CN108864229A - 分离红霉素b的方法以及制备红霉素b对照品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种分离红霉素B的方法。该方法包括：将红霉素样品进行高效液相色谱分离，以便获得红霉素B；其中，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：色谱柱：DAC‑HB100，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um)；色谱柱温度：室温；流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾‑乙腈，所述0.01mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；流速：450～470mL/min；等度洗脱；检测波长215nm。根据本发明实施例的方法，相比于现有技术，流动相无需调节pH值，节省了时间成本。根据本发明实施例的方法能够高效地将红霉素B从红霉素样品中分离出来，为后续红霉素B对照品的制备奠定了良好的基础。

Description

分离红霉素B的方法以及制备红霉素B对照品的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及分离红霉素B的方法以及制备红霉素B对照品的方法。

背景技术

红霉素(Erythromycin,简称EM)是一种大环内酯类广谱抗生素。目前已知其中有六种异构体，分别为红霉素A，B，C，D，E和F，A为主要活性成分。红霉素B的理化性质及抗菌谱与红霉素A相似，但抗菌活性却只有红霉素A的30％～60％。

高纯度的红霉素组分对照品对于红霉素的研究工作有着十分重要的意义。

而红霉素A与红霉素B的性质相似，一般的分离手段很难将其分离开来。现有的红霉素B对照品的纯化技术主要为专利CN 102924547 A所提及的纯化方法，该方法主要采用高效液相色谱仪将红霉素B从红霉素样品分离洗脱出来，再将洗脱液pH调为酸性，加入醋酸丁酯萃取，取水相，然后将水相pH调为碱性，用氯仿萃取，取氯仿层，氯仿层再用纯水洗两次，收集氯仿层，蒸干，得到红霉素B，但该方法的纯度最高只有93.4％。

而欧洲药典委员会出售的红霉素B对照品，但价格非常昂贵，不利于普及使用。

因此，红霉素B对照品的纯化方法仍有待开发和改进。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

专利CN 102924547 A所提及的纯化方法步骤繁琐，采用两次萃取，时间成本较高，而且红霉素B为弱极性化合物，水溶性较差，第一步在酸性体系下萃取，红霉素B回收率低，且产品纯度达不到欧洲药典委员会对杂质对照品纯度要求(95％以上)，另外专利实施案例中采用高效液相色谱分离洗脱上样量只有0.1g/针，效率极其低下。基于发明人对现有技术问题的发现和认识，发明人提出了一种改良的红霉素B对照品的制备方法，该方法能够高效、低成本地制备获得纯度95％以上的红霉素B对照品。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离红霉素B的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将红霉素样品进行高效液相色谱分离，以便获得红霉素B；其中，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：色谱柱：DAC-HB100，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um)；色谱柱温度：室温；流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾-乙腈，所述0.01mol/L～0.02mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；流速：450～470mL/min；等度洗脱；检测波长215nm。根据本发明实施例的方法中流动相采用0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾，其pH约为9.2左右，而红霉素样品本身为碱性化合物，因此，流动相无需调节pH即可用于红霉素样品的分离，相比于现有技术，节省了时间成本。并且发明人发现，该流动相很好的缓冲能力可以使得红霉素样品中各被分离的物质具有良好的峰形，利用该方法还可以实现较高的上样量，根据本发明实施例的方法能够高效地将红霉素B从红霉素样品中分离出来，为后续红霉素B对照品的制备奠定了良好的基础。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述红霉素样品中红霉素B的含量为不小于5％。进而，利用根据本发明实施例的方法，红霉素B的收率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述红霉素样品预先进行溶解和过滤处理。进而可将红霉素样品中干扰红霉素B分离纯化的杂质去除，红霉素B的收率会进一步提高。

根据本发明的实施例，所述红霉素样品预先溶于甲醇中，浓度为1g/mL。发明人发现，红霉素样品在甲醇中的溶解度高，同时红霉素样品在甲醇中的饱和浓度为1g/mL，因此，将红霉素样品以饱和浓度溶解在甲醇中，可最大限度地提高目标产物-红霉素B的分离效率。

根据本发明的实施例，所述过滤处理是将溶解后的红霉素样品经过0.45μm的有机滤膜进行的。进而红霉素样品中未溶解的杂质或直径大于0.45μm的杂质被过滤去除，所得滤液进一步用于高效液相色谱分离，红霉素B的收率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述红霉素样品的上样量为20mL。发明人发现，在此上样量下，可最大限度地提高目标产物-红霉素B的分离效率。根据本发明实施例的分离方法，相比于现有技术，实现了红霉素B克级别的分离和制备，红霉素B的分离效率显著提高。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备红霉素B对照品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)利用前面所述的方法从红霉素样品中分离红霉素B；2)将步骤1)获得的红霉素B进行一次萃取处理；3)将萃取产物进行重结晶处理，以便获得所述红霉素B对照品。相比于现有技术，根据本发明实施例的制备红霉素B对照品的方法，液相色谱分析中，流动相无需调节pH，节省了时间成本，经液相色谱洗脱后，洗脱液无需再调节pH，只需采用一次萃取，避免了多次萃取导致产品收率低下的问题，并且方法的最后一步增加重结晶处理过程，制备获得红霉素B对照品的纯度可高达95％以上。利用根据本发明实施例的方法，实现了高效、低成本地制备获得纯度95％以上，甚至高达98％的红霉素B对照品的技术目标。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述萃取处理是通过将所述步骤1)获得的红霉素B与二氯甲烷进行接触进行的。红霉素B为弱极性化合物，发明人发现，采用二氯甲烷进行一次萃取，二氯甲烷相比于其他萃取溶剂的用量少，且红霉素B的回收率显著提高。

根据本发明的实施例，所述步骤1)获得的红霉素B是以含有红霉素B的流分的形式存在的，所述红霉素B的流分与所述二氯甲烷的体积比为1L:(90～100)mL。发明人发现，红霉素B的流分与二氯甲烷的体积比在上述范围内，红霉素B的回收率进一步提高。

根据本发明的实施例，萃取处理后进一步包括将萃取处理产物的有机层进行旋转蒸干处理，以便获得红霉素B粗品。

根据本发明的具体实施例，所述旋转蒸干处理是在40℃～45℃的条件下进行的。在40℃～45℃的条件下，二氯甲烷能够快速挥发，而不破坏红霉素B的结构和活性，进而获得的红霉素B粗品用于后续进一步的重结晶处理，获得红霉素B的纯度会进一步提高。

根据本发明的实施例，所述重结晶处理是通过如下方式进行的：将所述萃取产物溶解在乙醇溶液中；以及将溶解在乙醇溶液中的萃取产物进行析出处理，析出产物构成所述红霉素B对照品。发明人发现，采用乙醇溶液进行重结晶处理，可以在较高温度下溶解多量的红霉素B，而在较低温度下，只能溶解极少量的红霉素B，红霉素B对照品经过乙醇重结晶处理后，其纯度显著提高。

根据本发明的实施例，所述乙醇溶液的浓度为70％～80％。发明人发现，乙醇溶液的浓度在70％～80％范围内，红霉素B具有适宜的溶解度且重结晶回收率高，可达80％以上，而乙醇浓度超过80％，红霉素B的溶解度相对较高而重结晶回收率会有所降低。

根据本发明的实施例，将所述萃取产物溶解在70℃～80℃的所述乙醇溶液中；以及将溶解在乙醇溶液中的萃取产物在0℃～5℃的条件下进行析出处理。发明人发现，萃取产物在上述温度条件下进行重结晶，红霉素B具有适宜的溶解度且重结晶效率进一步提高，红霉素B对照品产品纯度进一步提高，而乙醇溶液的温度低于70℃时，红霉素B的溶解度相对较低因此需要加大乙醇的用量来提高溶解红霉素B的量，反而导致最终B对照品产品的纯度有所降低。

根据本发明的实施例，进一步包括将析出产物在60～65℃的烘箱中进行烘干处理，进而产品纯度进一步提高。

根据本发明的实施例，析出处理之后，烘干处理之前，进一步包括将析出处理产物进行过滤处理。由于烘干处理主要是去除产品中的液相杂质，发明人发现，将析出处理产物进行过滤处理，可以有效去除产品中的固相杂质，最终红霉素B对照品产品的纯度的得到进一步提高。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备红霉素B对照品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)将红霉素样品进行甲醇溶解和0.45μm的有机滤膜过滤处理，所述红霉素样品中红霉素B的含量为不小于5％，所述红霉素样品在甲醇中的浓度为1g/mL；2)将步骤1)获得滤液进行高效液相色谱分离，以便获得含有红霉素B的流分，其中，上样量为20mL，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：色谱柱：DAC-HB100，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um)；色谱柱温度：室温；流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾-乙腈，所述0.01mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；流速：450～470mL/min；等度洗脱；检测波长215nm；高效液相色谱分离系统在上述条件下平衡5～6min；3)将含有红霉素B的流分进行二氯甲烷萃取处理，所述含有红霉素B的流分与所述二氯甲烷的体积比为1L:(90～100)mL，取萃取处理后的有机层在40℃～45℃的条件下进行旋转蒸干处理，以便获得红霉素B粗品；4)将所述红霉素B粗品溶解在70℃～80℃的浓度为70％～80％的乙醇溶液中，并将溶解有红霉素B粗品乙醇溶液在0℃～5℃的条件下进行析出处理，并将析出产物进行过滤以及在60～65℃的烘箱中进行烘干处理，以便获得红霉素B对照品。相比于现有技术，根据本发明实施例的制备红霉素B对照品的方法，液相色谱分析中，流动相无需调节pH，节省了时间成本，经液相色谱洗脱后，洗脱液无需再调节pH，只需采用一次二氯甲烷萃取，避免了多次萃取导致产品收率低下的问题，提高了红霉素B的收率，并且方法的最后一步增加乙醇重结晶处理过程，制备获得红霉素B对照品的纯度可高达95％以上，甚至高达98％。利用根据本发明实施例的方法，实现了高效、低成本地制备获得纯度95％以上的红霉素B对照品的技术目标，并且首次实现了对红霉B对照品克级别的分离和制备。

附图说明

图1是根据本发明实施例1的红霉素B纯度测试图谱；

图2是根据本发明实施例2的红霉素B纯度测试图谱；

图3是根据本发明对比例2的红霉素B纯度测试图谱；

图4是根据本发明对比例3的红霉素B纯度测试图谱；以及

图5是根据本发明对比例4的红霉素B纯度测试图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，如无特别说明，本申请所述的“红霉素B对照品”是指能够用于红霉素B检测或鉴定领域的红霉素B的标准品，定性用标准品或其他鉴别用标准品的纯度一般不小于90.0％，杂质或药理临床定量用标准品的纯度一般不小于95.0％。例如，本申请方法所获得的红霉素B对照品的纯度达到95％以上，属于可用于定量的红霉素B标准品。

实施例1

(1)仪器：半工业-工业级制备液相(江苏汉邦科技有限公司)；旋旋转蒸发仪(IKA公司)；

(2)制备柱：DAC-HB100(江苏汉邦科技有限公司)，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um，华谱公司)。

(3)制备分离色谱条件：以0.01mol/L磷酸氢二钾-乙腈(50:50，V/V)为流动相进行等度洗脱；流速为470mL/min；运行时间20min；检测波长215nm；柱温为室温。

(4)样品溶液的配制：选取红霉素B含量约为10％的红霉素样品，用甲醇溶解，样品浓度1g/mL，然后过0.45um有机滤膜，即可。

(5)红霉素B流分的收集：以制备分离色谱条件平衡制备系统5分钟后，取20mL样品溶液注入制备液相样品环进行洗脱分离，红霉素B的出峰时间在13min左右，在红霉素B峰刚出峰时开始收集红霉素B流分，至红霉素B峰尾部结束，常温保存红霉素B流分。重复若干次，合并所有红霉素B流分。

(6)红霉素B流分后处理：往每1L的红霉素B流分加入100ml二氯甲烷，振摇，静置分层，弃水层回收有机层，并把有机层于40℃用旋转蒸发仪蒸干，得到红霉素B粗品。

(7)红霉素B的精制：把红霉素B粗品加入适量70℃的80％乙醇溶液中，搅拌使之完全溶解，然后把乙醇溶液放置于0℃冰水中，使红霉素B结晶析出，过滤取固体，于60℃烘箱烘干，得到红霉素B精品(对照品)1.9g。

(8)红霉素B的含量测定：按照最新版欧洲药典红霉素含量测定方法对自制红霉素B精品(对照品)进行纯度测定，测试结果为98.59％。红霉素B纯度测试图谱如图1所示。

实施例2

(1)仪器：半工业-工业级制备液相(江苏汉邦科技有限公司)；旋旋转蒸发仪(IKA公司)；

(2)制备柱：DAC-HB100(江苏汉邦科技有限公司)，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um，华谱公司)。

(3)制备分离色谱条件：以0.02mol/L磷酸氢二钾-乙腈(50:55，V/V)为流动相进行等度洗脱；流速为450mL/min；运行时间20min；检测波长215nm；柱温为室温。

(4)样品溶液的配制：选取红霉素B含量约为20％的红霉素样品，用甲醇溶解，样品浓度1g/mL，然后过0.45um有机滤膜，即可。

(5)红霉素B流分的收集：以制备分离色谱条件平衡制备系统6分钟后，取20mL样品溶液注入制备液相样品环进行洗脱分离，红霉素B的出峰时间在13min左右，在红霉素B峰刚出峰时开始收集红霉素B流分，至红霉素B峰尾部结束，常温保存红霉素B流分。重复若干次，合并所有红霉素B流分。

(6)红霉素B流分后处理：往每1L的红霉素B流分加入90ml二氯甲烷，振摇，静置分层，弃水层回收有机层，并把有机层于45℃用旋转蒸发仪蒸干，得到红霉素B粗品。

(7)红霉素B的精制：把红霉素B粗品加入适量80℃的70％乙醇溶液中，搅拌使之完全溶解，然后把乙醇溶液放置于5℃冰水中，使红霉素B结晶析出，过滤取固体，于65℃烘箱烘干，得到红霉素B精品(对照品)3.9g。

(8)红霉素B的含量测定：按照最新版欧洲药典红霉素含量测定方法对自制红霉素B精品(对照品)进行纯度测定，测试结果为98.57％。红霉素B纯度测试图谱如图2所示。

在以下对比例实验中，发明人简要描述了制备红霉素B对照品方法开发过程中的部分对比实验数据。

对比例1

发明人参考2015版《中国药典》红霉素组分测定的高效液相方法，对红霉素组分进行了分离，采用的色谱条件如下：

(1)仪器：半工业-工业级制备液相(江苏汉邦科技有限公司)；

(2)制备柱：DAC-HB100(江苏汉邦科技有限公司)，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um，华谱公司)。

(3)制备分离色谱条件：以0.2mol/L磷酸氢二钾(用磷酸调节pH至7.0)-乙腈(65:35，V/V)为流动相进行等度洗脱；流速为470mL/min；检测波长215nm；柱温为室温。

结果，采用上述液相色谱条件，上样量最多只能到10mL，而且峰形较差，红霉素B的出峰时间在42min左右，红霉素B分离效率低。

对比例2

发明人采用与实施例1相同的方法制备红霉素B精品(对照品)，不同之处在于，在此对比例中采用80℃70％甲醇进行重结晶，按照最新版欧洲药典红霉素含量测定方法对该对比例中获得的红霉素B精品(对照品)进行纯度测定，测试结果仅为92.62％。红霉素B纯度测试图谱如图3所示。

对比例3

发明人采用与实施例1相同的方法制备红霉素B精品(对照品)，不同之处在于，在此对比例中采用80℃二氯甲烷进行重结晶，按照最新版欧洲药典红霉素含量测定方法对该对比例中获得的红霉素B精品(对照品)进行纯度测定，测试结果仅为92.12％。红霉素B纯度测试图谱如图4所示。

对比例4

发明人采用与实施例1相同的方法制备红霉素B精品(对照品)，不同之处在于，在此对比例中采用60℃80％乙醇进行重结晶，按照最新版欧洲药典红霉素含量测定方法对该对比例中获得的红霉素B精品(对照品)进行纯度测定，测试结果仅为96.34％。红霉素B纯度测试图谱如图5所示。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种分离红霉素B的方法，其特征在于，包括：

将红霉素样品进行高效液相色谱分离，以便获得红霉素B；

其中，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：

色谱柱：DAC-HB100，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um)；

色谱柱温度：室温；

流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾-乙腈，所述0.01mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；

流速：450～470mL/min；

等度洗脱；

检测波长215nm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红霉素样品中红霉素B的含量为不小于5％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红霉素样品预先进行溶解和过滤处理；

任选地，所述红霉素样品预先溶于甲醇中，浓度为1g/mL；

任选地，所述过滤处理是将溶解后的红霉素样品经过0.45μm的有机滤膜进行的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述红霉素样品的上样量为20mL。

5.一种制备红霉素B对照品的方法，其特征在于，

1)利用权利要求1～4任一项所述的方法从红霉素样品中分离红霉素B；

2)将步骤1)获得的红霉素B进行一次萃取处理；

3)将萃取产物进行重结晶处理，以便获得所述红霉素B对照品。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述萃取处理是通过将所述步骤1)获得的红霉素B与二氯甲烷进行接触进行的；

任选地，所述步骤1)获得的红霉素B是以含有红霉素B的流分的形式存在的，所述红霉素B的流分与所述二氯甲烷的体积比为1L:(90～100)mL；

任选地，萃取处理后进一步包括将萃取处理产物的有机层进行旋转蒸干处理，以便获得红霉素B粗品；

任选地，所述旋转蒸干处理是在40℃～45℃的条件下进行的。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重结晶处理是通过如下方式进行的：

将所述萃取产物溶解在乙醇溶液中；以及

将溶解在乙醇溶液中的萃取产物进行析出处理，析出产物构成所述红霉素B对照品；

任选地，所述乙醇溶液的浓度为70％～80％；

优选地，将所述萃取产物溶解在70℃～80℃的所述乙醇溶液中；以及

将溶解在乙醇溶液中的萃取产物在0℃～5℃的条件下进行析出处理。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步包括将析出产物在60～65℃的烘箱中进行烘干处理；

任选地，析出处理之后，烘干处理之前，进一步包括将析出处理产物进行过滤处理。

9.一种制备红霉素B对照品的方法，其特征在于，

1)将红霉素样品进行甲醇溶解和0.45μm的有机滤膜过滤处理，所述红霉素样品中红霉素B的含量为不小于5％，所述红霉素样品在甲醇中的浓度为1g/mL；

2)将步骤1)获得滤液进行高效液相色谱分离，以便获得含有红霉素B的流分，

其中，上样量为20mL，所述高效液相色谱分离的条件如下所示：

色谱柱：DAC-HB100，填料ACCHROM C18TDE(100*250mm,10um)；

色谱柱温度：室温；

流动相：0.01～0.02mol/L磷酸氢二钾-乙腈，所述0.01mol/L磷酸氢二钾和乙腈的体积比为50:50～50：55，所述磷酸氢二钾预先溶于水中；

流速：450～470mL/min；

等度洗脱；

检测波长215nm；

高效液相色谱分离系统在上述条件下平衡5～6min；

3)将含有红霉素B的流分进行二氯甲烷萃取处理，所述含有红霉素B的流分与所述二氯甲烷的体积比为1L:(90～100)mL，取萃取处理后的有机层在40℃～45℃的条件下进行旋转蒸干处理，以便获得红霉素B粗品；

4)将所述红霉素B粗品溶解在70℃～80℃的浓度为70％～80％的乙醇溶液中，并将溶解有红霉素B粗品乙醇溶液在0℃～5℃的条件下进行析出处理，并将析出产物进行过滤以及在60～65℃的烘箱中进行烘干处理，以便获得红霉素B对照品。