CN105572267B - 一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，采用如下色谱条件：色谱柱：XBridge Amide柱(waters，4.6mm×250mm，3.5μm)；流动相：有机相‑水相；流速：1.0‑1.4mL/min；检测波长：210nm；柱温：60‑70℃；进样量：10‑20μL；检测器采用紫外检测器；所述流动相中有机相‑水相的体积比为75：25‑80：20；所述流动相中的有机相为乙腈，所述流动相中含有乙酸铵，乙酸铵浓度范围为5‑10mM，pH范围为5.0‑10.0。与现有方法相比，可以实现阿卡波糖与杂质A的完全分离，并可以多分离出一种未知杂质，更好地控制阿卡波糖的产品质量。

Description

一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法。

背景技术

阿卡波糖(Acarbose)是一种从放线菌中分离得到的由四个单糖构成的寡糖，对小肠壁细胞刷状缘的α﹣葡萄糖苷酶具有竞争性抑制作用，能阻碍肠道内的多糖和低聚糖的水解，从而减少小肠对单糖的吸收，达到降低餐后血糖浓度的目的，是II型糖尿病的常用药物之一。

2015版中国药典增收了阿卡波糖的质量标准，其含量测定的方法为高效液相色谱法，与欧洲药典中收录的方法一致。该方法采用氨基色谱柱，紫外检测器，以乙腈-磷酸盐缓冲液(75：25)为流动相，在2mL·min^-1的流速，210nm检测波长，35℃柱温的条件下进行测定。但采用这种方法进行测定无法实现阿卡波糖(其结构式为下式I)与杂质A(其结构式为下式II)的完全分离，因此只能采用峰谷比进行限定，并且存在有关物质干扰大、及柱流失严重等问题。

目前国内外关于阿卡波糖的检测方法有HPLC-UV、HPLC-ELSD、HPLC-RID及CE法。Xie等将C18水相柱用于阿卡波糖的含量测定，但流动相中需添加离子对试剂；HPLC-ELSD/RID法主要用于阿卡波糖原料药或发酵液中无生色团杂质(葡萄糖、麦芽糖)的分离。B.Lachmann等利用CE法对阿卡波糖及其代谢物进行了分析研究。这些方法主要是针对于阿卡波糖或阿卡波糖代谢物等，并未很好地解决阿卡波糖及其杂质分离效果差、有关物质干扰大、及柱流失严重等问题。

现有阿卡波糖检测方法中阿卡波糖无法与杂质A实现完全分离，不能更好地控制阿卡波糖的产品质量；且现有检测方法流速快、运行时间长、试剂消耗量大；以及氨基柱键合相易流失，色谱柱寿命短，给分析工作带来不便，检测成本高等一系列问题。因此，迫切需要一种分离度良好、柱稳定性高的测定阿卡波糖及其杂质的方法。

发明内容

本发明提供一种准确度高、柱稳定性好的高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，实现了阿卡波糖与杂质A的完全分离，从而可以更好地控制产品质量。

本发明提供了一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，采用如下色谱条件：

色谱柱：XBridge Amide柱(waters,4.6mm×250mm,3.5μm)；

流动相：有机相-水相；

流速：1.0-1.4mL/min；

检测波长：210nm；

柱温：60-70℃；

进样量：10-20μL；

检测器采用紫外检测器；

所述流动相中的有机相为乙腈，所述流动相中含有乙酸铵，乙酸铵浓度范围为5-10mM，pH范围为5.0-10.0；

所述流动相中有机相-水相的体积比例为75：25-80：20。

所述流动相优选为预混流动相，即提前将乙腈、水和乙酸铵缓冲液按比例混合均匀后使用。与在先混合缓冲盐相比，预混流动相可以避免高浓度时乙腈盐析出，重现性好，可以更好地减少基线噪音和溶剂峰。

本发明提供的一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，色谱条件优选为：流动相中有机相-水相的体积比例为75:25；流动相中乙酸铵浓度为10mM，pH为9.0；流速：1.2mL/min，柱温：65℃，进样体积：20μL。

本发明提供的一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，其特征为：

(1)称取适量的阿卡波糖标准品溶解于流动相中，得阿卡波糖标准品溶液备用；

(2)称取适量的阿卡波糖样品溶解于流动相中，得阿卡波糖样品溶液备用；

(3)取阿卡波糖标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进行高效液相色谱分析。

本发明选用的色谱柱为XBridge Amide色谱柱，使用了化学稳定的、三键键合式的酰胺官能团，其选择性与氨基柱相近，且基于亚乙基桥杂化颗粒技术，色谱柱耐受性更强，pH2-11条件下均可以检测，极端pH条件下最高柱温可达90℃，相对于现有方法中规定的氨基键合相的稳定性更高，柱流失减少，寿命更长。

本发明提供的高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，与现有方法相比，具有明显的优点：实现了阿卡波糖与杂质A的完全分离，并且多分离出一种未知杂质，更好的实现阿卡波糖的质量控制，提高了分析的准确性；各杂质的专属性、线性及范围、回收率、精密度、耐用性等试验均良好；所选色谱柱柱稳定性好；且流动相配制简单、检测成本低。

附图说明

图1为杂质A与阿卡波糖对照品混合液色谱图；其中，1-阿卡波糖，4-杂质A；

图2为峰鉴别阿卡波糖标准品色谱图；其中，1-阿卡波糖，2-杂质D，3-杂质B，4-杂质A，5-新杂质，6-杂质C，7-杂质E，8-杂质F，9-杂质G；

图3为EDQM提供的峰鉴别阿卡波糖标准品色谱图；

图4为实施例1的阿卡波糖供试品色谱图；其中，1-阿卡波糖，4-杂质A，5-新杂质；

图5为对比例1的阿卡波糖供试品色谱图；其中，1-阿卡波糖，4-杂质A。

具体实施方式

本发明一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，步骤包括：配置阿卡波糖标准品溶液备用；配置阿卡波糖样品溶液备用；取阿卡波糖标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱分析。

其中，高效液相色谱分析中的色谱条件的选择，对本发明提高分析的准确性而言是重要的。尤其是本发明将XBridge Amide柱作为高效液相色谱法检测阿卡波糖的色谱柱，较之现有的高效液相色谱法检测阿卡波糖的氨基柱效果好。具体而言，色谱条件为：色谱柱：XBridge Amide柱(waters,4.6mm×250mm，3.5μm)；流动相组成：乙腈-水(75:25，v/v)，含10mM乙酸铵缓冲盐(pH 9.0)；所用紫外检测器的检测波长：210nm；流速：1.2mL/min；柱温：65℃；进样体积：20μL。本发明通过前期大量实验摸索，综合考虑阿卡波糖的保留时间及与杂质的分离情况，最终确定流动相中乙腈-水的体积比为75：25-80：20，优选流动相中乙腈-水的体积比为75:25。选用L₉3⁴正交表，考察流动相pH、柱温、盐浓度和流速4个高效液相色谱方法条件参数，具体如下：

因素A：流动相pH。考察酸性、中性和碱性条件对阿卡波糖峰型及保留的影响，故设定以下水平：①3.0 ②6.8 ③9.0。

因素B：柱温。预实验中35℃条件下阿卡波糖存在双峰现象，考虑到糖类α、β异构体间的转化率随温度变化而变化，提高温度可使分裂峰合并为单峰。故考察的水平为①45℃②55℃ ③65℃。

因素C：流动相中的盐浓度。为得到良好的峰型和保留作用，在流动相中添加缓冲盐，结合所用色谱柱性质，优选乙酸铵。考察水平为①5mM ②10mM ③20mM。

因素D：流速。流速不仅影响着保留时间，也与化合物间的分离情况有关。设定以下水平考察：①1.0mL/min ②1.2mL/min ③1.4mL/min。

每个试验条件下进样顺序分别如下：

(1)空白(流动相)

(2)杂质A与阿卡波糖对照品混合液

(3)峰鉴别阿卡波糖标准品溶液

优劣判断因素：①可分离的杂质个数n；②阿卡波糖色谱峰的拖尾因子T；③杂质A与主峰的分离度R。

表1列出了正交试验的因素与水平组合及相应的试验数据，按照主峰拖尾因子越接近1.0越好、杂质个数越多越好、杂质A与主峰分离度越大越好的原则，对它们分别按单指标进行极差分析，计算结果如表2所示。

表1方法条件参数的正交试验结果

备注：试验序号1条件下，阿卡波糖峰为双峰，主峰拖尾因子以“——”表示

表2极差分析表

根据表2和表3的结果显示，对于主峰拖尾因子而言，因素主次顺序为：D＞A(B)＞C，优选方案为：A3B3C3D1；

对于杂质个数而言，因素主次顺序为：A＞B(D)＞C，优选方案为：A3B2C1(C2)D1(D2)；

对于杂质A与主峰分离度而言，因素主次顺序为：A＞D＞C＞B，优选方案为：A3B2C2D1。

由于对于不同指标而言，因素主次、水平优劣差异较大，确定整体最优因素水平，有一定难度，因此综合各指标的优选方案初步确定整体较优组合，通过再次试验，确定最优组合。其中因素A选定水平3；因素B可选水平2或3；因素C在三项指标中影响均较小，选定中间值水平2；因素D可选水平1或2。故综合平衡因素水平初步确定的较优组合为A3B3C2D1、A3B2C2D1、A3B3C2D2或A3B2C2D2。

为了确定最优组合，对四种可能的组合进行再次试验，具体结果见表3数据所示。

表3组合筛选再试验结果

表3显示，四种条件下，主峰均有良好的对称性，从杂质A与主峰分离度来看，A3B3C2D1、A3B3C2D2优于A3B2C2D1、A3B2C2D2，而A3B3C2D2的保留时间要比A3B3C2D1的更短一些，所以选定的最优组合为A3B3C2D2。故本发明最优选的色谱条件参数为：pH 9.0，柱温65℃，盐浓度为10mM，流速1.2mL/min。

本发明色谱条件中色谱柱和流动相的配合使用，更好的实现阿卡波糖的质量控制，提高了分析的准确性。

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但是本发明的保护范围并不仅限于实施例。

在下面的各实施例中，所用仪器的信息如下：

高效液相色谱仪系统：型号：岛津LC-20A，包括LC-20AT泵；DGU-20A脱气机；SIL-20A自动进样器；CTO-10ASvp柱温箱；SPD-20A紫外检测器；Lab solution色谱工作站；

Waters XBridge Amide色谱柱：规格4.6mm×250mm,3.5μm粒径；

万分之一电子天平：AR1140型，Ohaus Corp.Brook，NJ，USA；

十万分之一电子天平：MS105Du型，METTLER TOLEDO；

电子pH计：pH Meter PHS-3C型，上海精科实业有限公司；

超声波清洗器：SK250HP型，无锡建仪实验器材有限公司。

在下面的实施例中，所用的各试剂信息如下：

阿卡波糖对照品：中国食品药品检定研究所，批号：100808-201203，含量95.8％；

峰鉴别阿卡波糖标准品：ACARBOSE FOR PEAK IDENTIFICATION CRS(20mg，含有A、B、C、D、E、F和G杂质，EDQM)；其中杂质A：Acarbose D-Fructose Impurity(1mg，trc-canada)；

阿卡波糖胶囊：四川绿叶宝光药业股份有限公司，批号：140308；

甲酸铵：99.995％，Sigma-Aldrich；

乙酸铵：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

乙腈：色谱纯；

氨水：分析纯；

甲酸：ACS级；

冰醋酸：分析纯；

水为纯净水。

实施例1

1溶液的配制

1.1备用缓冲溶液及流动相

200mM甲酸铵缓冲盐(pH 3.0)：称取甲酸铵12.6g至1L容量瓶中，加适量水溶解，加入甲酸25mL，混匀，加水定容至刻度。

200mM乙酸铵缓冲盐(pH 6.8)：称取乙酸铵15.4g至1L容量瓶中，加水溶解定容。

200mM乙酸铵缓冲盐(pH 9.0)：称取乙酸铵15.4g至1L容量瓶中，加适量水溶解，加入氨水8mL，混匀，加水定容至刻度。

各流动相是由相应的备用缓冲溶液，经75％乙腈水按比例稀释而得。例如配制1L含10mM乙酸铵(pH9.0)的流动相，在750mL乙腈和200mL水中加入50mL的200mM乙酸铵缓冲盐(pH9.0)，混匀，滤过，超声，即得。

1.2峰鉴别阿卡波糖标准品溶液

将20mg的峰鉴别阿卡波糖标准品溶液溶于1mL流动相中，即得。

1.3阿卡波糖对照品溶液

精密称取10mg阿卡波糖对照品置10mL容量瓶中，加流动相溶解定容，即得。

1.4杂质A对照品溶液

将1mg的杂质A对照品溶于1mL流动相中，即得。

1.5杂质A与阿卡波糖对照品混合液

取100μL杂质A对照品溶液(1mg/mL)与900μL阿卡波糖对照品溶液(1mg/mL)混匀，即得。

1.6阿卡波糖供试品溶液

精密称取装量差异下阿卡波糖胶囊内容物适量(相当于阿卡波糖50mg)置50ml容量瓶中，加流动相适量超声溶解，加流动相定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2阿卡波糖及其杂质的分离

色谱参数条件为：XBridge Amide色谱柱，pH 9.0，柱温65℃，盐浓度为10mM，流速1.2mL/min。

在该色谱条件下，杂质A与阿卡波糖对照品混合液在XBridge Amide色谱柱上可完全分离，具体见图1杂质A与阿卡波糖对照品混合液色谱图，图1所示，杂质A与阿卡波糖分离度为2.175(其峰谷比达到134.117)，阿卡波糖的保留时间约为19.1min，杂质A的相对保留时间约为0.90；在该色谱条件下得到的峰鉴别阿卡波糖标准品色谱图见图2所示，峰鉴别阿卡波糖标准品各峰信息见表4所示；与欧洲药品质量管理局(EDQM)提供的峰鉴别阿卡波糖标准品色谱图即图3比较可知，采用本发明方法测定，在杂质A与主峰间可多检测出一种未知杂质。通过杂质A的相对保留时间定位，可知图2中的4号峰为杂质A峰，其他杂质出峰顺序与图3类似，可以确定峰2、3、6、7、8、9分别为杂质D、B、C、E、F、G。说明该方法不仅进一步改善了阿卡波糖与各杂质的分离情况，尤其是与杂质A的分离，还可多分离出一种未知杂质。

表4峰鉴别阿卡波糖标准品各峰信息

3标准曲线和相关系数

精密称取阿卡波糖对照品适量，加流动相溶解，制成4mg/mL的阿卡波糖对照品贮备液。精密量取贮备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL分别置于10mL容量瓶中，加流动相定容。按色谱参数条件为：pH 9.0，柱温65℃，盐浓度为10mM，流速1.2mL/min，分别进样分析，记录色谱图。

结果显示，阿卡波糖在0.2～1.2mg/mL范围内，色谱峰面积(A)与浓度(C)呈良好的线性关系，回归方程为A＝3.3×10⁶C-40183，相关系数r＝0.9998。

4检测限

将线性范围项下浓度最低点的阿卡波糖对照品溶液逐级稀释，依次进样测定。

结果该系统在浓度为4μg/mL的情况下，主成分的峰高约为噪音的3倍，表明阿卡波糖在此色谱条件下，检测限量为0.08μg。

5精密度

取线性范围项下的阿卡波糖对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，进行精密度试验。峰面积的RSD为0.15％，结果表明仪器的精密度均良好。

6重复性

取同一批样品，照溶液配制项下的方法配制供试品溶液6份，按上述色谱条件进样，进行重复性试验。结果含量平均值为98.60％(n＝6)，RSD＝0.98％，表明重复性良好。

7稳定性

取阿卡波糖供试品溶液在室温下放置2、4、6、8、10、24h后测定，峰面积的RSD＝0.29％(n＝6)，说明供试品溶液至少在24h内稳定。

8加样回收率

精密称取同一批次胶囊内容物适量(相当于阿卡波糖100mg)于25mL容量瓶中，加流动相超声溶解，定容，过滤，制成4mg/mL的供试品贮备液。分别精密量取供试品贮备液1.0ml于9个10mL容量瓶中，分别于No.1～No.3加入4mg/mL对照品贮备液0.8ml，于No.4～No.6加入4mg/mL对照品贮备液1.0ml，于No.7～No.9加入4mg/mL对照品贮备液1.2ml，加流动相稀释定容，摇匀，使之成为3个不同的浓度(浓度均在线性范围内)，每个浓度分别制备3份供试品溶液，按上述色谱条件进样分析。同时精密量取4mg/mL的供试品贮备液1.0ml于10mL容量瓶中，流动相稀释定容，制成0.4mg/mL的阿卡波糖供试品溶液，测其峰面积，代入方程求出其含量。测得平均回收率为99.53％，RSD为0.87％(n＝9)，具体数据如表5所示。

表5加样回收率结果

试验结果：平均回收率为99.5％，RSD为0.87％。

结果表明：本发明高效液相色谱法对测定阿卡波糖准确可靠，重现性好，可用于阿卡波糖含量的测定。

本发明高效液相色谱法检测阿卡波糖的色谱图如图4所示，阿卡波糖供试品各峰信息如表6所示，根据峰鉴别阿卡波糖标准品相对主峰的保留时间(见表4)对供试品中所含杂质进行峰归属。

表6阿卡波糖供试品各峰信息

对比例1

按照2015版中国药典阿卡波糖胶囊测定项下检测阿卡波糖。

色谱参数条件为：氨基色谱柱，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液(75：25，v/v)，流速2mL/min，检测波长210nm，柱温35℃。

取实施例1中阿卡波糖胶囊，按2015版中国药典阿卡波糖胶囊测定项下方法配制供试品溶液，按药典中所规定的色谱条件进样分析，记录色谱图如图5所示，阿卡波糖供试品各峰信息如表7所示，根据相对主峰的保留时间对供试品中所含杂质进行峰归属。

表7阿卡波糖供试品各峰信息

综上，本发明对比例1中的色谱条件中色谱柱和流动相均与本发明实施例1中的色谱条件中色谱柱和流动相不同。

由实施例1和对比例1得到的阿卡波糖供试品色谱图可看出，对比例1可分离出3种杂质，杂质A与阿卡波糖间的峰谷比为1.375。实施例1可分离出5种杂质，杂质A与阿卡波糖间出现一个新杂质，新杂质与阿卡波糖间的峰谷比为1.730。新杂质的出现使得杂质A与阿卡波糖间的峰谷比无法直接从供试品图谱中得出，将杂质A与阿卡波糖对照混合液采用本发明提供的检测方法进行进样分析可知，杂质A与阿卡波糖可完全分离，峰谷比达到134.117。从杂质的分离情况可明显看出，相对于阿卡波糖现有的检测方法，本发明提供的检测方法实现了分离杂质个数多，分离情况良好，可提高阿卡波糖样品测定的准确性。并且本发明提供的检测方法精密度高、重复性和稳定性均良好。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明权利要求书的范围内。

Claims (4)

1.一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，其特征在于，采用如下色谱条件：

色谱柱：XBridge Amide柱；

流动相：有机相-水相；

流速：1.2mL/min；

检测波长：210nm；

柱温：65℃；

进样量：20μL；

检测器采用紫外检测器；

所述流动相中有机相-水相的体积比为75﹕25-80﹕20；

所述流动相中的有机相为乙腈，所述流动相中含有乙酸铵，乙酸铵浓度为10mM，pH为9。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相为预混流动相。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相中有机相-水相的体积比为75﹕25。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)称取适量的阿卡波糖标准品溶解于流动相中，得阿卡波糖标准品溶液备用；

(2)称取适量的阿卡波糖样品溶解于流动相中，得阿卡波糖样品溶液备用；

(3)取阿卡波糖标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照权利要求1-3任一项所述的条件进行高效液相色谱分析。