CN102936235A

CN102936235A - 葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102936235A
Application number: CN2012104410222A
Authority: CN
Inventors: 王凤芹; 杨航仙; 汪以真
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2032-11-07
Also published as: CN102936235B

Abstract

本发明公开了葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物及其制备方法和应用。取8g/mL的葡萄糖醛酸0.5mL于水解管中，55℃水浴加热，氮气吹干；然后加入乙硫醇2mL和三氟乙酸1mL，25℃水浴磁力搅拌25分钟，55℃水浴加热，氮气吹干；然后加入醋酐2mL和吡啶2mL，55℃水浴，磁力搅拌5小时，得到葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物。取岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸应用以上方法直接进入气相色谱-质谱联用分析得到岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸的含量。本发明得到了葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物；对糖醛酸含量的测定避免了使用对水分十分敏感的硅醚化试剂，能够有效提高样品检测的可操作性和准确性；能够同时检测中性糖和酸性糖。

Description

葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

在多糖的结构研究中，单糖组成分析是必不可少的环节。常见的单糖分析方法有柱前衍生化高效液相色谱法，主要的衍生化试剂有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮（NMP），对氨基苯甲酸（p-AMBA）。衍生化后的产物经HPLC分离、紫外检测器检测。另外，采用较多的是气相色谱法，因为单糖本身没有足够的挥发性，必须在气相色谱分析之前预先转化成易挥发、对热稳定的衍生物，常见的单糖衍生物有三甲基硅醚衍生物、糖肟三甲基硅醚衍生物、糖腈乙酸酯衍生物、糖醇乙酸酯衍生物和三氟乙酸酯衍生物等。在这些衍生化方法中，糖醛酸不能糖腈乙酸酯衍生化和糖醇乙酸酯衍生化（Foster C E, Martin T M, Pauly M. J Vis Exp, 2010, 37 : 1）。 Hama等（Hama Y, Nakagawa H, Kurosawa M, et al. Anal Biochem, 1998, 265 : 42）通过乙硫醇和氯化氢气体对多糖进行硫醇解，再通过硅烷化试剂对单糖进行衍生。Pitthard等（Pitthard V, Finch P. Chromatographia, 2001, 53 : 317）在此基础上改进，通过乙硫醇—三氟乙酸和六甲基二硅氮烷—三甲基硅烷体系对单糖和糖醛酸进行衍生，成功利用GC-MS分析了植物胶中的单糖和糖醛酸；同时也研究了单糖和糖醛酸的乙硫醇-乙酸酯化衍生物，但是认为糖醛酸不能用该方法衍生。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种制备葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物方法、萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物，以及气相色谱-质谱联用同时分析中性糖和糖醛酸的方法。

一种葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物，其分子结构式

。

所述的葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物的制备方法，取8 g/mL的葡萄糖醛酸0.5 mL于水解管中，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入乙硫醇2 mL和三氟乙酸1 mL，25 ℃水浴磁力搅拌25 分钟，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入醋酐2 mL和吡啶2mL，55℃水浴，磁力搅拌5 小时，得到葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物。

所述葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物的制备方法的应用，用于气相色谱-质谱联用同时分析中性糖和糖醛酸。

所述气相色谱-质谱联用同时分析中性糖和糖醛酸的方法，取8 g/mL的岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸各0.5 mL于同一水解管中混合，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入2 mL乙硫醇和1 mL三氟乙酸，25 ℃水浴磁力搅拌25 分钟，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入醋酐2 mL和吡啶2mL，55℃水浴，磁力搅拌5 小时，不经过浓缩，直接进入气相色谱-质谱联用分析得到岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸的含量。

所述的岩藻糖、葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸来源于Enterobacter cloacae Z0206细菌分泌的多糖水解产物。

本发明的有益效果

本发明得到了葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物；对糖醛酸含量的测定避免了使用对水分十分敏感的硅醚化试剂，因为对糖的硅醚化反应而言，样品的干燥和反应体系无水环境不易控制，少量的水分就可使其失去硅醚化反应能力，因此对反应体系的环境要求很高，易产生实验误差性，而本发明恰恰弥补这一缺陷，能够有效提高样品检测的可操作性和准确性；通过验证分析，岩藻糖、葡萄糖和半乳糖的含量与糖醇乙酸酯化吻合，而糖醛酸含量也与传统的糖醛酸咔唑法测定结果接近，能够同时检测中性糖和酸性糖，不仅高效测定样品中各糖分的含量，而且省时省力，避免样品的耗损，以及仪器重复使用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细的说明；

图1 Z0206细菌纯化多糖EPS的高效凝胶渗透色谱图；

图2木糖为内标的单糖和葡萄糖醛酸标样的缩硫醇乙酸酯化衍生物总离子流色谱图；

图3缩硫醇乙酸酯化葡萄糖醛酸衍生物质谱图；

图4缩硫醇乙酸酯化葡萄糖醛酸质谱裂解途径；

图5单糖乙酸酯化衍生物气相色谱图。

具体实施方式

一种制备葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物的方法，取8 g/mL的葡萄糖醛酸0.5 mL于水解管中，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入乙硫醇2 mL和三氟乙酸1 mL，25 ℃水浴磁力搅拌25 分钟，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入醋酐2 mL和吡啶2mL，55℃水浴，磁力搅拌5 小时，得到葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物。

所述的方法制备的葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物。

一种气相色谱-质谱联用同时分析中性糖和糖醛酸的方法，取8 g/mL的岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸各0.5 mL于同一水解管中混合，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入2 mL乙硫醇和1 mL三氟乙酸，25 ℃水浴磁力搅拌25 分钟，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入醋酐2 mL和吡啶2mL，55℃水浴，磁力搅拌5 小时，不经过浓缩，直接进入气相色谱-质谱联用分析得到岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸的含量。

仪器与试剂

Waters Alliance 2695高效液相色谱系统（美国Waters公司），含Waters 2414示差折光检测器和Empower 3色谱工作站。Ultrahydrogel 250, 500, 1000串联色谱柱；Trace DSQ气质联用仪（美国Thermo公司）；Agilent 7890A气相色谱仪（美国惠普公司），FID检测器；集热式恒温加热磁力搅拌器（杭州惠创仪器设备有限公司），N-EVAP^TM112氮吹仪（美国Organonation Associates公司）。木糖、岩藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、乙硫醇、三氟乙酸和咔唑均从sigma公司购买。吡啶、醋酸酐、硼氢化钠、十水合四硼酸钠、乙醇、甲醇、盐酸、氢氧化钠、二氯甲烷、氯化钠和冰醋酸酸均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产。

多糖样品：Enterobacter cloacae Z0206（Z0206）细菌由本课题组分离、驯化、鉴定并保存（中国专利申请号200810121312.2）。该细菌分泌的多糖（EPSs）为该研究所用的样品。

实施例1 多糖的分离纯化

将Z0206细菌分泌多糖用酒精沉淀并烘干。称取约20 克溶于80 ℃热水中提取约5 小时。用酶法结合Sevag法脱去蛋白质，得到的脱蛋白的粗多糖再经过DEAE-52纤维素柱层析分离，水和氯化钠溶液梯度洗脱。苯酚硫酸法检测，收集的洗脱液透析并冷冻干燥。

实施例2 多糖的完全酸水解

精确称取15 mg纯化多糖样品EPS于水解管中，加入0.5 mL木糖标准溶液（8 g/mL），再加入 3.5 mL三氟乙酸溶液（3 mol/L），密封后放置在120℃烘箱中，水解5 小时，后氮气吹干备用。

实施例3 单糖及糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物的制备

取8 g/mL的单糖（4种）及葡萄糖醛酸标样各0.5 mL于同一水解管中混合。55 ℃水浴加热，氮气吹干。加入2 mL乙硫醇和1 mL三氟乙酸，25 ℃水浴磁力搅拌25 分钟。55 ℃水浴加热，氮气吹干。然后加入4 mL醋酐-吡啶混合物（V/V，1:1），55℃水浴，磁力搅拌5 小时。溶剂不需要浓缩，直接进GC-MS分析。

完全酸水解产物的衍生化同上。

实施例4 单糖糖醇乙酸酯衍生物的制备

单糖的组成分析参考文献报道（Sawardeker J S, Sloneker J H, Jeanes A. Anal Chem, 1965, 37(12) : 1602）。按实施例2步骤水解15 mg纯化多糖样品，氮气吹干后，加入15 mg硼氢化钠，再加入3 mL 0.1% 氢氧化钠室温下还原10 小时，滴入数滴冰醋酸酸至无气泡冒出。加入盐酸-甲醇（V/V，1:100）反复氮吹。再加入4 mL醋酐-吡啶混合物（V/V，1:1），55 ℃水浴，磁力搅拌5 小时。溶剂不需要浓缩，直接进GC分析。

实施例5 色谱/色质联用条件

GC色谱条件：DB-1701石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），汽化室温度280 ℃，检测器温度300 ℃，以高纯氮气为载气，流速为2 mL/min，进样量0.3 uL。柱温程序升温：120 ℃→4 ℃/min→220 ℃保持10 min。

GC-MS色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），汽化室温度: 280 ℃，以高纯氦气为载气，流速为1 mL/min，进样量0.3 uL。柱温程序升温:80 ℃→2 min→15 ℃/min→200 ℃→1 ℃/min→210 ℃→25 ℃/min→280 ℃→6 min。接口温度: 260 ℃；EI+ 源: 70 eV , 220 ℃扫描频率: 1.5 次/ s, 质量范围: m/z 35～600。

实施例6 单糖的校正因子及摩尔比的计算

以木糖为内标，测定岩藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖的定量校正因子（f _i/s）。精密量取各标准溶液（均配成8 mg/mL）0.5 mL，按以上实施例3方法进行衍生反应。GC-MS分析，得到各组分的峰面积与内标的峰面积比，乘以f/M (M为各组分的分子量)，所得的值之比即为摩尔比，即R_i/s=f _i/s(A_i/A_s)/M。

实施例7 糖醛酸咔唑反应测定糖醛酸

按以上水解方法水解纯化多糖样品EPS 71.4 mg，氮气吹干溶剂，用250 mL去离子水定容，备用。

配制葡萄糖醛酸标准溶液4~40 ug/mL备用。

量取含0.025 M十水合四硼酸钠硫酸试剂5 mL，冰水浴冷却后加入1 mL样品剧烈摇动，冷却后加入0.2 mL 0.125% 咔唑乙醇溶液，剧烈摇动，沸水浴加热10 分钟。冷却后测定λ=530 nm处的吸光度。以吸光度对糖醛酸浓度制作标准曲线。

根据以上实施例1-7得到结果与讨论：

1、多糖的均一性及分子量分析

多糖经过柱分离，冷冻干燥后获得纯化多糖（EPS）。经HPGPC（条件: Ultrahydrogel-250, 500, 1000 multiple column; 溶剂, 0.1 M sodium chloride; 流速1mL/min）鉴定为单一对称峰（图1），表明该多糖为均质多糖，经分析该多糖分子量约为11万左右。

2、单糖及糖醛酸的衍生及定量分析

根据文献（Pitthard V, Finch P. Chromatographia, 2001, 53 : 317）单糖反应式如下a所示，本发明的葡萄糖醛酸的反应式如下b所示，葡萄糖醛酸的C-3位的-OH与C-6位的-COOH缩合形成五元环的内酯。衍生后经GC-MS分析如图2（HP-5MS column (30 m×0.32 mm); helium 流速 1 mL/min; 注射器和检测器温度界面温度分别设到280 and 260 ℃.）所示，经葡萄糖醛酸衍生物的保留时间和分子离子峰确认反应路线可行。并非如文献报道乙硫醇-三氟乙酸和醋酐-吡啶体系反应糖醛酸衍生物经GC-MS分析不能出峰。内标法定量结果如表1所示，样品中岩藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖摩尔比为1.91: 1.27: 1: 2.62。

表1 纯化多糖中三种单糖和葡萄糖醛酸缩硫醇乙酸酯化衍生物气相色谱质谱联用分析结果

组分	保留时间	校正因子	摩尔比例
				Fucose	20.47	1.35	1.91
Glucose	22.90	1.26	1.27
				Gluronic acid	22.97	2.97	1.0
Galactose	23.10	1.34	2.62

3、单糖及糖醛酸的衍生物的质谱解析

由葡萄糖醛酸衍生物EI质谱图（图3，EI 正源, 70 eV; 扫描率1.5 scan s^-1; 质谱记录范围m/z 35～600 Da.）可见分子离子峰为408，这与衍生物的理论分子量一致。由表2所示的单糖及糖醛酸质谱数据来看，四种单糖（含木糖）与葡萄糖醛酸均具有m/z 43、m/z 135和m/z 177这三种共同的碎片离子。其中最为显著的是碎片离子m/z 135，其代表的是离子(CH₃CH₂S)₂CH⁺。其产生有两种可能的途径（图4），第一种途径是：C1和C2键断裂，一个电子保留在C2上；第二种途径是：葡萄糖醛酸的分子离子相继丢失了一分子乙酸和乙烯酮。

由分子离子m/z 408丢失一个乙硫醇自由基产生了碎片离子m/z 347；分子离子丢失乙酸、乙烯酮和水等中性分子及乙硫醇和乙酰自由基后产生一系列的碎片离子m/z 287, m/z 245, m/z 203, m/z 185等。

而碎片离子m/z 243的产生可能是在分子离子m/z 408相继丢失了一个乙硫醇自由基，一个乙酸分子和一个二氧化碳分子后形成。其形成的机理可能是葡萄糖醛酸C3位的羟基和C6位的羧基形成的5元环内酯，经先后丢失乙硫醇自由基和乙酸分子后开环，再丢失一个二氧化碳分子，从而形成3元环的碎片离子。该碎片离子继续丢失一个乙酸分子形成碎片离子m/z 183，在此基础上，再接着丢失一个乙烯酮分子则形成了碎片离子m/z 141。

以上结果及分析表明，糖醛酸得到了有效衍生化，并且质谱断裂特征明显。

表2 五种糖的缩硫醇乙酸酯化衍生物气相色谱－质谱分析结果

4、单糖糖醇乙酸酯化定量分析

三种单糖经糖醇乙酸酯化后经GC分析（见图5，DB-1701 column (30 m×0.32 mm); nitrogen 流速 2 mL/min; 注射器和检测器温度界面温度分别设到280 and 300 ℃.），用面积归一化法定量，根据峰面积比得到岩藻糖、葡萄糖和半乳糖摩尔比：1.94: 1.27: 2.52（见表3）。与本发明所设计的内标法定量分析岩藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖组成（摩尔比为1.91: 1.27: 1: 2.62）分析结果吻合。

表3 三种单糖的糖醇乙酸酯化衍生物气相色谱分析结果

组分	保留时间	摩尔比例	面积 (%)
				Fucose	20.025	1.94	33.851
Galactose	26.664	2.52	43.967
				Glucose	26.990	1.27	22.182

5、糖醛酸咔唑法定量分析糖醛酸

糖醛酸咔唑法分析糖醛酸，当葡萄糖醛酸的浓度在4~40 ug/mL 时，吸光度与葡萄糖醛酸浓度之间有线性关系，线性方程为：Y=0.013X-0.007(R²=0.998)，其中X为葡萄糖醛酸浓度，Y为吸光度值。分析样品中糖醛酸含量为14.85%，因为前期研究中定量分析多糖结构中丙酮酸的含量为7.6%，折算出糖醛酸的含量为16.19%。两种方法分析葡萄糖醛酸结果较为接近。

Claims

1.一种葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物，其特征是：其分子结构式为

Figure 2012104410222100001DEST_PATH_IMAGE002

。

2.一种如权利要求1所述的葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物的制备方法，其特征是：取8 g/mL的葡萄糖醛酸0.5 mL于水解管中，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入乙硫醇2 mL和三氟乙酸1 mL，25 ℃水浴磁力搅拌25 分钟，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入醋酐2 mL和吡啶2mL，55℃水浴，磁力搅拌5 小时，得到葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物。

3.一种如权利要求2所述葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物的制备方法的应用，其特征是：用于气相色谱-质谱联用同时分析中性糖和糖醛酸。

4.如权利要求3所述葡萄糖醛酸缩硫醇-乙酸酯衍生物的制备方法的应用，其特征是：所述气相色谱-质谱联用同时分析中性糖和糖醛酸的方法，取8 g/mL的岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸各0.5 mL于同一水解管中混合，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入2 mL乙硫醇和1 mL三氟乙酸，25 ℃水浴磁力搅拌25 分钟，55 ℃水浴加热，氮气吹干；然后加入醋酐2 mL和吡啶2mL，55℃水浴，磁力搅拌5 小时，不经过浓缩，直接进入气相色谱-质谱联用分析得到岩藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖及葡萄糖醛酸的含量。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是：所述的岩藻糖、葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸来源于Enterobacter cloacae Z0206细菌分泌的多糖水解产物。