DE2148587A1

DE2148587A1 - Schwangerschaftsspezifisches beta tief 1-glykoprotein und verfahren zu seiner isolierung

Info

Publication number: DE2148587A1
Application number: DE19712148587
Authority: DE
Inventors: Hans Dipl-Chem Dr Bohn; Ferdinand Stutzinger
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1971-09-29
Filing date: 1971-09-29
Publication date: 1973-04-05

Description

Schwangerschaftsspezifisches ß1-Glykoprotein und Verfahren zu seiner Isolierung Es ist bisher nicht bekannt, dass in der Plazenta und im Urin von Schwangeren ein schwangerschaftsspezifisches ßl-Glyoprotein vorkommt. Es ist zwar immunologisch schon ein Protein im ß-Bereich von Schwangerenserum nachgewiesen worden, ein Verfahren zu seiner Isolierung Jedoch noch nie beschrieben worden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung des schwangerschaftsspezifischen ßl-Glykoproteins (abgekürzt das das dadurch gekennzeichnet ist, dass das schwangerschaftsspezifische B1-Glykoprotein aus Plazenta' sowie dem Blut oder Urin von Schwangeren durch Fraktionieren nach Ublichen Methoden isoliert wird. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das schwangerschaftsspezifische 131-Glykoprotein, gekennzeichnet durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der B-Globuline, eine Sedimentationskonstante von 4,6 S.
ein Molekulargewicht von etwa 100 000, einen Extinktionskoeffizienten E1% 1cm = 11.0 (278 mµ 1/15 molarer Phosphatpuffer pH 7,0) einen Kohlenhydratgehalt von 27 - 30 %, davon 11,0 -12,0% Hexosen, 8,5 - 9,5 % Hexosamin, 0,6 % Fucose und 7,0 - 8,0 % Neuraminsäure.
Das erfindungsgemäss hergestellte schwangerschaftsspezifische B1-Clyokoprotein dient zur Gewinnung von Antiseren. Mit diesen wiederum kann durch immunologische Methoden (Haemagglutinations-Hemmmgs-Test, Komplonent-Bindungs-Reaktion, Radio-Immunassay, Latex-Agglutination) eine Schwangerschaft nachgewiesen werden.
Der Nachweis kann mit Serum oder Urin der Schwangeren geführt werden. Eine quantitative Bestimmung von SP1, z.B. mit der radialen Immundiffusion, kann für eine Überwachung der Schwangerschaft von Bedeutung werden.
Für die Herstellung des schwangerschaftsspezifischen ßl-Glykoproteins werden zerkleinerte Plazenten mit einer schwachen Salzlösung extrahiert und die mit Diaminoäthoxyacridin-lactat fällbaren Proteine bei einem pH-Wert von etwa 8,0 abgetrennt.
Das im Uberstand verbleibende ST1 wird zusammen mit Cammaglobulin mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Zur Trennung des von der Hauptmenge des Gammaglobulins wird die in reinem wasser wieder aufgelöste Fällung, zweckmässig nach einer Vorbehandlung durch Dialyse gegen eine Pufferlösung, an Diäthylaminoäthyl (DEAE) - Cellulose adsorbiert und von dieser wieder eluiert.
Als Elutionsmittel hat sich eine 0,02 molare Tris-oxymethylaminomethyl-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 6,5 besonders bewährt, die noch etwa 0,85 % Natriumchlorid und eine kleine Menge, z.B. 0,05 % Natriumazid enthalten kann. Ausfällen des Eluats mit Ammoniumsulfat liefert das SP1 in angereicherter Form, das durch Gelfiltration beispielsweise mittels Sephadex G-150 weiter gereinigt werden kann.
Zur weiteren Reinigung eignet sich die präparative Zonenelektrophorese mit PVC als Träger in einer geeigneten Pufferlösung, z.B. 0,075 % Ammoniumhydrogencarbonat. Nach der elektrophoretischen Auftrennung wird die SP1-halti:ge ß-Zone des Trägers herausgeschnitten, mit Ammoniumhydrogencarbonat eluiert und lyophilisiert. Weitere geeignete Feinreinigungs verfahren sind eine Chromatographierung an VEAE-Sephadex mit nachfolgender Elution mit einem Natriumchlorid-Gradienten und eine Fraktionierung mit Alkohol, vorzugsweise mit Äthanol.
Das schwangerschaftsspezifische ß1-Glykoprotein wird in ähnlicher Weise aus Blut oder Urin von Schwangeren isoliert.
Beispiel 1 / Isolierung aus Plazenten 150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 Liter einer 0,5 %igen wässrigen Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2 normalem Natriumhydroxid auf pH 8 eingestellt und mit 50 Liter einer 3%igen wässrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridinlactat (Rivanol@) versetzt.
Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der Uberstand, der das SP1 zusammen mit Gammaglobulin enthält, abgehebert, mit 5 % festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Rivanols versetzt, filtriert und mit 26,5 %, bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit, festem Ammonsulfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert.
500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlags werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan (im folgenden mit "Tris" abgekürzt)-Salzsäure-Pufferlösung vom pH-Wort 7,0, die 0,05 % Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird' zentrifugiert und der Uberstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 250 g feuchter DEAE-Cellulose eine Stunde verrührt.
Sodann wird die DEAE-Cellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je einem Liter 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02 molarem Tris-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der 0,85 Vo Natriumchlorid und 0,05 % Natriumazid enthält, eluiert.
Den vereinigten i-luaten wird 30 Vo Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesotzt und das gauze verrührt. Der Niederschlag, der das Sg'1 enthält, wird in 300 ml destilliertem Wasser gelöst und der Colfiltration mittols Sophadex C-150 unter Verwendung von 0,1 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,G, der 1,0 Mol Natriumchlorid pro Liter enthält, unterzogen (100 : 20 cm-Säule).
Anschließend werden die Eluate mit spezifischem SP1-Antiserum getestet, die SP1-haltigon Fraktionen gesammeit und daraus die Proteine nochmals wie oben beschrieben mit 30 % festem Ammonsulfat ausgefällt.
Eine weitere Rei@igung erzielt man durch präparative Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlorid (PVC) als Träger. Als Puffer wird eine 0,075 molare Ammoniumhydrogencarbonatlösung (pH 8,0) verwendet. Man schneidet nach der elektrophoretischen Auftrennung die SP1-haltige ß-Zone heraus, eluiert mit dem Ammoniumhydrogencarbonat-Puffer und lyophilisiert die Eluate.
Die Trockensubstanz wird in 0,01 molarem Tris-Saizsäuro-Puffor pil 7,0, der 0,2 % Natriumchlorid enthält, gelöst, an DEAE-Sephadex (Säule 5 x 20 cm) chromatographiert und mit einem lineare Gradienten von 0,2 bis 2,0 % Natriumchlorid in 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer plI 7,0 eluiert, Es folgt oine Fällung mit 40 % Äthanol bei -50C.. Nach Abzentrifugation des Miedrschlages wird der überstand gogon destilliertes Wasser salzfroi dialysiert und lyophilisiert. Reinheit 90 - 95 %. Dieses Präparat kann zur Herstellung von Antiseren Vorwendung finden Beispiel 2 / Isolierung aus Blut 5 Liter Schwangerenserum werden mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1:1 verdünnt und daraus die Hauptmenge der Plasuaproteine durch2,5 Liter 3 %igen Rivanols bei pH 8,0 gefällt.
Der durch Zentrifugation erhaltene Überstand wird zur Entfernung des Rivanols mit 5 % Natriumchlorid versetzt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert, der Überstand vom Sediment getrennt und mit 30 % festem Ammonsulfat versetzt.
Im Niederschlag sind das Gammaglobulin und das schwangerschaftsspezifische 13' ß1-Glykoprotein enthalten. Der Niederschlag wird in 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 7,0 gelöst, gogen 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 7,0 dialysiert und anschließend mit DEAE-Cellulose gereinigt. Die DEAE-Collulosc-Bchandlung wird in 0,01 molarem Tris-Salzsäure-Puffer pH 8,0 ausgeführt.
Die Elution von DEAE-Cellulose, die Gel-Flltration mit Sephadex, die präparative Zonenelektrophorese, die Reinigung an DEAF,-Sephadex sowie die Fällung mit Alkohol werden gemäß Beispiel 1 ausgeführt.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Isolierung des schwangerschaftsspezifischen B1-Glykoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass das schwangerschaftsspezifische B1-Glykoprotein aus Plazenta sowie dem Blut oder Urin von Schwangeren durch Fraktionieren nach üblichen Methoden isoliert wird.

2 Schwangerschaftsspezifisches B1-Glykoprotein, gekennzeichnet durch eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der ßl-Globuline, eine Sedimentationskonstante von 4,6 S, ein Molekulargewicht von etwa 100 000, einen Extinktionskoeffizienten E 1Sd 11,0 (278 1 cm 1/15 molarer Phosphatpuffer, pH 7,0) einen Kohlenhydratgehalt von 27 - 30 %, davon 11,0 - 12,0% Hexosen, 8,5 - 9,5 6 Hexosamin, 0,6 % Fucose und 7,0 -8,0 6 Neuraminsäure.

3. Verwendung von schwångerschaftsspezifischem B1-Glykoprotein als Reagenz und zur Gewinnung von Antiseren als Reagenz zum Nachweis und zur Überwachung einer Schwangerschaft.