CN101206226B - 一种蜂王浆新鲜度检测试纸、其制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蜂王浆新鲜度检测试纸产品、其制备及应用方法，属于医药、食品及生物技术领域。我们最近通过蛋白质组学技术证明蜂王浆中的葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5可做为新鲜度蛋白标记。本发明通过制备检测上述蛋白质的纳米胶体金检测试纸，实现了蜂王浆品质的快速度、低成本和高灵敏度检测。本检测试纸可用于生产、销售和使用过程中的蜂王浆原料品质鉴定、产品质量控制和活性价值测定等方面，也可用于其他相关产品中蜂王浆含量检测。全世界90％以上的蜂王浆产自我国，蜂王浆的年产值在20多亿元，随着人们生活水平的提高，蜂王浆正逐渐成为重要的天然保健品，因此，研制快速、简洁的品种检测方法势在必行。

Description

一种蜂王浆新鲜度检测试纸、其制备及应用

技术领域

本发明涉及一种属于医药、食品及生物技术领域中用于蜂王浆新鲜度检测的检测设备、其制备及应用方法，更具体地，涉及一种可用于简便、快捷、有效地评判蜂王浆新鲜度的检测试纸、其制备及应用方法。

背景技术

由于鲜王浆通常贮存在-20℃或更低的温度以保持其活性成分，如果贮存温度不当，将会导致功能成分丢失或变质而失去商业价值，但目前尚无简便、快捷、有效的方法评判蜂王浆的新鲜度和品质。我们最近通过蛋白质组学技术证明蜂王浆中的葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5可做为新鲜度的蛋白标记物。

由于纳米级胶体金(Colloidal gold)具有高电子密度，能与生物大分子结合，胶体金技术已成为继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后新发展起来的一种常用的固相标记技术。纳米胶体金检测试纸技术以免疫层析反应和胶体金技术为基础，利用目标蛋白与其抗体的特异性反应，快速鉴别样品中是否存在目标蛋白。检测试纸的工作原理：试纸条上的硝酸纤维膜(NC膜)检测线固定有目标蛋白抗体，质控线则固定有前述抗体的二抗，检测线和质控线前的胶体金释放垫含有表面标记上了目标蛋白抗体的纳米胶体金颗粒，样品溶液在层析作用下移动到胶体金释放垫时将胶体金标记的抗体解吸下来并继续移动，如果样品溶液中含有目标蛋白，将形成目标蛋白-抗体-纳米胶体金复合物，当复合物移动到检测线时，复合物将与固定在检测线上的目标蛋白抗体结合，未结合上的复合物和剩余的胶体金标记抗体会继续移动到质控线与二抗结合，使检测线和质控线显现胶体金的红色。纳米胶体金检测试纸制作的具体数据方法极易从相关科学书籍和文献中获得。

通过对蜂王浆中的葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5进行色谱分离纯化、基因克隆表达和蛋白质表位氨基酸分析合成，分别获得上述三种天然蛋白，三种表达蛋白和三种人工合成多肽，制备这些蛋白多肽的单克隆抗体或多克隆抗体，可用于上述检测蜂王浆新鲜度的纳米胶体金检测试纸的制作。基因克隆表达、蛋白质表位氨基酸分析合成、单克隆抗体制备和多克隆抗体制备的具体数据方法极易从相关科学书籍和文献中获得。

发明内容

在已有的科学知识基础上，以蜂王浆中易受贮存温度影响的蛋白质为检测目标评价蜂王浆新鲜度和品质，发明了一种快速、低成本和高灵敏度的用于蜂王浆及其他相关产品生产、销售和使用过程中的原料品质鉴定、产品质量控制和活性价值测定等方面的纳米胶体金检测试纸。首先使用双向电泳分离/色谱分离-质谱分析技术确定蜂王浆中易受贮存温度影响的检测目标蛋白，如葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5。利用多肽合成、基因克隆表达和蜂王浆中天然蛋白分离技术获得检测目标蛋白及特异肽片段，获得检测目标蛋白及特异肽片段的单抗或多抗，制备可检测一种或多种易受贮存温度影响的目标蛋白的蜂王浆新鲜度纳米胶体金检测试纸。

本发明检测试纸包括：滤纸(1)、释放垫(2)、检测线(3)、质控线(4)和衬板(5)。

本发明检测试纸检测目标为蜂王浆中最易受贮存温度影响的葡萄糖氧化酶。

本发明检测试纸检测目标为蜂王浆中最易受贮存温度影响的王浆蛋白4。

本发明检测试纸检测目标为蜂王浆中易受贮存温度影响的王浆蛋白5。

本发明检测试纸检测目标蛋白在室温贮存下易降解。

本发明检测试纸制备检测目标蛋白或特异肽片段的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明检测试纸在蛋白质组分析比较结果基础上，利用多肽合成、基因克隆表达和蜂王浆中天然蛋白分离技术获得检测目标蛋白及特异肽片段。

本发明检测试纸的方法，其特征在于：获得葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5或特异肽片段的单抗或多抗，用抗体标记胶体金制作释放垫，用抗体作为检测线，用相应的二抗作为质控线，检测蜂王浆新鲜度和含量。

本发明检测试纸检测蜂王浆中的蛋白降解情况指示蜂王浆新鲜度和品质。

本发明检测试纸用于蜂王浆品质的快速、低成本和高灵敏度检测。

本发明检测试纸用于蜂王浆生产、销售和使用过程中的原料品质鉴定、产品质量控制和活性价值测定等方面。

本发明检测试纸用于其他相关产品中蜂王浆含量检测。

附图说明

图1：纳米胶体金检测试纸俯视图。

图2：纳米胶体金检测试纸侧视图。

图3：不同储存条件下王浆蛋白的双向电泳图谱。(a)，(b)，(c)和(d)分别对应新鲜王浆、-20℃储存一年、4℃储存一年和室温储存一年的王浆图谱。电泳上样量均为200μg，考马斯亮兰G-250染色。

图4：不同储存条件下王浆蛋白4(Apa4)的双向电泳图谱(从图1对应位置切割而来)。(a)，(b)，(c)，(d)同图2。从图中可以较为直观的看出随着储存温度的升高，王浆蛋白4(Apa4)降解程度越来越高，最后甚至消失殆尽。说明这种王浆蛋白对储存温度比较敏感。

图5：不同储存条件下王浆蛋白5(APa5)和葡萄糖氧化酶(God)电泳图谱(从图1对应位置切割而来)。(a)，(b)，(c)，(d)同图2。从图中可以较为直观的看出随着储存温度的升高，王浆蛋白5(Apa5)和葡萄糖氧化酶(God)降解程度越来越高，最后甚至消失殆尽。说明这两种王浆蛋白对储存温度比较敏感。

图6：王浆蛋白4的肽质量指纹图谱。

图7：王浆蛋白5的肽质量指纹图谱。

图8：葡萄糖氧化酶的肽质量指纹图谱。

图9：新鲜蜂王浆的Superose 12HR分子筛色谱分离结果。从图中可看出，新鲜蜂王浆蛋白经Superose 12HR分子筛分离可明显得到7个色谱峰。

图10：-20℃储存一年、4℃储存一年和室温储存一年的王浆经Superose 12HR分子筛色谱分离得到的7个蛋白质多肽峰相对峰面积比较，结果显示不同条件下储存的王浆7个蛋白组分含量存在较大差异。

图11：4℃储存一年的王浆经Superose 12HR分子筛色谱分离得到的第4个蛋白质多肽峰的Nano LC MS/MS序列分析结果，表明示4℃储存王浆的第4个色谱峰中可检测到王浆蛋白1、王浆蛋白2、王浆蛋白7、王浆蛋白3。

图12：-20℃储存一年的王浆经Superose 12HR分子筛色谱分离得到的第4个蛋白质多肽峰的Nano LC MS/MS序列分析结果，表明示-20℃储存王浆的第4个色谱峰中可检测到王浆蛋白1、王浆蛋白2、王浆蛋白7、王浆蛋白3和王浆蛋白5，表明示4℃储存王浆的第4个色谱峰中可检测到王浆蛋白1、王浆蛋白2、王浆蛋白7、王浆蛋白3，而王浆蛋白5只能在-20℃储存王浆的第4个色谱峰中检测到。

序列表

1、王浆蛋白4的氨基酸序列(SEQ IDNO.1)

1   MTKWLLLMVC LGIACQNIRG GVVRENSSGK NLTNTLNVIH KWKYLDYDFD

51  NDERRQAAIQ SGEYDRTKNY PLDVDQWHNK TFLAVIRYNG VPSSLNVVSD

101 KTGNGGRLLQ PYPDWSFAKY EDCSGIVSAH KIAIDEYERL WVLDSGLVNN

151 TQPMCSPKLF AFDLNTSQLL KQVEIPHDVA TTGKGELVSL TVQAMDSTNT

201 MVYMVDNKNT LIIYQNADDS FHRLSSHTLN HNSDKMSDQQ ENLTLKEVDN

251 KVYGMALSPV THNLYYNSPS SENLYYVNTE SLMKSENQGN DVQYERVQDV

301 FDSQLTVKAV SKNGVLLFGL ANNTLSCWNE HQSLDRQNID VVARNEDTLQ

351 MVVSMKIKQN VPQSGRVNNT QRNEYLLALS DRNQNVLNND LNLEHVNFQI

401 LGANVNDLIR NSRCANFDNQ DNNHYNHNHN QARHSSKSDN QNNNQHNDQA

451 HHSSKSNNRH NNND

2、王浆蛋白5的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)

1   MTTWLLLVVC LGIACQGITS VTVRENSPRK LANSMNVIHE WKYLDYDFGS

51  DERRQAAMQS GEYDHTKNYP FDVDQWRGMT FVTVPRYKGV PSSLNVISEK

101 IGNGGRLLQP YPDWSWANYK DCSGIVSAYK IAIDKFDRLW ILDSGI INNT

151 QPMCSPKLHV FDLNTSHQLK QVVMPHDIAV NASTGNGGLV SLVVQAMDPV

201 NTIVYMADDK GDALIVYQNS DESFHRLTSN TFDYDPKYIK MMDAGESFTA

251 QDGIFGMALS PMTNNLYYSP LSSRSLYYVN TKPFMKSEYG ANNVQYQGVQ

301  DIFNTESIAK IMSKNGVLFF GLMNNSAIGC WNEHQPLQRE NMDMVAQNEE

351  TLQTVVAMKM MHLPQSNKMN RMHRMNRVNR VNRMDRMDRI DRMDRMDRMD

401  TMDTMDRIDR MDRMDRIDRI DRMHTMDTMD TMDRTDKMSS MDRMDRMDRV

451  DRMDTMDRTD KMSSMDRMDR MDRVDTMDTM DTMDRMDRMD RMDRMDRMDR

501  MDTMDRTDKM SRIDRMDKID RMDRMDRTNR MDRMNRMNRQ MNEYMMALSM

551  KLQKFINNDY NFNEVNFRIL GANVNDLIMN TRCANSDNQN NNQNKHNN

3、葡萄糖氧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)

1   MAILNSMYNN VSPLQCTSPF LGGPQLTDVC SASNGELFLA LLNFFVATSP

51  VIGEPCQRVH SSRIPDLSYD FIVVGGGAAR AVVAGRLSEV SNWKVLLLEA

101 GPDEPAGAEI PSNLQLYLGG DLDWKYYTTN ESHACLSTGG SCYWPRGKNL

151 GGTTLHHGMA YHRGHRKDYE RWVQQGAFGW SWDEVMPYYL KSENNTELSR

201 VGTKYHRSGG LMNVERFPYQ PPFAWKILKA AEEAGFGVSE DLSGDRINGF

251 TVAQTISRNG VRLSSARAFI TPFENRSNLH VIVNATVTKV RTLNKRATGV

301 NVLINGRRRI IFARREVILS AGSVNTPQLL MLSGIGPKEH LRSLGIPVVV

351 DLPGVGENLH NHQSFGMDFS LNEDFYPTFN QTNVDQYLYN QTGPLSSTGL

401 AQVTGIWHSN LTTPDDPDIQ IFFAGYQAIC KPKLKIADLS AHDKQAVRMS

451 ALNVQPTSKG RITLNSKDPL DPPVIWSNDL ATEHDRSVMI QAIRVVQKLV

501 NTTVMRDLGV EFQKIELKQC DEFVEDSDDY WNCVIQYNTR AENHQTGTAK

551 MGPSYDPMAV VSPRLKVHGI RGLRVADASV QPQVISGNPV ASVNMVGERA

601 ADFIKEDWGE LLQLL

4、王浆蛋白4核苷酸序列

1    gtcacttgta aaatatttgt aatatcctag aaaaaaaatg acaaaatggt tgctgttgat

61   ggtatgcctt ggcatagctt gtcaaaatat tagaggtggc gttgttcgag aaaattcctc

121  gggaaaaaac ttgacaaata cgttgaacgt gattcacaaa tggaagtatc tcgattatga

181  tttcgataac gacgaaagga ggcaagctgc gattcaatct ggcgaatatg atcgtacaaa

241  aaattatcct cttgacgtcg atcaatggca caacaagact tttctcgctg taataagata

301  caatggtgtg ccttcctctt tgaacgtggt atctgacaaa actggcaacg gtggacgact

361  tctacaaccg tatcctgatt ggtcatttgc caagtacgaa gattgctctg gaatcgtgag

421  cgctcataaa attgctatcg acgaatatga gagattgtgg gttctggatt cgggtctcgt

481  caataatacg caacccatgt gttctccaaa actgttcgct tttgatctta atacctcgca

541  attgctcaag caagtcgaga taccgcacga tgttgccacc acaggaaagg gcgaattagt

601  atctttaact gttcaagcta tggattcgac aaatactatg gtgtacatgg tagacaacaa

661  aaatactttg atcatctacc aaaatgccga tgattctttt catcgattgt cttcccacac

721  tttgaatcac aactctgaca aaatgtcaga tcaacaagaa aatctcacct tgaaagaagt

781  agacaacaaa gtttatggaa tggcacttag tcccgtgacg cataatcttt attacaattc

841  tccgtcttct gagaatttgt attatgttaa cacagaatcg ttaatgaaat cggaaaatca

901  aggaaatgac gtgcaatatg aaagagtcca agacgttttc gacagtcaat taaccgttaa

961  agcagtatcg aaaaatggcg tactcctttt cggactcgcg aataatactc ttagttgctg

1021 gaacgagcat cagtcacttg acagacaaaa tatcgatgtc gtagctcgaa atgaggacac

1081 gcttcaaatg gtcgttagta tgaagattaa gcaaaacgtt ccacaatctg gcagagttaa

1141 taatacgcaa agaaatgaat atttgttggc tttaagcgac agaaaccaga acgtgctaaa

1201 caacgatctt aatctcgaac acgtgaactt ccaaattttg ggcgctaacg taaacgactt

1261 gatacggaat agtcgttgcg caaattttga caatcaggat aataatcact ataatcataa

1321 tcataatcaa gctcgtcatt cttcaaaatc tgacaatcag aataacaatc aacataacga

1381 tcaagctcat cattcttcaa agtctaacaa tcggcataac aataacgatt aagctcatca

1441 tttttcaaaa tttgataatc agaataacaa tcagaataac gattaatata ataatcaatt

1501 ttatcattct ttaaaatctg ttaattaatc ttttctcgat gtaagtcaaa tattttaaaa

1561 aaatttcatt acattataaa acgataaaat aaatatcgtt tttttgcata at

5、王浆蛋白5核苷酸序列

1    tacactgcgt tctcttgaaa ctgtcgtttg caaaatattt gcagcatcca agaacaatga

61   caacttggtt gttgctggtc gtgtgccttg gcatagcttg tcaaggtatc acaagcgtca

121  ctgttcgaga aaattctccg agaaagttgg caaattcgat gaacgtgatt cacgaatgga

181  agtatctcga ttatgatttt ggtagcgacg aaaggaggca agctgcgatg caatctggcg

241  agtatgacca tacgaaaaat tatcccttcg atgtcgatca atggcgtggt atgacttttg

301  taaccgtacc aagatacaaa ggtgtacctt cttctttgaa cgtgatatct gagaaaattg

361  gcaacggtgg acgacttcta caaccgtatc ctgattggtc gtgggcgaac tataaagatt

421  gctctggaat agtgagcgct tacaaaattg cgatcgacaa gttcgacaga ttgtggattc

481  tggactcagg tattatcaat aatactcaac ccatgtgttc accaaaattg catgtctttg

541  atctcaatac ctcacatcag cttaagcaag ttgtgatgcc gcacgatatt gccgtaaatg

601  ccagcacagg gaatggggga ctcgtatcac tagttgttca agctatggat cctgtgaata

661  ctatcgtgta tatggcagat gacaaaggtg atgctttaat cgtctaccaa aattctgacg

721  aatctttcca tcgattgact tccaacactt tcgattacga tcccaaatat atcaaaatga

781  tggacgcggg agaaagtttc acagcgcaag atggaatttt tggaatggca ctcagtccca

841  tgacaaacaa tctttattac agccctcttt cttctcgcag tttgtattat gttaatacaa

901  aaccattcat gaaatcagaa tatggagcaa ataacgtaca atatcaaggt gtccaagata

961  ttttcaacac tgaatcgatt gctaaaataa tgtcgaaaaa tggcgttctc tttttcggcc

1021 tcatgaataa ttcagctatt ggttgttgga acgagcatca accacttcag agagaaaata

1081 tggatatggt cgctcagaat gaagagactc ttcaaacggt cgttgctatg aaaatgatgc

1141 atctcccaca atccaacaag atgaatagga tgcataggat gaatagagtg aatagagtga

1201 atagaatgga tagaatggat agaatagata ggatggatag gatggatagg atggatacaa

1261 tggatacaat ggatagaata gataggatgg ataggatgga tagaatagat aggatagata

1321 ggatgcatac aatggataca atggatacaa tggatagaac agataagatg agtagcatgg

1381 ataggatgga tagaatggat agggtggata ggatggatac aatggataga acagataaga

1441 tgagtagcat ggataggatg gatagaatgg atagggtgga tacaatggat acaatggata

1501 caatggatag aatggatagg atggatagga tggatagaat ggatagaatg gataggatgg

1561 atacaatgga tagaacagat aagatgagta ggatagatag aatggataaa atagatagaa

1621 tggataggat ggataggaca aatagaatgg atagaatgaa taggatgaat agacaaatga

1681 atgaatatat gatggcttta agtatgaaat tacagaaatt tataaataat gattataatt

1741 tcaacgaagt aaacttccga attttgggtg caaatgtaaa cgatttaata atgaatactc

1801 gttgtgcaaa ttctgacaat cagaataaca atcaaaataa gcataataat taagatgatc

1861 gttctttata ttaaaatctg ttaatcagtc ttttctcgat ataaaccaaa tattctttaa

1921 aatttcttta tattataaat ga

6、葡萄糖氧化酶核苷酸序列

1    ccggttttca ttctctgagc gtaactcgac atggcgatct taaactcaat gtacaacaac

61   gtatccccgc tgcagtgcac gtcgccgttc cttggcgggc cgcagctgac cgacgtgtgc

121  tcggcgagca acggcgagct gttcctcgcc ctcctcaact tcttcgttgc cacgagcccg

181  gtgatcggcg agccgtgcca gcgcgtccac tcctcgagga tacccgacct cagctacgac

241  ttcatcgtgg tcggcggcgg agccgcgcgg gcagtggtcg ctggaaggct gagcgaggtt

301  tcgaattgga aggttctgct tctggaggca ggcccggacg agccggccgg cgccgagata

361  cctagcaacc ttcagcttta tctaggcggg gatctggact ggaagtatta cactacgaac

421  gagtcgcacg cctgcctaag cactggcggc agttgctact ggcctcgagg caagaatctc

481  gggggaacga cccttcacca cggcatggcg taccaccgtg gccatcgcaa ggattacgag

541  agatgggtcc agcagggcgc ctttggctgg agctgggacg aggttatgcc gtattacctg

601  aaatcggaga acaacaccga gctgagcaga gtcgggacaa agtaccatcg aagcggtgga

661  ctgatgaacg tggaaaggtt cccataccag ccacctttcg cttggaagat cctgaaagcg

721  gcggaggagg cgggtttcgg cgtttcggag gacttgtcgg gggatcggat aaacggtttc

781  acggtggcgc agacgataag caggaacggc gtgcgtttga gcagcgcgag agcgttcatc

841  acgccgttcg agaaccgaag taacctccac gtgatagtga acgcgaccgt gacgaaagtg

901  agaacgttga acaagagggc gacgggcgtg aacgtgttga tcaacgggag gaggaggatc

961  atattcgcga gacgggaggt gatcctgtcc gcaggctcgg tgaacactcc tcaactgctc

1021 atgttgtcgg gcatagggcc gaaggaacac cttcgatccc tgggaatccc ggtggtggtt

1081 gatctgcctg gagttggcga gaaccttcac aatcaccaat cgttcggcat ggatttctcg

1141 ttgaacgagg acttttaccc gaccttcaac cagaccaacg tcgaccagta cctgtacaat

1201 cagacgggcc ctctatccag caccgggttg gctcaggtga ccggtatatg gcactcgaat

1261 ctcaccaccc ccgacgaccc cgacatacag atattcttcg ccggttacca ggcaatttgc

1321 aagccaaaat tgaagatcgc agatctatcg gcccacgaca aacaggcggt gagaatgtcc

1381 gcgttgaacg ttcagccgac gagcaaaggt cgcatcacgt tgaacagcaa agaccccctc

1441 gacccgcccg tcatctggag caacgatctg gccaccgagc acgaccgcag cgtcatgata

1501 caggcgatcc gagtcgtgca aaaattggtg aacactaccg tcatgaggga tctgggggtc

1561 gagtttcaaa agatcgaact gaagcaatgc gacgagttcg tcgaggacag cgacgattac

1621 tggaactgcg tgatacagta caacacgagg gcggaaaatc atcagaccgg cacggcgaag

1681 atgggaccca gttacgatcc tatggcggtc gtctctcccc ggctcaaggt gcacggcatc

1741 aggggactga gagtggcaga cgcctccgtt cagccgcagg tgatctcggg taatcctgtc

1801 gcctctgtca atatggtcgg cgagagggct gcagacttta tcaaggagga ttggggagaa

1861 ttacttcaat tactgtaatc atttgttgga gttaactgta ctcgtgtttt aaagctacgt

1921 atatatatat aattattctg

具体实施方式

实施例1

蜂王浆蛋白双向电泳分离与质谱分析

将不同储存条件下的王浆分别经磷酸抽提缓冲液(PB)和蛋白样品溶解缓冲液(LB)提取，提取液加入三氯乙酸使蛋白沉淀，得到不同储存条件下的王浆全蛋白。将蛋白重新溶解并检测浓度，然后按一定的上样量作双向电泳(固相pH梯度，17cm胶条，pH 3-10)，所得电泳图谱(图1)用专业分析软件分析。对表达丰度较高的目标蛋白点经酶切作质谱分析，质谱结果提交专业数据库进行序列比对进行蛋白鉴定(图2)。分析结果表明随着储存温度的升高，王浆蛋白4、王浆蛋白5和葡萄糖氧化酶的降解越来越严重(图1)，说明这三种蛋白对储存温度比较敏感。

实施例2

蜂王浆蛋白色谱分离与质谱分析

不同贮存条件保存的蜂王浆分别经丙酮沉淀，碱性缓冲液(pH 8.2)复溶，获得新鲜蜂王浆、-20℃贮存一年蜂王浆、4℃贮存一年蜂王浆、室温贮存一年蜂王浆的总蛋白，将上述蛋白样品进行分子筛色谱分离(图3)，确定在分子量10K到100K的组分存在明显差异。选取其中第四组分(Re＝17.34min)经胰酶消化，钠升级色谱分离和质谱序列分析(Nano LCMS/MS，表1)，确定王浆蛋白5仅能在鲜蜂王浆和-20℃贮存的蜂王浆中检测到。

实施例3

检测目标蛋白基因的克隆表达

根据从NCBI数据库中提供的王浆蛋白4、王浆蛋白5和葡萄糖氧化酶的序列合成各自的正向和反向引物，以蜜蜂工蜂头部的DNA为模板，进行PCR扩增。将扩增得到的目的片段与适当的载体(T质粒，试剂盒)连接组成重组体，然后导入受体菌(大肠杆菌top10菌株，双抗)，菌落PCR筛选重组阳性克隆，对目标克隆产物进行核苷酸序列分析。将经测序证实无误的重组体重组入表达载体中，诱导使其表达。对表达产物分离纯化后进行质谱分析检测。

实施例4

检测目标蛋白表位氨基酸分析和多肽合成

葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5序列如图4所示，利用多种软件分析目标蛋白的亲疏水性并预测其二级结构，每个目标蛋白选择1-2个抗原表位氨基酸序列，利用化学方法分别合成抗原表位多肽并与载体蛋白交联后用于单克隆或多克隆抗体体制备。

实施例5

蜂王浆中检测目标蛋白分离制备

根据葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5的主要理化性质，对利用丙酮沉淀所得的-20℃贮存的蜂王浆总蛋白进行液相分离，具体方法是首先利用分子筛色谱技术将分子量不同的组分分离开，随后对上述各组分进行离子交换色谱分离、疏水色谱分离和反相色谱分离，再辅以SDS电泳及IEF进行纯度检验。对色谱分离到的纯蛋白组分进行胰酶消化和肽指纹图谱分析，确定可用于抗体制备的葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5后，将上述三种蛋白组分脱盐，冷冻真空干燥。

实施例6

检测目标蛋白单克隆抗体体制备

通过免疫小鼠和杂交瘤细胞制备检测目标蛋白单克隆抗体，具体方法是免疫与骨髓瘤细胞同源的健康小鼠后，分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合并培养，筛选出高分泌特异性的阳性杂交瘤细胞进行体外培养，从培养液中制备单克隆抗体，或小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，从腹水中制备单克隆抗体抗体，最后用亲和色谱方法分离获得各种检测目标蛋白单克隆抗体。

实施例7

检测目标蛋白多克隆抗体制备

通过免疫新西兰大白兔制备检测目标蛋白多克隆抗体，具体方法是在第0、28、42、56天皮内多点注射新西兰大白兔，每次注射1mg目标蛋白或多肽合成物，70天后收集血清，利用亲和色谱方法分离获得各种检测目标蛋白多克隆抗体。

实施例8

纳米胶体金-抗体结合物制备

采用柠檬酸三钠还原方法制备纳米直径的胶体金，调节pH至9.0～9.2，加入纯化的检测目标蛋白单克隆抗体或多克隆抗体后再加入含稳定剂的BSA溶液，完成标记后先低速离心弃去沉淀，再将上清液高速离心后将得到的沉淀物溶于pH8.2的TBS溶液中，完成纳米胶体金-抗体结合物制备。

实施例9

纳米胶体金-抗体结合物释放垫制备

将保存于TBS溶液中的纳米胶体金-抗体结合物进行适度稀释后，取吸水玻璃纤维素膜均匀等量浸于其中，随后冷冻真空干燥，剪切成所需大小，完成纳米胶体金-抗体结合物释放垫制备。

实施例10

硝酸纤维膜检测线和二抗控制线制备

将纯化的检测目标蛋白单克隆抗体或多克隆，以及相应的二抗分别包被或喷涂硝酸纤维膜，即用不同抗体分别包被不同的硝酸纤维膜，自然晾干或冷冻真空干燥后剪切成所需大小的细条，固定于吸水玻璃纤维素膜或经封闭液封闭过的硝酸纤维膜上，用作检测线和控制线；或者在硝酸纤维膜不同位置上喷涂出检测线和二抗控制线，自然晾干后用封闭液进行封闭。检测线可用葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5抗体中的一种或几种，也可用其他易受贮存温度影响的蜂王浆蛋白质的抗体。

实施例11

蜂王浆新鲜度纳米胶体金检测试纸组装

在白色塑料垫板上固定一层吸水玻璃纤维素膜作为衬板，从下至上依次粘贴用于吸附样品的滤纸、纳米胶体金-抗体结合物释放垫、检测线和二抗质控线、吸水滤纸，检测线和质控线区域可为封闭过的硝酸纤维膜。

实施例12

单克隆抗体纳米胶体金蜂王浆新鲜度测试纸制备

单克隆抗体纳米胶体金蜂王浆新鲜度测试纸制备方法参考实施例1-11，其检测线为单克隆抗体纳米胶体金，检测线可为一条至多条，含易受贮存温度影响的蜂王浆蛋白质抗体中的一种或几种，二抗质控线采用可市购的抗鼠Ig抗体。

实施例13

多克隆抗体纳米胶体金蜂王浆新鲜度测试纸制备

多克隆抗体纳米胶体金蜂王浆新鲜度测试纸制备方法参考实施例1-11，其检测线为多克隆抗体纳米胶体金，检测线可为一条至多条，含易受贮存温度影响的蜂王浆蛋白质抗体中的一种或几种，二抗质控线采用可市购的抗兔Ig抗体。

实施例14

利用蜂王浆新鲜度纳米胶体金检测试纸检测蜂王浆新鲜度

取鲜蜂王浆、-20℃贮存一年蜂王浆、4℃贮存一年蜂王浆、室温贮存一年蜂王浆，分别按一定比例加水稀释后，加于蜂王浆新鲜度纳米胶体金检测试纸下端吸附样品滤纸上，仅鲜蜂王浆和-20℃贮存一年蜂王浆能使检测线和质控线显现胶体金的红色；短期4℃贮存和室温贮存的蜂王浆能使同一抗体的前一条或两条检测线和质控线显现胶体金的红色，但不能使同一抗体的后几条检测线显现胶体金的红色；而长期4℃贮存和室温贮存的蜂王浆仅能使质控线显现胶体金的红色。

Claims (2)

1.一种蜂王浆新鲜度检测试纸，其特征在于检测目标为蜂王浆中的王浆蛋白4、王浆蛋白5和葡萄糖氧化酶；

所述王浆蛋白4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述王浆蛋白5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的检测试纸包括：滤纸(1)、释放垫(2)、检测线(3)、质控线(4)和衬板(5)；

所述检测试纸的制备方法是：获得王浆蛋白4、王浆蛋白5和葡萄糖氧化酶的抗体，用所述抗体标记胶体金制作释放垫，用所述抗体作为检测线，用相应的二抗作为质控线；所述抗体为单抗或多抗。

2.一种权利要求1所述的检测试纸在蜂王浆生产、销售和使用过程中，原料品质鉴定、产品质量控制和活性价值测定中的应用。

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