CN111077247A - 一种植物提取物或其制剂的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种植物提取物或其制剂中生物碱的检测方法，所述生物碱任选包括荞麦碱、1,4‑二脱氧‑1,4‑亚氨基‑D‑阿拉伯糖醇中的一种或多种，其中，所述方法包括：采用衍生化试剂将待测植物提取物或其制剂进行衍生化反应，得到含有生物碱衍生物的衍生化产物；(2)对步骤(1)所得的衍生化产物进行色谱分析，其色谱柱柱温为5±2—20±2℃。该方法能够实现多种结构相似的生物碱成分的同时检测，有利于相关制剂的生产监测和含量测定。

Description

一种植物提取物或其制剂的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种植物提取物或其制剂的检测方法。
背景技术
生物碱是存在于自然界(主要存在于植物体内，但也有少数存在于动物体内)中的一类含氮的碱性有机化合物，含有生物碱的植物有100多个科，同一种植物往往含有几种甚至几十种生物碱，如桑中至少含有4种生物碱，麻黄中含有7种生物碱，长春花中含有60多种生物碱。研究发现生物碱的药理活性众多，如降血糖、降压、抗肿瘤、抗炎镇痛、抗菌抗病毒等，被广泛应用于临床治疗各种疾病，但同时研究也发现一些生物碱对生物机体具有毒性或强烈生理作用，因此，就药物质量监测和用药安全性等方面而言，在实际生产和应用过程中应当严格监测生物碱的组成和含量。
生物碱的检测通常利用其本身有紫外吸收、呈碱性、能够发生特殊化学反应的特点进行。按照检测方法原理分类，常用的有紫外分光光度法和化学法。此外，对于结构中无发色基团，没有紫外吸收的生物碱类而言，需要借助衍生化试剂进行衍生处理后采用紫外分光光度法。
在中药生产过程中，由于中药提取液组成成分复杂，具有较多酸性或碱性成分，会对其中生物碱的测定造成较大影响，如干扰化学滴定反应和颜色反应等，一般借助先进的检测仪器，如液质联用和蒸发光散射法实现生物碱含量的测定，但是液质联用方法检测成本较高，不便于在生产上连续监测，而蒸发光散射法灵敏度和准确度较低，不适合定量检测。
目前常用HPLC-UV法对植物提取物中生物碱进行检测，但提取液中往往存在生物活性不同的结构相似的多种生物碱类成分，如何保证各成分能够完全分离，对其含量测定至关重要。根据Van-Deemter方程：H＝A+B/μ+Cu。式中μ为流动相线速度，A为径向扩散系数，B为纵向扩散系数，C为传质阻力系数。理论塔板数(H)越高，柱效越高，分离效果越好。常用于提高理论塔板数的方法有：改变流动相的组成，改变固定相，改变柱温等，其中改变柱温一般倾向于提高柱温。大量文献数据显示，柱温升高后，分离的选择性提高，峰形和对称因子得到改善，降低有机溶剂使用等优点，也催生了高温液相色谱技术的发展(参见文献1：“刘光会.色谱分析的新领域—高温液相色谱[J].天然气化工，2000,25:46-52.”和文献2：“成洪达，李彤，张维冰.温度对高效液相色谱分离性能的影响[J]. 现代科学仪器，2006(5):74-78.”)。
然而，由于生物碱成分具有结构相似的特点而不能很好的分离。例如，文献1：“夏学军,汪仁芸,刘玉玲.柱前衍生化RP-HPLC法测定桑枝总生物碱的含量[J].中国新药杂志,2008,17(23):2044-2047.”中，采用柱前衍生化RP-HPLC法测定桑枝总生物碱的含量，其中检测柱温为32℃，结果显示荞麦碱和DAB的衍生物色谱峰重叠，没有很好的分离。这将大大限制相关制剂的生产监测和含量测定。
同时研究发现通过调节流动相比例，改变流动相pH值，升高柱温等传统方法并不能改善其分离效果。
发明内容
针对上述问题，发明人通过大量的试验研究，意外发现，采用柱前衍生化色谱分析法对生物碱类成分进行测定的过程中，将色谱分析的柱温降低到特定范围内，能够实现多种结构相似的生物碱化合物，特别是荞麦碱和1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇的有效分离、鉴定和含量测定，有利于相关制剂的生产监测和含量测定。
为此，本发明提供一种植物提取物或其制剂中生物碱的检测方法，所述生物碱包括荞麦碱、1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇中的一种或两种，其中所述检测方法包括：
(1)采用衍生化试剂将待测植物提取物或其制剂进行衍生化反应，得到含有生物碱衍生物的衍生化产物；
(2)对步骤(1)所得的衍生化产物进行色谱分析，其色谱柱柱温为5±2—20±2℃，优选地，柱温为10℃。
优选地，所述生物碱还包括其他哌啶环类、其他四氢吡咯环类多羟基生物碱中的一种或多种；优选地，所述生物碱还包括1-脱氧野尻霉素、3-epi-荞麦碱、木豆树宁(Prosopinine，
Figure BDA0002334568150000021
)、
Figure BDA0002334568150000022
(Mannolactam)、脱氧甘露伊霉素(Deoxymannojirimycin，
Figure BDA0002334568150000031
)、茴香霉素 (Anisomycin，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
)、1-甲基-5-壬基-2苯甲基-3-吡咯烷醇 (1-Methyl-5-nonyl-2-(phenylmethyl)-3-pyrrolidinol，preussin中的一种或多种。优选地，所述生物碱还包括1-脱氧野尻霉素。
优选地，所述衍生化试剂包括但不限于氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、异硫氰酸苯酯、丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)中的一种或多种，优选为FMOC-Cl。
优选地，所述衍生化试剂的量足以使所述提取物或其制剂中的全部生物碱发生可检测的衍生化反应。
优选地，所述色谱分析采用的检测波长为210-360nm。
所述色谱分析选自吸附色谱分析或分配色谱分析，优选吸附色谱分析。进一步优选地，所述吸附色谱分析中使用的固定相选自硅胶、氧化铝、十八烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶和酰胺基键合硅胶中的任意一种或其组合，优选十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相。
优选地，本发明所述的色谱分析中使用的流动相选自乙腈-缓冲盐溶液、甲醇-缓冲盐溶液和异丙醇-缓冲盐溶液中的一种或其组合，优选为乙腈-缓冲盐溶液；
所述缓冲盐溶液优选为柠檬酸缓冲盐溶液、醋酸缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液中的一种或多种，优选地，所述缓冲盐选自钠盐、钾盐、铵盐中的一种或多种，所述盐溶液中的盐浓度为0.01-0.1mol/L，优选为0.018-0.075mol/L，优选地，所述缓冲盐溶液pH为 3.0-8.6，优选为3.4-5.4。
优选地，所述色谱分析中的洗脱方式为梯度洗脱，优选地，所述梯度洗脱的条件如下：
Figure BDA0002334568150000033
Figure BDA0002334568150000041
优选地，所述生物碱的衍生物的分离度为0.5以上，更优选地，所述生物碱的衍生物的分离度为1.0以上。
优选地，本发明所述的植物提取物为桑科(Moraceae)植物提取物；优选地，所述植物为桑属(Morus)植物；优选地，所述植物为鲁桑(Morus multicaulis Perrott.)、白桑(Morus alba L.)、广东桑(Morus atropurpurea Roxb)、瑞穗桑(Morusmizuho Hotta)、长穗桑(Morus wittiorum Hand Mazz.)、长果桑(Morus laevigata Wall)、黑桑(Morusnigra Linn.)、华桑(Morus cathayana Hemsi.)、细齿桑(Morus serrata Roxb.)、蒙桑(Morus mongolica Schneid.)、山桑(Morus bombycis Koidz.)、川桑(Morus notabilisSchneid.)、唐鬼桑(Morus nigriformis Koidz.)、滇桑(Morusyunnanensis Koidz.)、鸡桑(Morus australis Poir.)、鬼桑(Morus mongolica(Bur.)Schneid var.diabolicaKoidz.)、大叶桑、垂枝桑(Morus alba Var.Pendula Dippel)、白脉桑及用以上桑种育成的桑树品种、以上桑种的种内或种间选育的杂交桑中的任意一种或多种的组合；优选地，所述植物选自广东桑、鲁桑、白桑、细齿桑、山桑或杂交桑，所述杂交桑优选为粤桑11号、桂桑优62号或桑特优2号。
一方面，本发明的检测方法能够实现多种结构相似的生物碱化合物特别是荞麦碱和 1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇的有效分离、鉴定和含量测定，有利于相关制剂的生产监测和含量测定。另一方面，由于所用条件温度较低，分离度提高，可以采用较低流速来完成化合物的分离，有效节约流动相用量，保护色谱柱。并且低温条件下，可以采用较短的色谱柱实现分离，从而降低色谱体系压力，有助于系统的保护；分离度提高后，可以将体系中的缓冲盐浓度降低，减少系统阻塞的风险。此外，发明人对于本发明的检测方法进行了方法学验证，结果表明，所测生物碱的线性标准曲线r值均大于 0.999，方法耐用性、准确度、精密度、重复性良好，均符合要求，可用于样品中多种生物碱含量的同时测定。
附图说明
图1是实施例1在柱温为10℃条件下检测生物碱1-DNJ对照品衍生物的定位色谱图，其中，10.765min：1-DNJ衍生物定位色谱峰。
图2是实施例1在柱温为10℃条件下检测生物碱荞麦碱对照品衍生物的定位色谱图，其中，12.647min：荞麦碱衍生物定位色谱峰。
图3是实施例1在柱温为10℃条件下检测生物碱DAB对照品衍生物的定位色谱图，其中，13.061min：DAB衍生物定位色谱峰。
图4是实施例1在柱温为10℃条件下检测1-DNJ、荞麦碱与DAB的混合对照品衍生物的分离色谱图，其中，10.8min：1-DNJ衍生物色谱峰；12.7min：荞麦碱衍生物色谱峰；13.1min：DAB衍生物色谱峰。
图5是对比例1在柱温为30℃条件下检测的实施例1制备的1-DNJ、荞麦碱与DAB 的混合对照品衍生物的分离色谱图；其中，10.7min：1-DNJ衍生物色谱峰；12.9min：荞麦碱与DAB衍生物色谱峰。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明进一步详细说明，不用于对本发明的范围进行限定。通过这些示例性说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例1
选取结构类似的生物碱化合物标准品，1-脱氧野尻霉素 (1-deoxynojirimycin,1-DNJ)(1)、荞麦碱(Fagomine)(2)和1,4-二脱氧-1,4- 亚氨基-D-阿拉伯糖醇(1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol,DAB)(3)，结构式如下：
Figure BDA0002334568150000051
Figure BDA0002334568150000061
称取对照品适量，加水溶解，稀释配制成每1ml分别含1-DNJ 0.1mg、荞麦碱、DAB各为0.02mg的生物碱对照品溶液与每1ml含1-DNJ 0.1mg、荞麦碱、和DAB各为0.02mg的混合生物碱对照品溶液。
分别精密量取1-DNJ对照品溶液、DAB对照品溶液、荞麦碱对照品溶液与上述混合生物碱对照品溶液各1ml，分别采用如下检测方法进行检测：
检测步骤：置具塞试管中，加入200mmol/L碳酸氢钠溶液，摇匀，再精密加入2ml5mmol/L 9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)丙酮溶液，摇匀，30℃加热30min，精密加入0.1％乙酸4ml，振摇，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
检测条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以柠檬酸盐缓冲液(取柠檬酸三钠22.1g，加水800ml使溶解，用磷酸调节pH值至4.4，用水稀释至 1000ml)为流动相B，按下表1进行梯度洗脱；检测波长为264nm；流速为每分钟1.5ml。
表1洗脱条件参数
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 25 75
22 52.5 47.5
22.01 62.5 37.5
38 62.5 37.5
38.01 25 75
43 25 75
控制色谱柱温为10℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱对照品的分离度，结果见表2。柱温设置为10℃时不同生物碱对照品的定位图谱分别如图1-3所示，分离图谱如图4所示。
表2柱温10℃，样品溶液中生物碱对照品的分离效果
Figure BDA0002334568150000062
Figure BDA0002334568150000071
实施例2
取桑特优2号桑枝100g，加水，加热回流提取，过滤除杂，经阳离子树脂和阴离子树脂分离之后，浓缩干燥得桑枝提取物。
取桑枝提取物约100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水40ml，超声20min使溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置具塞试管中，精密加入200mmol/L碳酸氢钠溶液1ml，摇匀，再精密加入5mmol/L 9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl) 丙酮溶液1ml，摇匀，30℃加热30min，精密加入0.1％乙酸4ml，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以柠檬酸盐缓冲液(取柠檬酸三钠22.1g，加水800ml使溶解，用磷酸调节pH值至4.4，用水稀释至1000ml)为流动相B，按表1进行进梯度洗脱；检测波长为264nm；流速为每分钟1.5ml。控制色谱柱温分别为5、10、15、20℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表3。
表3柱温分别为5、10、15、20℃，桑枝提取物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000072
实施例3
取实施例2制备的桑枝提取物约100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水40ml，超声20min使溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置具塞试管中，精密加入200mmol/L碳酸氢钠溶液1ml，摇匀，再精密加入5mmol/L 9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)丙酮溶液1ml，摇匀，30℃加热30min，精密加入0.1％乙酸4ml，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以柠檬酸盐缓冲液(取柠檬酸三钠22.1g，加水800ml使溶解，用磷酸调节pH值至4.4，用水稀释至1000ml)为流动相B，按表1进行进梯度洗脱；检测波长分别为218nm、254nm；流速为每分钟1.5ml。控制色谱柱温为10℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表4。
表4波长分别为218、254nm，桑枝提取物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000081
实施例4
取实施例2制备的桑枝提取物约100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水40ml，超声20min使溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置具塞试管中，精密加入200mmol/L碳酸氢钠溶液1ml，摇匀，再精密加入5mmol/L 9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)丙酮溶液1ml，摇匀，30℃加热30min，精密加入0.1％乙酸4ml，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以柠檬酸盐缓冲液(取柠檬酸三钠22.1g，加水800ml使溶解，用磷酸调节pH值至4.4，用水稀释至1000ml)为流动相B，按表1进行进梯度洗脱；检测波长为264nm；流速分别为每分钟1.0ml、1.2ml。控制色谱柱温为10℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表5。
表5流速分别为每分钟1.0ml、1.2ml，桑枝提取物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000082
Figure BDA0002334568150000091
实施例5
取实施例2制备的桑枝提取物约100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水40ml，超声20min使溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置具塞试管中，精密加入200mmol/L碳酸氢钠溶液1ml，摇匀，再精密加入5mmol/L 9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)丙酮溶液1ml，摇匀，30℃加热30min，精密加入0.1％乙酸4ml，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以柠檬酸盐缓冲液(分别取柠檬酸三钠11.05g(37.5mmol/L)、5.525g(18.75mmol/L)，加水800ml使溶解，用磷酸调节pH值至4.4，用水稀释至1000ml)为流动相B，按表1进行进梯度洗脱；检测波长为264nm；流速为每分钟1.5ml。控制色谱柱温为10℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表6。
表6流动相盐浓度分别为37.5、18.75mmol/L，桑枝提取物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000092
实施例6
取实施例2制备的桑枝提取物约100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水40ml，超声20min使溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置具塞试管中，精密加入200mmol/L碳酸氢钠溶液1ml，摇匀，再精密加入5mmol/L9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)丙酮溶液1ml，摇匀30℃加热30min，精密加入0.1％乙酸4ml，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液(分别取磷酸二氢钾10.2g、乙酸铵5.8g(75mmol/L)，加水800ml使溶解，用磷酸调节pH值至4.4，用水稀释至1000ml)为流动相B，按表1进行进梯度洗脱；检测波长为264nm；流速为每分钟1.5ml。控制色谱柱温为10℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表7。
表7流动相分别为磷酸二氢钾、乙酸铵，桑枝提取物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000101
实施例7
取实施例2制备的桑枝提取物约100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水40ml，超声20min使溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置具塞试管中，精密加入200mmol/L碳酸氢钠溶液1ml，摇匀，再精密加入5mmol/L 9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)丙酮溶液1ml，摇匀，30℃加热30min，精密加入0.1％乙酸4ml，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以柠檬酸盐缓冲液(取柠檬酸三钠22.1g，加水800ml使溶解，用磷酸调节pH值分别为3.4、3.6、4.0、5.4与8.6，用水稀释至1000ml)为流动相B，按表1进行进梯度洗脱；检测波长为264nm；流速为每分钟1.5ml。控制色谱柱温为10℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表8。
表8缓冲盐溶液pH分别为3.4、3.6、4.0、5.4、8.6，桑枝提取物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000102
Figure BDA0002334568150000111
实施例8
取广东桑桑枝100g，分2次提取，每次加水600ml，每次加热回流提取1h，合并提取液，过滤除杂，即得桑枝粗提物供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置具塞试管中，精密加入200mmol/L碳酸氢钠溶液1ml，摇匀，再精密加入5mmol/L9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)丙酮溶液1ml，摇匀，30℃加热30min，精密加入0.1％乙酸4ml，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以柠檬酸盐缓冲液(取柠檬酸三钠22.1g，加水800ml使溶解，用磷酸调节pH值至3.4，用水稀释至1000ml)为流动相B，按表1进行进梯度洗脱；检测波长为264nm；流速为每分钟1.5ml。控制色谱柱温为10℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表9。
表9柱温10℃，桑枝粗提物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000112
实施例9
取实施例2提取物，加入适量辅料，混合均匀，加水制软材，制粒干燥，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片，即得桑枝提取物制剂，每片含提取物50mg。
称取桑枝提取物片剂10片，研细，称取粉末400mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水40ml，超声20min使溶解，放冷至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置具塞试管中，精密加入200mmol/L碳酸氢钠溶液1ml，摇匀，再精密加入5mmol/L9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)丙酮溶液1ml，摇匀，30℃加热30min，精密加入0.1％乙酸4ml，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以柠檬酸盐缓冲液(取柠檬酸三钠22.1g，加水800ml使溶解，用磷酸调节pH值至4.4，用水稀释至1000ml)为流动相B，按表1进行进梯度洗脱；检测波长为264nm；流速为每分钟1.5ml。控制色谱柱温为10℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表10。
表10柱温10℃，桑枝提取物制剂中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000121
实施例10
取鲁桑桑叶100g，水提，过滤除杂，浓缩醇沉，蒸干得提取物。
按照实施例2的方法制备供试溶液，取供试溶液1ml，加入0.5mmol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.5ml和浓度为0.1％的三乙胺溶液0.2ml，混匀，室温放置1h，加入2ml正己烷终止反应，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件准备：以酰胺基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，以0.1mol/L 醋酸钠(pH8.6)为流动相B，按表11进行进梯度洗脱；检测波长为254nm；流速为每分钟1.0ml。控制色谱柱温为10～20℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表12。
表11洗脱条件参数
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 35 65
23 55 45
35 55 45
45 35 65
55 35 65
表12柱温10-20℃，制备例3的提取物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000122
Figure BDA0002334568150000131
实施例11
取细齿桑桑白皮100g，水提，过滤除杂，浓缩，浓缩液经阳离子树脂分离，浓缩干燥得提取物。
按照实施例2的方法制备供试溶液，取供试溶液1ml，取供试溶液1ml，加入 0.5ml碳酸氢钠缓冲溶液(无水碳酸钠2g，加水1L，用盐酸调节PH至10.5)，摇匀，加入 2.5ml丹磺酰氯乙腈溶液(每毫升2.2mg丹磺酰氯)。边加边振摇，25℃条件下避光反应 90min，加入2％盐酸甲胺溶液，摇匀，终止反应，乙腈定容，离心取上清液进HPLC，注入液相色谱仪。
色谱柱以及洗脱条件准备：以八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠4.0g，加水1L溶解，用磷酸调制pH3.0)为流动相B，按表13进行梯度洗脱；检测波长为360nm；流速为每分钟1.0ml。控制色谱柱温为10～20℃，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表14。
表13洗脱条件参数
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 20 80
13 50 50
21 62.5 37.5
26 70 30
35 52.5 47.5
40 20 80
表14柱温10-20℃下不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000132
对比例1
对实施例1制备得到的生物碱对照品混合溶液中的成分进行检测，控制色谱柱温为 30℃，其他条件与实施例1相同，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表11。柱温设置为30℃时不同生物碱对照品的分离图谱如图5所示。
表11柱温30℃，实施例1中生物碱对照品的分离效果
Figure BDA0002334568150000141
对比例2
对实施例2得到的桑枝提取物中的成分进行检测，控制色谱柱温高于20℃(具体柱温如表12所示)，其他条件与实施例2相同，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表12。
表12柱温分别为25、30℃，实施例2的桑枝提取物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000142
对比例3
对实施例4得到的桑枝提取物中的成分进行检测，控制色谱柱温高于20℃(具体柱温如表13所示)，其他条件与实施例4相同，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表13。
表13柱温分别为25、30℃，实施例3的桑枝提取物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000143
Figure BDA0002334568150000151
对比例4
对实施例8得到的桑枝粗提物的成分进行检测，控制色谱柱温为30℃，其他条件与实施例8相同，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表14。
表14柱温30℃，实施例9的桑枝粗提物中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000152
对比例5
对实施例9得到的桑枝提取物制剂进行检测，控制色谱柱温为30℃，其他条件与实施例9相同，在供试品色谱图中，记录不同生物碱类成分的分离度，结果见表15。
表15柱温30℃，实施例9的桑枝提取物制剂中不同生物碱成分的分离效果
Figure BDA0002334568150000153
以上结合了优选的实施方式对本发明进行了说明，不过这些实施方式仅是范例性的，仅起到说明性的作用。在此基础上，可以对本发明进行多种替换和改进，这些均落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种植物提取物或其制剂中生物碱的检测方法，所述生物碱包括荞麦碱、1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇中的一种或两种，其中，所述检测方法包括：
(1)采用衍生化试剂将待测植物提取物或其制剂进行衍生化反应，得到含有生物碱衍生物的衍生化产物；
(2)对步骤(1)所得的衍生化产物进行色谱分析，其色谱柱柱温为5±2—20±2℃，更优选地，所述柱温为10℃。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述生物碱还包括其他哌啶环类、其他四氢吡咯环类多羟基生物碱中的一种或多种；
优选地，所述生物碱还包括1-脱氧野尻霉素、3-epi-荞麦碱、木豆树宁、
Figure FDA0002334568140000011
脱氧甘露伊霉素、茴香霉素、1-甲基-5-壬基-2苯甲基-3-吡咯烷醇中的一种或多种，优选地，所述生物碱还包括1-脱氧野尻霉素。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述衍生化试剂包括氯甲酸芴甲酯，异硫氰酸苯酯，丹磺酰氯，6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯中的一种或多种，优选为氯甲酸芴甲酯。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱分析采用的检测波长为210-360nm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱分析选自吸附色谱分析或分配色谱分析；
优选地，所述色谱分析为吸附色谱分析。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱分析中使用的固定相选自硅胶，氧化铝，十八烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶和酰胺基键合硅胶中的一种或其组合，优选为十八烷基硅烷键合硅胶。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱分析中使用的流动相选自乙腈-缓冲盐溶液、甲醇-缓冲盐溶液和异丙醇-缓冲盐溶液中的一种或其组合，优选为乙腈-缓冲盐溶液；
优选地，所述缓冲盐优选为柠檬酸缓冲盐、醋酸缓冲盐或磷酸缓冲盐中的一种或多种，优选地，所述缓冲盐选自钠盐、钾盐、铵盐中的一种或多种，优选地，所述缓冲盐溶液的盐浓度为0.01-0.1mol/L，优选为0.018-0.075mol/L；
优选地，所述缓冲盐溶液的pH为3.0-8.6，优选为3.4-5.4；
优选地，所述色谱分析中的洗脱方式为梯度洗脱，
优选地，所述梯度洗脱的条件如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 15-35 65-85 22 42.5-62.5 37.5-57.5 22.01 52.5-72.5 27.5-47.5 38 52.5-72.5 27.5-47.5 38.01 15-35 65-85 43 15-35 65-85
。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述生物碱的衍生物的分离度为0.5以上，优选地，所述生物碱的衍生物的分离度为1.0以上。
9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于，所述植物提取物为桑科植物提取物；优选地，所述植物为桑属(Morus)植物；优选地，所述植物为鲁桑(Morusmulticaulis Perrott.)、白桑(Morus alba L.)、广东桑(Morus atropurpurea Roxb)、瑞穗桑(Morusmizuho Hotta)、长穗桑(Morus wittiorum Hand Mazz.)、长果桑(Moruslaevigata Wall)、黑桑(Morus nigra Linn.)、华桑(Morus cathayana Hemsi.)、细齿桑(Morus serrata Roxb.)、蒙桑(Morus mongolica Schneid.)、山桑(Morus bombycisKoidz.)、川桑(Morus notabilis Schneid.)、唐鬼桑(Morus nigriformis Koidz.)、滇桑(Morusyunnanensis Koidz.)、鸡桑(Morus australis Poir.)、鬼桑(Morus mongolica(Bur.)Schneid var.diabolica Koidz.)、大叶桑、垂枝桑(Morus alba Var.PendulaDippel)、白脉桑及用以上桑种育成的桑树品种、以上桑种的种内或种间选育的杂交桑中的任意一种或多种的组合；优选地，所述植物选自广东桑、鲁桑、白桑、细齿桑、山桑或杂交桑，所述杂交桑优选为粤桑11号、桂桑优62号或桑特优2号。
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