CN103512995A - 啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质同时检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质同时检测的方法，采用顶空衍生固相微萃取-GCMS/MS的方法进行检测，采用了PFBBr作为衍生试剂，并在萃取过程中加入NaCl、EDTA，将吸附了含硫物质的萃取头通过GC-MS/M解析、分离、检测。本发明改变纤维萃取头吸附特性，使不能有效萃取MBT等微量硫醇的纤维萃取头实现了对啤酒及麦汁挥发物中的挥发性非硫醇含硫化合物及硫醇衍生物的同时衍生和萃取，以达到同时检测非硫醇含硫化合物及硫醇物质的目的。本发明可在同一过程依次完成衍生剂吸附、衍生、萃取、进样、分离和检测五个步骤，实现了自动化连续操作，提高了检测效率和准确性，实现了10种啤酒及麦汁中的非硫醇含硫化合物及硫醇物质的准确高效定量分析。

Description

啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质同时检测的方法

技术领域

本发明创造涉及一种啤酒的分析检测方法，具体涉及一种啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质同时检测的方法。 

背景技术

啤酒中的含硫化合物对啤酒风味是一把双刃剑。低于阈值时它们是构成啤酒风味不可少的物质，高于阈值时则会对啤酒风味带来不利的影响。随着消费者口味的改变，淡爽型啤酒的日益盛行，人们对啤酒中的不良风味物质的感觉越来越灵敏。因此了解啤酒中的含硫化合物，采取有效的措施减少啤酒中的含硫化合物，是酿造风味优良的啤酒的关键之一。啤酒中的含硫挥发性化合物有几十种，对啤酒风味影响较大的也有十几种，而且不排除它们之间能发生的相互转化。 

含硫化合物因其低含量、且挥发性等理化特性相差很大不宜检测，需要用合适的富集装置和高敏感、高选择的检测器才能对这些物质实现有效检测。虽然已有像SPME、吹扫捕集前处理技术和GCMS、PFPD等高灵敏度的检测器应用到啤酒中挥发性含硫化合物的检测，但至今还没有一个完备的方法同时检测啤酒中的多种主要含硫化合物。 

挥发性硫类物质对啤酒的风味影响很大，会赋予类似甜玉米、洋葱、硫臭以及白菜等味道。硫类物质在啤酒中含量较低，一般为0.1-20ppb。BRI(BrewingReasechInternationl国际酿造研究中心)对将硫味的描述分为总硫味、DMS味、洋葱味、硫化物味、烂白菜味、熟的蔬菜味，并认为硫代乙酸甲酯（S-MAC）、硫代乙酸乙酯（S-EAC）、3-甲硫基丙酸乙酯（3-MePrAc）、3-甲硫基丙醇（3-MeProl）二甲基二硫（DMDS）、二甲基三硫（DMTS）为啤酒中主要非硫醇含硫风味物质，而主要硫醇如甲硫醇（MT）、乙硫醇（ET）和3-甲基-2-丁烯-1-硫醇（MBT）、苄硫醇（BMT）等对啤酒风味影响也很大。我们对目前国外主要关注的硫类化合物于整理，如表1。由于硫醇物质具有风味活性高、阈值低的特点，虽在啤酒中的含量极低，控制不当也会对啤酒风味造成极大的影响，例如甲硫醇、3-甲基-2-丁烯-1-硫醇、苄硫醇。甲硫醇是硫醇的代表性物质，据报道其风味阈值仅为0.15μg/L，通常情况下其含量不高，一旦控制不当将会导致恶心的腐败味，对啤酒风味造成严重的不良影响。同时，甲硫醇是许多硫化合物的前驱体，因而其含量多少对啤酒品质的影响很大。同时，啤酒的风味物质多达千种，背景的复杂性使得微量硫醇的检测更为困难，一直是酿造研究者未顺利攻克的难题。3-甲基-2-丁烯-1-硫醇（MBT）是通常所说的啤酒被太阳光暴晒后产生的“臭鼬味或日光臭”的物质基础，其风味阈值为2ng/L，一般认为其含量的多少与异α-酸（来自酒花）的侧链降解有关。苄硫醇的 

风味阈值为1.7ng/L，通常是使用质量不好的酒花造成的。 

表1啤酒中主要含硫化合物阈值及其风味特征 

目前国内外，检测啤酒中甲硫醇、乙硫醇的方法主要有HongLi（JAmSocBrewChem,2008,66(3):188）顶空气相色谱法、贺立东（啤酒科技，2010，12）顶空固相微萃取结合气质联用仪等方法。上述两种方法只能实现μg/L级的含硫化合物检测，对于含量只有几个ng/L的MBT和BMT因检出限问题无法实现有效检测。R.E.Miracle（J.Am.Soc.Brew.Chem.63(3):129-134,2005）采用了顶空固相微萃取技术检测了啤酒中的甲硫醇、多硫化合物及硫代乙酸甲酯，但对MBT等痕量硫醇无法检测。PeterG.Hill（Germany，EBC2001）将啤酒进行强化试验，其中MBT前驱体全部转化为MBT，再利用顶空固相微萃取结合GC-MS检测，此法不能反映啤酒中MBT及其前驱体的含量，而非MBT的真实值，因此在实际风味缺陷的研究应用中意义不大。SabrinaNizet（J.Am.Soc.Brew.Chem.71（1）：15-22，2013）采用pHMB汞苯试剂萃取、结合气质的方法测定，虽能够检测十几种硫醇物质，但使用的萃取溶液毒性大容易对人体造成伤害，且步骤多、重现性差、需要定置复杂的低温旋转蒸发系统。目前该设备还未商品化，只是个别科研机构在做研究，不适合日常检测使用。另外，Laura Mateo-Vivaracho（JournalofChromatographyA,1121(2006)1–9）利用顶空固相微萃取衍生技术结合化学源（CI）质谱等方法。此方法只能检测MBT等高分子硫醇，不能同时完成低分子硫醇与高分子硫醇的检测，且一般有气质的实验室多只装备EI源、不装备CI源。文献报道的含硫物质检测方法的缺陷见表2。 

表2上述文献报道的方法的缺陷 

发明内容

本发明采用了PFBBr（五氟苯甲基溴）作为衍生试剂，通过将纤维萃取头吸附衍生试剂，使其吸附能力发生改变，从而能够吸附挥发性非硫醇含硫化合物及硫醇衍生物（硫醇-PFBBr），如果纤维萃取头不吸附衍生试剂则其只能吸附挥发性非硫醇含硫化合物和含量较高的甲硫醇、乙硫醇，根本无法实现微量3-甲基-2-丁烯-1-硫醇（MBT）、苄硫醇（BMT）的有效吸附。衍生试剂与啤酒及麦汁中的硫醇物质含有的巯基相结合形成稳定的衍生化合物，这些化合物与相应的硫醇相比分子量增大，分子离子峰在GC-MS/MS的高质量端有明显的响应，从而避免了低分子碎片的干扰。同时，二级质谱的使用比单四极杆质谱具有更高灵敏度，这样可进一步提高信噪比，降低最小检出限，使硫醇的检测范围达到ng/L。本发明通过挥发性非硫醇含硫化合物和硫醇衍生的同时有效萃取以及高分辨GC-MS/MS技术的结合，实现了啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质的同时检测。 

本发明的技术方案是： 

一种啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质同时检测的方法，其特征在于，所述方法利用五氟苯甲基溴（PFBBr）改性PDMS/DVB纤维萃取头，同时吸附啤酒及麦汁中的挥发性硫醇衍生物及非硫醇含硫化合物，再经GC-MS/MS进行检测，具体步骤如下： 

（1）将检测样品排气，取5mL放入20mL顶空瓶中； 

（2）在顶空瓶中再加入2gNaCl； 

（3）再向顶空瓶中加入0.01～0.05g铜离子螯合剂； 

（4）将65μmPDMS/DVB萃取头插入装有五氟苯甲基溴（PFBBr）衍生液的顶空瓶内10分钟使衍生液吸附在纤维萃取头上；将吸附了PFBBr纤维萃取头插入装有检测样品的顶空瓶内进行萃取，萃取衍生温度为55℃，萃取衍生时间为10分钟。 

（5）萃取完毕，将纤维萃取头插入气相色谱（GC）进样口，解吸2分钟进入GC-MS/MS检测。 

所述步骤（4）纤维萃取头衍生化过程，改变其吸附特性，使其原本只能吸附非硫醇含硫化合物的纤维萃取头保留对非硫醇含硫化合物的吸附能力的同时也能吸附硫醇衍生物，使其能达到同时吸附非硫醇含硫化合物及微量硫醇衍生物目的。 

在以上方案的基础上，所述步骤（3）向啤酒及麦汁样品中加入0.025gEDTA，使其样品中的浓度达到5000mg/L，这样使铜离子等被螯合，从而降低铜离子对硫醇物质检测的干扰。 

在以上方案的基础上，所述步骤（5）中的GC-MS/MS的检测条件如下： 

（1）色谱条件为：气相色谱柱为DB-5MS，0.25mm内径，15m长，膜厚0.25μm；载气为氦气，流速1.5mL/min，进样口温度250℃，无分流进样；程序升温：60℃保持2分钟，10℃/分钟升温至130℃，5℃/分钟升温至180℃，30℃/分钟升温至300℃，保持2分钟； 

（2）质谱条件为：电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV；气相色谱-二级质谱联用（GC-MS/MS）接口温度：250℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：180℃；全扫描范围：40～400amu；采用标准物质定性，采用子离子模式定量。 

在以上方案的基础上，所述非硫醇含硫化合物和硫醇物质为硫代乙酸甲酯、硫代乙酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙醇、二甲基二硫、二甲基三硫、甲硫醇、乙硫醇、3-甲基-2-丁烯-1-硫醇、苄硫醇的一种或几种的组合。 

本发明的有益效果：采用顶空衍生固相微萃取-GC-MS/MS，与常规的检测方法相比，具备以下优势： 

（1）通过使用EDTA，提高检测的稳定性和重现性。EDAT可与检测样品中的Cu²⁺等金属离子形成络合物，Cu²⁺作为催化剂参与硫醇氧化，Cu²⁺的减少可确保硫醇的稳定，从而保证结果的稳定性、灵敏性。 

（2）本发明通过NaCl的添加有效提高了非硫醇含硫化合物及硫醇在啤酒中及麦汁中的挥发度，提高被测组分的吸附，便于进一步降低检测的最小检出限，提高了检测结果的真实性和可靠性。 

（3）五氟苯甲基溴衍生的PDMS/DVB纤维萃取头萃取特性发生了变化，可同时萃取啤酒及麦汁挥发物中的挥发性非硫醇含硫化合物及硫醇衍生物，降低了其它挥发物对检测的干扰，实现啤酒中的共10种硫类物质的准确的定量检测。 

（4）本发明利用电子轰击离子源-GC-MS/MS的方法，无需使用传统检测为实现多种含硫物质而必须使用的pHMB等剧毒试剂，并减少了人为操作、降低了基体差异效应，实现了 微量硫醇的安全、高效、准确的检测。 

（5）本发明在一个过程中同时完成了衍生剂吸附、（衍生）萃取、进样、分离和检测五个步骤，操作简单，实现自动化，提高结果准确率和稳定性，检测效率高，能满足样品大量检测的商业化需求。 

附图说明

图1为本发明实施例1中麦汁样品1#的质谱图，共有10个特征峰，其中①为MT、②为ET、③为MBT、④为BMT、⑤为S-MAC、⑥为S-EAC、⑦为3-MePrAc、⑧为3-MeProl、⑨为DMDS、⑩为DMTS； 

图2本发明实施例1中麦汁样品2#的质谱图，共有10个特征峰，其中①为MT、②为ET、③为MBT、④为BMT、⑤为S-MAC、⑥为S-EAC、⑦为3-MePrAc、⑧为3-MeProl、⑨为DMDS、⑩为DMTS； 

图3本发明实施例2中啤酒样品1#的质谱图，共有10个特征峰，其中①为MT、②为ET、③为MBT、④为BMT、⑤为S-MAC、⑥为S-EAC、⑦为3-MePrAc、⑧为3-MeProl、⑨为DMDS、⑩为DMTS； 

图4本发明实施例2中啤酒样品2#的质谱图，共有10个特征峰，其中①为MT、②为ET、③为MBT、④为BMT、⑤为S-MAC、⑥为S-EAC、⑦为3-MePrAc、⑧为3-MeProl、⑨为DMDS、⑩为DMTS； 

图5本发明实施例3中啤酒样品3#的质谱图，共有10个特征峰，其中①为MT、②为ET、③为MBT、④为BMT、⑤为S-MAC、⑥为S-EAC、⑦为3-MePrAc、⑧为3-MeProl、⑨为DMDS、⑩为DMTS； 

图6本发明实施例3中啤酒样品4#的质谱图，共有10个特征峰，其中①为MT、②为ET、③为MBT、④为BMT、⑤为S-MAC、⑥为S-EAC、⑦为3-MePrAc、⑧为3-MeProl、⑨为DMDS、⑩为DMTS。 

具体实施方式

本发明的具体实施方式如下： 

（1）仪器：气相色谱质谱联用仪SCIONTQ（美国Bruker），固相微萃取自动进样器Autosampler（美国Bruker）。 

（2）试剂：硫代乙酸甲酯（99%）、硫代乙酸乙酯（99%）、3-甲硫基丙酸乙酯（95%）、3-甲硫基丙醇（98%）二甲基二硫（95%）、二甲基三硫（99%）、甲硫醇（99%）、乙硫醇（98%）、3-甲基-2-丁烯-1-硫醇（95%）、苄硫醇99%(美国Sigma公司)、PFBBr（99%）、EDTA（分析 纯AR）（上海试剂一厂）。 

标准曲线制定： 

定量分析通过仪器用标准物质进行校正，该标准物质被制成水溶液，并调节成与啤酒及麦汁相近的pH=4和酒精含量5%，用调制好的该溶液分别配置表3浓度标准溶液得到校准曲线。 

表3.10种化合物的标准曲线浓度（单位：ng/L）及方法验证指标 

标准曲线制作：将上述5个浓度的标样分别进行测试，得到相应被测组分峰面积。以横坐标为标样浓度，纵坐标为响应面积，分别得到MT-PFBBr、ET-PFBBr和MBT-PFBBr、BMT-PFBBr、硫代乙酸甲酯（S-MAC）、硫代乙酸乙酯（S-EAC）、3-甲硫基丙酸乙酯（3-MePrAc）、3-甲硫基丙醇（3-MeProl）二甲基二硫（DMDS）、二甲基三硫（DMTS）10条线性曲线和相应的曲线方程，根据此曲线计算检测样品中被测组分含量。 

实施例1： 

（1）将麦汁样品排气，取5mL放入20mL顶空瓶中； 

（2）在顶空瓶中再加入2gNaCl； 

（3）再向顶空瓶中加入0.025gEDTA(乙二胺四乙酸二钠)； 

（4）将65μmPDMS/DVB纤维萃取头插入装有五氟苯甲基溴（PFBBr）衍生液的顶空瓶内10分钟使衍生液吸附在纤维萃取头上；将吸附了PFBBr的纤维萃取头插入装有检测样品的顶空瓶内进行衍生萃取，萃取温度为55℃，萃取时间为10分钟； 

（5）萃取完毕，将纤维萃取头插入GC进样口，解吸2分钟进入GC-MS/MS检测；GC-MS/MS的检测条件如下： 

色谱条件为：气相色谱柱为DB-5MS，0.25mm内径，15m长，膜厚0.25μm；载气为 氦气，流速1.5mL/min，进样口温度250℃，无分流进样；程序升温：60℃保持2分钟，10℃/分钟升温至130℃，5℃/分钟升温至180℃，30℃/分钟升温至300℃，保持2分钟。 

质谱条件为：电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV；GC-MS/MS接口温度：250℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：180℃；全扫描范围：40～400amu；采用标准物质定性，采用子离子模式定量。表4列出了麦汁中10种目标组分的离子选择及能量优化条件。 

表4列出了10种目标组分的离子选择及能量优化条件。 

表4挥发性非硫醇含硫化合物及硫醇的定性定量离子选择 

麦汁1#和麦汁2#的含硫物质色谱图（如图1、2），表5列出麦汁1#和麦汁2#检测到的含硫物质含量。 

表5麦汁1#和麦汁2#中的含硫物质含量（单位：ng/L） 

实施例2 

（1）将啤酒样品排气，取5mL放入20mL顶空瓶中； 

（2）在顶空瓶中再加入2gNaCl； 

（3）再向顶空瓶中加入0.01gEDTA(乙二胺四乙酸二钠)； 

（4）将65μmPDMS/DVB纤维萃取头插入装有五氟苯甲基溴（PFBBr）衍生液的顶空瓶内10分钟使衍生液吸附在纤维萃取头上；将吸附了PFBBr的纤维萃取头插入装有检测样 品的顶空瓶内进行衍生萃取，萃取温度为55℃，萃取时间为10分钟； 

（5）萃取完毕，将纤维萃取头插入GC进样口，解吸2分钟进入GC-MS/MS检测；GC-MS/MS的检测条件如下： 

色谱条件为：气相色谱柱为DB-5MS，0.25mm内径，15m长，膜厚0.25μm；载气为氦气，流速1.5mL/min，进样口温度250℃，无分流进样；程序升温：60℃保持2分钟，10℃/分钟升温至130℃，5℃/分钟升温至180℃，30℃/分钟升温至300℃，保持2分钟。 

质谱条件为：电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV；GC-MS/MS接口温度：250℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：180℃；全扫描范围：40～400amu；采用标准物质定性，采用子离子模式定量。表4列出了啤酒中10种目标组分的离子选择及能量优化条件。 

啤酒1#和啤酒2#的含硫物质色谱图（如图3、4），表6列出啤酒1#和啤酒2#检测到的含硫物质的含量。 

表6啤酒1#和啤酒2#中的含硫物质含量（单位：ng/L） 

实施例3： 

（1）将啤酒样品排气，取5mL放入20mL顶空瓶中； 

（2）在顶空瓶中再加入2gNaCl； 

（3）再向顶空瓶中加入0.05gEDTA(乙二胺四乙酸二钠)； 

（4）将65μmPDMS/DVB纤维萃取头插入装有五氟苯甲基溴（PFBBr）衍生液的顶空瓶内10分钟使衍生液吸附在纤维萃取头上；将吸附了PFBBr的纤维萃取头插入装有检测样品的顶空瓶内进行衍生萃取，萃取温度为55℃，萃取时间为10分钟； 

（5）萃取完毕，将纤维萃取头插入GC进样口，解吸2分钟进入GC-MS/MS检测；GC-MS/MS的检测条件如下： 

色谱条件为：气相色谱柱为DB-5MS，0.25mm内径，15m长，膜厚0.25μm；载气为氦气，流速1.5mL/min，进样口温度250℃，无分流进样；程序升温：60℃保持2分钟，10℃/分钟升温至130℃，5℃/分钟升温至180℃，30℃/分钟升温至300℃，保持2分钟。 

质谱条件为：电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV；GC-MS/MS接口温度：250℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：180℃；全扫描范围：40～400amu；采用子离子模式定量。 

啤啤酒3#和啤酒4#的含硫物质色谱图（如图5-6），表7列出啤酒3#和啤酒4#检测到的 含硫物质的含量。 

表7啤酒3#和啤酒4#中的含硫物质含量（单位：ng/L） 

实施例4： 

（1）将成品啤酒排气，分别取10个5mL样品放入10个20mL顶空瓶中； 

（2）在顶空瓶中再加入2gNaCl； 

（3）再向其中5个样品中加入0.05gEDTA(乙二胺四乙酸二钠)，做为添加EDTA组，另外5个样品作为不添加EDTA组； 

（4）将65μmPDMS/DVB纤维萃取头插入装有五氟苯甲基溴（PFBBr）衍生液的顶空瓶内10分钟使衍生液吸附在纤维萃取头上；将吸附了PFBBr的纤维萃取头插入装有检测样品的顶空瓶内进行衍生萃取，萃取温度为55℃，萃取时间为10分钟； 

（5）萃取完毕，将纤维萃取头插入GC进样口，解吸2分钟进入GC-MS/MS检测；GC-MS/MS的检测条件如下： 

色谱条件为：气相色谱柱为DB-5MS，0.25mm内径，15m长，膜厚0.25μm；载气为氦气，流速1.5mL/min，进样口温度250℃，无分流进样；程序升温：60℃保持2分钟，10℃/分钟升温至130℃，5℃/分钟升温至180℃，30℃/分钟升温至300℃，保持2分钟。 

质谱条件为：电子轰击(EI)离子源，电子能量70eV；GC-MS/MS接口温度：250℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：180℃；全扫描范围：40～400amu；采用子离子模式定量。 

（6）对MBT数据结果进行相对标准偏差计算。 

结果如表8。 

表8添加EDTA与未添加EDTA对照试验中MBT的含量及RSD%（单位：ng/L） 

由结果可知，添加EDAT可使检测MBT的检测数据的重现性提高，且检测数值比未添加EDTA时要低，进一步提升了方法的可靠性。 

Claims (4)

1.一种啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质同时检测的方法，其特征在于，所述方法利用五氟苯甲基溴（PFBBr）改性PDMS/DVB纤维萃取头，使其能够同时吸附啤酒及麦汁中的挥发性硫醇的PFBBr衍生物及非硫醇含硫化合物，然后进行GC-MS/MS进行检测，具体步骤如下：

（1）将检测样品排气，取5mL放入20mL顶空瓶中；

（2）在顶空瓶中再加入2g NaCl；

（3）再向顶空瓶中加入0.01～0.05g 铜离子螯合剂；

（4）将65μm PDMS/DVB纤维萃取头插入装有五氟苯甲基溴（PFBBr）衍生液的顶空瓶内10分钟，使衍生液吸附在纤维萃取头上；将吸附了PFBBr的纤维萃取头插入装有待检测样品的顶空瓶内进行衍生萃取，萃取温度为55℃，萃取时间为10分钟； 

（5）萃取完毕，将纤维萃取头插入气相色谱（GC）进样口，解吸2分钟进入GC-MS/MS检测。

2.根据权利要求1所述的啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质同时检测的方法，其特征在于所述步骤（3）向检测样品中加入0.025g EDTA，使其在检测样品中的浓度达到5000mg/L。

3.根据权利要求1或2任一项所述的啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质同时检测的方法，其特征在于所述步骤（5）中的GC-MS/MS的检测条件如下：

（1）色谱条件为：气相色谱柱为DB-5MS，0.25 mm 内径，15 m 长，膜厚0.25μm；载气为氦气，流速1.5mL/min，进样口温度250℃，无分流进样；程序升温：60℃保持2分钟，10℃/分钟升温至130℃，5℃/分钟升温至180℃，30℃/分钟升温至300℃，保持2分钟；

（2）质谱条件为：电子轰击(EI) 离子源，电子能量70eV；气相色谱-二级质谱联用（GC-MS/MS）接口温度：250℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：180℃；全扫描范围：40～400amu；采用标准物质定性，采用子离子模式定量。

4.根据权利要求3所述的啤酒和麦汁中硫醇与非硫醇含硫类物质同时检测的方法，其特征在于所述非硫醇含硫化合物和硫醇物质为硫代乙酸甲酯、硫代乙酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、3-甲硫基丙醇、二甲基二硫、二甲基三硫、甲硫醇、乙硫醇、3-甲基-2-丁烯-1-硫醇、苄硫醇的一种或几种的组合。

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