NO761306L - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til anrikning av

' svangerskaps spes i fikt $-^-glykoprot ein,

I tysk søknad 21 57 610 er det omtalt et i plazenta forekommende glykoprotein, som tilkommer betegnelsen "svangerskapsspesifikt B-^-glykoprotein" (SP1) . Videre er det i nevnte søknad omtalt en fremgangsmåte til isolering av dette glykoprotein.

Det er nå funnet en fremgangsmåte som muliggjør isolering av det svangerskapsspesifikke gn-glykoprotein i bedre utbytte og .større renhet. Fremgangsmåten erkarakterisert vedat man bringer blodserum, urin eller plazentaekstrakt ved en pH-verdi mellom 4 og 9 i berøring med et til en uoppløse-lig bærer bundet antilegeme mot svangerskapsspesif ikt 3-|_-glykoprotein, adskiller bæreren som inneholder glykoproteinet bundet, fra den flytende fase og ti-1 utløsning av glykoproteinet behandler med et vandig medium av pH-verdi 2-4 eller en oppløs-ning av et stoff som dissosierer proteinmolekyler ved en pH-verdi på 4 - 9, fortrinnsvis ca. pH 7-

Ved denne fremgangsmåte fremstilles det svangerskapsspesif ikke 3-^-glykoprotein fra disse oppløsninger ved spesifikk immunadsorpsjon ved hjelp av en bærer, som inneholder det tilsvarende antilegeme i uoppløselig form.

Antilegemet som på kjent måte kan bindes til en fast bærer fåes ved immunisering av dyr med det svangerskapsspesifikke 3-]_-glykoprotein. Blodet fra således behandlede for-søksdyr opparbeides på kjent måte til fremstilling av immuno-globulinf raks j onen. Det på denne måte dannede anti-SP]_-serum bindes til tilsvarende kjente fremgangsmåter til egnet bærer. Slike fremgangsmåter er eksempelvis omtalt i Ann. Rev. Biochem. 40 (1971) 259; Naturwissenschaften 58 (1971) 389 eller Nature 214 (1967) 1302. Spesielt egnede bærer er høypolymere kullhydrater som cellulose eller agar, syntetiske harpikser som polyakrylamid eller kopolymere av etylen/maleinsyreanhydrid.

Også glasspartikler kan anvendes som bærere.

Spesielt foretrukket som bærematerial er en renset agarose i form av små kuler med en diameter på ca. 20 - 200^um, hvortil etter den ovenfor sistnevnte metode anti-legemene kan bindes kovalent mot SP-^.

Por isolering av SP^fra oppløsninger som des-suten inneholder andre proteiner og kullhydrater som plazenta-ekstrakter eller serum eller urin fra svangere, bringes de nevnte utgangsstoffer i berøring med adsorbenset som bærer antilegemet, idet pH-verdien innstilles på over 4. Por å unngå en denaturering av proteinet lønner dét seg å velge pHrverdien ikke høyere enn 9- Saltkonsentrasjonen av oppløsningen er ikke kritisk. Imidlertid bør det unngås betingelser som er egnet til å løse bindingen av antigenet til antilegemet. Fortrinnsvis inneholder den vandige oppløsning nøytrale salter og/eller pufferstoffer slik de vanligvis anvendes i biokjemiske reak-sjoner, spesielt natriumklorid, fosfatpuffere, trishydroksy-metylaminometan eller andre kjente pufferstoffer, slik de eksempelvis er omtalt i Biochemistry 5 (1966) 472. Konsentrasjonen av disse stoffer ligger hensiktsmessig i området mellom 0,01 og 2 mol/liter. Forholdet proteinoppløsning : adsorbens er hensiktsmessig i området 1 : 1 til 10 : 1, fortrinnsvis : 1. Adsorbenset bør forbli i berøring med proteinoppløsningen

0,1 til 5 timer for at det skal stå tilstrekkelig tid til dis-posisjon til å.knytte antigen-antilegemebindingen.

Adsorbenset adskilles deretter fra oppløsningen

ved sentrifugering eller filtrering og vaskes flere ganger med en nøytral saltoppløsning for å eliminere overskytende salter og uspesifikt adsorberte forurensninger.

Elueringen av SP-^fra antilegemeholdige bærere

kan foregå på kjent måte ved forholdsregler som bevirker oppløs-ning av antigen-antilegeme-bindingen. Eksempelvis kan elueringen foregå ved innbringning av bæreren i et vandig medium på pH-verdi under 4, fortrinnsvis mellom 2 og 4. Den tilsvarende oppløsning bør inneholde salter av egnede pufferstoffer i egnet konsentrasjon, fortrinnsvis 0,2 til 8 mol pr. liter.

Det lønne.r seg å omrøre dispersjonen av adsorbenset i denne oppløsning 0,1 til 2 timer, idet SP-^desorberes av immunadsorbenset. Etter adskillelse av adsorbens innstilles pH-verdien av den SP-^-holdige oppløsning til ca. nøytral (6 til 8). Oppløsningen kan hvis ønsket underkastes en ytterligere rensning, eksempelvis fra adsorpsjon på hydroksylapatit.

Elueringen av SP-^fra den antilegeme-holdige bærer kan også foregå ved hjelp av proteindissosierende stoffer, eksempelvis urinstoffoppløsninger eller oppløsninger av såkalte kaotrope salter som NaNO^, NaBr, NaClO^, CF^COONa, NaSCN eller CCl-^COONa. Konsentrasjonen av disse salter i elueringsmediet utgjør hensiktsmessig 0,2 til 8 mol/liter. Por å fjerne protein-molekyldissosierende stoffer fra. oppløsningen etter desorpsjonen av SPjog til adskillelse av adsorbenset kan oppløsningen dialyseres mot en nøytralsaltoppløsning eller pufferoppløsningen av konsentrasjon 0,1 til 1 mol/liter.

Det etter denne fremgangsmåte dannede SP-^ har en renhetsgrad fra 60 til 95%- Ved ytterligere rensningsfrem-gangsmåter kan det anrikes til over 99%.

Fremgangsmåten skal forklares nærmere ved hjelp

av et eksempel:

Eksempel.

Isolering av svangerskapsspesifikt 3-|_-glykoprotein fra dets oppløsninger ved immunadsorps j on. . Et til spesifikk binding av svangerskapsspesifikt 3-£~glykoprotein egnet immunoadsorbens får man ved kovalent sammenknytning av anti-svangerskapsspesifikt 3-^-glykoprotein-immunoglobuliner med en egnet bærer. Det i foreliggende eksempel anvendte immunoadsorbens ble fremstillet ved binding av 1,75 g protein av en fra anti-svangerskapsspesif ikt 8-^-glykoprotein-kaninserum utvunnet immunoglobulinfraksjon på 175 g "Sepharose 4 B" (Pharmacia Uppsala), som var blitt aktivert med 21,8 g BrCN, (Axen, R., Porath, J., Ernbach, S.: Nature 214, 1302 (1967))- Ved hjelp av denne immunoadsorbens lar det seg isolere svangerskapsspesif ikt 3-^-glykoprotein etter følgende fremgangsmåte fra ekstraktet fra plazenta: Det svangerskapsspesifikke Sj-glykoproteinholdig plazentaekstrakt dialyseres i første rekke mot 0,1 molar tris-hydroksymetylaminometan-saltsyre-puffer (pH 8,0), som inneholder 1,0 mol/liter NaCl og 1 g/liter natriumazid. Til denne oppløs-ning har man som spesifikk adsorbens det bærerbundne antisvanger-skapsspesifikke 3-|_-glykoprotein-immunoglobulin, omrører 2 timer ved 4°C og frasuger på en filternutsch adsorbenset med det bundede svangerskapsspesifikke 3^glykoprotein. Adsorbenset vaskes i første rekke med 2 x 250 ml av den 0,1 molare tris- hydroksymetylaminometan-saltsyre-pufferoppløsning og deretter med 2 x 250 ml av en fysiologisk (0,9%-ig) kokesaltoppløsning, deretter eluerer man det svangerskapsspesifikke 3^-glykoprotein fra adsorbenset ved seks gangers behandling av adsorbenset

hver gang 20 minutter med 400 ml av en 0,5 molar glycin-HCl-

puffer av pH-verdi 2,5- De forenede eluater innstilles med 1 N NaOH på pH 7,0 og inndampes på et ultrafilter til 10 ml.

Den svangerskapsspesif ikke 3-j_-glykoproteinholdige oppløsning

gjøres deretter ved dialyse saltfri overfor vann og lyofili-

seres til slutt. Hvis ønsket kan vidererensningen av SP-^-oppløsningen f.eks. foretas ved følgende fremgangsmåte. Kon-sentratet dialyseres mot en 0,005 molar natriumfosfatpuffer av pH-verdi 6,8 og/eller vidererenses ved kromatografi på hydroksylapatit. Derved adsorberes de av immunoadsorbenset uspesifikt bundne og deretter eluerte plasmaproteiner til hydroksylapatitten, men gjennomløpet foreligger det svangerskapsspesif ikke B-]_-glykoprotein i høyrenset form. (renhet over 99$).

Samme fremgangsmåte kan anvendes, når det skal fremstilles det svangerskapsspesif ikke (3-^-glykoprotein fra serum eller urin åv svangre.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til anrikelse av det svangerskapsspesifikke 3-j _-glykoprotein (SP-^ ) fra blodserum, urin eller plazentaekstrakt, karakterisert ved at man bringer utgangsmaterialet ved en pH-vérdi mellom 4 og 9 i berøring med ett til en uoppløselig bærer bundet antilegeme mot det svangerskapsspesif ikke 3-^-glykoprotein, adskiller bæreren som inneholder bundet SP-j^ fra den flytende fase og til utløsning av SP-^ behandler med et vandig medium- av pH-verdi 2-4 eller en oppløsning av et proteinmoleky1-dissosierende stoff ved en pH-verdi 4-9-