CN1719247A - 一种利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种一种利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，该方法主要应用于蜂胶与杨树胶的鉴别，用真空干燥法测定蜂胶固形物含量，然后称取适量该蜂胶提取溶液，用流动相进行定容，混匀，用滤膜过滤，上液相色谱仪分析，采集0－20min的色谱图，得到该蜂胶的色谱图，再用同样的方法得到纯蜂胶和杨树胶的色谱图，将三者进行比较，判断蜂胶的真假。本发明方便快捷、效果好、耗费少、准确性高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，该方法主要应用于蜂胶与杨树胶的鉴别。
背景技术
由于蜂胶在市场上的热销，很多不法商贩想方设法制假售假，以牟取暴利，现在最常见的制假售假方法，就是以杨树皮加水熬制，制成杨树胶。早期杨树胶见于2000年，其外观发粘，气味近似蜂胶，比较容易用外观鉴别，发展到现今，杨树胶与正宗的蜂胶掺杂在一起出售或对杨树胶进一步提纯精制以达到蒙蔽客户的目的，经过处理的杨树胶已难用感官来区别。以至于如今市场上假胶横行，有专家认为，现在市场上至少有70％的蜂胶是假的。而目前用于鉴别蜂胶真假的有效方法很少，蜂胶的两个标准：一个是商业部颁发的标准代号为SB/T10096-92的蜂胶，另一个是国家农业部颁发的标准代号为NY/T5136-2002的无公害食品蜂胶。用这两个标准均无法鉴别蜂胶与杨树胶，因为标准中的胶含量、总黄酮、氧化指标等项目，杨树胶均能达到要求。所以不能运用这两个标准进行鉴别。液相指纹图谱已被广泛用于中药材的原料鉴别[何春年等，葛根药材HPLC指纹图谱研究，中国中药杂志2003.(12).28]，文献已有报道，用气相色谱法测定超临界萃取后的蜂胶的指纹图谱[马海乐等，蜂胶超临界CO2萃取物的GC指纹图谱研究，养蜂科技2005，(1)，36-38]，以区别于乙醇提取的蜂胶。还有运用气相质谱联用技术研究蜂胶中化学成分[刘波静，气相色谱/质谱法分析研究蜂胶中化学成分，分析化学2001，(7)，861]，以上方法均不能提供蜂胶与杨树胶鉴别方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种方便快捷、效果好、耗费少、准确性高的利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是该利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，其步骤是：
(1)、将纯蜂胶用乙醇超声溶解、过滤后，得到纯蜂胶提取溶液；
(2)、用真空干燥法测定纯蜂胶固形物含量，然后称取适量该纯蜂胶提取溶液，用流动相进行定容，混匀，用滤膜过滤，上液相色谱仪分析，采集0-20min的色谱图，得到纯蜂胶的色谱图；
(3)、重复上述(1)、(2)的方法，得到杨树胶的色谱图；
(4)、重复上述(1)、(2)的方法，得到目标蜂胶的色谱图；
(5)、将目标蜂胶的色谱图与纯蜂胶的色谱图和杨树胶的色谱图进行比较，从而判断目标蜂胶的真假。
本发明所述的液相色谱仪的流速为：0.5——1.5ml/min。
本发明所述的液相色谱仪的检测波长为360nm或254nm或272nm或276nm。
本发明所述的液相色谱仪的进样量为1-10ul。
本发明所述的液相色谱仪所用的色谱柱为Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)或相当的色谱柱。
本发明所述的流动相为甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35。
本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：1、运用HPLC法来鉴别蜂胶，不需要使用质谱仪来确证，因此成本低；2、根据黄酮类化合物组份组成的不同，区别蜂胶真假。蜂胶黄酮类化合物的组份组成用液相指纹图谱来反映，建立杨树胶与蜂胶的标准液相指纹图谱，用比对法鉴别蜂胶真假，准确性高。
附图说明
图1为实施例1纯蜂胶原料检测的指纹色谱图。
图2为实施例1杨树胶原料指纹色谱图。
图3为实施例1掺假30％商品胶的检测指纹色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：
取纯蜂胶5g，用20ml，95％乙醇超声溶解，过滤，得到纯蜂胶溶液，用真空干燥法测定其中的纯蜂胶固形物，称取该液适量，使其中含纯蜂胶固形物20mg，用甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35的流动相定容至50ml，混匀，用0.45um滤膜过滤，上液相色谱仪进行分析，液相色谱仪采用Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)的色谱柱，流速调整到1.0ml/min，检测波长为360nm，进样量为2ul，采集0-20min的色谱图，即图一。
取杨树胶5g，用20ml，95％乙醇超声溶解，过滤，得到杨树胶溶液，用真空干燥法测定其中的杨树胶固形物，称取该液适量，使其中含杨树胶固形物20mg，用甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35的流动相定容至50ml，混匀，用0.45um滤膜过滤，上液相色谱仪进行分析，液相色谱仪采用Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)的色谱柱，流速调整到1.0ml/min，检测波长为360nm，进样量为2ul，采集0-20min的色谱图，即图二。
取目标蜂胶5g，用20ml，95％乙醇超声溶解，过滤，得到目标蜂胶溶液，用真空干燥法测定其中的目标蜂胶固形物，称取该液适量，使其中含目标蜂胶固形物20mg，用甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35的流动相定容至50ml，混匀，用0.45um滤膜过滤，上液相色谱仪进行分析，液相色谱仪采用Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)的色谱柱，流速调整到1.0ml/min，检测波长为360nm，进样量为2ul，采集0-20min的色谱图，即图三。
表1蜂胶HPLC特征峰峰号、保留时间
| 峰号 | 相对保留时间(min) | 峰号 | 相对保留时间(min) |
| 1 | 4.51 | 11 | 9.16 |
| 2 | 5.02 | 12 | 9.47 |
| 3 | 5.27 | 13 | 10.57 |
| 4 | 5.72 | 14 | 11.44 |
| 5 | 6.99 | 15 | 12.26 |
| 6 | 7.26 | 16 | 13.67 |
| 7 | 7.56 | 17 | 15.67 |
| 8 | 7.86 | 18 | 17.51 |
| 9 | 8.17 | 19 | 18.47 |
| 10 | 8.76 |
根据上述方法，分别测定了纯蜂胶、杨树胶和掺假商品蜂胶的指纹图谱。由图1至3可知，纯蜂胶的7号峰、11号峰特征明显，而杨树胶则无7号和11号峰，且7号峰高于附近的峰；纯蜂胶不含6号峰，而杨树胶含有6号峰。以此，可以鉴别蜂胶真假，而目标蜂胶的实际掺假量为30％。
实施例2：
取纯蜂胶5g，用20ml，95％乙醇超声溶解，过滤，得到纯蜂胶溶液，用真空干燥法测定其中的纯蜂胶固形物，称取该液适量，使其中含纯蜂胶固形物20mg，用甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35的流动相定容至50ml，混匀，用0.45um滤膜过滤，上液相色谱仪进行分析，液相色谱仪采用Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)的色谱柱，流速调整到0.5ml/min，检测波长为254nm，进样量为1ul，采集0-20min的色谱图。
取杨树胶5g，用20ml，95％乙醇超声溶解，过滤，得到杨树胶溶液，用真空干燥法测定其中的杨树胶固形物，称取该液适量，使其中含杨树胶固形物20mg，用甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35的流动相定容至50ml，混匀，用0.45um滤膜过滤，上液相色谱仪进行分析，液相色谱仪采用Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)的色谱柱，流速调整到0.5ml/min，检测波长为254nm，进样量为1ul，采集0-20min的色谱图。
取目标蜂胶5g，用20ml，95％乙醇超声溶解，过滤，得到目标蜂胶溶液，用真空干燥法测定其中的目标蜂胶固形物，称取该液适量，使其中含目标蜂胶固形物20mg，用甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35的流动相定容至50ml，混匀，用0.45um滤膜过滤，上液相色谱仪进行分析，液相色谱仪采用Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)的色谱柱，流速调整到0.5ml/min，检测波长为254nm，进样量为1ul，采集0-20min的色谱图。
表1蜂胶HPLC特征峰峰号、保留时间
| 峰号 | 相对保留时间(min) | 峰号 | 相对保留时间(min) |
| 1 | 4.51 | 11 | 9.16 |
| 2 | 5.02 | 12 | 9.47 |
| 3 | 5.27 | 13 | 10.57 |
| 4 | 5.72 | 14 | 11.44 |
| 5 | 6.99 | 15 | 12.26 |
| 6 | 7.26 | 16 | 13.67 |
| 7 | 7.56 | 17 | 15.67 |
| 8 | 7.86 | 18 | 17.51 |
| 9 | 8.17 | 19 | 18.47 |
| 10 | 8.76 |
根据上述方法，分别测定了纯蜂胶、杨树胶和掺假商品蜂胶的指纹图谱。由得到的色谱图可知，纯蜂胶的7号峰、11号峰特征明显，而杨树胶则无7号和11号峰，且7号峰高于附近的峰；纯蜂胶不含6号峰，而杨树胶含有6号峰。以此，可以鉴别蜂胶真假，而目标蜂胶的实际掺假量为30％。
实施例3：
取纯蜂胶5g，用20ml，95％乙醇超声溶解，过滤，得到纯蜂胶溶液，用真空干燥法测定其中的纯蜂胶固形物，称取该液适量，使其中含纯蜂胶固形物20mg，用甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35的流动相定容至50ml，混匀，用0.45um滤膜过滤，上液相色谱仪进行分析，液相色谱仪采用Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)的色谱柱，流速调整到1.5ml/min，检测波长为272nm，进样量为10ul，采集0-20min的色谱图。
取杨树胶5g，用20ml，95％乙醇超声溶解，过滤，得到杨树胶溶液，用真空干燥法测定其中的杨树胶固形物，称取该液适量，使其中含杨树胶固形物20mg，用甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35的流动相定容至50ml，混匀，用0.45um滤膜过滤，上液相色谱仪进行分析，液相色谱仪采用Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)的色谱柱，流速调整到1.5ml/min，检测波长为272nm，进样量为10ul，采集0-20min的色谱图。
取目标蜂胶5g，用20ml，95％乙醇超声溶解，过滤，得到目标蜂胶溶液，用真空干燥法测定其中的目标蜂胶固形物，称取该液适量，使其中含目标蜂胶固形物20mg，用甲醇0.4％ H3PO4＝65∶35的流动相定容至50ml，混匀，用0.45um滤膜过滤，上液相色谱仪进行分析，液相色谱仪采用Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)的色谱柱，流速调整到1.5ml/min，检测波长为272nm，进样量为10ul，采集0-20min的色谱图。
表1蜂胶HPLC特征峰峰号、保留时间
| 峰号 | 相对保留时间(min) | 峰号 | 相对保留时间(min) |
| 1 | 4.51 | 11 | 9.16 |
| 2 | 5.02 | 12 | 9.47 |
| 3 | 5.27 | 13 | 10.57 |
| 4 | 5.72 | 14 | 11.44 |
| 5 | 6.99 | 15 | 12.26 |
| 6 | 7.26 | 16 | 13.67 |
| 7 | 7.56 | 17 | 15.67 |
| 8 | 7.86 | 18 | 17.51 |
| 9 | 8.17 | 19 | 18.47 |
| 10 | 8.76 |
根据上述方法，分别测定了纯蜂胶、杨树胶和掺假商品蜂胶的指纹图谱。由得到的色谱图可知，纯蜂胶的7号峰、11号峰特征明显，而杨树胶则无7号和11号峰，且7号峰高于附近的峰；纯蜂胶不含6号峰，而杨树胶含有6号峰。以此，可以鉴别蜂胶真假，而目标蜂胶的实际掺假量为30％。
Claims (6)
1、一种利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，其特征是：
(1)、将纯蜂胶用乙醇超声溶解、过滤后，得到纯蜂胶提取溶液；
(2)、用真空干燥法测定纯蜂胶固形物含量，然后称取适量该纯蜂胶提取溶液，用流动相进行定容，混匀，用滤膜过滤，上液相色谱仪分析，采集0-20min的色谱图，得到纯蜂胶的色谱图；
(3)、重复上述(1)、(2)的方法，得到杨树胶的色谱图；
(4)、重复上述(1)、(2)的方法，得到目标蜂胶的色谱图；
(5)、将目标蜂胶的色谱图与纯蜂胶的色谱图和杨树胶的色谱图进行比较，从而判断目标蜂胶的真假。
2、根据权利要求1所述的利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，其特征是：所述的液相色谱仪的流速为：0.5——1.5ml/min。
3、根据权利要求1所述的利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，其特征是：所述的液相色谱仪的检测波长为360nm或254nm或272nm或276nm。
4、根据权利要求1所述的利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，其特征是：所述的液相色谱仪的进样量为1-10ul。
5、根据权利要求1所述的利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，其特征是：所述的液相色谱仪所用的色谱柱为Hypersil Rp-C18(4.6mm×150mm，3um)或相当的色谱柱。
6、根据权利要求1所述的利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，其特征是：所述的流动相为甲醇0.4％H3PO4＝65∶35。
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