CN105434575A - 俄色叶及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了俄色叶的嫩叶或及提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。本发明俄色叶的嫩叶或及提取物用于保肝药效明确,可控,为临床提供了一种新的选择。

Description

俄色叶及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途
技术领域
本发明涉及俄色叶及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。属药物领域。
背景技术
“俄色叶”(藏语)是甘孜州藏族自治州藏族民间的一味习用药材,来源于蔷薇科植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.和花叶海棠Malustiansitoria(Batal.)Schneid.的干燥叶,已收录于四川省藏药材标准中。始载于《晶镜本草》:“俄色,花白如月光一般漂亮,果如宝石一般美丽”。在我国主要分布于四川西部、甘肃南部、青海和西藏部分地区。经调查发现,“俄色叶”在甘孜州藏族自治区为一较常用的民族民间药,使用历史悠久。当地居民经常用“俄色叶”泡水服用治疗消化不良,脘腹胀痛等症;当地藏医还用“俄色叶”与酥油茶同煮治疗高血压,高血脂。其果实中还含有较丰富的维生素,其中维生素B的含量高于多种普通水果种类及其品种的含量,具有很高的营养价值。近年,四川炉霍县林业部门已经开发变叶海棠及花叶海棠嫩叶制茶。该茶叶富含蛋白质、碳水化合物、多种维生素和有益人体的微量元素;具有降血压、降血糖、降血脂、抗缺氧、养身、养颜、活血化瘀、增加食欲等功效。变叶海棠和花叶海棠属于灌木至小乔木,花为白色,叶片嫩绿,果实成熟后红果满树,是理想的观赏绿化树种,可作为盆景。
发明内容
本发明的技术方案是提供了俄色叶的嫩叶或及提取物的新用途。
本发明提供了俄色叶及提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。
其中,所述的俄色叶来源于蔷薇科植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.或花叶海棠Malustiansitoria(Batal.)Schneid.的干燥叶芽及叶。
其中,所述俄色叶为变叶海棠大叶或者变叶海棠嫩叶。
变叶海棠大叶:是7-8月月采摘的蔷薇科植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.或花叶海棠Malustiansitoria(Batal.)Schneid.的干燥叶;
变叶海棠嫩叶:是5-6月采摘的蔷薇科植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.或花叶海棠Malustiansitoria(Batal.)Schneid.的干燥叶。
其中,所述的俄色叶的提取物为水提取物。
其中,所述的俄色叶的提取物为乙酸乙酯提取物。
其中,所述的俄色叶的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备:取俄色叶95%乙醇回流提取;乙醇部位浸膏加水分散,再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯萃取溶剂,除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物。
优选地,所述的俄色叶的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备:取俄色叶,粉碎,每次称取一定质量,提取3次,分别加20倍95%的乙醇加热回流提取,过滤,收集续滤液,减压回收,得乙醇部位浸膏;将乙醇部位的浸膏加水溶解,然后加入2倍的石油醚(60~90)萃取至石油醚无色,再加入2倍乙酸乙酯反复萃取直至乙酸乙酯溶液无色,合并乙酸乙酯溶液,减压回收得溶剂后得乙酸乙酯提取物。
其中,所述保肝的药物或保健食品是治疗和/或预防化学性肝损伤的药物或保健食品。
本发明还提供了一种俄色叶提取物,它是俄色叶的乙酸乙酯提取物,由下述方法制备:取俄色叶95%乙醇回流提取;乙醇部位浸膏加水分散,再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯萃取溶剂,除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物。
优选地,所述的俄色叶的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备:取俄色叶,粉碎,每次称取一定质量,提取3次,分别加20倍95%的乙醇加热回流提取,过滤,收集续滤液,减压回收,得乙醇部位浸膏;将乙醇部位的浸膏加水溶解,然后加入2倍的石油醚(60~90)萃取至石油醚无色,再加入2倍乙酸乙酯反复萃取直至乙酸乙酯溶液无色,合并乙酸乙酯溶液,减压回收得溶剂后得乙酸乙酯提取物。
本发明俄色叶的嫩叶或及提取物用于保肝药效明确、可控,为临床提供了一种新的选择。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实验例1本发明俄色叶提取物的保肝作用
1.1实验材料
1.1.1药材收集
变叶海棠和花儿海棠均为2013年5月23日采自甘孜州炉霍县,赶黄草购自荷花池中药材市场,均由成都中医药大学李敏教授鉴定为蔷薇科植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.和花叶海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid.的干燥叶,赶黄草为虎耳草科植物扯根菜PenthorumchinensePursh的干燥地上部分。
1.1.2实验药物
变叶海棠、花叶海棠及赶黄草提取物:以20倍水为提取溶剂,加热回流提取3次,每次时间1h,滤过,合并滤液,得水提物,用生理盐水溶解,配制成0.5g生药/ml备用。根据参考文献,实验时再用生理盐水将提取物分别设成3个剂量组(赶黄草1个剂量组),小鼠的低、中、高剂量组依次为:0.5g/kg·d、1g/kg·d、2g/kg·dg。
不同入药部位含量(%)
根皮苷、根皮素:为自制对照品,纯度在99.0%以上,根据参考文献,试验时以生理盐水分散将分别设成3个剂量组,小鼠的低、中、高剂量组依次为:5mg/kg·d、10mg/kg·d、15mg/kg·d。
联苯双酯:由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供,生产批号:110805,实验时以生理盐水分散作为阳性药对照组60mg/kg。
1.1.3实验动物
KM小鼠,清洁级,18~22g,雌雄各半,合格证号为:SCXK(川)2008-19,由四川省中医药科学院实验动物中心提供。
动物购回后饲养3天,观察各鼠的一般外观、行为活动、饮水进食情况、大小便性状,并进行称重,符合实验要求的动物供试验用。
1.1.4其他试剂及药品
实验试剂:四氯化碳(CCl4),成都市科龙试剂有限公司;橄榄油,成都市科龙试剂有限公司;谷丙转氨酶试剂盒(GPT/ALT,赖氏法),南京建成生物工程研究所,生产批号:20131106;谷草转氨酶试剂盒(GOT/AST,赖氏法),南京建成生物工程研究所,生产批号:20131107;超氧化物歧化酶试剂盒(SOD,WST法),南京建成生物工程研究所,生产批号:20131104;丙二醛试剂盒(MDA,TBA法),南京建成生物工程研究所,生产批号:20131108;总蛋白试剂盒(考马斯亮蓝法),南京建成生物工程研究所,生产批号:20131224。
实验仪器:恒温水浴锅,Thermo冷冻离心机,酶标定量测定仪(美国ThermoFisher公司VarioskanTM)。
1.2试验方法
1.2.1试验分组及处理
将小鼠随机分成空白对照组、模型对照组、联苯双酯对照组、赶黄草对照组、变叶海棠低、中、高剂量组、花叶海棠低、中、高剂量组、根皮素低、中、高剂量组、根皮苷低、中、高剂量组。共16个组,空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水,其余组按照表1剂量分别给予相应药物,灌胃体积均为0.2ml/10g,连续灌胃给药4天,末次给药1h后,将CCl4溶于橄榄油中,配成0.6%的CCl4橄榄油溶液,按0.1ml/10g的剂量进行皮下注射建立小鼠急性肝损伤模型。空白对照组皮下注射等量的橄榄油,禁食不禁水,20h后摘眼球取血,分离血清,-4℃低温保存,用以测定血清生化指标(ALT、AST)。处死动物,剖取肝脏,称重,取0.5g肝组织,减碎,置于玻璃匀浆器中,加预冷的9被体积的0.9%生理盐水匀浆,2500rpm离心10min,上清液置-4℃低温保存备用,用以测定肝组织生化指标(SOD、MDA)。
1.2.2统计方法
运用PASW18.0软件提供的方差分析(ONE-WAYANOVA)进行处理。1.3试验结果
1.3.1俄色叶提取物对CCl4诱导肝损伤的作用
1.3.1.1俄色叶对CCl4引起的急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响
表1各组别对对CCl4引起的急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响(±s,n=10)
注:与模型对照组比较:**p<0.01,*p<0.05
与空白对照组比:##p<0.01,#p<0.05
与赶黄草对照组:△△p<0.01,△p<0.05
由表1可知,与空白对照组比较,模型对照组小鼠的血清ALT和AST水平均明显升高(p<0.01),说明CCl4所致小鼠急性肝损伤模型造模成功;与模型组相比较,俄色叶提取物的低、中、高剂量组均能明显降低CCl4致急性肝损伤小鼠的ALT、AST水平(p<0.01)。
与赶黄草对照组相比,变叶海棠组、花叶海棠组对CCl4致急性肝损伤小鼠的血清中ALT水平无显著性差异。变叶海棠高剂量组和花叶海棠低、中、高组均能明显降低对CCl4致急性肝损伤小鼠血清中AST水平(p<0.01)。
1.3.1.2俄色叶提取物对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝组织中SOD、MDA的影响
表2各组别对对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝组织中SOD活性及MDA含量的影响(±s,n=10)
注:与模型对照组比较:**p<0.01,*p<0.05
与空白对照组比:##p<0.01,#p<0.05
与赶黄草对照组:△△p<0.01,△p<0.05
由表2可知,与空白对照组比较,模型对照组小鼠的肝组织中SOD酶活力明显降低(p<0.01),MDA含量明显升高(p<0.01),说明CCl4所致小鼠急性肝损伤模型造模成功;与模型组相比较,俄色叶提取物的低、中、高剂量组均能明显升高CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织中SOD酶活力(p<0.01),降低MDA含量(p<0.01)。
与赶黄草对照组相比,变叶海棠组和花叶海棠高、低剂量组均能显著地升高对CCl4致急性肝损伤小鼠的肝组织中SOD酶活力(p<0.01)。变叶海棠组、花叶海棠组均能明显升高对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织中MDA含量(p<0.01)。
实验例2本发明俄色叶不同提取部位的抗氧化活性及成分含量不同提取部位的抗氧化活性及成分含量
IC50越低,抗氧化活性越强(侧面反保肝活性)
实验例3本发明俄色叶乙醇提取物的保肝功效
一、药物制备和实验分组
变叶海棠大叶为2014年7月16日采自甘孜州炉霍县,变叶海棠嫩叶为2015年5月23日采自甘孜州炉霍县,均由由成都中医药大学李敏教授鉴定为蔷薇科植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.的干燥叶。
取干燥叶,粉碎,每次称取一定质量,提取3次,分别加20倍95%的乙醇加热回流提取,过滤,收集续滤液,减压回收,得乙醇部位浸膏。将乙醇部位的浸膏加水溶解,然后加入2倍的石油醚(60~90)萃取至石油醚无色,再加入2倍乙酸乙酯反复萃取直至乙酸乙酯溶液无色,合并乙酸乙酯溶液,减压回收得溶剂后得部位浸膏。
石油醚(60~90),购自成都市科龙化工试剂厂。
根皮苷、根皮素:为自制对照品,纯度在99.0%以上。
联苯双酯:由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供。
二、俄色叶提取物及其单体对CCl4体外诱导肝细胞株HL-7702HL-7702损伤的影响。
(1)HL-7702细胞的培养、传代、冻存、复苏、收集足够数量的细胞
人肝HL-7702细胞为贴壁细胞。将细胞接种于培养瓶中,加入含10%灭火胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基5ml,置37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱内培养(传代、冻存、复苏)。镜下观察细胞贴壁生长情况。收集对数生长期细胞进行各项实验。
(2)CCl4损伤HL7702细胞模型的建立
正交试验设计选择二因素三水平确定细胞损伤模型。A-CCl4损伤时间(h);B-CCl4浓度(mmol/L)。根据L9(34)正交表进行试验设计。在96孔培养板中加入1×105个/mL细胞悬液,毎孔100μL。待细胞完全贴壁后,试验孔分别加入相应的含CCl4mmol/L无血清培养基,100μL,每组4孔,正常对照孔加入含0.1%DMSO的无血清培养液100μL。培养箱中孵育相应的时间后,毎孔加入5mg/mLMTT20μL,培养4h,吸弃上清液,毎孔加入150μLDMSO,摇床上振摇10min。在酶标仪490nm波长处测定各孔吸光度OD值,并按下式计算肝细胞的存活率:
存活率(%)=实验组A490nm/正常对照组A490nm*100%,以确定CCl4对肝细胞的损伤条件。
不同浓度CCl4作用不同时间后HL7702细胞存活率(x±s,n=3)
方差分析表
最终选择A3B2:10mmol/LCCl4作用六小时。
(3)生化仪检测各组肝细胞培养上清液ALT(GPT)、AST(GOT)泄露量、LDH渗出率
ALT、AST、LDH可以敏感地提示肝细胞损伤及程度,因此本试验中,选择ALT、AST、LDH作为肝细胞损伤程度的评定指标。
①收集对数生长期细胞,接种人肝HL-7702细胞于24孔培养板中,每孔加入300ul完全培基,使细胞密度为1*10^6个/孔,置37℃、5%C02培养箱内孵育12小时过夜,至接近长满。
②实验孔加入不同浓度药物200μL,每组设6个重复孔,并设正常对照组和模型组。给药24h,后加入10mmol/LCCl4(注意动作快,防止挥发)于培养板中共同干预细胞6小时。
③收集培养上清液,按试剂盒说明书用酶标仪测定ALT、AST泄露量及LDH渗出率。
所有数据均以X土S来表示,由SPSS19.0统计软件完成。先进行方差齐性检验,如符合方差齐性,组间比较釆用单因素方差分析,治疗前后两组间比较采用配对样本t检验方法,确定P<0.05为差异有显著性意义。
三、实验结果
实验结果如下表所示:
LDH AST ALT
CK 1 473.8155 CK 1 16.1668 CK 1 8.672639
1 469.9806 1 14.03893 1 5.261071
1 479.137 1 17.54841 1 3.182696
1 459.1051 1 13.04387 1 3.976474
1 470.1031 1 15.18267 1 3.342478
1 471.0312 1 10.37887 1 4.021828
M 2 479.8487 M 2 28.81031 M 2 10.18256
2 488.7997 2 27.57676 2 12.1142
2 648.6793 2 27.25547 2 14.5701
2 667.1483 2 28.91702 2 23.1827
2 569.2456 2 29.3211 2 11.57119
2 572.1234 2 31.13231 2 17.26283
变小L 3 460.2017 变小L 3 27.80989 变小L 3 6.167896
3 471.9956 3 27.71808 3 5.201294
3 422.3582 3 26.99969 3 3.346938
3 488.7997 3 29.75974 3 4.889158
3 458.2341 3 20.93994 3 6.74028
3 462.2134 3 28.97418 3 5.74028
变小M 4 394.0456 变小M 4 12.88117 变小M 4 6.425395
4 476.6196 4 18.04376 4 8.279906
4 485.4027 4 13.42816 4 5.96047
4 472.808 4 12.41374 4 4.977332
4 455.3451 4 16.23625 4 4.640838
4 459.1324 4 4.414069 4 1.782192
5 528.7059 5 28.76912 5 9.935945
变小H 5 503.4552 变小H 5 8.407847 变小H 5 7.544342
5 511.4845 5 11.74134 5 4.767122
5 513.81 5 3.455855 5 5.509021
5 516.2451 5 6.114284 5 5.223004
5 504.5083 5 14.36379 5 5.223004
变大L 6 394.0456 变大L 6 13.44261 变大L 6 5.180544
6 476.6196 6 18.71775 6 5.108884
6 485.4027 6 24.43354 6 5.943185
6 472.808 6 20.12735 6 5.304222
6 452.2134 6 43.51817 6 7.098323
6 462.1452 6 18.47769 6 7.764252
变大M 7 457.218 变大M 7 22.57591 变大M 7 7.939575
7 468.4694 7 10.99869 7 5.719108
7 476.2722 7 19.80517 7 6.499278
7 493.695 7 11.31592 7 3.205271
7 470.0218 7 11.50141 7 4.994228
7 476.1321 7 23.72577 7 13.42619
变大H 8 447.9067 变大H 8 9.316239 变大H 8 5.80946
8 476.9296 8 17.70431 8 6.617571
8 477.3287 8 17.63439 8 4.851247
8 485.9194 8 17.3458 8 4.241075
8 470.1324 8 16.55652 8 6.48178
8 474.1642 8 6.65612 8 2.583747
BHT5 9 471.1267 BHT5 9 13.96676 BHT5 9 7.759754
9 473.7638 9 15.22994 9 16.06391
9 479.6821 9 15.78281 9 7.356228
9 459.6476 9 8.537482 9 4.319965
9 472.0768 9 13.67236 9 8.289003
9 473.1657 9 15.91809 9 8.489116
甘L 10 440.0277 甘L 10 14.95507 甘L 10 9.026536
10 397.9734 10 15.57888 10 8.736417
10 458.653 10 20.78119 10 7.746261
10 479.1525 10 13.25622 10 7.027433
10 440.6543 10 12.22851 10 7.103201
10 446.0976 10 12.93043 10 7.943222
甘M 11 427.2536 甘M 11 11.70958 甘M 11 9.967052
11 404.1518 11 16.15449 11 9.913915
11 410.1288 11 15.13583 11 4.272661
11 386.7659 11 13.22108 11 7.864321
11 440.9637 11 13.14938 11 6.341212
11 500.3729 11 16.6488 11 4.32125
甘H 12 401.8483 甘H 12 7.793767 甘H 12 3.541666
12 392.2614 12 19.89815 12 9.379284
12 399.2157 12 17.40733 12 5.887056
12 503.4443 12 10.47561 12 2.575799
12 54.3514 12 18.68524 12 6.085991
12 448.4654 12 21.08502 12 5.719108
素L 13 439.7802 素L 13 15.73243 素L 13 2.572223
13 475.1881 13 24.84186 13 8.512418
13 439.6486 13 12.46227 13 13.83872
13 419.2243 13 21.40138 13 7.975712
13 470.625 13 19.80959 13 4.13337
13 511.4615 13 13.67236 13 2.663716
素M 14 429.7424 素M 14 16.02355 素M 14 9.691938
14 450.9444 14 22.12871 14 12.44601
14 501.732 14 16.7197 14 6.930581
14 455.2772 14 16.93194 14 9.100954
14 432.5505 14 24.54649 14 9.435138
14 441.7645 14 25.8578 14 14.19927
素H 15 396.627 素H 15 24.4654 素H 15 11.22189
15 405.6644 15 27.19294 15 8.530702
15 419.3438 15 28.1279 15 16.12691
15 420.2872 15 32.33697 15 10.38904
15 422.5029 15 30.54126 15 4.025541
15 448.7298 15 27.49317 15 0.695032
由上表可以看出,与模型组相比,本发明俄色叶的乙酸乙酯提取物,无论是变叶海棠大叶还是变叶海棠嫩叶的提取物,高、中、低剂量组均可以有效降低LDH、AST、ALT的含量,说明其可以有效保护肝细胞免受CCl4的损害。
将本发明变叶海棠大叶、变叶海棠嫩叶的提取物的高、中剂量组,与纯的根皮苷、根皮素的高、中剂量主要相比可知,本发明提取物在给药剂量更小的情况下,对肝细胞的保护与纯的根皮苷、根皮素却相当。
综上,本发明俄色叶及提取物用于保肝药效明确、可控,为临床提供了一种新的选择,且制备方法简单,成本低廉,工业应用前景良好。

Claims (10)

1.俄色叶及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的俄色叶来源于蔷薇科植物变叶海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.或花叶海棠Malustiansitoria(Batal.)Schneid.的干燥叶芽及叶。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于:所述俄色叶为变叶海棠大叶或者变叶海棠嫩叶。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的用途,其特征在于:所述的俄色叶的提取物为水提取物。
5.根据权利要求1~3任意一项所述的用途,其特征在于:所述的俄色叶的提取物为乙酸乙酯提取物。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于:所述的俄色叶的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备:取俄色叶95%乙醇回流提取;乙醇部位浸膏加水分散,再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯萃取溶剂,除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于:所述的俄色叶的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备:取俄色叶,粉碎,每次称取一定质量,提取3次,分别加20倍95%的乙醇加热回流提取,过滤,收集续滤液,减压回收,得乙醇部位浸膏;将乙醇部位的浸膏加水溶解,然后加入2倍的石油醚(60~90)萃取至石油醚无色,再加入2倍乙酸乙酯反复萃取直至乙酸乙酯溶液无色,合并乙酸乙酯溶液,减压回收得溶剂后得乙酸乙酯提取物。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的用途,其特征在于:所述保肝的药物或保健食品是治疗和/或预防化学性肝损伤的药物或保健食品。
9.一种俄色叶提取物,其特征在于:它是俄色叶的乙酸乙酯提取物,由下述方法制备:取俄色叶95%乙醇回流提取;乙醇部位浸膏加水分散,再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯萃取溶剂,除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物。
10.根据权利要求9所述的俄色叶提取物,其特征在于:所述的俄色叶的乙酸乙酯提取物是由下述方法制备:取俄色叶,粉碎,每次称取一定质量,提取3次,分别加20倍95%的乙醇加热回流提取,过滤,收集续滤液,减压回收,得乙醇部位浸膏;将乙醇部位的浸膏加水溶解,然后加入2倍的石油醚(60~90)萃取至石油醚无色,再加入2倍乙酸乙酯反复萃取直至乙酸乙酯溶液无色,合并乙酸乙酯溶液,减压回收得溶剂后得乙酸乙酯提取物。
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