CN101363828A - 一种蜂王浆品质的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蜂王浆品质的评价方法，其通过测定蜂王浆中糠醛类物质5－羟甲基－2－糠醛的含量来评价蜂王浆的品质。该方法灵敏度高、分析方法简单，并且其用来测定糠醛类物质的方法可以高效、灵敏、准确地分离5－羟甲基－2－糠醛、5－甲基糠醛、2－糠醛、2－糠酸、3－糠酸、5－羟甲基－2－糠酸6种糠醛类物质，并能对蜂王浆中的5－羟甲基－2－糠醛进行准确定量。

Description

一种蜂王浆品质的评价方法

技术领域

本发明涉及食品品质评价领域，具体地说，涉及一种通过测定蜂王浆中糠醛类物质5-羟甲基-2-糠醛的含量来评价蜂王浆品质的方法。

背景技术

蜂王浆(Royal jelly)是由哺育蜂头部咽下腺(Hypopharyngealgland)和上颚腺(Mandibular gland)共同分泌的，具有酸、涩、辣、甜且略带特殊芳香气味的乳白色或淡黄色的浆状物。蜂王浆在蜜蜂的级型分化中发挥着重要的作用，同样由蜂王产下的受精卵孵化成的小幼虫，如果在整个幼虫期都被饲喂蜂王浆，只需16d就能发育成生殖器官完全的蜂王；如果只在幼虫期的前三天饲喂蜂王浆，随后改喂蜂蜜和花粉，需要21d，并只能发育成生殖器官不完全的工蜂。

蜂王浆的组分非常复杂，富含蛋白质、碳水化合物和脂类，还包含许多可能发挥重要生理功能的微量组分。蜂王浆含有丰富的生物活性物质，具有诸如抗疲劳、抗菌消炎、抗肿瘤、降血压、促生长等多方面的营养保健作用，在保健食品、医药、化妆品等领域具有很高的应用价值。

由于一些活性成分对贮存温度和贮存时间敏感，蜂王浆对贮存条件要求较高。若贮存不当(温度过高或贮存时间过长)，其物理性状、化学成分及其品质会发生显著变化，致使其保健功效降低甚至丧失。人工饲养蜜蜂幼虫实验表明，贮存不当的蜂王浆不能使蜜蜂幼虫正常发育。长期临床验证也表明，蜂王浆所经历的贮存条件是决定蜂王浆品质的极其关键的因素。但是由于缺少相应的评价方法，质量监管部门及加工、贸易企业迄今无法在蜂王浆生产和流通过程中进行有效的监管和控制，难以对蜂王浆所经历的贮存条件和品质做出如实的评价，从而导致市场上蜂王浆质量良莠不齐。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种蜂王浆品质的评价方法，该方法通过测定蜂王浆中糠醛类物质5-羟甲基-2-糠醛的含量来评价蜂王浆的品质。

蜂王浆化学组成非常复杂，含有大量的单糖、蛋白质等物质且呈酸性，满足了糠醛类物质形成的基本条件。在蜂王浆的贮存过程中(尤其是在较高温度下或较长时间贮存时)，各组分之间不可避免地会发生一些化学反应。美拉德反应是其中最主要的反应之一，这个反应与单糖在酸性条件下降解和脂质过氧化都是引起蜂王浆贮存和加工过程中发生褐变的重要原因。在引起褐变的同时，反应还会在蜂王浆中积聚糠醛类物质，如2-糠醛(Furfural，F)和5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，HMF)等。

5-羟甲基-2-糠醛(5-HMF)是食品贮存过程中常见的一种环状醛类物质，它的产生通常有两条途径：第一，在酸性条件下，食品中的单糖降解为5-HMF；第二，食品中的糖类物质与游离胺基之间发生美拉德反应形成5-HMF及其它糠醛类物质。在这个过程中，反应造成了食品中部分氨基酸降解，并产生一些损害营养的物质，其中部分可能还是有毒性的。

本发明研究人员在不同贮存条件下对蜂王浆中5-羟甲基-2-糠醛(5-HMF)、5-甲基糠醛(5-MF)、2-糠醛(F)、2-糠酸(2-OIC)、3-糠酸(3-OIC)、5-羟甲基-2-糠酸(5-HMFacid)6种糠醛类物质的含量进行了分析。结果表明，在新采收的蜂王浆中没有检出这6种物质；而在经过不同时间(0、1、3、6、9、12个月)贮存后，4个温度梯度(25℃、16℃、4℃、-18℃)的样品中均检出了5-HMF，其含量随着贮存时间增加和温度升高而增加，变化幅度为25℃>16℃>4℃>-18℃；在12个月的试验期内，仅在25℃下贮存的蜂王浆中检出了F。根据5-HMF和F含量与贮存时间和温度的相关性，结合蜂王浆贮存的实践经验，一般以蜂王浆在4℃下保存3个月即已视为不新鲜，那么使得在16℃下保存3个月的蜂王浆即可以视为极不新鲜，因此将蜂王浆的品质按新鲜度分为新鲜、不新鲜和极不新鲜三个等级；其中，新鲜等级的蜂王浆其5-羟甲基-2-糠醛的含量小于或等于90μg/kg；不新鲜等级的蜂王浆其5-羟甲基-2-糠醛的含量大于90μg/kg小于150μg/kg；极不新鲜等级的蜂王浆其5-羟甲基-2-糠醛的含量大于或等于150μg/kg。

本发明的蜂王浆品质的评价方法中，5-羟甲基-2-糠醛的含量测定可通过液相色谱法或紫外分光光度法来测定。

用于液相色谱法或紫外分光光度法的样品处理过程为：蜂王浆经纯水提取、乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白，其上清液经微孔滤膜过滤后，供液相色谱仪或紫外分光光度仪测定。

所述液相色谱法的色谱条件为：流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为甲醇。淋洗梯度为：0-15min，B 2.0％；15-20min，B 2.0-5.0％；20-35min，B5.0-35.0％。色谱柱为C₁₈柱，检测波长285nm。

本发明所提供的蜂王浆品质的评价方法，与现有技术相比，具有如下优点：

1、本发明中糠醛类物质的含量测定方法能高效、灵敏、准确地分离5-羟甲基-2-糠醛、5-甲基糠醛、2-糠醛、2-糠酸、3-糠酸、5-羟甲基-2-糠酸6种糠醛类物质，并能对蜂王浆中的5-羟甲基-2-糠醛进行准确定量。

2、利用本发明方法来评价蜂王浆品质的高低，其灵敏度高，分析方法简单。

附图说明

图1为6种糠醛类化合物标准样品的液相色谱图；

其中：a为波长270nm下的液相色谱图；b为波长285nm下的液相色谱图；c为波长243nm下的液相色谱图；

c中1为5-HMF；2为F；3为5-HMFacid；4为2-OIC；5为3-OIC；6为5-MF。

图2为蜂王浆在16℃下贮存0-12个月的5-羟甲基-2-糠醛含量变化图。

图3为蜂王浆在-18℃贮存12个月时的色谱图。

图4为蜂王浆在4℃贮存12个月时的色谱图。

图5为蜂王浆在16℃贮存12个月时的色谱图。

图6为蜂王浆在25℃贮存12个月时的色谱图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1

将市购的5-羟甲基-2-糠醛(Sigma公司)溶于甲醇，配制成浓度为0.5mg/kg的标准品溶液。

分别称取新采收的茶花蜂王浆(浙江)、荆条蜂王浆(北京)、洋槐蜂王浆(山东)、油菜蜂王浆(青海)样品1.0g于10mL具盖塑料离心管中，加入5mL去离子水，涡旋振荡5min，超声提取3min后，在12000rpm下离心10min，收集上清液；在残渣中再加入3mL去离子水，重复上述提取离心步骤，弃去残渣，合并两次上清液。向上清液中加入300g/L亚铁氰化钾溶液1mL，混匀后再加入150g/L乙酸锌溶液1mL，充分混匀，静止30min后在10000rpm离心10min，取上清液5mL至10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度。样液用0.45μm滤膜过滤后，用液相色谱仪进行测定，HPLC的色谱条件为：色谱柱Symmetry300^TM C₁₈(4.6×250mm，5μm)，柱温30℃、波长285nm，流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，淋洗梯度为：0-15min，B 2.0％；15-20min，B 2.0-5.0％；20-35min，B 5.0-35.0％，流速为1.0mL/min，进样量20μL，测定标准品与样品峰面积S_标、S_样分别为17469、0、0、0、0，根据公式：样品浓度C_样＝样品峰面积S_样/标准品峰面积S_标×标准品浓度C_标×稀释倍数，计算可得样品浓度C_样均为0μg/kg。

上述茶花蜂王浆(浙江)、荆条蜂王浆(北京)、洋槐蜂王浆(山东)、油菜蜂王浆(青海)均为新采收的蜂王浆，在采收后立刻进行了测定。结果表明不同来源的蜂王浆在采收后均未检出5-羟甲基-2-糠醛，这也为利用本发明方法准确地评价蜂王浆的新鲜度品质奠定了基础。

实施例2

将市购的5-羟甲基-2-糠醛(Sigma公司)溶于甲醇，分别配制成浓度为0.5mg/kg的标准品溶液。

分别称取茶花蜂王浆(浙江)、荆条蜂王浆(北京)、洋槐蜂王浆(山东)、油菜蜂王浆(青海)样品1.0g于10mL具盖塑料离心管中，加入5mL去离子水，涡旋振荡5min，超声提取3min后，在12000rpm下离心10min，收集上清液；在残渣中再加入3mL去离子水，重复上述提取离心步骤，弃去残渣，合并两次上清液。向上清液中加入300g/l亚铁氰化钾溶液1mL，混匀后再加入150g/L乙酸锌溶液1mL，充分混匀，静止30min后在10000rpm离心10min，取上清液5mL至10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度。样液用0.45μm滤膜过滤后，用液相色谱仪进行测定，HPLC的色谱条件为：色谱柱Symmetry300^TM C₁₈(4.6×250mm，5μm)，柱温30℃、波长285nm，流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，淋洗梯度为：0-15min，B 2.0％；15-20min，B 2.0-5.0％；20-35min，B 5.0-35.0％，流速为1.0mL/min，进样量20μL，测定标准品与样品峰面积S_标、S_样分别为17540、124、175、276、321，根据公式：样品浓度C样＝样品峰面积S样/标准品峰面积S标×标准品浓度C标×稀释倍数，计算可得样品浓度C_样为70.70μg/kg、99.77μg/kg、157.35μg/kg、183.01μg/kg，从而判断其品质等级分别为新鲜，不新鲜，极不新鲜和极不新鲜。

上述茶花蜂王浆(浙江)、荆条蜂王浆(北京)、洋槐蜂王浆(山东)、油菜蜂王浆(青海)分别为16℃下保存了1、2、3和4个月的样品，与此次实际测定的新鲜度等级相符，从而进一步验证了本发明方法可以准确地评价蜂王浆的新鲜度品质。

实施例3

将市购的5-羟甲基-2-糠醛(Sigma公司)溶于甲醇，配制成浓度为0.5mg/kg的标准品溶液。

分别称取市售蜂王浆样品：A(山东，批号20070815)，B(北京，批号20080409)，C(湖北，批号20070106)和D(浙江，批号20071013)1.0g于10mL具盖塑料离心管中，加入5mL去离子水，涡旋振荡5min，超声提取3min后，在12000rpm下离心10min，收集上清液；在残渣中再加入3mL去离子水，重复上述提取离心步骤，弃去残渣，合并两次上清液。向上清液中加入300g/L亚铁氰化钾溶液1mL，混匀后再加入150g/L乙酸锌溶液1mL，充分混匀，静止30min后在10000rpm离心10min，取上清液5mL至10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度。样液用0.45μm滤膜过滤后，用液相色谱仪进行测定，HPLC的色谱条件为：色谱柱Symmetry300^TM C₁₈(4.6×250mm，5μm)，柱温30℃、波长285nm，流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，淋洗梯度为：0-15min，B 2.0％；15-20min，B 2.0-5.0％；20-35min，B 5.0-35.0％。流速为1.0mL/min，进样量20μL，测定标准品与样品峰面积S_标、S样分别为17523、165、62、293、449，根据公式：样品浓度C样＝样品峰面积S样/标准品峰面积S标×标准品浓度C标×稀释倍数，计算可得样品浓度C样为：A、94.15μg/kg；B、35.37μg/kg；C、167.18μg/kg；D、256.19μg/kg；从而判断A的品质等级为不新鲜，B的品质等级为新鲜，C和D的品质等级为极不新鲜。

其中蜂王浆样品A、B、C实际测定的新鲜度等级与其产品批号推断的保存时间相符，从而进一步验证了本发明方法可以准确地评价蜂王浆的新鲜度品质。而样品D的生产批号为20071013，但其5-羟甲基-2-糠醛含量却达到了256.19μg/kg，说明生产企业在利用这批王浆加工前已经在不适条件下贮存了一段时间，经与厂家核实，此批蜂王浆在加工前确实在20℃左右环境中放置了近1个月。说明用本发明方法能准确地评价蜂王浆的新鲜度。

实验例1 糠醛类物质含量的HPLC测定法的确立

1 试验材料

1.1 试验仪器：高效液相色谱仪(P680，DIONEX公司)，P680四元梯度洗脱泵ASI-100自动进样器，UVD170UV检测器，TCC-100柱温箱，CHROMELEON工作站；

2K15型高速离心机(SIGMA公司)；

涡旋振荡器；

KQ-100B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；

德国SKRTORITUS AG GOTTINGEN电子天平，感量0.0001g；

Milli-Q纯水机(BEDFORD，MA，美国)。

1.2 试验试剂：标准品：5-羟甲基-2-糠醛(5-HMF)、5-甲基糠醛(5-MF)、2-糠醛(F)、2-糠酸(2-OIC)、3-糠酸(3-OIC)、5-羟甲基-2-糠酸(5-HMFacid)，购自Sigma公司；甲酸(色谱纯，DIMA公司)；

甲醇(色谱纯，J.K.BAKER公司)；

乙酸锌溶液(150g/L)；

亚铁氰化钾溶液(300g/L)；

氢氧化钠溶液(0.1mol/L)；

实验用水为超纯水。

1.3 标准溶液配制

标准贮备液的配制：准确称取100mg标准品，置于100mL容量瓶中，甲醇定容，配制成1.0mg/mL的标准贮备液。

标准工作液的配制：分析前用流动相配制成系列浓度的标准工作溶液。

2.色谱条件的优化

2.1 液相色谱柱的选择

用标准贮备液配制成含5-HMF 0.10mg/mL、5-M F0.10mg/mL、F0.10mg/mL、2-OIC 0.10mg/mL、3-OIC 0.10mg/mL、5-HMFacid0.10mg/mL的样品溶液，分别选用Symmetry C18 5μm，4.6×250mm；Diamonsil C 18 5μm，4.6×250mm；Waters Nova-Pak C 18 5μm，3.9×150mm；μBondapak C 18 10μm，4.0×300mm 4种色谱柱对蜂王浆中糠醛类物质进行了色谱条件的实验。实验发现，这4种色谱柱都可以用于6种糠醛类物质含量的分析，只是保留时间、分离度和灵敏度有所不同；Symmetry C 18柱灵敏度和峰形均很好，能将6种化合物完全分开，分离度均大于1.5，所以试验选用Symmetry C 18 5μm，4.6×250mm色谱柱进行测定。

2.2 流动相的选择

由于要分离的6种糠醛类物质的极性差别很大，为了将它们充分分离，必须选择合适的流动相。流动相的pH值能改变色谱柱的选择性，在很大程度上影响化合物，尤其是对酸性较强化合物在色谱柱上的保留能力。为了获得较好的试验效果，其中一种流动相应该是酸性的。试验最终选择甲酸水溶液和甲醇作为流动相，并在保持甲醇比例为2％的基础上，分别测试了不同浓度甲酸水溶液(0.1-1.0％之间)对6种化合物的分离效果，结果发现甲酸浓度为0.5％时，6种化合物之间最小的分离度达到1.5以上，且灵敏度和峰形良好，因此试验选择0.5％的甲酸溶液作为流动相之一。

由于3-OIC和5-MF在色谱柱上的保留能力很强，为了减少检测时间，试验采用了梯度洗脱程序，如表1所示。

表1 糠醛类物质分析梯度洗脱程序

2.3 柱温的选择和检测波长的确定

随着柱温的升高，各种化合物在色谱柱上的保留时间会缩短。为了尽量减少分析时间，分别测定了柱温为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃各种糠醛类化合物在色谱柱上的保留时间和分离度。结果表明，30℃是最合适的柱温。

由于各种化合物的最佳吸收波长不一样，为了定量的准确性，尽量选择在各种化合物的最佳波长或接近最佳波长处进行分析测试。本试验中，5-HMF、5-MF和F在285nm处测定，2-OIC和3-OIC在243nm下测定，而5-HMFacid在270nm下测定。优化条件下标准样品分离图谱见图1。

3.线性关系和检测限

配制7个不同浓度的混合标准样品工作液，其中5-HMF浓度在0.03-20.0μg/mL，5-MF、F、2-OIC、3-OIC、5-HMFacid浓度在0.03-15.0μg/mL。按照优化的色谱条件对标准样品进样测试，以标准样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得6种标准样品峰面积与浓度线性关系，并计算线性相关系数。结果如表2所示。

表2 6种标准样品的线性方程及相关系数(n＝5)

结果表明，在各自的线性范围内，6种化合物含量与峰面积有良好线性关系，线性相关系数R²≥0.9993。

配制不同浓度的混合标准样品工作液，进样分析，以信噪比(S/N)分别为10和3为标准，确定定量检出限(LOQ)和定性检出限(LOD)，结果见表3。

4.分析方法的检出限、精密度和重现性

配制6种化合物浓度均为0.10μg/mL的标准工作溶液，重复进样分析6次，计算6次所得样品浓度的相对标准偏差(RSD)，其RSD≤2.52％，结果见表3。

在相同条件下连续6d取同一样品1.0g，分别加入50μl 6种1000μg/mL的标准贮备液，按照相同的样品处理方式制备样品溶液，进样分析后计算6种糠醛类物质浓度，分析相对标准偏差(RSD)，结果RSD≤4.01％，结果见表3。

表3 分析方法的检出限、精密度和重现性

由表3可见，该方法的精密度和重现性均较好。

5、提取方法的优化

由于蜂王浆富含蛋白类物质，在提取过程中必须去除蛋白质以减少基质干扰和提高回收率。常用的沉淀蜂王浆蛋白的试剂有无水乙醇溶液、磷酸溶液、盐酸溶液、偏磷酸溶液、乙酸锌和亚铁氰化钾溶液、三氯醋酸(TCA)等，经过实验，这些溶液均能很好地将蜂王浆中的蛋白沉淀。但由于糠醛类物质对强酸、热和氧化剂敏感，当用磷酸、盐酸、偏磷酸溶液沉淀蛋白时，回收率很低，有可能是在提取过程中，发生了分解。80％的乙醇水溶液对蜂王浆中羟甲基糠醛提取有很高的回收率，但在进一步净化前，需要用旋转蒸发仪蒸干，而由于乙醇和水的混合液沸点很高，需要长时间的挥发，这不仅延长了测试样品的时间，而且在挥发的过程中羟甲基糠醛等糠醛类物质很容易降解或挥发，从而导致回收率降低。

比较了三氯醋酸和乙酸锌与亚铁氰化钾溶液的沉淀效果。结果显示：用三氯醋酸沉淀蛋白质后的色谱图有很多杂质峰，而用乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白后杂质峰明显少得多，说明乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蜂王浆蛋白质比用三氯醋酸效果好。

因此，本试验采用乙酸锌和三氯醋酸溶液作为蜂王浆蛋白质的沉淀剂。通过优化实验确认，乙酸锌溶液的浓度为150g/L；亚铁氰化钾溶液浓度为300g/L，各使用1mL就可以有效地将蜂王浆中蛋白沉淀，并获得很好的提取回收率。

通过优化提取方法，进行了添加回收率比较。分别用纯水、不同浓度的乙酸水溶液、甲酸溶液、磷酸溶液提取，结果发现使用纯水提取时，6种糠醛类物质的回收率均在85％以上。因此，最终选择纯水提取蜂王浆中的糠醛类物质。

因此，确定样品的处理方法：称试样1.0g于10mL具盖塑料离心管中，加入5mL去离子水，涡旋振荡5min，超声提取3min后，在12000rpm下离心10min，收集上清液；在残渣中再加入3mL去离子水，重复上述步骤，弃去残渣，合并两次上清液。向上清液中加入300g/L亚铁氰化钾溶液1mL，混匀后再加入150g/L乙酸锌溶液1mL，充分混匀，静止30min后在10000rpm离心10min，取上清液5mL至10mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度。样液用0.45μm滤膜过滤后，用液相色谱仪进行测定。

6、回收率

取新采集的蜂王浆样品(经测定6种化合物含量均在检测限以下)1.0g，分别加入6种标准样品。共设置3个添加梯度，使各种标准样品在进样液中的理论最终浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、3μg/mL。按照上述方法提取，计算回收率，结果如表4所示。

表4 回收率试验

结果表明，6种糠醛类物质的平均添加回收率在86.2％-99.7％之间，相对标准偏差小于2.40％，能够满足蜂王浆中糠醛类物质含量的常规分析。

实验例2 蜂王浆品质评价方法的建立

1.蜂王浆的采集和贮存

蜂王浆样品在2006年茶花花期由浙江不同地区的10个蜂场采集，采集蜂种为意大利蜂。蜂王浆采集后立刻放入冰盒中，于当天送回实验室。均质后分装(每份约10g)，存于密封塑料小管中，共130份样品，其中10份立即用于实验例1方法学试验和贮存期为0月的蜂王浆糠醛类物质含量分析试验。剩下的120份样品分别贮存于-18℃、4℃、16℃和25℃，当贮存时间分别达到1、3、6、9、12月时，分别从每个贮存温度条件下取出6个小管进行试验，即试验为6个重复。

2.酸度和含水量分析

酸度和水分能通过影响蜂王浆贮存过程中单糖(果糖等)的异构化或Amadori化合物形成的速度，改变糠醛类物质的形成速度。因此，本试验测定了不同温度下贮存不同时间的蜂王浆的含水量和酸度，结果如表5、表6所示。

表5 不同条件下贮存后蜂王浆的含水量(％)

表6 不同条件下贮存后蜂王浆的酸度(mL)

由表5可见，由于蜂王浆贮存中密封比较严实，水分在各个温度条件下变化很小(P>0.05)，水分平均含量为63.95±1.38％，贮存期间的变化范围在64.35％-63.12％之间。

由表6可见，在-18℃、4℃和16℃贮存下，蜂王浆的酸度变化很小(P>0.05)，其平均值为30.30±0.62mL；但在25℃下贮存3个月后，酸度发生了显著的变化，从第3个月的32.62mL上升到第12个月的39.93mL，可能原因是在较高温度下贮存时，蜂王浆发生了腐败，其中的糖转化成了酸。但总体而言，蜂王浆贮存过程中酸度和水分变化并不大。

3、蜂王浆中糠醛类物质含量及其在贮存中的变化

按实验例1确定的糠醛类物质含量的HPLC测定方法对贮存于-18℃、4℃、16℃和25℃，贮存时间分别为0、1、3、6、9、12个月的样品分别进行含量测定。

在新采收的蜂王浆样品中，6种糠醛类物质的含量均在检测限以下。而在12个月的贮存过程中，贮存在-18℃、4℃和16℃的大部分蜂王浆样品检出了不同含量的5-HMF，但没有检出另外5种糠醛类物质；在25℃贮存时，分别检出了较高含量的5-HMF和F，但也没有检出5-MF、2-OIC、3-OIC和5-HMFacid。

美拉德反应过程中形成的第一种糠醛类化合物是5-HMF，而F，MF和FMC都是美拉德反应的高级阶段产物，它们与2-OIC、3-OIC和5-HMFacid一样，都只有在经过较高温度处理或较长时间贮存的条件下才能产生。由于蜂王浆通常在较低温度下贮存，试验中发现的糠醛类物质大多是美拉德反应的初级产物—5-HMF，只在较高温度(25℃)贮存的蜂王浆中才检出F。

蜂王浆分别在-18℃、4℃、16℃和25℃下贮存12个月时检测6种糠醛类物质的色谱图，如图3、4、5、6所示。

蜂王浆在不同温度下贮存不同时间的5-HMF和F含量如表7和表8所示，分别用μg/kg蜂王浆和μg/kg蜂王浆干重表述。

表7-1 不同贮存过程中蜂王浆的5-HMF含量(18℃、4℃)

表7-2 不同贮存过程中蜂王浆的5-HMF含量(16℃、25℃)

注：表7-1、7-2中数据以平均数±相对标准偏差表示(n＝6)；

同一列数值之间右上角英文字母不同表示相同贮存温度下经过不同贮存时间王浆5-HMF含量差异显著(p<0.05)；

同一行数值之间右上角数字不同表示不同贮存温度下经过相同贮存时间王浆5-HMF含量差异显著(p<0.05)；

ND表示未检出。

表8 25℃贮存不同时间的蜂王浆中F含量

注：表8中数据以平均值±相对标准误差表示；ND表示未检出；

同一列数值之间右上角英文字母不同表示相同贮存温度下经过不同贮存时间蜂王浆F含量差异显著(P<0.05)。

在蜂王浆贮存过程中，5-HMF含量在不同贮存条件下的变化情况差异较大。总体而言，5-HMF随着贮存时间延长而增加，且增幅随着贮存温度升高而增加。这主要是因为当蜂王浆在不当条件下(如25℃)贮存时，更有利于其组分间美拉德反应的发生。

贮存温度为-18℃时，在贮存的前3个月，所有蜂王浆样品均未检出5-HMF；当贮存时间为6个月和12个月时，5-HMF的含量分别为45.75μg/kg和107.21μg/kg。尽管贮存期为12个月时，蜂王浆中5-HMF含量与新采蜂王浆差异显著(P<0.05)，但含量仍比较低。说明蜂王浆的美拉德反应在-18℃(冷冻状态下)，反应速度缓慢。

在4℃和16℃条件下贮存时，蜂王浆中的5-HMF含量分别从1个月时的37.4μg/kg和69.7μg/kg增加到12个月时的256.8μg/kg和228.1μg/kg，差异显著(P<0.05)。而在25℃贮存时，5-HMF含量随贮存时间的增速明显要快。在贮存1个月后，蜂王浆中5-HMF含量就达到了598.73μg/kg，显著高于-18℃、4℃和16℃贮存12个月时的5-HMF含量。另外，在25℃贮存1个月后，蜂王浆样品中就检出了F，其含量从1个月时的89.42μg/kg增加到12个月时的573.64μg/kg。说明贮存温度影响蜂王浆美拉德反应速度，温度越高，美拉德反应速度越快。

总体而言，5-HMF和F的含量随着蜂王浆贮存时间的延长和贮存温度的增加而增加。但从表7-1、表7-2和表8看出，这些增加并不规则，如在4℃和16℃贮存时，蜂王浆在9个月时的5-HMF含量反而要低于6个月时，可能是因为5-HMF本身易被氧化，蜂王浆中的5-HMF处于一个被氧化分解和从前体生成的动态平衡过程之中，在贮存的前6个月，5-HMF的形成速度要快于降解速度。

为了考察5-HMF含量与贮存时间和贮存温度的相关性，以5-HMF含量(μg/kg)为纵坐标Y，以贮存时间(月)为横坐标X，分析了不同贮存温度下这两个变量的线性关系。其中，未检出5-HMF的样品，含量以0μg/kg计算。结果如表9所示。

表9 5-HMF含量与贮存时间的相关性

由表9可见，在-18℃和4℃条件下贮存时，5-HMF含量和贮存时间之间存在着良好的线性关系，R²分别为0.9523和0.9113。可能是因为蜂王浆在这两个温度贮存时，5-HMF的形成速度一直要快于其降解速度。在16℃和25℃下，这两个变量之间也存在较好的线性关系，R²分别为0.7008和0.7140。其R²相对较低的主要原因可能在于贮存6个月后，5-HMF形成(从前体生成)和降解(通过被氧化)速度之间形成了动态平衡，其含量随贮存时间延长而增加的速度变缓甚至出现负增长所致。

分析5-HMF含量的变化规律可以发现，在-18℃、4℃和16℃贮存的前6个月，5-HMF含量始终呈现增长趋势，而且4℃贮存6个月和16℃贮存3个月的5-HMF含量分别为189.7μg/kg和152.4μg/kg，与-18℃贮存9个月和4℃贮存3个月时的89.12μg/kg和89.2μg/kg均有显著差异。根据蜂王浆中5-HMF含量变化规律，结合蜂王浆贮存的实践经验，一般以蜂王浆在4℃下保存3个月即已视为不新鲜，那么使得在16℃下保存3个月的蜂王浆即可以视为极不新鲜，因此保守地选择16℃贮存约3个月时的蜂王浆5-HMF含量，即150μg/kg为蜂王浆新鲜度的阈值。照此计算，5-HMF含量大于90μg/kg小于150μg/kg的蜂王浆可以认为是不新鲜的。而5-HMF含量大于150μg/kg的蜂王浆可以认为是极不新鲜的。

另外，由于在-18℃、4℃和16℃ 3个温度条件下贮存12个月的蜂王浆中均未检出F，而在25℃贮存1个月的蜂王浆就检出美拉德反应较高反应阶段的产物F，并且其含量有随着贮存时间延长而增加的趋势。因此，可以考虑将不得检出F列为蜂王浆新鲜度的另一个阈值。

5.结论

蜂王浆贮存过程中不可避免地发生组分之间的化学反应，其中美拉德反应是蜂王浆贮存过程中最常见的反应之一，而糠醛类物质是美拉德反应的部分产物。

糠醛类物质的含量是研究食品在加工贮藏过程中质量发生变化的一个重要参数，尤其是糠醛(F)和5-羟甲基糠醛(HMF)可被用作衡量蜂王浆新鲜度及品质的重要评价参数。

本发明建立了能同时高效、灵敏、准确分离并定量蜂王浆中的6种糠醛类物质的HPLC分析方法，并利用这种方法测定了不同贮存条件下蜂王浆中糠醛类物质的含量。结果表明：在新采收的蜂王浆中没有检出这6种物质；而在经过不同时间贮存后，多数样品中检出了5-HMF，其5-HMF含量随着贮存时间增加和温度升高而增加，变化幅度为25℃>16℃>4℃>-18℃；但F仅在25℃下贮存的蜂王浆中检出。根据蜂王浆经过不同时间(0、1、3、6、9、12个月)贮存后，4个温度梯度(25℃、16℃、4℃、-18℃)下5-HMF和F的含量的数据，结合蜂王浆贮存的实践经验，将蜂王浆的品质按新鲜度分为新鲜、不新鲜和极不新鲜三个等级；以5-HMF含量小于或等于90μg/kg为新鲜等级的蜂王浆；以5-羟甲基-2-糠醛的含量大于90μg/kg小于150μg/kg为不新鲜等级的蜂王浆，以5-羟甲基-2-糠醛的含量大于或等于150μg/kg为极不新鲜等级的蜂王浆。

Claims (6)

1、一种蜂王浆品质的评价方法，其通过测定蜂王浆中糠醛类物质5-羟甲基-2-糠醛的含量来评价蜂王浆的品质。

2、如权利要求1所述的评价方法，其特征在于，蜂王浆的品质按新鲜度分为新鲜、不新鲜和极不新鲜三个等级。

3、如权利要求2所述的评价方法，其特征在于，所述新鲜等级的蜂王浆其5-羟甲基-2-糠醛的含量小于或等于90μg/kg；所述不新鲜等级的蜂王浆其5-羟甲基-2-糠醛的含量大于90μg/kg小于150μg/kg；所述极不新鲜等级的蜂王浆其5-羟甲基-2-糠醛的含量大于或等于150μg/kg。

4、如权利要求1-3所述的评价方法，其特征在于，所述5-羟甲基-2-糠醛的含量测定通过液相色谱法或紫外分光光度法来测定。

5、如权利要求4所述的评价方法，其特征在于，用于液相色谱法或紫外分光光度法的样品处理过程为：蜂王浆经纯水提取、乙酸锌和亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白，其上清液经微孔滤膜过滤后，供液相色谱仪或紫外分光光度仪测定。

6、如权利要求4所述的评价方法，其特征在于，所述液相色谱法的色谱条件为：流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；淋洗梯度为：0-15min，B 2.0％，15-20min，B 2.0-5.0％，20-35min，B 5.0-35.0％；色谱柱为C₁₈柱，检测波长285nm。

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