CN104817570B - 一种银杏内酯b制备方法及其制备得到的银杏内酯b - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种银杏内酯B的制备方法及其制备得到的银杏内酯B。本发明摒弃了有毒的有机溶剂，代之以乙醇和水并配合分离柱、水处理以及中低浓度乙醇重结晶技术用于银杏内酯B的分离纯化，得到高纯度的银杏内酯B，杂质含量少且未检出白果内酯和致敏性成分银杏酸。

Description

一种银杏内酯B制备方法及其制备得到的银杏内酯B
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种银杏内酯B的制备方法及其制备得到的银杏内酯B。
背景技术
银杏内酯属于萜类化合物，是银杏叶中一类重要的活性成分，均具有拮抗血小板活化因子(PAF)受体、甘氨酸(Gly)受体、γ-氨基丁酸(GABA)受体的作用，其中拮抗PAF受体作用表现为能高度选择性地拮抗由PAF诱导的血小板聚集，从而防止血栓的形成，拮抗Gly受体、GABA受体作用表现为对中枢神经系统的保护作用；拮抗PAF受体活性研究表明，银杏内酯B(GB)的活性最强，其次为银杏内酯A(GA)，再次为银杏内酯C，最后为银杏内酯M(仅存在于银杏根皮中，叶中不含)。
银杏内酯B在银杏叶中的含量较低，约为0.2％，在银杏叶提取物中含量在1％～2％，且银杏各内酯成分结构相似、性质差异小，因而从银杏叶、银杏叶提取物中分离银杏内酯B具有很大的困难。现有的银杏内酯B的分离纯化报道较多，但绝大部分都用到乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有机溶剂，对工业化生产带来诸多不便和安全隐患。
银杏内酯B分离纯化方法已经报道很多，如专利200510063407.X、200310104958、200710050245.5、200810046162.3中所提到的方法，分离纯化过程中均用到有机溶剂，如正丁醇、甲醇、乙酸乙酯、正己烷，且所得银杏内酯B的收率普遍很低，溶剂消耗量较大，不具备工业应用价值；再如专利200910184916.6中所提到的方法，以纯度>95％的银杏总内酯为原料，采用重结晶-超临界CO2萃取组合工艺进行纯化，得到纯度>99.5％的单体GA、GB，该方法对起始原料要求较高，且采用超临界CO2萃取对设备要求较高；又如专利00117758.3采用制备型高效液相色谱分离制备GA、GB，且液相流动相为乙酸乙酯和石油醚的混合液，不适宜工业化大生产。
为了解决现有问题，本发明摒弃了有毒的有机溶剂，代之以乙醇和水并配合分离柱、水处理以及中低浓度乙醇重结晶技术用于银杏内酯B的分离纯化，得到高纯度的银杏内酯B，杂质含量少且未检出白果内酯和致敏性成分银杏酸。
发明内容
针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种银杏内酯B的制备方法及其制备得到的银杏内酯B。本发明所述的银杏内酯B制备方法，摒弃了有毒的有机溶剂，仅应用乙醇和水，并配合分离柱和重结晶技术即可得到高纯度的银杏内酯B，含量≥98％，并且白果内酯和银杏酸均未检出。
所述制备方法包括如下步骤：
(1)以银杏叶为原料，中高浓度乙醇热回流提取，合并提取液，回收乙醇，浓缩，过分离柱，纯水、乙醇分别洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物；
(2)高浓度乙醇溶解银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱，高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得总银杏内酯粗品；
(3)向总银杏内酯粗品加入纯水，30～90℃下溶解搅拌，过滤，收集滤饼，浓缩，干燥，得干品；
(4)向干品加中低浓度乙醇，重结晶，得银杏内酯B。
优选的，
所述步骤(1)中，以银杏叶为原料，粉碎，8-12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)50％～90％乙醇热回流提取1-2次，每次1-2小时；
更优选的，10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)60％-80％的乙醇热回流提取，提取2次，每次2小时。
优选的，所述步骤(1)中，乙醇热回流提取，合并提取液，回收乙醇，浓缩体积至3-5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)；
更优选的，浓缩体积至4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)。
优选的，所述步骤(1)中，分离柱为HPD450、DM130或HPD700大孔树脂柱，洗脱液乙醇的体积百分浓度为60％～80％；
更优选的，分离柱为HPD450大孔树脂柱，乙醇洗脱浓度为70％。
所述步骤(1)的优选技术方案为：
以银杏叶为原料，粉碎，8-12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)50％～90％乙醇热回流提取1～2次，每次1-2小时，合并提取液，浓缩至乙醇尽，且浓缩体积至3-5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450或DM130或HPD700大孔树脂柱，先用纯水洗脱，弃去洗脱液，再用60-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。
所述步骤(1)更优选的技术方案为：
以银杏叶为原料，粉碎，用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)60％-80％乙醇加热回流，提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至乙醇尽，且浓缩体积至4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，弃去洗脱液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。
还优选的，所述步骤(2)中，银杏叶提取物，用95％乙醇溶解1～2次，合并溶解液，加至重量是银杏叶提取物10～30倍的酸性氧化铝(100-300目)层析柱，用2-4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇洗脱，收集洗脱液；
更优选的，酸性氧化铝的重量是银杏叶提取物重量的20倍，用3倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇洗脱。
还优选的，所述步骤(3)中，总银杏内酯粗品中加入40-80倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比值，V/W)纯水，40-90℃搅拌溶解0.5-1小时，趁热过滤，收集滤饼，浓缩至干，得干品；
更优选的，加入50-70倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比值，V/W)纯水，于50℃-80℃搅拌溶解0.5小时。
还优选的，所述步骤(4)中，向步骤(3)所述得到的干品中加20-50倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)5％-50％乙醇；
更优选的，加入40倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)15％-30％乙醇。
所述步骤(4)的优选技术方案为：
向步骤(3)得到的干品中，加入20-50倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)5％-50％的乙醇，加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏12-24小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程1-3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，得银杏内酯B；
所述步骤(4)更优选的技术方案为：
向步骤(3)得到的干品中，加入40倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)15％-30％的乙醇，加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏12小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程1-3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，得银杏内酯B；
本发明的有益技术效果：(1)制备过程未使用有毒的有机试剂，在能够制备出高纯度银杏内酯B的同时提高了制备提取过程的安全，不仅对环境友好，同时能够有效的提高对实验、生产人员的健康保障；(2)使用纯水加热分离银杏内酯B，有别于分离柱的纯水洗脱，可以有效分离银杏内酯B；(3)使用中低浓度乙醇进行重结晶纯化银杏内酯B，避免甲醇等毒性有机试剂的使用；(4)制备得到的银杏内酯B纯度能够达到98％以上，同时未检测到白果内酯与致敏物质银杏酸。
附图说明：
图1：实施例1银杏内酯B液相色谱图，峰1为溶剂峰，峰2为银杏内酯B；
图2：实施例2银杏内酯B液相色谱图，峰1为溶剂峰，峰2为银杏内酯B；
图3：实施例3银杏内酯B液相色谱图，峰1为溶剂峰，峰2为银杏内酯B。
图4：空白溶剂液相色谱图，峰1为溶剂峰。
具体实施方式：
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：
银杏叶150kg，粉碎，用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)70％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至乙醇尽，且浓缩液体积至4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点，弃去洗脱液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物53.79kg。
取银杏叶提取物10.0kg，先用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，再用5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，合并溶解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的20倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝(100-300目)层析柱，用3倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；
总银杏内酯粗品中加入60倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比值，V/W)纯水，于60℃搅拌溶解0.5小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃减压浓缩至干，得干品；
干品先用40倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)15％乙醇加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏12小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程2次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏内酯B 14.76g，转移率为16.56％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为99.2％，白果内酯和银杏酸均未检出。
实施例2：
银杏叶150kg，粉碎，用8倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)90％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至乙醇尽，且浓缩液体积至3倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入DM130大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点，弃去洗脱液，再用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物57.34kg。
取银杏叶提取物10.0kg，先用8倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5h，再用4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5小时，合并溶解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的30倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝(100-300目)层析柱，用2倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；
总银杏内酯粗品中加入80倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比值，V/W)纯水，于30℃搅拌溶解1小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃减压浓缩至干，得干品；
干品先用50倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)50％乙醇加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程2次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏内酯B 17.56g，转移率为21.17％，经HPLC检测，银杏内酯B含量98.3％，白果内酯和银杏酸均未检出。
实施例3：
银杏叶150kg，粉碎，用12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)50％乙醇加热回流提取1次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至乙醇尽，且浓缩液体积至5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)，置于0℃-5℃冷藏12小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏12小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD700大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点，弃去洗脱液，再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物60.56kg。
取银杏叶提取物10.0kg，先用12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5小时，再用6倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，合并溶解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的10倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝(100-300目)层析柱，用4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；
总银杏内酯粗品中加入40倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比值，V/W)纯水，于90℃搅拌溶解0.5小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃减压浓缩至干，得干品；
干品用20倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)5％乙醇加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏内酯B 20.52g，转移率为22.77％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为98.1％，白果内酯和银杏酸均未检出。
实施例4：
银杏叶150kg，粉碎，用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)60％乙醇加热回流提取1次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至乙醇尽，且浓缩液体积至3倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点，弃去洗脱液，再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物59.46kg。
取银杏叶提取物10.0kg，先用12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，再用4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5小时，合并溶解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的15倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝(100-300目)层析柱，用4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；
总银杏内酯粗品中加入50倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比值，V/W)纯水，于50℃搅拌溶解0.5小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃减压浓缩至干，得干品；
干品用30倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)30％乙醇加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏内酯B 18.67g，转移率为19.61％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为98.7％，白果内酯和银杏酸均未检出。
实施例5：
银杏叶150kg，粉碎，用12倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)80％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至乙醇尽，且浓缩液体积至5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点，弃去洗脱液，再用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物59.34kg。
取银杏叶提取物10.0kg，先用8倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解0.5小时，再用6倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，合并溶解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的30倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝(100-300目)层析柱，用2倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；
总银杏内酯粗品中加入70倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比值，V/W)纯水，于80℃搅拌溶解1小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃减压浓缩至干，得干品；
干品用20倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)40％乙醇加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏内酯B18.19g，转移率为20.35％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为98.5％，白果内酯和银杏酸均未检出。
实施例6：
银杏叶150kg，粉碎，用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)70％乙醇加热回流提取1次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至乙醇尽，且浓缩液体积至4倍(乙醇体积(ml)与银杏叶重量(g)比值，V/W)，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，用molish反应和薄层色谱控制洗脱终点，弃去洗脱液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶54.32kg。
取银杏叶提取物10.0kg，先用10倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，再用5倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)95％乙醇室温搅拌溶解1小时，合并溶解液；溶解液加入用95％乙醇已处理过的20倍银杏叶提取物重量的酸性氧化铝(100-300目)层析柱，用3倍(乙醇体积(ml)与银杏叶提取物重量(g)比值，V/W)乙醇洗脱，收集洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液于50℃减压浓缩至干，得总银杏内酯粗品；
总银杏内酯粗品中加入60倍(纯水体积(ml)与总银杏内酯粗品重量(g)比值，V/W)纯水，于40℃搅拌溶解0.5小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃减压浓缩至干，得干品；
干品用40倍(乙醇体积(ml)与干品重量(g)比值，V/W)20％乙醇加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏24小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，即得银杏内酯B17.34g，转移率为19.78％，经HPLC检测，银杏内酯B含量为98.6％，白果内酯和银杏酸均未检出。
表1：实施例1-6银杏内酯B纯度及转移率
具体实施例序号 银杏内酯B纯度 银杏内酯B转移率
1 99.2％ 16.56％
2 98.3％ 21.17％
3 98.1％ 22.77％
4 98.7％ 19.61％
5 98.5％ 20.35％
6 98.6％ 19.78％
试验例1：
银杏内酯B和白果内酯的色谱测定方法：
色谱系统和系统适用性试验：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以甲醇/水(30:70)为流动相，蒸发光散射检测器检测(参数：Agilent380-LC:漂移管温度40℃，雾化室温度35℃，载气流量1.6SLM，柱温30℃)。
对照品溶液的制备：分别取银杏内酯B对照品、白果内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含1mg、2mg的混合溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取银杏内酯B纯化物1mg，用甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定方法：分别精密量取对照品溶液5ul、15ul，供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，用外表两点法对数方程分别计算银杏内酯B、白果内酯的含量，即得。
总银杏酸的测定方法：
色谱系统和系统适用性试验：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以甲醇-1％冰醋酸溶液(90:10)为流动相；检测波长为310nm；
对照品溶液的制备：取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含5ug的溶液，作为对照品溶液。另取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含100ug的溶液，作为定位用对照溶液。
供试品溶液的制备：取银杏内酯B纯化物100mg，精密称定，加入石油醚(60-90℃)50ml，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用石油醚(60-90℃)补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干，精密加入甲醇2ml，密塞，摇匀，即得。
测定方法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各10ul，注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量，即得。
利用上述检测方法，对实施例1-3的银杏内酯B、白果内酯和银杏酸进行检测，检测结果分别见图1-3。
试验例2：
本发明制备方法与表2所列四种不同制备方法(对比例)做对比，分别检测银杏内酯B成品中银杏内酯B纯度和转移率，白果内酯以及总银杏酸含量。试验结果见表2。
其中四个对比例与本发明制备方法比较，不同点在于：
对比例1：由相同重量的银杏叶提取银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱得总银杏内酯粗品，用15％乙醇重结晶得银杏内酯B成品；
对比例2：由相同重量的银杏叶提取银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱得总银杏内酯粗品，用甲醇重结晶得银杏内酯B成品；
对比例3：由相同重量的银杏叶提取银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱得总银杏内酯粗品，加纯水于60℃下搅拌溶解，过滤，收集滤饼，浓缩至干，用甲醇重结晶得银杏内酯B成品；
对比例4：由相同重量的银杏叶提取银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱得总银杏内酯粗品，加纯水于60℃下搅拌溶解，过滤，收集滤饼，浓缩至干，95％乙醇重结晶得银杏内酯B成品；
以上四个对比例的实验参数均与本发明具体实施例1中参数相同。
表2 不同提取分离纯化方法效果对比
表1的测定结果表明，与4种对比例相比，本发明制备方法得到的银杏内酯B的纯度高、转移率高、杂质含量少，尤其是未检出致敏成分银杏酸。整个工艺过程仅使用纯水和乙醇，未使用有毒有机溶剂，重结晶用中低浓度乙醇，整个过程适合工业化大生产，对环境友好，也保障了实验及工作人员的健康。

Claims (20)

1.一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于：该银杏内酯B由以下步骤制备：
(1)以银杏叶为原料，50％～90％乙醇热回流提取，合并提取液，回收乙醇，浓缩，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽；过分离柱，纯水、乙醇分别洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物；
(2)95％乙醇溶解银杏叶提取物，过酸性氧化铝柱，95％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得总银杏内酯粗品；
(3)向所述总银杏内酯粗品加入纯水，所述纯水体积毫升数与所述总银杏内酯粗品重量克数的比值以V/W计为40-80倍，于30～90℃下溶解搅拌，过滤，收集滤饼，浓缩，干燥，得干品；
(4)向干品加5％-50％乙醇，重结晶，得银杏内酯B。
2.根据权利要求1所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的热回流提取，是使用乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为8-12倍的50％～90％乙醇热回流提取1～2次，每次1-2小时，回收乙醇后，浓缩体积至乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为3-5倍。
3.根据权利要求2所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的热回流提取，是使用乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为10倍的60％-80％乙醇，提取2次，每次2小时，浓缩体积至乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为4倍。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的分离柱，为HPD450、DM130或HPD700大孔树脂柱，乙醇洗脱浓度为60％～80％。
5.据权利要求4所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的分离柱为HPD450大孔树脂柱，所述乙醇洗脱浓度为70％。
6.根据权利要求1所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的技术方案为：以银杏叶为原料，粉碎，使用乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为8-12倍的50％～90％乙醇热回流提取1～2次，每次1-2小时，合并提取液，浓缩至乙醇尽，且浓缩体积至乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为3-5倍，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450或DM130或HPD700大孔树脂柱，先用纯水洗脱，弃去洗脱液，再用60-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。
7.根据权利要求6所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，以银杏叶为原料，粉碎，用乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为10倍的60％-80％乙醇加热回流，提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至乙醇尽，且浓缩体积至乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为4倍，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450大孔树脂柱，先用纯水洗脱，弃去洗脱液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，银杏叶提取物，用95％乙醇溶解1-2次。
9.根根据权利要求1-3中任一项所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将溶解液加至重量是银杏叶提取物10～30倍的100-300目的酸性氧化铝层析柱，用2-4倍乙醇体积毫升数与银杏叶提取物重量克数的比值以V/W计为2-4倍的95％乙醇洗脱。
10.根据权利要求9所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述酸性氧化铝的重量是银杏叶提取物重量的20倍，用乙醇体积毫升数与银杏叶提取物重量克数的比值以V/W计为3倍的95％乙醇洗脱。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的技术方案为：银杏叶提取物用95％乙醇溶解1～2次，合并溶解液，溶解液加至重量是银杏叶提取物10～30倍的100-300目的酸性氧化铝层析柱，用乙醇体积毫升数与银杏叶提取物重量克数的比值以V/W计为2-4倍的95％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得总银杏内酯粗品。
12.根据权利要求11所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的技术方案为：银杏叶提取物用95％乙醇溶解1～2次，合并溶解液，溶解液加至重量是银杏叶提取物20倍的100-300目的酸性氧化铝层析柱，用乙醇体积毫升数与银杏叶提取物重量克数的比值以V/W计为3倍的95％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得总银杏内酯粗品。
13.根据权利要求1-3任一项所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，向步骤(3)得到的总银杏内酯粗品中加入所述纯水体积毫升数与所述总银杏内酯粗品重量克数的比值以V/W计为40-80倍的纯水，于40-90℃搅拌溶解0.5-1小时。
14.根据权利要求13所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，向步骤(3)得到的总银杏内酯粗品中加入所述纯水体积毫升数与所述总银杏内酯粗品重量克数的比值以V/W计为50-70倍的纯水，于50℃-80℃搅拌溶解0.5小时。
15.根据权利要求1-3任一项所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，加入的乙醇的乙醇体积毫升数与所述干品重量克数的比值以V/W计为20-50倍，体积百分浓度为5％-50％。
16.根据权利要求15的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，加入乙醇体积毫升数与所述干品重量克数的比值以V/W计为40倍的15％-30％的乙醇。
17.根据权利要求1-3任一项所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的技术方案为：向所述步骤(3)得到的干品中加入乙醇体积毫升数与所述干品重量克数的比值以V/W计为20-50倍的5％-50％的乙醇，加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏12-24小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程1-3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，得银杏内酯B。
18.根据权利要求17所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的技术方案为：向所述步骤(3)得到的干品中加入乙醇体积毫升数与所述干品重量克数的比值以V/W计为40倍的15％-30％的乙醇，加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏12小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程1-3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，得银杏内酯B。
19.根据权利要求1所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作如下：
(1)以银杏叶为原料，粉碎，乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为8-12倍的50％-90％乙醇加热回流提取1-2次，每次1-2小时，合并提取液，浓缩至乙醇尽，且浓缩液体积至乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为3-5倍，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏12-24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450、DM130或HPD700大孔树脂柱，纯水洗脱，弃去洗脱液，60％-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物；
(2)银杏叶提取物，用95％乙醇溶解1～2次，合并溶解液，溶解液加至用95％乙醇处理过的重量是银杏叶提取物10～30倍的100-300目的酸性氧化铝层析柱，用乙醇体积毫升数与银杏叶提取物重量克数的比值以V/W计为2-4倍的95％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得总银杏内酯粗品；
(3)总银杏内酯粗品中加入纯水体积毫升数与总银杏内酯粗品重量克数比值以V/W计为40-80倍的纯水，于40-90℃搅拌溶解0.5-1小时，趁热过滤，收集滤饼，减压浓缩至干，得干品；
(4)向所述步骤(3)得到的干品中加入乙醇体积毫升数与所述干品重量克数比值以V/W计为20-50倍的5％-50％的乙醇，加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏12-24小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程1-3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，得银杏内酯B。
20.根据权利要求19所述的一种银杏内酯B的制备方法，其特征在于，所述制备方法的更优操作如下：
(1)以银杏叶为原料，粉碎，用乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为10倍的60％-80％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，低温减压浓缩至乙醇尽，且浓缩液体积至乙醇体积毫升数与银杏叶重量克数的比值以V/W计为4倍，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，滤液中缓慢滴加95％乙醇至溶液醇浓度达75％，置于0℃-5℃冷藏24小时，取出，过滤，浓缩至乙醇尽，滤液加入HPD450大孔树脂柱，纯水洗脱，弃去洗脱液，70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得银杏叶提取物；
(2)银杏叶提取物，用95％乙醇溶解1～2次，合并溶解液，溶解液加至用95％乙醇处理过的重量是银杏叶提取物20倍的100-300目的酸性氧化铝层析柱，用乙醇体积毫升数与银杏叶提取物重量克数的比值以V/W计为3倍的95％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得总银杏内酯粗品；
(3)总银杏内酯粗品中加入纯水体积毫升数与总银杏内酯粗品重量克数的比值以V/W计为50-70倍的纯水，于50℃-80℃搅拌溶解0.5小时，趁热过滤，收集滤饼，于50℃减压浓缩至干，得干品；
(4)向所述步骤(3)得到的干品，加入乙醇体积毫升数与干品重量克数的比值以V/W计为40倍的15％-30％的乙醇，加热搅拌溶解，过滤，收集滤液，放置室温后继续于0-10℃冷藏12小时析晶，过滤，得湿晶，所得湿晶重复上述过程1-3次，收集湿晶，于50℃真空干燥，得银杏内酯B。
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