CN110308236A - 一种检测血液中林可霉素含量的在线固相萃取液相色谱法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医学检验领域，涉及体内抗菌药物含量测定方法，具体涉及一种检测血液中林可霉素含量的在线固相萃取液相色谱法。种检测血液中林可霉素含量的在线固相萃取液相色谱法，对待测血样进行预处理后，通过高效液相色谱仪采用标准曲线法测定林可霉素含量本发明所述的检测血液中林可霉素药物浓度的在线固相萃取液相分析方法，血浆经过蛋白沉淀后直接进样，减少了人员操作，提高了定量结果的准确性。

Description

一种检测血液中林可霉素含量的在线固相萃取液相色谱法
技术领域
本发明属于医学检验领域，涉及体内抗菌药物含量测定方法，具体涉及一种检测血液中林可霉素含量的在线固相萃取液相色谱法。
背景技术
林可霉素作用于敏感菌核糖体的50S亚基，阻止肽链的延长，从而抑制细菌细胞的蛋白质合成。林可霉素一般系抑菌剂，但在高浓度下，对高度敏感细菌也具有杀菌作用。林可霉素分子式为C18H35ClN2O6S。林可霉素的当血药浓度＞7.5mg/L时，毒副作用增强。可引起心跳、呼吸停止。静脉给药可引起血栓性静脉炎。可引起胃肠道反应：恶心，呕吐，食欲不振，腹胀，腹泻.。可引起二重感染，伪膜性结肠炎及光敏反应。可致皮疹，哮喘，耳鸣，眩晕，过敏性休克。亦有血象改变的报道。偶尔出现手脚麻木。由于VCMC治疗窗较窄，体内代谢过程存在较大的个体差异，所以对其血药浓度的监测是调整剂量，减少不良反应的重要参考，在临床用药中具有重大意义。
目前常用的林可霉素血药浓度的测定方法众多，但目前仍存在前处理复杂、成本高，或对实验人员和环境要求高，分析时间较长等问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的现状，提供一种检测血液中林可霉素含量的在线固相萃取液相色谱法。
本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测血液中林可霉素含量的在线固相萃取液相色谱法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)血浆样品的预处理：取待测样品，加入蛋白沉淀剂进行沉淀；
(2)标准曲线的绘制:取20uL标准工作液，加入空白血浆至1ml，混匀至成6个浓度的标准溶液，将获得的标准溶液分别加入蛋白沉淀剂进行沉淀，9000-15000rpm下离心10-15min，分别取上清液用高效液相色谱仪和DAD检测器对上述上清液进行检测，得出上述标准溶液中的林可霉素谱图，以林可霉素的峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有林可霉素的浓度作为标准曲线图的横坐标x，将数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a、b及相关系数R2；该标准曲线至少用三份不同批次的标准工作液绘制三次；标准工作液是含有林可霉素的溶液；
(3)检测血液的离心:取待检测血液至少2ml，在离心速度为3500-4500rpm下离心10-15min，得到上清液，将上述上清液置于-20℃冷冻下保存备用；
(4)待测样品的检测：
S1:用水浴加热(37℃)，将步骤(3)中的上清液复融；
S2:用移液枪移取步骤S1中复融后的上清液800-1000uL按步骤(1)进行预处理后，离心得上清液即为待测样品；
S3:移取步骤(c)待测样品600-800uL，使用高效液相色谱仪和DAD检测器对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的林可霉素色谱图，将上述色谱图中的林可霉素峰面积y代入上述步骤(2)的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中林可霉素的浓度。
所述的蛋白沉淀剂为乙腈。
进一步的，所述步骤(2)中的标准工作液为0.5、2.0、4.5、7.5、11.0和15.0μg/mL浓度的林可霉素溶液。
进一步的，所述步骤(2)中高效液相色谱仪包括进样模块、液相泵模块、柱温模块和检测器模块，还包括萃取泵、补液泵、六通阀、分析柱及SPE柱。
进一步的，所述的SPE柱的流动相为0.02-0.04％的磷酸水溶液，流速为0.4-0.5mL/min，所述的SPE柱采用反冲模式。
进一步的，所述的分析柱的流动相为30％的有机相和70％的水相，所述有机相为乙腈，所述水相为0.02-0.04％的磷酸水溶液；流速为1-1.2mL/min，所述分析柱采用梯度洗脱方式。
进一步的，所述步骤(2)中所述DAD检测器的检测波长为246nm。
本发明的优点在于：本发明所述的检测血液中林可霉素药物浓度的在线固相萃取液相分析方法，血浆经过蛋白沉淀后直接进样，减少了人员操作，提高了定量结果的准确性，极大地缩短分析时间，使检测过程简便快速，实验成本降低，更利于在临床治疗中对患者体内的林可霉素血药浓度进行监测，为林可霉素的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础。
附图说明
图1为在线固相萃取分析工作流程示意图。
图2为本发明中标准溶液中林可霉素色谱图；
图3为本发明中加标血浆样本中林可霉素色谱图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合图示与具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
(一)血浆样品的预处理：取待测样品，加入蛋白沉淀剂进行沉淀。
(二)标准曲线的绘制
首先用移液枪将取标准工作液20uL置于10ml离心管中，加空白血浆至1mL,混匀制成6个浓度的标准溶液，将上述标准溶液分别加入蛋白沉淀剂进行沉淀，再用转速为15000rpm的离心机离心10-15min后，分别取上述上清液500uL，用高效液相色谱仪和DAD检测器对上述上清液进行检测，得出上述标准溶液中的林可霉素谱图，以林可霉素峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有林可霉素的浓度作为标准曲线图的横坐标x，将数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a、b及相关系数R2。该标准曲线至少用三份不同批次的标准工作液绘制三次。标准工作液是含有林可霉素的溶液。
标准工作液的配制：
(a)精确称取林可霉素标准品10mg置于1ml容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，得到标准储备液A，其中林可霉素的浓度为10mg/mL，将标准储备液A用血浆进行稀释，分别在含有15-600μg/mL林可霉素的范围内配置出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(三)检测血液的离心
取待检测血液至少2ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液，将上述上清液置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(四)待测样品处理
(b)用水浴加热(37℃)，将步骤(三)冷冻的血浆复融。
(c)用移液枪移取(b)项下的血浆1000uL于10mL离心管中，按步骤(一)进行预处理后，离心得上清液即为待测样品。
(四)待测样品的检测
移取步骤(c)待测样品800uL，使用高效液相色谱仪和DAD检测器对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的林可霉素色谱图，将上述色谱图中的林可霉素峰面积y代入上述步骤(二)的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中林可霉素的浓度。
在步骤(二)中使用六种不同浓度的标准工作液，六种不同浓度的标准工作液分别为含有0.5、2.0、4.5、7.5、11.0和15.0μg/mL浓度的林可霉素溶液；
如图1所示，现有高效液相色谱仪包括：进样模块、液相泵模块、柱温模块和检测器模块，高效液相色谱仪还包括：萃取泵、补液泵、六通阀及SPE柱，所使用的SPE柱为SPENJH301002；在线固相萃取仪的SPE柱流动相为含有0.02％磷酸水溶液，流速为0.4mL/min；补液泵流动相为纯水，流速为1.0mL/min；SPE柱采用反冲模式。
分析色谱柱流动相含有30:70比例的有机相：水相，其中有机相为乙腈，水相为含0.02％磷酸的水溶液，分析色谱柱流速为1.0mL/min，分析色谱柱采用等度洗脱方式；
所述DAD检测器为Thermo DAD-3000，其检测波长为246nm。
本实施例中技术方法论证如下：
一、该方法的线性关系和定量限
将上述配制的20μL的各个浓度的林可霉素标准工作液，加入980μL空白血浆混匀，经稀释后进样，林可霉素的浓度在0.3mg/L到12mg/L范围内，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明林可霉素的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：0.1mg/L。
(2)定量限(LOQ)：0.6mg/L。
(3)线性范围：
林可霉素在0.6mg/L到18mg/L范围内，线性良好，相关系数R2＞0.99。
二、该方法的回收率和精密度
取林可霉素标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如表1。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为92.6％～100.7％，相对标准偏差为1.31％～1.72％，表1为林可霉素加标回收率和精密度。
加标量/(mg/L) 1.0 8.0 16.0
平均回收率/％ 92.6 100.7 97.3
精密度RSD/％ 1.31 1.72 1.52
表1林可霉素加标回收率和精密度
三、溶液稳定性
取配制好的林可霉素精密度样品，按本实施例方法进行样品溶液稳定性测定。实验结果表明样品在7小时内稳定。
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度、稳定性等各项技术指标均符合要求，该方法检测血液中林可霉素药物浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
标准溶液中林可霉素色谱图见图2，血清样本中林可霉素色谱图见图3，林可霉素保留时间为8.83min，由图2和图3可知本实施例方法目标化合物的识别准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。
本以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (7)

1.一种检测血液中林可霉素含量的在线固相萃取液相色谱法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)血浆样品的预处理：取待测样品，加入蛋白沉淀剂进行沉淀；
(2)标准曲线的绘制:取20uL标准工作液，加入空白血浆至1ml，混匀至成6个浓度的标准溶液，将获得的标准溶液分别加入蛋白沉淀剂进行沉淀，9000-15000rpm下离心10-15min，分别取上清液用高效液相色谱仪和DAD检测器对上述上清液进行检测，得出上述标准溶液中的林可霉素谱图，以林可霉素的峰面积作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有林可霉素的浓度作为标准曲线图的横坐标x，将数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a、b及相关系数R2；该标准曲线至少用三份不同批次的标准工作液绘制三次；标准工作液是含有林可霉素的溶液；
(3)检测血液的离心:取待检测血液至少2ml，在离心速度为3500-4500rpm下离心10-15min，得到上清液，将上述上清液置于-20℃冷冻下保存备用；
(4)待测样品的检测：
S1:用水浴加热(37℃)，将步骤(3)中的上清液复融；
S2:用移液枪移取步骤S1中复融后的上清液800-1000uL按步骤(1)进行预处理后，离心得上清液即为待测样品；
S3:移取步骤(c)待测样品600-800uL，使用高效液相色谱仪和DAD检测器对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的林可霉素色谱图，将上述色谱图中的林可霉素峰面积y代入上述步骤(2)的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中林可霉素的浓度。
2.根据权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于：所述的蛋白沉淀剂为乙腈。
3.根据权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于：所述步骤(2)中的标准工作液为0.5、2.0、4.5、7.5、11.0和15.0μg/mL浓度的林可霉素溶液。
4.根据权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于：所述步骤(2)中高效液相色谱仪包括进样模块、液相泵模块、柱温模块和检测器模块，还包括萃取泵、补液泵、六通阀、分析柱及SPE柱。
5.根据权利要求4所述的的液相色谱法，其特征在于：所述的SPE柱的流动相为0.02-0.04％的磷酸水溶液，流速为0.4-0.5mL/min，所述的SPE柱采用反冲模式。
6.根据权利要求4所述的液相色谱法，其特征在于：所述的分析柱的流动相为30％的有机相和70％的水相，所述有机相为乙腈，所述水相为0.02-0.04％的磷酸水溶液；流速为1-1.2mL/min，所述分析柱采用梯度洗脱方式。
7.根据权利要求根据权利要求1所述的液相色谱法，其特征在于：所述步骤(2)中所述DAD检测器的检测波长为246nm。
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