0.517

由表9可知，不同剂量的俄色果与HL7702细胞共同孵育24h，基本表现出明显的促进HL7702细胞增殖作用。结果显示俄色果能增加正常肝细胞的细胞活力。并对HL7702细胞无毒性作用。

3.3俄色果对CCl4引起的LDH、AST、ALT水平变化的影响

表10各组细胞上清液中LDH、AST、ALT含量变化的影响(n＝6)

组别	药物浓度(μg/ml)	LDH(U/L)	AST(U/L)	ALT(U/L)
					Control	－	470.53±6.57	14.39±2.52	4.74±2.06
Model	－	570.97±77.91^**	28.84±1.39^**	14.81±4.80^**
					DDB	5	471.58±6.57^##	13.85±2.76^##	8.71±3.91^##
PCP	10	536.25±50.98	17.28±7.52^##	5.23±3.54^##
					G-L	1	427.87±18.01^##	23.21±6.88	9.60±1.86^##
G-M	10	443.61±15.10^##	18.73±10.36^##	6.34±1.75^##
					G-H	100	449.01±15.97^##	12.79±5.25^##	7.63±4.30^##

注：与正常对照组比较：**p<0.01，*p<0.05；与模型组比较：##p<0.01，#p<0.05

实验采用CCl₄诱导肝细胞损伤后，细胞通过代谢将CCl₄转化为三氯甲基、氯自由基等，与肝细胞膜、肝细胞器膜、细胞线粒体等结合，致使细胞损伤，产生脂质过氧化反应，LDH、AST、ALT等酶的活力增加，又因细胞膜的通透性增大，导致各种酶大量进入细胞培养上清液。因此测定细胞损伤后释放到上清液中的LDH、AST、ALT含量，是评价肝细胞损伤的常用指标。

由表10可知，与正常组相比，模型组的LDH、AST、ALT含量显著增加(P<0.01)，说明细胞在CCl₄的作用下，肝细胞膜、细胞器等受到损害。实验造模成功。

3.3.1俄色果对CCl4引起的LDH活性的影响

在CCl₄诱导损伤6h后，各组HL7702细胞培养上清液中LDH值产生变化。由表3可知：与模型组比较，俄色果各组均能显著降低HL7702细胞损伤后的LDH泄露量(P<0.01)，且与正常对照组无显著差异(P>0.05)。提示：俄色果可能通过降低HL7702细胞的损伤，减少LDH的泄露量，起到良好的肝脏保护的作用。

3.3.2俄色果对CCl4引起的AST活性的影响

在CCl₄诱导损伤6h后，各组HL7702细胞培养上清液中AST值产生变化。由表3可知：与模型组比较，俄色果的中高剂量组均能显著降低AST值，起到降低肝细胞损伤的作用。提示：俄色果具有一定的保护肝脏的作用。

3.3.3俄色果对CCl4引起的ALT活性的影响

由表3可知，在CCl₄诱导损伤6h后，各组HL7702细胞培养上清液中ALT值产生变化。与模型组比较，俄色果各剂量组均能显著降低ALT值(P<0.01)。

2.3.4俄色果对CCl4引起的HL7702细胞SOD、MDA、GSH的影响

表4各组细胞内SOD、MDA、GSH变化的影响(n＝6)

组别	μg/ml	SOD(U/gprot)	GSH(μmol/gprot)	MDA(pmol/mL)
					Control	－	143.31±25.19	439.02±41.57	90.71±5.27
Model	－	65.66±8.36**	257.50±15.66**	115.86±1.94**
					DDB	5	110.6±15.32^##	411.69±6.69^##	94.6±3.46^##
G-L	1	129.58±33.45^##	416.81±33.09^##	98.19±8.17^##
					G-M	10	119.09±11.33^##	344.26±44.25^##	93.38±7.11^##
G-H	100	108.85±12.76^##	345.04±39.71^##	94.41±7.20^##

在CCl₄诱导损伤肝细胞后，细胞通过代谢将CCl4转化为大量的三氯甲基、氯自由基等，严重超出机体本身的清除能力，其次肝细胞的脂质过氧化反应加重，产生大量的MDA。肝脏细胞中的抗氧化酶：SOD、GSH等可与自由基进行氧化反应，中和自由基的数量，导致细胞自身酶活性也降低，因此MDA、SOD、GSH的变化程度可反应肝脏的受损程度。

由表4可知，在CCl4诱导损伤HL7702细胞6h后，与正常对照组相比，模型组细胞MDA含量显著增加(P<0.01)，SOD、GSH活性显著降低(P<0.01)，说明细胞在CCl4的作用下受到损伤。

3.4.1俄色果对CCl4引起的HL7702细胞SOD的影响

由表4可知，与模型组相比，各给药组能显著升高CCl₄诱导损伤的HL7702细胞中SOD活性(P<0.05)，清除多余自由基，降低细胞的脂质过氧化程度，说明俄色果对肝脏有一定的保护作用。

3.4.2俄色果、根皮苷、根皮素、俄色果对CCl4引起的HL7702细胞GSH的影响

由表4可知，HL7702细胞在CCl₄诱导损伤6h后，与模型组相比，各给药组能显著升高细胞中的GSH(P<0.01)活力，降低细胞的脂质过氧化程度，说明俄色果对恢复CCl₄引起的HL7702细胞GSH含量有良好的效果，具有较好的肝脏保护作用。

2.3.4.3俄色果对CCl4引起的HL7702细胞MDA的影响

由表4可知，HL7702细胞在CCl₄诱导损伤6h后，与模型组相比，各给药组能显著降低CCl₄引起的HL7702细胞MDA含量(P<0.01)，降低细胞膜脂质过氧化水平，减少细胞损伤。提示：果实对降低CCl₄引起的HL7702细胞MDA有良好的效果；具有一定的肝脏保护作用。

3.5俄色果、根皮苷、根皮素、俄色果对HL7702细胞形态学的影响

实验结果表明，正常对照组呈多边形上皮样细胞生长(如图2A)，与正常对照组相比，HL7702肝细胞经10mmol.L-1CCl₄损伤6h后细胞存活率显著降低，模型组细胞间隔变宽(如图2B)，部分细胞脱落、悬浮，皱缩，扁圆。给药组细胞形态多恢复，呈多边形样，但细胞间隙仍明显变大(如H-2，I-3)。以上结果说明，俄色果对CCl₄诱导的肝细胞形态变化有较好的恢复作用。

2.3讨论

人源性HL7702肝细胞是目前肝脏研究中常用的模型。四氯化碳(CCl₄)是典型的肝脏毒物之一，可经口、鼻进入体内，对肝脏、黏膜等均有损伤。因此，实验采用CCl₄诱导体外培养的HL7702肝细胞损伤模型，能较为贴近的体现人体肝损伤。

实验造模方法采用正交试验设计，并对试验结果进行方差统计分析，得出最优造模方法。本实验确立了CCl₄10mmol.L^-1诱导损伤HL7702细胞6h作为实验模型。

本实验通过MTT法测定俄色果单独应用时对HL7702细胞的活力的作用，实验结果说明体外应用俄色果无细胞毒作用。

肝脏是物质代谢的中心，当肝脏受到损伤时，物质代谢就会变得紊乱，肝脏中的酶等受到影响，血液中的酶也因此产生变化。CCl₄在细胞中代谢产生-O^- ₂、-CCl^- ₃、-OH等自由基与细胞膜产生脂质过氧化、氧化应激等反应，导致肝细胞损伤或死亡，细胞膜通透性改变，胞内、血清中转氨酶(ALT、AST)、乳酸脱氢酶(LDH)升高，抗氧化酶(GSH、SOD)大量消耗，脂质过氧化产物丙二醛(MDA)急剧增加。因此，测定细胞培养上清液和细胞匀浆中的相应指标即可评价肝损伤的程度。

本实验使用低、中、高不同浓度的俄色果进行细胞的预处理，12h后添加10mmol.L^- ¹CCl₄损伤细胞后，实验结果发现，各给药组细胞培养上清液中LDH、ALT、AST活性显著降低(P<0.05)；各给药组细胞中抗氧化酶SOD(P<0.01)、GSH(P<0.05)活性显著升高，细胞脂质氧化产物MDA含量(P<0.01)显著减少，说明预给药组的肝细胞损伤程度有所减轻。

本部分实验表明：俄色果能减轻肝细胞的损伤程度，改善肝功能，增强抗氧化酶活力，其机制可能是通过对自由基进行清除、抑制脂质过氧化，从而保护肝脏。

2.4小结

(1)通过实验可知，正交设计结果中CCl₄ 10mmol.L^-1诱导损伤HL7702细胞6h能成功建立损伤模型。

(2)在一定剂量范围内使用俄色果无细胞毒作用。

(3)俄色果能降低肝损伤细胞中的ALT、AST、LDH活性；降低MDA含量；升高SOD、GSH抗氧化酶的活性，表现出一定的抗肝损伤作用。

(4)俄色果对CCl₄引起的肝损伤的保护作用机制可能是通过对自由基进行清除、抑制脂质过氧化，从而保护肝脏。

实验结果说明，本发明俄色果及其乙酸乙酯提取物可以有效护肝，预防和治疗化学性肝损伤。

综上，本发明俄色果及提取物用于保肝药效明确、可控，为临床提供了一种新的选择，且制备方法简单，成本低廉，工业应用前景良好。

Claims

1.俄色果及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的俄色果来源于蔷薇科苹果属植物变叶海棠Malus toringoides(Rehd.)Hughes.和花叶海棠Malus transitoria(Batal.)Schneid.的干燥成熟果实。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的俄色果的提取物为水提取物；

优选地，所述俄色果的水提取物由下述方法制备：取俄色果，用水加热回流提取，即可；

进一步优选地，所述俄色果的水提取物是由下述方法制备：俄色果实，粉碎，过三号筛，加20倍体积水，加热回流提取3次，每次2h，合并滤液，即可。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的俄色果的提取物为乙酸乙酯提取物；

优选地，所述俄色果的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备：取俄色果，用95％乙醇回流提取；乙醇部位浸膏加水分散，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取溶剂，除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物；

进一步优选地，所述俄色果的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备：取俄色果，粉碎，提取3次，分别加20倍95％的乙醇加热回流提取，过滤，收集续滤液，减压回收，得乙醇部位浸膏；将乙醇部位浸膏以水溶解，然后加入两倍石油醚(60～90)萃取至石油醚无色，再加入2倍乙酸乙酯反复萃取，直至乙酸乙酯溶液无色，合并乙酸乙酯溶液，减压回收溶剂后得乙酸乙酯提取物。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的用途，其特征在于：所述保肝的药物或保健食品是治疗和/或预防化学性肝损伤和/或物理性肝损伤的药物或保健食品。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：

所述化学性肝损伤是化学毒物、酒精、药物引起的肝损伤；

和/或，所述肝损伤是CCl₄、酒精、氨基半乳糖等引起的肝损伤；

和/或，所述肝损伤是急性酒精性肝损伤。

7.根据权利要求1～4任意一项所述的用途，其特征在于：所述保肝的药物或保健食品是治疗和/或预防急性肝损伤和/或慢性肝损伤的药物或保健食品。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述肝损伤是硫代乙酰胺、对刀豆蛋白A、乙酰氨基酚、脂多糖、四环素、α-萘异硫氰酸酯等引起的肝损伤。

9.一种俄色果提取物，其特征在于：它是俄色果的乙酸乙酯提取物，由下述方法制备：取俄色果，用95％乙醇回流提取；乙醇部位浸膏加水分散，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取溶剂，除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物；

10.一种俄色果提取物，其特征在于：它是俄色果的水提取物，由下述方法制备：取俄色果，用水加热回流提取，即可；

优选地，所述俄色果的水提取物是由下述方法制备：俄色果，粉碎，过三号筛，加20倍体积水，加热回流提取3次，每次2h，合并滤液，即可。