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Während der Schwangerschaft wird bei einer Reihe von Plasmaproteinen die Konzentration im Blut signifikant verändert ; andere Proteine, die normalerweise nicht vorkommen, erscheinen im mütterlichen Blut neu.
Zu diesen als Schwangerschaftsproteine bezeichneten Substanzen gehören alle in der Plazenta gebildeten Enzyme, Inhibitoren und Hormone, die Eiweissnatur besitzen und in das mütterliche Blut abgegeben werden. Beispiele dafür sind die Oxytocinase, die hitzestabile alkalische Phosphatase, die Histaminase, die Urocinaseinhibitoren sowie das humane Plazentalactogen und das humane Choriongonadotropin (HCG). In der menschlichen Plazenta wurde nun ein ssl-Glykoprotein nachgewiesen, das sich in seinen chemischen und physikalischen Eigenschaften von den bisher beschriebenen Plazentarsubstanzen unterscheidet. Es wurde gefunden, dass dieses neue ssl-Glykoprotein zur Gewinnung von Antiseren zum Nachweis und/oder zur Überwachung einer Schwangerschaft geeignet ist.
Das neue ssl-Glykoprotein ist durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Agargel im Bereich der ssl-Globuline ; eine Sedimentationskonstante von 4, 6 S, : 0, 5 S ;
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;10, 0 bis 11, 0% Hexosen, 9, 5 bis 10, 5% Hexosamin, 0, 5 bis 0, 6% Fucose und
6, 5 bis 7, 5% Neuraminsäure gekennzeichnet.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Überwachung einer Schwangerschaft, das im wesentlichen dadurch gekennzeichnet ist, dass man den zu prüfenden Harn oder das zu prüfende Serum mit einem Antiserum zusammenbringt, das nach bekannten Methoden durch Immunisierung von Tieren mit diesem neuen schwangerschaftsspezifischen ssl-Glykoprotein erhalten worden ist.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens kann man durch immunologische Methoden (Haemagglutinations-Hemmungs-Test, Komplement-Bindungs-Reaktion, Radio-Immunassay, Latex-Agglutination) eine Schwangerschaft nachweisen. Der Nachweis kann mit Serum oder Urin der Schwangeren geführt werden.
Eine quantitative Bestimmung von ssi-Glykoprotein, z. B. mit der radialen Immundiffusion, kann für eine Überwachung der Schwangerschaft von Bedeutung werden.
Das erfindungsgemäss verwendete neue schwangerschaftsspezifische ssi-Glykoprotein kann dadurch erhalten werden, dass man aus einem mit Hilfe einer Salzlösung aus Plazenten gewonnenen Extrakt oder aus Blut oder Urin von Schwangeren die mit Diaminoäthoxyacridin-lactat fällbaren Proteine abtrennt, sodann das im Überstand verbleibende schwangerschaftsspezifische ssi-Glykoprotein zusammen mit Gammaglobulin, insbesondere mittels Ammoniumsulfat, ausfällt und von diesem durch Chromatographie und/oder Elektrophorese abtrennt.
Zweckmässigerweise werden für die Herstellung des schwangerschaftsspezifischen ssi-Glykoproteins zerkleinerte Plazenten mit einer schwachen Salzlösung extrahiert und die mit Diaminoäthoxyacridin-lactat
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der Hauptmenge des Gammaglobulins wird die in reinem Wasser wieder aufgelöste Fällung, zweckmässig nach einer Vorbehandlung, durch Dialyse gegen eine Pufferlösung, an Diäthylaminoäthyl (DEAE)-Cellulose adsorbiert und von dieser wieder eluiert. Als Eluierungsmittel hat sich eine 0, 02-molare Tris-oxymethylaminomethyl/Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 6,5 besonders bewährt, die noch etwa 0, 85% Natriumchlorid und eine kleine Menge, z. B. 0, 05% Natriumazid enthalten kann.
Ausfällen des Eluats mit Ammoniumsulfat liefert das ssl-Glykoprotein in angereicherter Form, das durch Gelfiltration, beispielsweise mittels mit Epichlorhydrin dreidimensional vernetztem Dextran in Perlform mit einer Ausschlussgrenze für Proteine von grösserem Mol.-Gew. als 150000, im Handel als Sephadex G-150 der Firma Pharmacia, Uppsala, erhältlich, weiter gereinigt werden kann.
Zur weiteren Reinigung eignet sich die präparative Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlorid als Träger in einer geeigneten Pufferlösung, z. B. 0, 075% Ammoniumhydrogencarbonat. Nach der elektrophoretischen Auftrennung wird die ssi-Glykoproteinhaltige ss-Zone des Trägers herausgeschnitten, mit Ammoniumhydrogencarbonat eluiert und lyophilisiert. Weitere geeignete Feinreinigungsverfahren sind eine Chromatographierung an dem basischen Ionenaustauscher auf der Basis von mit Epichlorhydrin dreidimensional vernetztem Dextran in Perlform mit eingebauten Diäthylaminoäthylgruppen, im Handel als DEAE-Sephadex der Firma Pharmacia, Uppsala, erhältlich, mit nachfolgender Eluierung mit einem Natriumchlorid-Gradienten, und eine Fraktionierung mit Alkohol, vorzugsweise mit Äthanol.
Das schwangerschaftsspezifische ssi-Glykoprotein wird in ähnlicher Weise aus Blut oder Urin von Schwangeren isoliert.
Gewinnung des erfindungsgemäss verwendbaren, neuen ssi-Glykoproteins :
A) Aus Plazenten.
150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 I einer 0, 5%gen wässerigen Natriumchloridlösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2n-Natriumhydroxyd auf PH 8 eingestellt und mit 50 l
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einer 3% eigen wässerigen Lösung von Diaminoäthoxyacridin-lactat versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 h wird der überstand, der das ssi-Glykoprotein zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert, mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Diaminoäthoxyacridin-lactats versetzt, filtriert und mit 26, 5%, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 h wird der Niederschlag abfiltriert.
500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlages werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0, 01-molare Tris- (oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit"Tris"abge- kürzt)-Salzsäure-Pufferlösung vom PH-Wert 7, 0, die 0, 05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der Überstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0, 1n-Natriumhydroxydlösung auf PH 8, 0 eingestellt und mit 250 g feuchter Diäthylaminoäthylcellulose (Firma Serva, Heidelberg) 1 h verrührt.
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Gelfiltration mittels Sephadex G-150 unter Verwendung von 0, 1-molarem Tris/Salzsäurepuffer vom PH 8, 0 der 1, 0 Mol Natriumchlorid pro Liter enthält, unterzogen (100 : 20 cm-Säule).
Anschliessend werden die Eluate mit spezifischem ssl-Glykoprotein-Antiserum getestet, die ssi-glykoproteinhaltigen Fraktionen gesammelt und daraus die Proteine nochmals, wie oben beschrieben, mit 30% festem Ammonsulfat ausgefällt.
Eine weitere Reinigung erzielt man durch präparative Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlorid als Träger.
Als Puffer wird eine 0, 075-molare Ammoniumhydrogencarbonatlösung (PH 8, 0) verwendet. Man schneidet nach der elektrophoretischen Auftrennung die ssi-glykoproteinhaltige ss-Zone heraus, eluiert mit dem Ammoniumhydrogencarbonatpuffer und lyophilisiert die Eluate.
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01-molaremlinearen Gradienten von 0, 2 bis 2, 0% Natriumchlorid in 0, 01-molarem Tris/Salzsäurepuffer, PH 7, 0, eluiert. Es folgt eine Fällung mit 40% Äthanol bei -5OC. Nach Abzentrifugieren des Niederschlages wird der überstand gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert und lyophilisiert. Reinheit : 90 bis 95%. Dieses Präparat kann zur Herstellung von Antiseren Verwendung finden.
B) Aus Blut.
51 Schwangerenserum werden mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 : 1 verdünnt und daraus die Hauptmenge der Plasmaproteine durch 2, 51 einer 3% igen wässerigen Lösung von Diaminoäthoxyacridin-lactat bei PH 8, 0 gefällt. Der durch Zentrifugieren erhaltene überstand wird zur Entfernung des Diaminoäthoxyacridin-lactats mit 5% Natriumchlorid versetzt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert, der überstand vom Sediment getrennt und mit 30% festem Ammonsulfat versetzt. Im Niederschlag sind das Gammaglobulin und das schwangerschaftsspezifische ssl-Glykoprotein enthalten. Der Niederschlag wird in
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01-molarem0, 01-molarem Tris/Salzsäurepuffer, PH 8, 0, ausgeführt.
Die Eluierung von Diäthylaminoäthylcellulose, die Gelfiltration mit Sephadex, die präparative Zonenelektrophorese, die Reinigung an Diäthylaminoäthyl-Sephadex sowie die Fällung mit Alkohol werden gemäss Abschnitt A ausgeführt.
Das im Rahmen des Beispiels verwendete Antiserum wurde wie folgt erhalten :
Es werden Kaninchen mit dem gereinigten schwangerschaftsspezifischen ssi-Glykoprotein unter Verwendung von Aluminiumhydroxyd als Adjuvans über einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert.
Das schwangerschaftsspezifische ssl-Glykoprotein wird in physiologischer Kochsalzlösung gelöst (Konzentration 0, 06 mg/3 ml) und unter Zusatz von Aluminiumhydroxyd zu einer Suspension verrührt. Die Kaninchen erhalten an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0, 06 mg Protein in 3 ml Suspension pro Tier i. v. injiziert. Anschliessend lässt man die Tiere 9 Tage ruhen. Dann immunisiert man wieder an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit der oben angegebenen gleichen Menge Antigen, lässt die Tiere wieder 9 Tage ruhen und injiziert schliesslich nochmals an 5 aufeinanderfolgenden Tagen je 0, 06 mg des Antigens. Nach einer erneuten Wartezeit von 7 bis 9 Tagen werden die Tiere entblutet. Nach dem Gerinnen des Blutes wird das Serum vom Blutkuchen abgeschleudert und gewonnen.
Beispiel : Quantitative Bestimmung des schwangerschaftsspezifischen ssl-Glykoproteins.
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erhitzt, bis sich eine klare Lösung gebildet hat. 15 ml der Lösung werden mit einer vorgewärmten Messpipette auf eine vollkommen waagrecht liegende Glasplatte von 10 X 10 cm ausgegossen. Nach kurzem Stehen bei
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Raumtemperatur erstarrt die Lösung zu einem transparenten Gel von gleichmässiger Schichtdicke. In einer Entfernung von 2 cm vom Rand der Glasplatte werden in regelmässigen Abständen Löcher von 4 mm Durchmesser gestanzt.
Die Löcher dienen zur Aufnahme der zu untersuchenden Seren von Frauen bzw. den als Bezugsstandard dienenden Lösungen, die 4,8, 16 und 32 mg SPi/100 ml enthalten. 15 pI der zu untersuchenden Lösungen werden in die Löcher eingefüllt und 3 h in einer feuchten Kammer belassen. Danach wird ausgehend von den Löchern in einem Abstand von 0, 5 cm die Agaroseschicht durchtrennt und von der Glasplatte entfernt.
Der freie Teil der Glasplatte wird nun mit 15 ml einer Agaroselösung beschichtet, die wie oben beschrieben hergestellt und der beim Abkühlen auf etwa 50 C bis zu einer Konzentration von 1, 5% Anti-SPI-Serum zugemischt wurde. Anschliessend an die Oberschichtung erfolgt eine elektrophoretische Auftrennung der in den Löchern aufgetragenen Proben während 15 h bei 2 V/cm in das angrenzende Antiserum-haltige Gel. Danach werden die Gele wie bei Agarelektrophoresen üblich gewaschen und getrocknet und die Immunpräzipitatlinien, die sich während der Elektrophorese ausgebildet haben, zur besseren Sichtbarmachung mit Amidoschwarz angefärbt. Die Höhe der Präzipitatspitzen ist ein Mass für die Konzentration des SPl in den untersuchten Proben.
Sie wird zu den Präzipitatlängen, die durch die Standardlösungen ausgebildet wurden, in Beziehung gesetzt. Im vorliegenden Versuch ergab sich bei einem Serum einer nicht schwangeren Frau keine Präzipitatbildung, bei einer Frau in der 8. Schwangerschaftswoche ein Gehalt von 1 mg SP1 pro 100 ml Serum, bei einer Frau in der 20. Schwangerschaftswoche 5 mg SP1 pro 100 ml Serum und bei einer Frau in der 32. Schwangerschaftswoche 20 mg SP1 pro 100 ml Serum.