NL8100243A - Werkwijze voor het verkrijgen van menselijk relaxinum. - Google Patents

Description

- 1 - ' *

Werkwijze voor het verkrijgen van menselijk relaxinum.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van menselijk relaxinum. Relaxinum is een polypeptidehormoon, dat de relaxatie van de bekken-gewrichtsband van zoogdieren vergemakkelijkt. Hisaw 5 (Proc. Soc. Expl. Biol. 23,661,1926) nam het bestaan van relaxinum voor eerst waar in 1926. Ondanks de vele jaren die sinds de eerste ontdekking voorbij zijn gegaan, is er weinig informatie over dit hormoon beschikbaar, in het bijzonder bij mensen.

10 Bij dieren is relaxinum aangetroffen in verschil lende weefsels van zoogdieren en niet-zoogdieren. Tot nog toe is de enige rijke en overvloedige bron van relaxinum het ovarium van de drachtige zeug, waar relaxinum van wordt verkregen voor commerciële en experimentele toepassing.

15 Bij mensen is weinig bekend over de oorsprong, de fysiologische of pathologische betekenis, en de structuur van relaxinum.

Het vruchtbare ovarium schijnt rijk te zijn aan relaxinumachtige activiteit eveneens bij de vrouw.

20 De mogelijkheid evenwel om menselijk relaxinum te verkrijgen van deze bron is zeer gering wegens de praktische onmogelijkheid om te beschikken over voldoende hoeveelheden menselijke vruchtbare eierstokken, die beschikbaar zijn voor de extractieprocedure.

25 De uitvinding is gebaseerd op het inzicht, dat een nieuwe gemakkelijk beschikbare bron van menselijk relaxinum het complex van foetale membranen is, die gemakkelijk kunnen worden verkregen bij een bevalling samen met de placenta.

30 Meer in het bijzonder is gevonden, dat het deciduale membraan bijzonder rijk is aan relaxinum.

De zgn. "foetale membranen" zijn een complex van de drie lagen amnion,chorion en decidua.

Amnion wordt gemakkelijk gescheiden van de 35 geassocieerde chorion-decidua-membranen door delaminatie. Daarentegen zijn chorion en decidua moeilijk volledig van 8100243 -*· - 2 - · elkaar te scheiden.

Het hoofddoel van de uitvinding is een werkwijze voor het verkrijgen van relaxinum, waarbij gebruik gemaakt wordt van de foetale membranen als het bronmateriaal. Bij 5 voorkeur worden de geassocieerde chorion-deciduamembranen, of, met nog meer voorkeur, de decidua zelf gebruikt als dergelijk bronmateriaal.

Menselijk relaxinum kan worden verkregen rechtstreeks van de bovengenoemde bron(nen) door extractie, of, 10 op indirekte wijze, van het incubatiemedium van in vitro culturen van de genoemde weefsel(s) of cellen.

Bio-onderzoek van relaxinum-bevattende preparaten is algemeen gebaseerd op de volgende methoden: 1) de inhibitie van spontane uteruscontractie 15 zowel in vivo als in vitro? en 2} de relaxatie van de symphis pubis, die kan worden bepaald door: a) betasting van de symphis pubis van de cavia; b) röntgenbestraling van de symphis pubis van 20 de muis? of c) direkte meting van de symphis pubis van de muis.

De biologische activiteit van de relaxinum-bevattende preparaten, verkregen volgens de uitvinding, 25 is gemeten onder gebruikmaking van methode 2c hierboven en is uitgedrukt in GPU (guinea pig units) in overeenstemming met het varkensrelaxinumpreparaat, dat als standaard is gebruikt (NIH)«

De preparaten van de uitvinding zijn eveneens 30 actief gebleken bij de uteruscontractie-inhibitieproef (zie 1 hierboven).

Relaxinum kan therapeutisch worden gebruikt in verschillende pathologische toestanden van zwangerschap (voortijdige baring, dreigende abortus) en van bindweefsel 35 (sclerodermia en trofische ulcer). Verder is menselijk relaxinum van uiterst belang bij de bereiding van een homologe radio-immuuntestuitrusting, die de meting van relaxinum in menselijke lichaamsvloeistoffen en weefsels mogelijk maakt.

40 De uitvinding wordt in het onderstaande nader 8100243

’’ ' JL

- 3 - toegelicht aan de hand van de volgende niet beperkende voorbeelden.

VOORBEELD I

Menselijk relaxinum van een weefselhomogenaat.

5 Menselijk placenta en de geassocieerde foetale membranen werden verzameld bij baring en gewassen in Hank's oplossing of een gebufferde zoutoplossing, pH 7,4.

Het materiaal werd opgeslagen bij -30°C totdat het werd behandeld (placenta kan worden gescheiden van de geassocieerde 10 foetale membranen hetzij voor hetzij na opslag).

De foetale membranen kunnen als geheel worden behandeld/ of, bij voorkeur wordt amnion gescheiden van de decidua-chorionmembranen door delaminatie, en verwijderd.

Desgewenst kan decidua worden afgeschraapt van 15 chorion en als zodanig behandeld. Deze laatste operatie wordt evenwel niet gemakkelijk uitgevoerd en lijkt niet geschikt voor routine-extractieprocedures.

Ongeveer 500 g membraanmateriaal, afkomstig van 15 tot 20 bevallingen, werden op één tijdstip behandeld.

20 Het weefsel vrerd fijngemaakt en gehomogeniseerd in 200 ml gedestilleerd water.

Het aldus verkregen weefselhomogenaat werd vervolgens behandeld volgens één van de volgende methoden: a) volgens Schwabe en Braddon, Biochem. Biophys.

25 Res. Commun. 68,1126,1976: na toevoeging van 30 ml geconcentreerd HC1 werd het mengsel gedurende 24 uur op 4°C gehouden, vervolgens werd 160 ml koud aceton toegevoegd, en werd het mengsel overnacht bewaard bij 4°C. Het precipi-taat werd afgescheiden door centrifugering bij 2000 toeren/min. 30 gedurende 15 min. en verwijderd. De heldere bovendrijvende vloeistof werd behandeld met 5 volumina koud aceton gedurende 24 uur en vervolgens gecentrifugeerd bij 27.000 toeren per minuut gedurende 30 minuten; b) volgens Sherwood, Endocrinology 104,886,1979: 35 het mengsel werd eerst geëxtraheerd met fosfaatbuffer, vervolgens werden de weefselresten en de zwaarste cellulaire organellen gescheiden door centrifugeren bij 27.000 toeren per minuut gedurende 30 minuten en verwijderd.

In beide gevallen werd relaxinum als een ruw 40 extract verkregen. Dit ruwe extract kan verder worden 8100243 - 4 - i * gezuiverd door seriechromatografie op CM-cellulose,

Sephadex G-50 superfine en Sephadex G-15, waarbij de methoden worden gevolgd voorgesteld door de bovengegeven auteurs, waardoor een gezuiverd materiaal verkregen wordt 5 met een totale relaxinumactiviteit van 1500 tot 2500 GPU en een specifieke activiteit van 150 tot 1500 GPU/mg proteïne in afhankelijkheid van het aantal chromatografische trappen.

VOORBEELD II

10 Menselijk relaxinum van in vitro cultuur van menselijk decidua.

Decidua werd afgeschraapt van het oppervlak van de decidua-chorion geassocieerde membranen en fijngemaakt.

1 tot 2 g van de fijngemaakte weefsels werd geplaats in Erlenmeyer-kolven, elk gevuld met 40 ml 15 geoxygeneerde oplossing van Gey, gemodificeerd door toevoeging van Hepes (20 mM),Penicilline (50 U/ml) en 10 % kalfsserum.

De culturen werden geïncubeerd in een metabolische incubator gedurende 48 uur bij 37°C, 20 De media werden verzameld, behandeld met 5 volumi na koud aceton en gehouden op 4°C gedurende 24 uur. Het mengsel werd vervolgens gecentrifugeerd bij 27.000 toeren per minuut gedurende 30 minuten waardoor een pellet verkregen werd, die een ruw relaxinumextract bevatte met 25 een specifieke activiteit van 500 tot 2000 GPU/mg proteïne.

Het ruwe extract kan vervolgens verder worden gezuiverd volgens de bekende methodes, waarnaar is verwezen in voorbeeld I.

- conclusies - 8100243 Éfe.. —

Claims (6)

1. Werkwijze voor het verkrijgen van menselijk relaxinum, gekenmerkt door de volgende stappen: a) het fijnmaken en homogeniseren van menselijke 5 foetale membranen, en b) het precipiteren en verwijderen van de weefselresten en de zwaarste cellulaire organellen, teneinde een ruw relaxinumextract te verkrijgen.

2. Werkwijze volgens conclusie l,met het 10 kenmerk, dat amnion wordt gescheiden van de geassocieerde chorion-deciduamembranen en verwijderd, waarna de chorion-deciduamembranen worden gebruikt als bronmateriaal in stap a.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, m e t 15 het kenmerk, dat decidua wordt weggeschraapt van het geassocieerde chorionmemfaraan en gebruikt als bronmateriaal in stap a.

4. Werkwijze voor het produceren van menselijk relaxinum met een in vitro cultuur, gekenmerkt 20. o o r de volgende stappen: a} het incuberen van menselijk deciduaal weefsel of cellen? en b) het zuiveren van de relaxinum uit het incubatiemedium door gebruikelijke procedures.

5. Werkwijze voor het verkrijgen van menselijk relaxinum uit menselijk bronmateriaal, met het kenmerk, dat er gebruik gemaakt wordt van foetale membranen als bronmateriaal.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, m e t het 30 kenmerk, dat men als foetaal membraan de chorion-deciduamembranen neemt. 8100243