CN103575827A - 一种检测单糖的方法及衍生试剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及一种单糖的检测方法及衍生试剂的制备方法，包括如下步骤：(1)用衍生试剂对单糖进行衍生；(2)将衍生产物进行液相色谱质谱联用(LC-MS)分析；衍生试剂包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)。该检测方法对微量样品既可以定性又可以定量，检测灵敏度高，操作简便，可同时对两种未知样品进行相对定量，质谱图信噪比低，分离所需流动相极性小，大大延长了柱子的使用寿命。本发明方法比传统1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮(PMP)衍生法的灵敏度高4-5倍，比传统NMP衍生法更好地分离单糖，不会出现单糖色谱峰重叠的现象。

Description

一种检测单糖的方法及衍生试剂的制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种检测单糖的方法及衍生试剂的制备方法。

背景技术

目前，多糖领域中面临很多挑战。多糖的研究不仅仅限于对大量样品的分析，对于生物来源的样品研究也越来越多。由于生物来源(如血液、细胞、组织)的样品多糖量少，单糖极性较强，结构相近，且缺乏光学活性，采用常规方法对其分离鉴定较为困难。糖在紫外区无吸收，传统的示差折光检测法的灵敏度低且不利于梯度洗脱。为了改善其分离选择性和提高检测灵敏度，人们常采用衍生化处理，将糖类组分转变为带发色基团的分子，然后进行紫外或荧光检测。

液相色谱质谱联用(LC-MS)是一种很好的检测方法。它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品由流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱的优势互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。

糖类物质的衍生反应多基于还原氨化法，不仅过程繁琐、反应时间长，而且可导致不稳定基团如唾液酸残基的解离，给测定结果带来偏差。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，常被用于衍生单糖，结合高效液相色谱法分析，具有反应条件较温和，产物无立体异构等优点。1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)也是常用的衍生试剂，如孙志伟等用NMP衍生测定油菜花粉多糖中单糖的组成(孙志伟，刘凌君，户宝军，等.1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生试剂的制备及其在高效液相色谱-质谱法测定糖类化合物中的应用[J].色谱,2008(02)：200-205)，其反应机理与PMP相同，都可以与单糖反应生成具有紫外吸收的糖-双衍生试剂产物，但是以上两种衍生试剂都存在检测限高，样品消耗量大，用质谱检测只能对样品定性，不能定量等缺点。用普通衍生试剂衍生结合LC-MS对单糖定量，需要做一系列的标准曲线，不仅步骤繁琐，而且对珍贵的生物样品来说也是一种浪费，同时单糖的分离结果并不理想。

发明内容

针对以上现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种定性定量检测单糖的方法。

实现上述发明目的的技术方法是：

1.一种检测单糖的方法，具体包括如下步骤：

(1)用衍生试剂对单糖进行衍生；

(2)将衍生产物进行液相色谱质谱联用(LC-MS)分析；

所述的衍生试剂包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)；

所述的衍生试剂D3NMP单独使用或与NMP联用。

2.一种检测单糖的方法，其特征在于，所述的单糖为动物、植物和微生物来源的多糖及寡糖的基本组成单元。

3.D3NMP的制备方法包括如下步骤：

(1)称取萘肼盐酸盐，置于水中，加热至100℃，使其完全溶解，用20％NaOH溶液调节PH至8-9，抽滤后得到固体，用水洗涤直至PH为7，抽滤后真空干燥，得萘肼；

(2)将萘肼加入无水乙醇中，于55℃水浴条件下搅拌至其溶解，滴加氘代乙酰乙酸乙酯，滴加完毕后反应2h，然后升温至80℃回流7h，将反应液减压浓缩至原体积的1／3，用甲醇将其重结晶3次，得D3NMP；

其中萘肼与氘代乙酰乙酸乙酯的物质量之比为1.2：1。

反应方程式如下：

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明方法对微量样品既可以定性又可以定量，检测灵敏度高，操作简便，可以同时对两种未知样品进行相对定量，质谱图信噪比低，分离所需的流动相极生小，对色谱柱有很好的保护作用，大大延长了柱子的使用寿命。本发明方法比传统PMP衍生法的灵敏度高4-5倍，比传统NMP衍生法能够更好地分离单糖，不会出现单糖色谱峰重叠的现象。

附图说明

图1为七种单糖标准品D3NMP衍生产物的紫外吸收图。

图2为葡糖糖NMP衍生物及葡萄糖D3NMP衍生物的质谱图。

图3为葡糖糖醛酸NMP衍生物及葡萄糖醛酸D3NMP衍生物的质谱图。

图4为葡糖糖胺NMP衍生物及葡萄糖胺D3NMP衍生物的质谱图。

图5为未知样品1的NMP衍生物及未知样品2的D3NMP衍生物的质谱图。

图6为七种单糖标准品PMP衍生产物与D3NMP衍生产物紫外吸收对比图。

图7为标准单糖NMP衍生物的色谱分离图。

图8为甘露糖NMP衍生产物的一级质谱图。

具体实施方式

实施例1 D3NMP的制备

称取萘肼盐酸盐5g，置于60mL水中，加热至100℃，使其完全溶解，用20％NaOH溶液调节至8-9，抽滤后得到固体，用水洗涤直至PH为7，抽滤后真空干燥，得3.5g萘肼。

将2g萘肼加入20mL无水乙醇中，于55℃水浴条件下搅拌至其溶解，滴加1.37g氘代乙酰乙酸乙酯，滴加完毕后反应2h，然后升温至80℃回流7h，将反应液减压浓缩至原体积的1／3，用10mL甲醇将其重结晶3次，得0.9gD3NMP。

计算得D3NMP的收率为33.3％

实施例2 D3NMP衍生产物的液相分析

将D3NMP配成0.5mol／L乙醇溶液，在氨水碱性介质下和葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、岩藻糖(0.05mol／L)于70℃条件下反应90mm。反应完毕后，用氯仿萃取3次，离心，取上清液，终体积为25uL，进行LC-MS分析。液相条件：液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速1mL／min，流动相A为乙腈，流动相B为0.01mol／L乙酸铵溶液，上样量为2uL；流动相条件：流动相29％A15min，29％A30min线性增加到33％A，33％A15min线性增加到35％A，29％A10min，245nm检测。结果见图1。

结果显示，D3NMP衍生的七种单糖得到了很好的分离。

实施例3 NMP、D3NMP衍生的LC-MS分析

将NMP／D3NMP配成0.5mo1/L乙醇溶液，在氨水碱性介质下NMP与已知量的葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺(0.01mol／L)共10uL反应，D3NMP与待测的葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺反应，70℃反应90min。反应完毕后，用氯仿萃取3次，离心，取上清液，终体积都为50uL，等体积混合已知量与未知量样品，进行LC-MS分析。液相条件：液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为乙腈，流动相B为0.01mol／L乙酸铵溶液，上样量为0.02uL；流动相条件：流动相27％A15min，27％A30min线性增加到31％A，31％A15min线性增加到34％A，27％A10min，245nm检测。质谱检测为负离子模式。结果见图2，图3，图4。

图2显示，m／z＝609.22为NMP衍生的葡萄糖的质谱峰，m／z=615.24为D3NMP衍生的葡萄糖的质谱峰，两种衍生试剂可以成功衍生葡萄糖，通过相对丰度可知，待测葡萄糖的浓度为0.82mg／mL。

图3显示，m／z＝623.20为NMP衍生的葡萄糖醛酸的质谱峰，m／z=629.24为D3NMP衍生的葡萄糖醛酸的质谱峰，两种衍生试剂可以成功衍生葡萄糖醛酸，通过相对丰度可知，待测葡萄糖醛酸的浓度为0.7mg／mL。

图4显示，m／z＝608.22为NMP衍生的葡萄糖胺的质谱峰，m／z＝614.24为D3NMP衍生的葡萄糖胺的质谱峰，两种衍生试剂可以成功衍生葡萄糖胺，通过相对丰度可知，待测葡萄糖胺的浓度为0.8mg／mL。

本实施例采用D3NMP和NMP分别衍生待测样品和已知样品，进行LC-MS分析，不仅能对待测样品进行定性而且还能定量。

实施例4 NMP、D3NMP衍生两种未知样品的LC-MS分析

将NMP／D3NMP配成0.5mol／L乙醇溶液，取含甘露糖的未知样品1和未知样品2各10uL，分别在氨水碱性介质下与NMP和D3NMP于70℃反应90min。反应完毕后，用氯仿萃取3次，离心，取上清液，终体积都为50uL，等体积混合未知样品1和未知样品2，进行LC-MS分析。液相条件：液相柱0.3×250mmSB-C18柱(5un，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为乙腈，流动相B为0.01mol／L乙酸铵溶液，上样量为0.02uL；流动相条件：流动相27％A15min，27％A30min线性增加到31％A，31％A15min线性增加到34％A，27％A10min，245nm检测。质谱检测为负离子模式。结果见图5。

图5显示，m／z＝609.22为NMP衍生的未知样品1中甘露糖的质谱峰，m／z=615.24为D3NMP衍生的未知样品2中甘露糖的质谱峰，样品1中甘露糖的含量是样品2中甘露糖含量的1.82倍。说明该方法可以同时对两种未知样品进行相对定量。

对比实施例1 PMP衍生产物的液相分析

将PMP配成0.5mol／L乙醇溶液，在氨水碱性介质下和葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、岩藻糖(0.05mol／L)于70℃条件下反应90min。反应完毕后，用氯仿萃取3次，离心，取上清液，终体积为25ul，进行LC-MS分析。液相条件：液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速1mL／min，流动相A为乙腈，流动相B为0.01mol／L乙酸铵溶液，上样量为2uL；流动相条件：流动相17％A10min，17％A30min线性增加到21％A，21％A10min线性增加到23％A，17％A10min，245nm检测。结果见图6。

图6显示，PMP衍生的七种单糖得到了很好的分离。比较PMP衍生产物与D3NMP衍生产物的紫外吸收图，后者坐标比前者升高了4-5倍，说明对于等量样品的分析，D3NMP衍生比PMP衍生灵敏度升高了4-5倍。实施例2的流动相中乙腈含量比对比实施例1流动相中乙腈含量高，说明实施例2比对比实施例1的流动相极性小，这样对C-18反相柱有很好的保护作用，大大延长了柱子的使用寿命。

对比实施例2 NMP衍生产物的LC-MS分析

孙志伟等报道NMP衍生产物的LC-MS分析(孙志伟，刘凌君，户宝军，等.1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡比唑啉酮衍生试剂的制备及其在高效液相色谱-质谱法测定糖类化合物中的应用[J].色谱,2008(02)：200～205)，详细过程是：向安瓿瓶中加入200mL NMP乙腈溶液、20mL单糖标准品混合液、20mL17％氨水，封口后于70℃水浴中反应35min，取出放冷后用氮气吹干，加入2mL乙腈-水(体积比为4：1)超声溶解，取10uL进样分析。色谱柱：Hypersil ODS2柱(4.6mm×200mm，5um)。流动相：A相为30％乙腈(含30mmol／LNH₄H₂PO₄)；B相为60％乙腈。洗脱程序：0-50min，100％A-55％A；流速1.0m L／min；进样量10uL；柱温30℃；检测波长254nm。质谱条件：质谱分析时缓冲盐换为20mmol／L CH₃COONH₄(pH=5.0)。电喷雾电离源，正离子模式监测，电喷雾压力241.3kPa(35psi)，干燥气流量为9L／min，干燥气温度350℃，毛细管电压3500V，单糖分离结果见图7，图8。

比较对比实施例2与实施例2的紫外吸收图，由图1可知，本发明可以很好地分离七种单糖标准品，但图7显示，两种中性糖葡萄糖和半乳糖并没有得到分离，二者的质谱峰有重叠，此结果说明本发明方法比传统的NMP方法可以更好地分离单糖。

比较对比实施例2与实施例3，对比实施例2最后用于LC-MS分析的每种单糖的物质的量为1×10^-2umol，而实施例3最终的量为1×10^-4umol，说明实施例3检测样品用量比对比实施例2降低了100倍；比较图2、图3、图4和图8，图2、图3，图4比图8的杂峰少，说明信噪比低；对比实施例2只能对待测样品进行定性，不能用LC-MS进行定量。

实施例2-4单糖与NMP、D3NMP的反应方程式如下：

X=H或D。

反应式中的葡萄糖可以为其他单糖，当X=H时反应物为NMP，当X=D时反应物为D3NMP。

Claims (3)

1.一种检测单糖的方法，包括如下步骤：

(1)用衍生试剂对单糖进行衍生；

(2)将衍生产物进行液相色谱质谱联用(LC-MS)分析；

其特征在于，所述的衍生试剂包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)；

所述的衍生试剂D3NMP单独使用或与NMP联用。

2.如权利要求1所述的一种检测单糖的方法，其特征在于，所述的单糖为动物、植物和微生物来源的多糖及寡糖的基本组成单元。

3.制备权利要求1或2任意一项所述的D3NMP的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)称取萘肼盐酸盐，置于水中，加热至100℃，使其完全溶解，用20％NaOH溶液调节PH至8-9，抽滤后得到固体，用水洗涤直至PH为7，抽滤后真空干燥，得萘肼；

(2)将萘肼加入无水乙醇中，于55℃水浴条件下搅拌至其溶解，滴加氘代乙酰乙酸乙酯，滴加完毕后反应2h，然后升温至80℃回流7h，将反应液减压浓缩至原体积的1／3，用甲醇将其重结晶3次，得D3NMP；

所述的萘肼与氘代乙酰乙酸乙酯的物质量之比为1.2∶1。

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