DE3102487C2 - Verfahren zum Herstellen von Humanrelaxinextrakt aus Placenta - Google Patents

Verfahren zum Herstellen von Humanrelaxinextrakt aus Placenta

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Abstract

Human-Relaxin wird aus menschlicher Foetusmembran, vorzugsweise Chorion-Decideua-Memran gewonnen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Humanrelaxinextrakt aus Placenta durch Zerkleinern und Homogenisieren des Ausgangsmaterials, Befreien des Homogenisats von Geweberesten, Organzelwn und anderen Ballaststoffen durch Ansäuern und Aussalzen, Zentrifugieren des Homogenisats, Fällen des Relaxins mit Aceton aus dem klaren Überstand und Fraktionieren der Acetonfällung durch Serienchromatographie an Sephadex G50.
Relaxin ist ein Polypeptidhormon, das die Relaxierung des Beckenligaments von Säugetieren erleichtert. Von Hisaw (Prod. Sue. Ex. Piol. 23,661,1926) wurde als erstem die Existenz des Relaxins im Jahr 1926 beobachtet. Trotz der zahlreichen Jahre, die seit dieser ersten Entdeckung vergangen sind, ist derzeit — besonders beim Menschen — nur geringe Kenntnis über dieses Hormon verfügbar.
Bei Tieren wurde Relaxin in verschiedenen Geweben von Säugetieren und Nicht-Säugetieren gefunden. Bislang ist die einzige reiche und üppig vorhandene Quelle für Relaxin das Ovarium der trächtigen Sau, aus dem Relaxin für Handels· und Versuchszwecke erhalten wird.
Sn ist es beispielsweise aus der US-PS 28 52 431 bekannt. Relaxin aus den Ovarien herzustellen. Beim Menschen ist jedoch nur wenig über den Ursprung, die physiologische oder pathologische Rolle und die Struktur von Relaxin bekannt.
Das trächtige Ovarium scheint auch bei der Frau an einer relaxinartigen Aktivität reich zu sein. Die Möglichkeit, Human-Relaxin aus dieser Quelle zu erhalten, ist jedoch wegen der praktischen Unmöglichkeit, genügende Mengen von menschlichen trächtigen Ovarien für die Extraktion zu haben, nur sehr begrenzt.
H.). Struck berichtet in »Untersuchungen über Reinigung, Bestimmung und Wirkung des Relaxin in Forschungsbericht des Landes Nordrhein-Westfalen« 1972. Nr. 2304. insbesondere Seiten 6, 7 und 21 und 22.
über die Isolierung von Relaxin aus menschlicher Placenta. H. J. Struck erhält jedoch nur geringe Ausbeuten an der gewünschten Substanz,
Die Isolierung des Relaxins erfolgt bei den bekannten Verfahren im allgemeinen durch Zerkleinern des Ausgangsmaterials und Homogenisieren, Abtrennen von Gewebsresten, Organzellen und anderen Ballaststoffen, Ansäuern, Acetonzugabe bzw. Aussalzen, Zentrifugieren und Fällen des Relaxins aus dem klären Oberstand mittels Aceton und Aufarbeiten des Acetonpräparats durch Serienchromatographie an Sephadex G50. Bei den bekannten Verfahren ist jedoch die Ausbeute an Relaxin niedrig.
Die Erfindung baut darauf auf, daß der Komplex von Foetalmembranen, der zusammen mit der Placenta leicht bei der Niederkunft erhalten werden kann, eine neue, leicht verfügbare Quelle für Human-Relaxin ist.
Insbesondere wurde festgestellt, daß die Deciduamembran an Relaxin besonders reich ist.
Die sogenannten »Foetalmembranen« sind ein Komplex der drei Schichten Amnion, Chorion und Decidua.
Das Amnion wird von den begleitenden Chorion-Decidua-Membranen leicht durch Delaminierung abgetrennt. Im Gegensatz dazu sind daf; Chorion und die Decidua voneinander nur schwierig abtrennbar.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem Foetalmembranen als Ausgangsmaterial verwendet werden. Vorzugsweise sollten die begleitenden Chorion-Decidua-Membranen oder mehr bevorzugt die Decidua selbst als solches Ausgangsmaterial verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Herstellen von Human-Relaxinextrakt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Ausgangsmaterial die die Placenta begleitenden Foetalmembranen als Ganzes verwendet werden.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es erstmals möglich, Humanrelaxin in größeren Mengen herzustellen.
Human-Relaxin kann direkt aus der obigen Quelle bzw. den obigen Quellen durch Extraktion oder indirekt aus dem Inkubationsmedium von in-vitro-Kulturen des bzw. der genannten Gewebe oder Zellen erhalten werden.
Der Bioassay von Relaxin enthaltenden Zubereitungen baut sich im allgemeinen auf folgenden Methoden auf:
1. der Hemmung der spontanen Uteruskontraktion sowohl in vivo als auch in vitro, unu
2. der Relaxierung des Symphisschambeins, die durch
a) Papierung des Meerschweinchen-Symphisschambeins.
b) Röntgenstrahlungsuntersuchung des Maus-Symphisschambeins, und
c) direkte Messung des Maus-Symphisschambeins
bestimmt werden kann.
Die biologische Aktivität von erfindungsgemäß erhaltenen, Relaxin enthaltenden Zubereitungen wurde nach der obigen Methode 2c gemessen und als MSE (Meerschweincheneinheiten) unter Verwendung einer Schweine-Relaxin-Zubereitung (NIH) als Standard ausgedrückt.
Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Zubereitungen beim Hemmtest der Uteruskontraktion
aktiv waren (vgl. 1 oben).
Relaxin kann therapeutisch bei verschiedenen pathologischen Zuständer. -Jer Schwangerschaft (vorzeitige Niederkunft, drohender Abort) und des Verbindungsgewebes (Sclerodermie und Trofik-Ulcus) verwendet werden. Weiterhin ist Human-Relaxin von äußerster Wichtigkeit für die Herstellung eines homologen Radioimmunoassaybestecks, das die Messung von Relaxin in menschlichen Körperflüssigkeiten und -geweben gestattet
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert
Beispiel 1 Human-Relaxin aus Gewebehomogenat
Menschliche Placenta und die begleitenden Foetalmembranen wurden bei der Niederkunft gesammelt und in einer Hank-Lösung oder in gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, gewaschen. Das Material wurde bis zur Weiterverarbeitung bei -300C gelagert (die Placenta kann von den begleitenden Foetalmembranen entweder vor oder nach der Lagerung abgetrennt werden).
Die Foetalmembranen als Ganzes können sodann weiterverarbeitet werden oder vorzugsweise wird das Amnion von den Decidua-Chorion-Membranen durch Delaminierung abgetrennt und verworfen.
Gewünschtenfalls kann die Decidua von dem Chorion abgekratzt und als solche weiterverarbeitet werden. Jedoch ist der letztgenannte Vorgang nicht leicht durchführbar und scheint für routinemäßige Extraktionsverfahren nicht von Wert zu sein.
Ungefähr 500 g Membranmaterial, das von 15 bis 20 Niederkünften herrührte, wurden auf einmal verarbeitet.
Das Gewebe wurde zerkleinert und in 200 ml destilliertem Wasser homogenisiert.
Das so erhaltene Gewebehomogenat wurde sodann nach einer der folgenden Methoden verarbeitet:
a) nach der Methode von Schwabe und Braddon in »Biochem. Biophys. Res. Cummun.« 68, 1126, 1976. Nach der Zugabe von 30 ml konzentrierter HCl wird das Gemisch 24 h lang bei 4°C gehalten und sodann mit 160 ml kaltem Aceton versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei 40C stehen gelassen. Der Niederschlag wird durch 15minütige Zentrifugierung mit 2000 Upm abgetrennt und verworfen. Der klare Oberstand wird mit 5 Volumina kaltem Aceton 24 h lang behandelt und sodann 30 min lang bei 27 000 Upm zentrifugiert
b) nach der Methode von Sherwood in »Endocrinology« 104, 886, 1979. Das Gemisch wird zuerst mit Phosphatpuffer extrahiert Sodann werden die Gewebereste und die schwersten zellulären Organzellen durch 30minütiges Zentrifugieren bei 27 000 Upm abgetrennt und verworfen.
In beiden Fällen wird Reiaxin als roher Extrakt erhalten. Der rohe Extrakt kann durch Serienchromatographie auf CM-Cellulose, superfeinem Sephadex G-50 und Sephadex G-15 nach den von den genannten Autogen vorgeschlagenen Methoden weiter gereinigt werden, wodurch ein gereinigtes Material mit einer Gesamt-Relaxin-Aktivität von 1500 bis 2500 MSE und einer spezifischen Aktivität von 150 bis 1500 MSE'mg Proteinen je nach der Anzahl der chromatographischen Stufen erhalten wird.
/ Beispiel 2
Human-Relaxin aus einer in-vitro-Kultur
von menschlicher Decidua
Die Decidua wurde von der Oberfläche der decidua-chorion-begleitenden Membranen abgekratzt in und zerkleinert
1 bis 2 g des zerkleinerten Gewebes wurden in
Erlenmeyer-Kolben gegeben, die jeweils mit 40 ml oxygenierter Gey-Lösung, modifiziert durch Zugabe von Hepes (2OmM), Penicillin (50 E/ml) und 10%
Ji Kalbserum, gefüllt waren.
Die Kulturen wurden in einem Stoffwechselinkubator 48 h lang bei 37°C inkubiert. Die Medien wurden gesammelt, mit 5 Volumina kaltem Aceton behandelt und 24 h bei 4° C gehalten. Das Gemisch wurde sodann -to 30 min bei 27 000 Upm zentr iugiert, wodurch ein Pellet erhalten wurde, das einen rohen Relaxin-Extrakt mit einer spezifischen Aktivität von 500 bis 200 MSE/mg Proteinen enthielt.
Der rohe Extrakt kann sodann nach den bekannten Methoden, die im Beispiel 1 angegeben sind, weiter gereinigt werden.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Herstellen von Humanrelaxinextrakt aus Placenta durch Zerkleinern und Homogenisieren des Ausgangsmaterials, Befreien des Homogenisats von Geweberesten, Organzellen und anderen Ballaststoffen durch Ansäuern und Aussalzen, Zentrifugieren des Homogenisats, Fällen des Relaxins mit Aceton aus dem klaren Oberstand und Fraktionieren der Acetonfällung durch Serienchromatographie an Sephadex G50, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsmaterial die die Placenta begleitenden Foetalmembranen als Ganzes verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsmaterial vom Amnion abgetrennte Chorion-Decidua-Membran verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsmaterial vom Chorion abgekratzte Decidua verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsmaterial das Inkubationsmedium von menschlichen Decidualgeweben oder -zellen verwendet wird, das in viro kultiviert worden ist
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